MARCOS VINÍCIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA AVALIAÇÃO DA ... · Os linfócitos T totais também...

UNIVERSIDADE DO CEUMA

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

MESTRADO ACADÊMICO

MARCOS VINÍCIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE

MARCADORES FENOTÍPICOS E DE ATIVAÇÃO

EM LINFÓCITOS DE PACIENTES PORTADORES

DE HEPATITE C CRÔNICA

SÃO LUÍS

2013

MARCOS VINICIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MARCADORES FENOTÍPICOS E DE

ATIVAÇÃO EM LINFÓCITOS DE PACIENTES PORTADORES DE

HEPATITE C CRÔNICA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária do CEUMA para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientador: Prof. Dr. Marcos Augusto Grigolin Grisotto

São Luís

2013

iii

Queiroga, Marcos Vinícius de Oliveira

Avaliação da expressão de marcadores fenotípicos e de

ativação em linfócitos de pacientes portadores de hepatite c

crônica. / Marcos Vinícius de Oliveira Queiroga. São Luís:

UNICEUMA, 2013.

102 p.: il.

Dissertação (Mestrado) – Curso de Biologia Parasitária.

Universidade CEUMA, 2013.

1. Vírus da Hepatite C. 2. Imunofenotipagem. 3. Linfócitos T

CD8+CD161high I. Grisotto, Marcos Augusto Grigolin (Orientador)

II. Grisotto, Marcos Augusto Grigolin (Coordenador). III. Título.

CDU: 616.36-002

Q3a

iv

MARCOS VINICIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MARCADORES FENOTÍPICOS E DE

ATIVAÇÃO EM LINFÓCITOS DE PACIENTES PORTADORES DE

HEPATITE C CRÔNICA

A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia __/__/____, considerou o(a) candidato(a):

( ) APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A)

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________

1º Examinador:

______________________________________________________________

2º Examinadora:

______________________________________________________________

3º Examinador:

______________________________________________________________

Orientador: Marcos Augusto Grigolin Grisotto

v

RESUMO

A hepatite C é uma doença infecciosa que atinge cerca de 130 milhões

de pessoas no mundo, que causa alterações significativas no sistema

imunológico dos afetados, que na maioria dos casos evolui de forma crônica

com tendência a complicações graves por falhas de diagnóstico precoce e

tratamento eficaz, como a cirrose hepática e o hepatocarcinoma. Este estudo

objetivou avaliar características imunofenotípicas de linfócitos e monócitos de

uma amostra de 29 pacientes com hepatite C crônica antes do tratamento,

comparando-os com 16 controles saudáveis, através da análise do sangue

periférico por Citometria de Fluxo com o intuito de avaliar possíveis

marcadores de prognóstico. Os pacientes cronicamente infectados com HCV

apresentaram freqüências significativamente reduzidas de linfócitos T

CD8+CD161high, linfócitos estes com indícios de padrão de atividade Th17,

tanto entre as células CD8+CD56+ (NKT) quanto nas CD8+CD56- (linfócitos

típicos). Apesar disso, nos pacientes, estas subpopulações celulares

apresentaram maiores índices de ativação medidos pela expressão de CD69.

Os linfócitos T totais também apresentam maiores freqüências tanto em

números absolutos, quanto em percentual de células ativadas, medidos

através da expressão de HLA-DR em suas membranas. Em relação à

molécula de CD81, o principal receptor para o HCV, verificou-se que a

expressão é maior em linfócitos T CD4+ e CD8+, mas não em monócitos. Já

os linfócitos B, além terem freqüências relativamente aumentadas nos

pacientes em relação aos controles, também apresentaram aumento

significativo da expressão de Toll Like Receptor 2 (TLR2) e de CD81 em suas

membranas. Apesar destas alterações, não foram observadas diferenças

significativas no número total e percentual de células T CD4+ regulatórias ou

ativadas, fato que pode estar relacionado ao curso geralmente silencioso e

difícil detecção da infecção.

Palavras chave: vírus da hepatite C (HCV), imunofenotipagem, linfócitos T

CD8+CD161high, crônico.

vi

ABSTRACT

Hepatitis C is an infectious disease that affects around 130 million

people throughout the world and causes significant changes in patients’

immune system, most of the time progressing to a chronic form, tending to

serious complications, like liver cirrhosis and cancer, due to lack of an early

diagnosis or a not always efficient treatment. The objective of this study was

to evaluate immunophenotypic features of lymphocytes and monocytes of 29

subjects chronically infected by HCV before treatment, comparing them with

16 health controls through the analysis of their blood samples with Flow

Cytometry, in order to evaluate possible prognostic markers. Subjects

chronically infected with HCV show significant reduced frequencies of T-

Lymphocytes CD8+CD161high in both subtypes, CD8+CD56+ (NKT cells)

and CD8+CD56- (typical lymphocytes), which have been correlated with a

possible Th17 response pattern. In spite of that, on subjects, these cell

populations presented greater activation levels checked by the expression of

CD69. Total T-lymphocytes also displayed higher frequencies in absolute

numbers as much as in the percentage of activated cells measured by the

expression of HLA-DR on their membranes. In relation to CD81 molecule, the

main HCV receptor, it was found that it was overexpressed on the

membranes of T CD4 and CD8 lymphocytes, but no differences were found

on monocytes. When it comes to B-lymphocytes, besides their higher

frequencies on subjects as well as the frequencies of these cells expressing

Toll Like Receptor 2 (TLR2) when compared to controls, they also have a

higher expression of CD81 on their membranes. Despite all of these

alterations, it was not observed significant differences on the total number and

percentage of regulatory or even activated T CD4+ cells, a fact that may be

related to the usually silent and hardly detectable course of the disease.

Keywords: Hepatitis C Virus (HCV), Immunophenotyping, T-Lymphocytes

CD8+CD161high, chronicle.

vii

SUMÁRIO

RESUMO ____________________________________________________ v

ABSTRACT __________________________________________________ vi

LISTA DE FIGURAS ___________________________________________ ix

LISTA DE TABELAS ___________________________________________ xii

LISTA DE ABREVIAÇÕES _____________________________________ xiii

1. INTRODUÇÃO ____________________________________________ 16

1.1. Aspectos históricos e epidemiológicos .............................................. 16

1.2. Virologia ............................................................................................ 19

1.3. Resposta do hospedeiro ao HCV ...................................................... 24

1.4. Células NK, NKT CD8+ e padrão Th17 ............................................. 29

2. OBJETIVOS ______________________________________________ 33

2.1. Geral ................................................................................................. 33

2.2. Específicos: ....................................................................................... 33

3. MATERIAIS E MÉTODOS ___________________________________ 34

3.1. Delineamento do Estudo ................................................................... 34

3.2. População Estudada ......................................................................... 34

3.3. Coleta de material ............................................................................. 35

3.4. Processamento das amostras ........................................................... 35

3.5. Análise Estatística ............................................................................. 36

viii

4. RESULTADOS ____________________________________________ 38

4.1. População estudada .......................................................................... 38

4.2. Linfócitos T Totais ............................................................................. 38

4.3. Linfócitos T CD8+ .............................................................................. 40

4.4. Linfócitos T CD4+ .............................................................................. 45

4.5. Linfócitos B ........................................................................................ 47

5. DISCUSSÃO _____________________________________________ 50

CONCLUSÕES _______________________________________________ 59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _______________________________ 60

ANEXOS ____________________________________________________ 69

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação das estruturas do vírus da hepatite C. (Hepatology,

2012)19

Figura 2: Representação da poliproteína viral e proteínas que surgem com as

clivagens durante a replicação viral (Rehermann, 2009). _______________ 20

Figura 3: Distribuição mundial dos genótipos do HCV (Fang, Chow et al.,

1997). ______________________________________________________ 21

Figura 4: Esquematização dos ciclo de replicação do HCV na célula

hospedeira. (Pharmaceuticals, 2000-2010) _________________________ 24

Figura 5: Resposta imune inata autócrina (A) e parácrina (B) gerada pelo

HCV ao infectar o hepatócito. As setas vermelhas representam os

mecanismos inibitórios virais de escape a essa resposta (Rehermann,

2009)_______________________________________________________Er

ro! Indicador não definido.

Figura 6 Análise da distribuição de CD161 em linfócitos TCD8. (A) Seleção

de células fortemente positivas na expressão de CD8 com baixa

granulosidade. (B) Exclusão de células com tamanho ou granulosidade

incompatíveis com linfócitos íntegros. (C) Separação de linfócitos TCD8 em

três subgrupos, de acordo com a presença forte (high), fraca (med) ou nula

(neg) de CD161 em sua membrana plasmática. _____________________ 41

Figura 7: Freqüência de células CD8+CD161high no grupo de pacientes

virgens de tratamento e de controles saudáveis. _____________________ 41

Figura 8: Separação de dos linfócitos CD8+ (A) em células NKT CD8+CD56+

(B) e linfócitos TCD8 típicos CD8+CD56- (C). _______________________ 42

Figura 9: Freqüência relativa de células NKT (CD8+CD56+) em relação ao

total de células CD8+. ___________________ Erro! Indicador não definido.

x

Figura 10: Freqüências relativas de células CD161high dentre os linfócitos

TCD8 típicos CD8+CD56- (A) e células CD8+CD56+ NKT (B). __________ 43

Figura 11: Expressão de CD69 por células TCD8+ (A) e células T

CD8+CD161high (B). __________________________________________ 43

Figura 12: Freqüência de células CD69+ na subpopulação de células

CD8+CD161high (A) e nas células T CD8+ totais (B). _________________ 44

Figura 13: Expressão de CD81 pelas células T CD8 totais (A) e por células

CD8+CD161+ (B). _____________________________________________ 44

Figura 14: Freqüências de células CD8+CD81high em pacientes e

controles(A). ExpressÃo de CD81 medida pela mediana de fluorescência em

células CD8+CD161- de pacientes e controles (B). ___________________ 45

Figura 15: Freqüência de células CD4+ (A) em relação ao tamanho e

granulosidade compatíveis com Linfócitos (B). Análise comparativa da

intensidade de fluorescência de CD81 (C) em pacientes (azul) e controles

(Vermelho). Divisão das subpopulações de células T CD4+ Reguladoras

(Treg) (CD25+CD127low) e Ativadas (CD25+CD127high) (D). __________ 46

Figura 16: Freqüência de células T CD4+ Regulatórias (Treg) (A) e Ativadas

(B) nos portadores crônicos de HCV e controles. Expressão de CD81 por

células T CD4+ nos portadores crônicos de HCV e controles (C). _______ 47

Figura 17: Seleção de linfócitos T por expressão positiva de CD3 (A) com

tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos T (B). Foram

selecionadas células com expressão negativa de CD14 (C) para posterior

análise de expressão de HLA-DR por células CD3+(D). _______________ 39

Figura 18: Freqüências relativas de linfócitos T totais de pacientes e controles

(A). Freqüência células Cd3+ HLA-DR+ por pacientes e controles (B). ___ 40

xi

Figura 19: Figura 20: Seleção de células CD19+ (A), CD14- (B). Expressão

do TLR2 (C) e TLR4 (D) em linfócitos B (CD19+). Análise comparativa da

intensidade de fluorescência de CD81 (E) entre Paciente (vermelho) e

controle (Azul). _______________________________________________ 48

Figura 21: Freqüências relativas (A) e expressão de CD81 de Linfócitos B

CD19+ (B). Expressão de ,TLR2 (C) e TLR4 (D) por células B no grupo de

pacientes e controles. __________________________________________ 49

Figura 22: Análise de monócitos pela separação de células CD14+ (A) com

tamanho e granulosidade compatíveis com monócitos (B). Freqüência de

monócitos com alta expressão de HLA-DR (C).Iintensidade de fluorescência

de TLR2 (D), TLR4 (E) e CD81 (F) em monócitos.Erro! Indicador não

definido.

Figura 23: Freqüências de monócitos HLA-DR+ em pacientes e controles.

Erro! Indicador não definido.

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Sumário da epidemiologia do HCV em vários países da África, Ásia

e Oceania (Sievert, Altraif et al., 2011). _____________________________ 3

xiii

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ADAR – Adenosine Deaminase RNA-specific

ALT – Alanina aminotransferase

AST – Aspartato aminotransferase

CCR – CC Chemokine Receptor

CD – Cluster of Differentiation

cDCs – Conventional Dendritic Cells

CLDN – Claudine

CMV – Cytomegalovirus

CTL – Cytotoxic T Lymphocytes

CXCL – Chemokine (C-X-C motif) Ligand

CXCR – Chemokine (C-X-C motif) Receptor

DNA – Deoxyribonucleic Acid

EBV – Epstein Barr Virus

EDTA - Ethylenediaminetetraacetic Acid

EHSSS – Enhanced Hepatitis Strain Surveillance System

FACS – Fluorescence-activated Cell Sorting

FoxP3 – Forkhead Box P3

GBD – Global Burden of Disease

GBV-C – GB virus type-C

HAV – Hepatitis A Virus

HBsAg – Hepatitis B surface Antigen

HBV – Hepatitis B Virus

HCV – Hepatitis C Virus

HGV – Hepatitis G Virus

HIV – Human Immunodeficiency Virus

HLA - Human Leukocyte Antigen

HuH-7 - Human Hemochromatotic type-7

HVR – Hipervariable Regions

IFN – Interferon

IGS – Interferon Gene Stimulated

IL – Interleucina

xiv

IRES - Internal Ribosome Entry Site

IRF – Interferon Regulatory Factor

JAK/STAT – Janus Kinase / Signal Transducers and Activation of

Transcription

Kb – Kilobases

KDa - Kilodalton

LDL – Low-density Lipoprotein

MHC – Major Histocompatibility Complex

NANBH – Non-A Non-B Hepatitis

NK – Natural Killer

NKT – Natural Killer T

NR – Não-Respondedor

NS – Non-structural

NTRs – Non-translated Regions

OAS - Oligoadenylate Synthetase

ORF – Open Reading Frame

PCSK-9 – Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9

pDCs – Plasmacytoid Dendritic Cells

PKR – Protein Kinase R

RER – Retículo Endoplasmático Rugoso

RIG-I – Retinoic Acid Induced Gene I

RNA – Ribonucleic Acid

RORT - Retinoic acid-related Orphan Receptor T

RPM – Rotações por Minuto

RPMI - Roswell Park Memorial Institute

RVS – Resposta Viral Sustentada

SINAM – Sistema Nacional de Atendimento Médico

SR-BI – Scavenger Receptor class B type 1

TAPA - Target of the Antiproliferative Antibody

Tc – T citotóxica

TECLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TGF – Tumor Growth Factor

Th – T helper

xv

TLR – Toll-like Receptor

TNF – Tumor Necrosis Factor

Treg – T regulatória

WHO – World Health Organization

16

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos históricos e epidemiológicos das hepatites

Desde a década de 50 a ciência estuda as afecções inflamatórias

hepáticas, inicialmente identificando-as como “Hepatite Infecciosa” e

“Hepatite Sérica” (KRUGMAN; WARD; GILES, 1962), e em um segundo

momento, ao se descobrir a natureza viral de ambas, dando-as a

denominação de hepatites A (FEINSTONE; KAPIKIAN; PURCELI, 1973) e B

(BAYER; BLUMBERG; WERNER, 1968), respectivamente. Mas só em

meados dos anos 70, com o desenvolvimento de técnicas sorológicas

específicas para a detecção de pacientes infectados pelos vírus A (HAV) e B

(HBV) da hepatite, constatou-se que a maioria dos casos característicos de

transmissão intrafamiliar da doença se apresentavam negativos para ambos

os vírus. Foi caracterizado então um novo subtipo de hepatite infecciosa

nomeada de Hepatite Não-A Não-B (NANBH) (FEINSTONE et al., 1975), que

apenas em 1989, teve seu agente etiológico identificado pelo Dr. Choo e sua

equipe, após o aprimoramento de técnicas de clonagem molecular (CHOO et

al., 1989), recebendo o nome de Vírus da Hepatite C (HCV).

É impossível saber ao certo a origem específica do vírus, já que

não há amostras de sangue de pacientes infectados datadas de antes da

década de 50. No entanto, levando em conta um parente próximo do vírus

encontrado em primatas do Velho e do Novo Mundo, o HGV/GBV-C, há

especulações de que as origens do HCV datam de até 35 milhões de anos

atrás (SIMMONDS, 2001a). Devido sua via usual de transmissão (contato

sangue-sangue), a disseminação do vírus na raça humana só se deu nos

últimos séculos, com a popularização de utensílios que servem de

intermediários entre hospedeiros, como seringas, lâminas, técnicas de

transfusão sanguínea, dentre vários outros, o que facilitou o surgimento de

mutações e causou o aparecimento de diferentes genótipos, oriundos de um

ancestral comum provavelmente cerca de 500 a 2000 anos atrás, e subtipos

virais há pelo menos 200 anos (SIMMONDS, 2001b).

Sendo assim, até a sua descoberta, o HCV se disseminou pelo

planeta sem qualquer controle humano, e apesar de a última divulgação

17

oficial da Organização Mundial de Saúde (WHO – World Health Organization)

sobre a epidemiologia global do vírus da hepatite C ter sido feita há mais de

10 anos (Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO

Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention

Board, Antwerp, Belgium, 1999), constatando uma prevalência de cerca de

3%, com 170 milhões de pessoas infectadas pelo HCV (Vírus da Hepatite C),

e estudos mais recentes apontarem uma diminuição dos números,

assumindo-se atualmente que cerca de 130 milhões de pessoas (2,2% da

população mundial) são portadoras do vírus, a hepatite C ainda é

considerada por muitos pesquisadores como a “Epidemia do Século”,

havendo considerável subnotificação em muitos países (ALTER, M. J., 2007;

Global burden of disease (GBD) for hepatitis C, 2004; TE; JENSEN, 2010).

Tal subnotificação ocorre principalmente pela típica evolução

subclínica da doença. Sendo poucos os casos de uma apresentação aguda

significantemente sintomática, o que faz com que uma boa parcela dos

indivíduos infectados pelo vírus, ainda não tenha conhecimento a seu

respeito (DE MARCO et al., 2009).

A prevalência real da hepatite C varia muito entre os países,

dependendo em grande parte, das dificuldades de vigilância e dos fatores

socioeconômicos ligados à transmissão da infecção. Na Europa, essa

prevalência pode variar de 0,1 a 6,0% (RANTALA; VAN DE LAAR, 2008),

chegando a ser menor que 0,5% nos países escandinavos, e maior que 3%

em países como Bulgária, Itália e Grécia (ESTEBAN; SAULEDA; QUER,

2008), sendo assim considerada nos estudos últimos estudos

(MUHLBERGER et al., 2009), como um amplo problema de saúde pública,

levando a altos gastos para a administração de cada país, e necessitando

ainda de vastos melhoramentos quanto ao diagnóstico e tratamento precoce,

vigilância e prevenção.

A Organização Mundial de Saúde calcula que na África hajam

cerca de 31,9 milhões de infectados pelo HCV (Global surveillance and

control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in

collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium,

1999), sendo mais endêmica nas regiões da África Central, com até 6% de

prevalência, seguida pela África Oriental com 2,4%, enquanto no sul e no

18

leste estima-se ocorrência de apenas 1,6% de pessoas infectadas com o

HCV (MADHAVA; BURGESS; DRUCKER, 2002). Neste continente encontra-

se o país com maior prevalência do mundo, estando o vírus presente em 15 a

20% da população do Egito (ABDEL-AZIZ et al., 2000; STRICKLAND, 2006),

sendo mais comuns em homens adultos e responsabilizando-se por 60 a

78,5% dos casos de carcinoma hepatocelular neste país (LEHMAN;

WILSON, 2009).

Nos Estados Unidos a prevalência do HCV na população tem sido

avaliada pelo Inquérito Nacional de Saúde e Nutrição (National Health and

Nutrition Examination Survey - NHANES), sendo a coleta de dados mais

recente datada de 1999 a 2002, pelo Centro de Controle de Doenças (CDC -

Center of Disease Control), que demonstrou a presença de cerca de 4,1

milhões de pessoas anti-HCV positivas, ou 1,6% da população

(ARMSTRONG et al., 2006), levando em 1998 a um gasto de cerca de um

bilhão de dólares, tanto com a doença, quanto com o controle de suas

comorbidades (LOUIE et al., 2012; RAY KIM, 2002). Já no Canadá, através

do Sistema de Vigilância Avançada em Cepas de Hepatites (Enhanced

Hepatitis Strain Surveillance System - EHSSS), estima-se que 0,8% da

população seja afetada pelo vírus, havendo um pico de prevalência em

jovens e adultos de 15 a 39 anos, tendo ocorrido uma diminuição de 36,4%

na incidência entre 1998 e 2004(WU et al., 2006).

Na América latina, encontram-se prevalências relativamente mais

baixas que no restante do mundo subequatorial, sendo estimada em torno de

1,23%, mas variando de país a país, ou mesmo nas diferentes regiões de

cada país, como no caso do Brasil (MENDEZ-SANCHEZ; GUTIERREZ-

GROBE; KOBASHI-MARGAIN, 2010), onde ainda é desconhecida a

verdadeira dimensão da sua situação epidemiológica atual.

Segundo os dados do Ministério da Saúde, houve uma incidência

de 52.489 casos entre os anos de 1994 e 2005, com uma tendência

temporalmente crescente de incidência devido à maior disponibilidade de

acesso a meios diagnósticos nos serviços públicos e privados. Com base em

cálculos feitos baseados no Censo de 2000 e inquéritos sorológicos feitos em

diversos centros do país, estima-se que devam existir de 400.000 a

19

3.800.000 casos de hepatite C no Brasil, atingindo o equivalente a 0,28 a

2,61% da população (DE ARAUJO et al., 2007).

No Maranhão, os dados mais confiáveis são provindos do Sistema

de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) do Ministério da Saúde, e

mostram apenas uma incidência variável da doença nos últimos anos,

variando amplamente entre 1999 e 2007, desde 0,25 a 2,55 casos novos por

100.000 habitantes. Assim, não há estudos conclusivos sobre a real

prevalência da doença no estado.

1.2. Virologia

O vírus da hepatite C é pequeno (55 a 65nm), esférico e

envelopado, apresentando virions com densidades altamente variáveis

(Figura 01), estando as mais infectantes entre 1,15 a 1,17 g/ml, e contendo

dentro de seu envelope externo um núcleo de 30 a 35nm, que encapsula

uma fita simples e positiva de RNA viral com aproximadamente 9,6kb,

relacionada fortemente tanto com o pestivirus quanto com o flavivirus

(OKAMOTO et al., 1991; TAKAMIZAWA et al., 1991), ambos da família

Flaviviridae, dentro da qual foi então classificado como o único representante

do gênero Hepacivirus.

Figura 1: Representação das estruturas do vírus da hepatite C. (Adaptada de HEPATOLOGY, 2012)

Essa estrutura nucleotídica é composta basicamente por uma

“sequência aberta de leitura” ou ORF (Open Reading Frame), ladeada em

suas terminações por duas pequenas “regiões não traduzidas”, ou NTRs

Glicoproteína de Envelope

RNA de fita única

Nucleocapsídeo

20

(Non-Translated Regions), essenciais para a tradução e replicação do RNA.

A ORF decodifica uma poliproteína de cerca de 3008 a 3037 aminoácidos, de

acordo com o isolado viral (CHAMBERLAIN et al., 1997), que é clivada

durante e após a tradução em ao menos 10 produtos com funções diferentes,

sendo três proteínas estruturais (core, envelope E1, e E2) e ao menos sete

proteínas não estruturais, conhecidas como NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B,

NS5A, e NS5B (Figura 02), em grande parte responsáveis pelo evasão do

vírus ao sistema imune do hospedeiro (SHARMA, 2010).

Figura 2: Representação da poliproteína viral e proteínas que surgem com as clivagens durante a replicação viral (Adaptada de REHERMANN, 2009).

Além das diferenças no tamanho de suas ORFs, as várias cepas

de HCV têm uma grande diversidade seqüencial de seus nucleotídeos,

diferenciando-se em diferentes genótipos quando há uma variedade maior

que 30%. Atualmente já existem ao menos 6 genótipos identificados

numericamente de 1 a 6, os quais podem variar em até 50% de sua estrutura,

e mais de cem subtipos (variações entre 15 e 30% dentro do mesmo

genótipo) identificados com letras seqüenciais maiúsculas (A, B, C, etc). A

variabilidade genômica viral chega a ser tanta que é possível encontrar

21

dentro do mesmo indivíduo, cepas ligeiramente diferentes (1 a 5%) umas das

outras, (conhecidas como quasispecies). Essa variabilidade ocorre

principalmente nas glicoproteínas do envelope E1 e E2 (BUKH; MILLER;

PURCELL, 1995; SIMMONDS, 1995), tendo esta última duas HVRs

(Hipervariable Regions, ou Regiões de Hipervariação): HRV-1, formada por

uma seqüência de 27 aminoácidos no terminal N da molécula; e HRV-2,

formada por 9 aminoácidos localizados em contigüidade após HRV-1

(KUMAGAI et al., 2007) devido à alta freqüência de replicação e à falta de

atividade revisora da RNA-polimerase, havendo uma taxa de incorporação

errônea de bases de cerca de 10-3 substituições por locus por ano (MAJOR et

al., 1999).

O genótipo 1 é encontrado em todo o mundo (Figura 3), sendo

ainda o mais prevalente no Brasil, enquanto os outros 5 são restritos a áreas

geográficas específicas, estando os genótipos 2 e 3 também

significativamente presentes no território nacional (LONGO, 2012). Apesar de

todos os genótipos identificados serem hepatotrópicos e patogênicos,

evidências sugerem que as diferenças no fenótipo geradas por essas

variações influenciam no grau de infectividade e patogenicidade de cada

cepa, e por conseqüente na taxa de progressão para cirrose e no risco de

Carcinoma Hepatocelular (SIMMONDS et al., 1996).

Figura 3: Distribuição mundial dos genótipos do HCV (FANG; CHOW; LAU, 1997).

22

Ao entrar na circulação de um novo hospedeiro através do contato

sangue-sangue, o primeiro passo para o vírus é invadir sua célula alvo, neste

caso o hepatócito. Na corrente sanguínea, o HCV se associa naturalmente a

lipoproteínas circulantes, facilitando assim sua fase de adesão inicial à célula

alvo, através dos receptores de LDL. Após a adesão, a penetração do vírus

pela membrana plasmática é um processo de várias etapas lentas e

complexas, envolvendo várias proteínas receptoras da célula do hospedeiro

como glicosaminoglicanas, SR-BI (Scavenger Receptor class B type I),

membros da família Claudina (CLDN1, 6 e 9), dentre várias outros auxiliares

(HELLE; DUBUISSON, 2008). Porém uma proteína específica é considerada

essencial para a ligação do vírus com a célula, o CD81, ou Tetraspanina-8,

membro da superfamília transmembrana 4 (Tetraspanina), contendo 236

aminoácidos aparentemente não modificados após a tradução, estimando-se

um peso molecular de 25,8 kDa, sendo fisiologicamente o alvo do anticorpo

antiproliferativo 1, ou TAPA-1 (ANDRIA et al., 1991), presente em todas as

células nucleadas do corpo.

Tendo sido identificado em 1998, varrendo-se um banco de

expressões de cDNA utilizando um recombinante da proteína estrutural E2 do

HCV como sonda (PILERI et al., 1998), o CD81 executa várias funções,

incluindo adesão celular, metástase por motilidade e ativação celular. Várias

pesquisas já demonstraram uma super-expressão do CD81 nos leucócitos

totais do sangue periférico (KRONENBERGER et al., 2001), em células B

CD5+ (ZUCKERMAN et al., 2003), CD19+ (HOFMANN et al., 2004) e CD8+

(KRONENBERGER et al., 2006) de pacientes infectados pelo HCV, podendo-

se associar o nível de expressão do CD81 ao nível de infecção das células

alvo e de alteração de suas propriedades funcionais. Tais trabalhos também

verificaram uma queda significativa na expressão do receptor durante o

tratamento com IFN-, em pacientes com uma Resposta Virológica Precoce

(RVP, quando o paciente tem HCV-RNA indetectável com 12 semanas de

tratamento), e a manutenção dessa baixa expressão nos pacientes com

Resposta Virológica Sustentada (RVS, quando o HCV-RNA é indetectável 6

meses após o fim do tratamento), em contraste com a super-expressão

verificada nos pacientes não respondedores (NR) ao tratamento, o que

23

impulsionou a pesquisa de novas substâncias capazes de modular a

expressão dessa molécula, sendo a PCSK9 uma das mais promissoras em

estudos in-vitro até o momento (LABONTE et al., 2009).

A proteína estrutural E2 faz uma ligação de alta afinidade com o

loop externo maior do CD81, interagindo também inicialmente com o SR-BI, e

ao final com CLDN1 (HARRIS et al., 2008), tendo então seu nucleocapsídeo

imediatamente liberado dentro do citoplasma. Após a descapsidação, no

interior da célula, o RNA viral, sendo uma fita positiva, é imediatamente

traduzido e replicado pelos ribossomos do Retículo Endoplasmático Rugoso

(RER), ao se ligarem à extremidade 5’-IRES do genoma viral, por um

mecanismo não dependente da sinalização por CAP. A poliproteína formada

é clivada após e mesmo durante a própria tradução, pela ação de proteases

tanto virais quanto celulares, produzindo as proteínas estruturais e não

estruturais anteriormente citadas (GOSERT et al., 2003), destacando-se

neste momento a RNA polimerase RNA-dependente NS5B, que replica o

genoma viral pela síntese de uma fita de RNA negativa que serve de molde

para a produção de várias outras fitas positivas no complexo de replicação da

rede membranosa formado pelas outras proteínas não-estruturais junto com

proteínas da célula hospedeira, sendo tais fitas subsequentemente envoltas

pelo capsídeo no RER, maturadas no complexo de Golgi e posteriormente

liberadas no meio extracelular por exocitose (PENIN et al., 2004), como é

visto na Figura 4.

24

Figura 4: Esquematização dos ciclo de replicação do HCV na célula hospedeira. (Adaptada de PHARMACEUTICALS, 2000-2010)

1.3. Resposta do hospedeiro ao HCV

Por seu caráter tipicamente crônico e silencioso, a hepatite C

raramente é diagnosticada na fase inicial, sendo usualmente detectada em

exames de rotina, que inesperadamente detectam alterações nos níveis de

aminotransferases dos pacientes já cronicamente infectados, o que torna

difícil o estudo da fase aguda em humanos. Sendo assim as informações

obtidas até hoje, em sua maior parte vêm de modelos experimentais de

infecção em primatas (chimpanzés). Por sua vez, estudos in vitro de infecção

só foram possíveis após o desenvolvimento de um meio de cultura de

hepatócitos bem diferenciados permissíveis ao vírus, chamado de células

HuH7, derivados de um carcinoma celular originalmente retirado do tumor de

fígado de um paciente japonês do sexo masculino, em 1982.

A partir de tais modelos, verificou-se que de oito a doze semanas

após o contato com o vírus, ocorre um aumento da Alanina Aminotransferase

(ALT) sérica, em conjunto com as células T e anticorpos HCV específicos na

25

circulação. Além disso, há um aumento de células T HCV-específicas no

fígado, em paralelo com uma queda nas titulações do vírus no sangue. Neste

momento decisivo, 20 a 40% dos pacientes que conseguem desenvolver uma

resposta imunológica Th1 de grande intensidade, evoluem para resolução

espontânea da doença, enquanto o restante permanece cronicamente

infectado, numa batalha constante entre imunidade e mecanismos de evasão

viral que levam o fígado a um estado inflamatório constante e progressivo.

Neste caso, o quadro evolui com cirrose hepática dentro de 20 anos em 40%

dos casos, o que por fim leva a morte por complicações como a hipertensão

portal, distúrbios de coagulação, entre outros, e em cerca de 4% destes, por

hepatocarcinoma celular. Dependendo do genótipo viral, de quando e se

diagnosticados, será observada uma taxa de resolução da infecção com os

tratamentos atualmente disponíveis de apenas 40 a 80%, sendo o restante

dos casos, os maiores responsáveis pelas indicações de transplante hepático

no mundo.

A resposta do hospedeiro à infecção viral inicia-se tão logo ocorra

a invasão do hepatócito pelo vírus, dando início a uma resposta imune inata.

O padrão de fita dupla de RNA gerado durante a replicação viral é

reconhecido dentro dos endossomos, enquanto o Gene I Induzido por Ácido

Retinóico (RIG-I) reconhece a parte da poliuridina da extremidade não

traduzível 3’, quando no citoplasma (SAITO et al., 2008), ambas levando a

cascatas de sinalizações intracelulares que culminarão na síntese de IFN-,

que será secretado e liberado pela célula infectada, induzindo um estado

antiviral nas células vizinhas ainda saudáveis (KAWAI; AKIRA, 2008).

Ao ligar-se ao receptor de IFN- das células vizinhas, o IFN-

desencadeia a produção de várias enzimas, parte delas ajudam no combate

ao vírus ao degradarem tanto RNA viral quanto celular (GUO et al., 2004);

outras desestabilizam unicamente estruturas de RNA de dupla fita (TAYLOR

et al., 2005); e duas outras, a P56 (HUI et al., 2003) e PKR (PFLUGHEBER

et al., 2002), inibem a tradução de RNA em geral.

O HCV, por sua vez, adquiriu em sua evolução vários mecanismos

de escape a essa resposta imune inicial do hospedeiro, tendo como

principais armas as proteínas não estruturais, ou mesmo estruturais como a

26

proteína de núcleo (Core), produzidas durante sua replicação. Em estudo de

cultura celular, foi possível observar a importante ação de algumas proteínas

in vitro, como a NS3/4A, que é capaz bloquear as cascatas de sinalização do

de reconhecimento endossômico e do RIG-1, o que leva à uma diminuição

conseqüente de todos os eventos descritos anteriormente (FOY et al., 2003;

LI et al., 2005). Já a NS5A estimula a produção de IL-8 (POLYAK et al., 2001)

e diminui a expressão de genes estimulados por IFN, além de formar

heterodímeros com a PKR e também de levar a sua inibição (GALE et al.,

1997). A proteína NS3, possivelmente estimula monócitos, induzindo a

secreção de TNF- por estes, o que levaria a uma diminuição na produção

de IFN por parte das Células Dendríticas plasmacitóides (pDCs), além de

sua apoptose (DOLGANIUC et al., 2006), e a proteína de núcleo (Core)

interfere diminui a produção de IFN (LIN et al., 2006), além de ligar-se ao

receptor de complemento de macrófagos e Células Dendríticas

convencionais (cDCs), diminuindo a produção do IL-12, aumentando a

produção de IL-10 (DOLGANIUC et al., 2003), e assim sendo a provável

responsável pela baixa ativação de células T, assim como pelo atraso no

aparecimento de células T específicas para o vírus.

Evadindo então a resposta inicial das células parenquimatosas e

obtendo sucesso em sua replicação, o HCV passa a ser encontrado livre na

circulação e então é captado por diversos outros tipos celulares que por sua

vez, também desempenham papéis específicos no combate viral. A primeira

linha de defesa é provida por células NK e células NKT, cujas populações

encontram-se relativamente elevadas no fígado em comparação com a

periferia. Estas células e outras são ativadas pelo IFN-α, cujos níveis são

extremamente elevados na fase inicial da infecção. Uma vez ativadas, estas

células secretam IFN-γ, o qual inibe a replicação do HCV através de um

mecanismo não citolítico. Além disso, as NKs desempenham um papel

essencial no controle da infecção pelo HCV pois são capazes de eliminar

hepatócitos infectados diretamente através de um mecanismo citolítico

inespecífico e indiretamente através da produção de citocinas que induzem

um estado antiviral (IRSHAD; KHUSHBOO; SINGH, 2008), sendo tal

resposta fortemente influenciada por fatores genéticos. Também foi verificado

27

que as células NK de pacientes infectados aumentam a expressão de

receptores inibitórios e produzem citocinas que atenuam a resposta imune

adaptativa, como TGF-β e IL-10, in vitro (REHERMANN, 2009).

Durante a hepatite aguda, as células T específicas são ativadas

por partículas virais do HCV promovendo a migração destas células para o

fígado. Uma das principais características da infecção pelo HCV é justamente

o atraso nesta ativação, sendo detectadas células específicas ativadas na

circulação em cinco a nove semanas após a infecção (THIMME et al., 2002),

e anticorpos específicos contra o vírus encontrados de oito a vinte semanas

depois (LOGVINOFF et al., 2004), sendo tal atraso fator determinante para a

perpetuação da infecção.

A resposta das células TCD4+ e CD8+ HCV específicas e a

produção de IFN-γ coincidem com a redução da quantidade de vírus HCV.

Uma vigorosa resposta de células TCD4+ contra vários antígenos virais é

detectada em casos resolvidos. Em contrapartida, nos casos que evoluem

para hepatite crônica, respostas celulares de células TCD4+ são fracas e de

curta duração. A freqüência de células TCD8+ HCV específicas é elevada

durante a fase aguda da infecção (2-8% periféricas), no entanto, diminui à

medida que a persistência do HCV se desenvolve (0,01-1,2%). Vários

estudos têm demonstrado que a resposta citotóxica HCV específica

correlaciona-se inversamente com a carga viral. Além disso, células TCD8+

HCV específicas em pacientes crônicos com hepatite C possuem menos

capacidade de proliferar e produzem menos IFN-γ em resposta aos

antígenos do HCV (KANTO; HAYASHI, 2006). Assim, observa-se que

durante a fase aguda de infecção, no início da resposta específica contra o

vírus, predomina um padrão Th1 anti-HCV, sendo que a persistência do vírus

e conseqüentemente a passagem para a fase crônica, estão relacionados a

uma mudança e prevalência para o padrão Th2 (CABRERA et al., 2004).

Os linfócitos TCD4+ são cruciais na orquestração da imunidade

celular contra o HCV. Estas células reconhecem os peptídeos virais

antigênicos ligados às moléculas de histocompatibilidade (HLA) classe II na

membrana das células infectadas, ativando-se e promovendo o recrutamento

de linfócitos T citotóxicos (CD8+), responsáveis pela eliminação das células

infectadas por vírus e que em conjunto, produzem citocinas que podem inibir

28

a replicação viral. A resposta eficiente aos diferentes antígenos virais,

incluindo os do núcleo (core), está associada a uma evolução benigna da

infecção pelo HCV. O mesmo é observado em um estudo de Barbosa (2008)

o qual demonstrou que à medida que a infecção viral progride, ocorre o

aparecimento de linfócitos T CD4+ específicos que promovem a expansão

clonal de células T CD8+ citotóxicas (CTLs) (LASARTE et al., 1998).

As CTLs vírus-específicas contribuem para o controle do vírus por

mecanismos citolíticos e/ou pela secreção de citocinas como o IFN-γ, IFN-α/β

e TNF-α, os quais induzem a um estado antiviral em células hospedeiras,

como o que ocorre com hepatócitos infectados. Este estado antiviral torna as

células não infectadas resistentes à infecção, interrompendo a replicação

viral além de induzir o aumento da expressão de moléculas de MHC de

classe I (IRSHAD; KHUSHBOO; SINGH, 2008).

Em um estudo realizado com 28 pacientes observou-se a forte

influência de uma resposta imunológica predominantemente Th1 em doentes

com resposta viral sustentada (RVS), com células TCD8+ produzindo altos

níveis de IFN- durante o tratamento. Por outro lado, pacientes Não

Respondedores (NRs) tiveram uma resposta imunológica mais polarizada

para Th2/Tc2 caracterizada por elevados níveis de IL-4 no sangue periférico

no final do tratamento, com uma diminuição posterior durante o seguimento

(TRAPERO et al., 2005).

A persistência do vírus no hospedeiro acaba por estimular não

apenas mecanismos de controle viral, mas também as células imunológicas

responsáveis pelo autocontrole da resposta inflamatória. As células T

regulatórias (Tregs), que perfazem cerca de 5 a 10% das células TCD4+

periféricas, são responsáveis por manter a tolerância e suprimir linfócitos

auto-reativos, mas podem ser induzidas pela presença do vírus através a

persistência dos antígenos ao longo do tempo. Esta atividade pode ser

promovida pela ação de subpopulações de células dendríticas moduladas

pela viremia persistente. As Tregs podem regular a resposta das células

TCD4+ e TCD8+ na infecção persistente, especialmente na inflamação do

fígado, sendo revelado em um estudo que aproximadamente uma em cada

três células TCD4+ no fígado de pacientes cronicamente infectados são

29

FoxP3+, uma forte população de Treg potenciais. Isto poderia ter um efeito

importante sobre a manutenção e o crescimento de células TCD4+

específicas para o antígeno e células TCD8+ (SEMMO; KLENERMAN, 2007).

Em um estudo anterior foi postulado que as células T CD4+CD25+

estão envolvidos na persistência do HCV, tendo sido observado uma

proporção significativamente maior de células T CD4+CD25+ em pacientes

cronicamente infectados em comparação com os espontaneamente

recuperados e controles normais (CABRERA et al., 2004), levantando a

hipótese de a freqüência de células Treg antes e durante a infecção pode

estar relacionada com a cronificação ou resolução espontânea da hepatite.

Além disso, verificou-se que estas células regulatórias suprimiram a secreção

de IFN-γ e a proliferação de células T HCV-específicas em uma dose

dependente, levantando-se também a possibilidade de que a deficiência

intra-hepática na regulamentação destas células pode levar a um aumento da

inflamação e fibrose do fígado, como demonstrado a partir de amostras

colhidas de tecidos hepáticos fibrosados.

1.4. Células NK, NKT CD8+ e padrão Th17

Usual e didaticamente, costuma-se dividir as células do sistema

imune em famílias, linhagens e subgrupos da imunidade inata ou adquirida,

baseando-se tanto na citada expressão de marcadores de membrana, como

na produção de citocinas, sendo muitos desses marcadores, também

moléculas efetoras. In vivo, porém, essa dicotomia não costuma ser tão clara,

e com a crescente identificação de inúmeras células com expressões

diferentes de marcadores, e sendo esses marcadores, usualmente também

efetores, pode ocorrer um entrelaçado de funções tanto inatas como

adquiridas numa mesma célula. É o caso cada vez mais “confuso” dos

linfócitos T, células NK e células NK-T, comumente consideradas como parte

do sistema imune adquirido e inato (as duas últimas), mas que expressam

várias moléculas em comum, como é o caso de uma lecitina do tipo C que

vem sendo amplamente estudada, o CD161, expresso pela maior parte das

células NK e por aproximadamente 24% das células T periféricas (LANIER;

30

CHANG; PHILLIPS, 1994) e permanecendo ainda pouco estudada quanto à

sua função exata nestas células, se apenas fenotípicas, ou se efetoras.

Análises demonstraram a existência de duas populações distintas

de células T CD8+ expressando CD161 em sua membrana, uma com

expressão intensa (CD161high) e outra com expressão intermediária

(CD161int), além de uma população de linfócitos T CD4+ expressando níveis

intermediários da molécula (TAKAHASHI; DEJBAKHSH-JONES; STROBER,

2006). A função exata de cada uma dessas subpopulações celulares ainda

permanece não esclarecida, apesar de estudos posteriores (COSMI et al.,

2008) terem identificado uma grande expressão desta molécula em células T

helper 17 (Th17), quando comparadas com células Th1 e Th2, apresentando

um novo nicho de células T helper que secretam tanto IL-17A e IL-17F, e

expressam o Receptor Órfão do Fator de Transcrição Mestre Relacionado ao

Ácido Retinóico (RORt) necessário para tal resposta (IVANOV et al., 2006),

passando então o CD161 a ser considerado um marcador de células Th17 na

população linfocitária.

O paradigma Th1/Th2 tem sido ampliado com a descoberta sobre

este subconjunto de células efetoras que também produzem interleucinas do

padrão celular Th17. A função primária destas células parece ser a

eliminação de patógenos que não são adequadamente controlados por

células Th1 ou Th2 e também são potentes indutores de inflamação nos

tecidos. Em 2006, três estudos independentes descobriram que uma

combinação de TGF-β e IL-6 é necessária para a diferenciação de células

Th17 e a indução da síntese de IL-17 em células T imaturas (KORN et al.,

2009).

Foi demonstrado que células T CD4+ produtoras de IL-17A e IL-

17F, formam uma linhagem separada, a Th17, que inclui células que

expressam ácido retinóico para a sua diferenciação. Além da IL-17, essas

células também podem produzir IL-22 e IL-21. A IL-17 foi descrita pela

primeira vez em 1995 como uma glicoproteína de aproximadamente 20 kDa

(155 aminoácidos), sendo um importante mediador da inflamação uma vez

que tem efeitos pleiotrópicos sobre tecidos e várias células do sistema

imunológico. Ela mobiliza os neutrófilos, em parte através do aumento da sua

31

sobrevivência local e em parte pela indução de quimiocinas. Dentre os

agentes infecciosos que induzem a um padrão Th17 no hospedeiro podem

ser identificadas espécies de bactérias, fungos e vírus (DE JONG;

SUDDASON; LORD, 2010).

Quando Takahashi et al. (2006) identificou os subgrupos de

células CD8+CD161high e CD8+CD161int, o primeiro grupo foi classificado

como de células anérgicas por não terem se proliferado ou produzido

citocinas no padrão Th1 ou Th2. Porém em um estudo posterior

(BILLERBECK et al., 2010), estas células foram identificadas como

secretoras de IL-17, apresentando um fenótipo compatível com o padrão,

expressando RORt, CCR6, CXCR6 e IL-18R, além de também

apresentarem um baixo potencial citotóxico, quando comparadas aos

linfócitos T CD8+ típicos, tendo em vista a baixa produção de granzima B e

perforina.

A expressão usual do receptor de quimiocinas CXCR6 por parte

destas células instigou vários estudos levantando a possibilidade de sua

importância no combate a infecções localizadas em tecidos específicos,

como o hepático e pulmonar, levando em conta o direcionamento de seu

ligante, o CXCL16, expresso constitutivamente nestes órgãos, além de

também ser induzido pela inflamação em articulações e intestino (FREEMAN;

CURTIS; CHENSUE, 2007; HEYDTMANN et al., 2005; KIM et al., 2001;

NANKI et al., 2005; SATO et al., 2005; WANG et al., 2004), levando então à

busca do papel desta molécula nas infecções hepáticas virais, e a

conseqüente identificação da expressão de CD161 em células T vírus-

específicas circulantes de pacientes com hepatites B e C, além de uma alta

concentração de linfócitos T CD8+CD161+ infiltrantes no tecido hepático dos

mesmos, não sendo encontrados resultados equivalentes nas infecções por

HIV, CMV e EBV, e sendo todas caracterizadas fenotipicamente como

células de memória efetoras (NORTHFIELD et al., 2008). Além disso, a

própria molécula de CD161 tem sido proposta como participante do processo

de migração transendotelial. As células CD4+CD161+ migram através do

endotélio em maior intensidade que as CD4+CD161-, possivelmente pela

32

ligação da molécula a oligossacarídeos ácidos, sendo tal característica

reduzida após a incubação com anti-CD161 monoclonal (POGGI et al., 1997).

Apesar de todos os avanços no estudo dos mecanismos de

sobrevivência do vírus no hospedeiro, os mecanismos específicos desta

interação ainda estão por ser completamente elucidados, sendo necessária

melhor investigação sobre a influência do vírus no comportamento das

células do sistema imune.

33

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Comparar a expressão de marcadores imunofenotípicos em

linfócitos T CD4+, CD8+ e Linfócitos B de pacientes portadores de hepatite C

crônica e controles saudáveis.

2.2. Específicos:

- Avaliar, a expressão do receptor viral CD81 em linfócitos T e B, além

das freqüências absolutas dessas células.

- Analisar a freqüência de linfócitos T CD8+ com alta expressão da

molécula de CD161 e avaliar sua possível correlação com o perfil

Th17

- Avaliar a expressão do marcador específico de ativação CD69 em

células T CD8+.

- Investigar a freqüência de células T CD4 regulatórias e ativadas

circulantes, através da expressão de CD25/CD127 e HLA-DR.

34

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Delineamento do Estudo

Trata-se de um estudo transversal, analítico, individualizado,

observacional, realizado utilizando-se dados e amostras por conveniência

recolhidas de junho de 2010 a junho de 2012, de pacientes com hepatite C

crônica antes de iniciarem o tratamento adquirindo os medicamentos na

Farmácia Estadual de Medicamentos Excepcionais (FEME), e de um grupo

controle de voluntários não portadores da doença.

3.2. População Estudada

Foram avaliadas amostras sanguíneas e exames laboratoriais de

uma amostra por conveniência de 30 pacientes, 18 mulheres e 12 homens,

com idade média de 48 anos, portadores de hepatite C crônica antes de

iniciarem o tratamento, que se encaixaram nos critérios de inclusão e

exclusão descritos a seguir, e aceitaram participar da pesquisa assinando o

termo de consentimento livre e esclarecido (TECLE) em anexo (Anexo A).

Foram incluídos na pesquisa pacientes portadores de:

vírus da hepatite C com detecção persistente de HCV-RNA por mais

de seis meses;

anti-HCV positivo por teste imunoenzimático de terceira geração e;

exame histológico realizado por patologista experiente (quando

excluídas as contra-indicações de tal procedimento), sendo realizada a

graduação e estadiamento da lesão hepática de acordo com o

Consenso Nacional sobre a classificação das hepatites crônicas

(GAYOTTO, 1994).

Não foram incluídos na pesquisa os pacientes:

positivos para o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg);

positivos para os anticorpos contra o vírus da imunodeficiência

humana dos tipos 1 e 2;

35

portadores de doenças hepáticas de outra etiologia, como doenças

auto-imunes;

que ingeriam mais de 20g de álcool por dia;

portadores de doença hepática descompensada.

Dezoito pacientes saudáveis, sendo 10 mulheres e 8 homens,

entre 18 e 64 anos (média: 35) escolhidos aleatoriamente, sem hábitos de

consumo de álcool ou história de doença hepática, e que aceitaram participar

do estudo assinando o termo de consentimento livre e esclarecido em anexo,

foram utilizados como grupo controle, sendo submetidos aos mesmos

procedimentos realizados no grupo de estudo. Ao primeiro contato, tanto

pacientes quanto controles foram apresentados e assinaram ao termo de

consentimento livre e esclarecido, sendo realizada então a coleta de dados

clínicos, laboratoriais e epidemiológicos, através do questionário em anexo

(Anexo B). Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em pesquisa

com seres humanos da Universidade do Ceuma sob o protocolo 00427/10,

de 26/07/2010 (Anexo C).

3.3. Coleta de material

Foi coletada uma amostra de cerca de 4 ml de sangue total em

tubos contendo EDTA, por punção venosa periférica, sendo então

imediatamente transportadas em caixa térmica a 4ºC ao laboratório de

Imunologia das Parasitoses da Uniceuma, onde foram processadas para

análise por citometria de fluxo.

3.4. Processamento das amostras

As amostras foram colocadas em tubos de ensaio plásticos,

centrifugadas a 1500nrpm por 5 minutos para a retirada do plasma. As

células do corpo de fundo foram então misturadas a 10ml de tampão de lise

de hemácias contendo 8,3 g NH4Cl, 1g KHCO3, 1,8ml de uma solução de

5% EDTA para cada litro de solução, e agitadas levemente a uma

36

temperatura de 37ºC em banho Maria por 2 minutos para otimização da ação

do cloreto de amônia.

Após o processo de lise, a mistura foi levada novamente à

centrífuga a 1500rpm por mais 5 minutos, ao final dos quais, foi retirado todo

o sobrenadante, sendo obtido um pellet de leucócitos ao fundo do tubo. Estas

células foram então lavadas e centrifugadas (sempre com os mesmos

parâmetros) por duas vezes com 5ml de uma solução contendo 90% de

RPMI e 10% de Soro Bovino Fetal, sendo descartados os sobrenadantes e

então diluídas novamente em 0,5ml da mesma solução, para posteriormente

serem divididas em 10 amostras iguais de 50l, colocadas em placas de

acrílico com poços de fundo em U e adicionados 50l de uma solução com

três anticorpos, cada um ligado a um diferente fluorocrômo (Fitc, Pe ou Pe-

Cy5), diluída em RPMI.

A mistura de leucócitos com os anticorpos conjugados foi então

incubada em geladeira por 30 minutos e logo após lavada e centrifugada

primeiramente com 100l de RPMI, e logo em seguida com 200l de solução

fisiológica de NaCl a 0,9%. Após o descarte do sobrenadante, as células

foram então ressuspensas em 400l solução fisiológica e inseridas em tubos

de FACS, misturadas a 100l de Paraformaldeído a 2% para fixação, sendo

então lacrados os tubos e levados à geladeira até o momento da leitura no

Citômetro de Fluxo (BD FACSCalibur - BD Biosciences), realizado no máximo

até dois dias do processamento.

3.5. Análise Estatística

As análises realizadas pelo citômetro foram interpretadas pelo

programa BD CellQuestTM Pro 5.1, sendo posteriormente analisadas

utilizando o FlowJo 8.7, ambos para o Sistema Operacional Mac OS.

Todas as possíveis diferenças entre os grupos foram analisadas

utilizando o Teste T de Student para amostras independentes e teste F de

variância. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A

análise estatística foi realizada através do GraphPad Prism for Mac OS X

5.0d (2010).

37

Todos os resultados de médias apresentados a seguir seguirão o

mesmo padrão de Média (para freqüências) ou Mediana (para intensidades

de expressão) ± Erro Padrão, seguido do tamanho da amostra analisada (N).

38

4. RESULTADOS

Através da citometria de fluxo, estudou-se os marcadores externos

de membrana dos Linfócitos T totais, além das subpopulações de linfócitos T

CD8, T CD4 e os Linfócitos B.

4.1. População estudada

Ao total foram analisadas amostras de 30 pacientes cronicamente

infectados e não tratados, doravante denominados nos gráficos apenas como

Pacientes, e 18 pacientes saudáveis, denominados Controles, distribuídos de

acordo com a Tabela a seguir:

Tabela 1: Perfil das amostras selecionadas para o estudo

PACIENTES (n=30) CONTROLES (n=18)

Idade média: 48a (23-68a) 35a (18-64a)

Gênero n(%)

Masculino 12(40%) 8(44%)

Feminino 18(60%) 10(56%)

Genótipo n(%)

1a 8(27%)

1b 10(33%)

1? 4(13%)

2 2(7%)

3 6(20%)

4.2. Linfócitos T Totais

Analisando-se a freqüência média da população de linfócitos T

totais dos pacientes infectados, através do isolamento das células

39

CD3+CD14- com tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos

(Figura 5-A, B e C), assim como a freqüência de expressão do marcador de

ativação precoce HLA-DR (Figura 5-D), que também é uma das variantes da

molécula de MHC de classe II, verificou-se que os pacientes virgens de

tratamento têm tanto uma freqüência média superior de linfócitos T totais no

sangue periférico (Pacientes: 24,1 ± 1,54; N=30 / Controles: 17,3 ± 1,55;

N=15), quanto uma maior freqüência média da expressão de HLA-DR por

estas células (Pacientes: 36,6 ± 2,03; N=30 / Controles: M ± EP = 27,2 ±

2,47; N=15), indicando certa tendência tanto a um maior estado de

proliferação quanto de ativação de linfócitos T em pacientes infectados pelo

HCV, se comparados a controles saudáveis (Figura 6).

Figura 5: Seleção de linfócitos T por expressão positiva de CD3 (A) com tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos T (B). Foram selecionadas células com expressão negativa de CD14 (C) para posterior análise de expressão de HLA-DR por células CD3+(D).

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100

101

102

103

104

AFSC FRESH C.006…Linf. T Totais

FL2-H: FL2-CD3 PE

FL3-H

: F

L3

-HL

A D

R P

EC

Y5

0 53.8

46.20

0 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

1000

AFSC FRESH C.006…CD3+CD14-

FSC-H: FSC-Height

SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

99.4

100

101

102

103

104

0

200

400

600

800

1000

AFSC FRESH C.006

FL2-H: FL2-CD3 PE

SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

20.7

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

AFSC FRESH C.006…CD3+

FL2-H: FL2-CD3 PE

FL1

-H:

FL

1-C

D1

4 F

ITC

98.7

A B

C D

40

Figura 6: Freqüências relativas de linfócitos T totais de pacientes e controles (A). Freqüência células Cd3+ HLA-DR+ por pacientes e controles (B).

4.3. Linfócitos T CD8+

Considerou-se então como Linfócitos T CD8 todas as células com

alta expressão de CD8, sendo ainda selecionadas apenas as que atendiam

ao tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos (Figura 7).

Analisando a freqüência de expressão do receptor de membrana CD161,

típico de células NK, por estes linfócitos, identificou-se uma distribuição em 3

subpopulações distintas, sendo então classificadas como CD161high, as

células que se apresentam agrupadas com uma grande intensidade de

fluorescência deste marcador; CD161med, as células que tinham expressão

positiva porém em menor intensidade, e CD161-, as que tinham não

expressavam este marcador (Figura 7).

Linfócitos T HLA-DR+

Pacientes (n-30)

Controles (n-15)0

20

40

60

80

%

p=0,0078

Frequência de Linfócitos T Totais

Pacientes (n-30)

Controles (n-15)0

10

20

30

40

50%

p=0,0077

A B

41

Figura 7: Análise da distribuição de CD161 em linfócitos TCD8. (A) Seleção de células fortemente positivas na expressão de CD8 com baixa granulosidade. (B) Exclusão de células com tamanho ou granulosidade incompatíveis com linfócitos íntegros. (C) Separação de linfócitos TCD8 em três subgrupos, de acordo com a presença forte (high), fraca (med) ou nula (neg) de CD161 em sua membrana plasmática.

Analisando as freqüências das células CD8+CD161high

demonstradas, nota-se que o grupo de pacientes infectados pelo HCV

virgens de tratamento tem uma média de freqüências (2,98 ± 0,47; N=28)

significantemente menor quando comparada à dos controles (7,1 ± 1,37;

N=16). Realizando o Teste F, nota-se ainda uma diferença significante

(p=0,0004) na variância de cada amostra (Figura 8).

Figura 8: Freqüência de células CD8+CD161high no grupo de pacientes virgens de tratamento e de controles saudáveis.

Entretanto, este grupo de células CD8+CD161High não é

composto apenas de linfócitos T CD8+ típicos. Dentro dele ainda é possível

encontrar um subtipo de células T conhecido como NKT, por compartilharem

CD8+CD161High

Pacientes (n-28)

Controles (n-16)0

5

10

15

20

25

p=0,0014

%10

010

110

210

310

4

0

200

400

600

800

1000

EBAF T0 FRESH A.002

FL3-H: FL3-CD8 PECY5

SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

5.79

0 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

1000

EBAF T0 FRESH A.002…CD8+

FSC-H: FSC-Height

SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

96.8

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

DSC T0 CONTR FRESH A.002…Linfócitos T CD8


FL

2-H

: F

L2

-CD

161

PE

85.6

6.52

7.93

A B C

42

várias características com as células Natural Killer, como a produção de

granzima e a expressão de CD16, e principalmente de CD56, o típico

marcador de células NK. Para verificar qual subgrupo exatamente era o

responsável por essa diminuição na freqüência das células CD8+CD161high

(população linfocitária típica ou de células NKT), separou-se o conjunto de

células CD8+ em dois grupos, de acordo com a presença ou ausência de

expressão de CD56, que pode ser observado na Figura 9.

Figura 9: Separação dos linfócitos CD8+ (A) em células NKT CD8+CD56+ (B) e linfócitos TCD8 típicos CD8+CD56- (C).

Não houve diferença significativa nas médias de freqüências da

população de células consideradas NKT CD8+ ao se comparar pacientes aos

controles. No que diz respeito à expressão de CD161high por cada subgrupo

de linfócitos estudado, é possível notar uma diminuição global nas

freqüências relativas, visto que tanto os linfócitos CD8+CD56- (Pacientes: 2,4

± 0,46; N=28 / Controles: 5,47 ± 0,93; N=16), quanto as células CD8+CD56+

(Pacientes: 11,64 ± 2,6; N=27 / Controles: 22,1 ± 4,17; N=16) têm

freqüências médias significantemente diminuídas nos pacientes (Figura 10).

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

DSC T0 CONTR FRESH A.002…Q2: FL3-CD8 PECY5+, FL1-CD56 FITC+


FL

2-H

: F

L2

-CD

161

PE

89.3

5.36

5.3

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

DSC T0 CONTR FRESH A.002…Q3: FL3-CD8 PECY5+, FL1-CD56 FITC—


FL

2-H

: F

L2

-CD

16

1 P

E

82.9

7.45

9.66

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

DSC T0 CONTR FRESH A.002…Linfócitos T CD8


FL1

-H:

FL

1-C

D5

6 F

ITC

0 36.4

63.60

A B

C

43

Figura 5: Freqüências relativas de células CD161high dentre os linfócitos TCD8 típicos CD8+CD56- (A) e células CD8+CD56+ NKT (B).

Verificou-se ainda a freqüência de ativação deste grupo celular

pela expressão do marcador precoce de ativação linfocitária CD69 (Figura

11), e apesar da tendência a menores freqüências de células

CD8+CD161high nos portadores de HCV cronicamente infectados pelo vírus,

observou-se que mesmo em menor número, os linfócitos CD8+CD161high

dos pacientes cronicamente infectados pelo HCV encontram-se em média,

mais ativados do que os dos controles saudáveis (Pacientes: 14,5 ± 2,5;

N=23 / Controles: 5,07 ± 1,05; N=14) (Figura 12A), que reflete também no

grau de ativação dos linfócitos CD8+ totais (Pacientes: 2,1 ± 0,22; N=23 /

Controles: 1,28 ± 0,33; N=14)(Figura 12B).

Figura 6: Expressão de CD69 por células TCD8+ (A) e células T CD8+CD161high (B).

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

MCA FRESH D.006…Linfócitos T CD8

FL1-H: FL1-CD69 FITC

FL

2-H

: F

L2

-CD

161

PE

10.8 1.73

0.9886.5

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

FMT FRESH D.002…Linfócitos CD8


FL3

-H:

FL

3-C

D8

PE

CY

5

96.9 3.14

00

A B

CD8+CD56+CD161high

Pacientes (n-27)

Controles (n

-16)0

20

40

60

80

%

p=0,03

CD8+CD56-CD161high

Pacientes (n-28)

Controles (n-16)0

5

10

15

p=0,002

%

A B

44

Figura 7: Freqüência de células CD69+ na subpopulação de células CD8+CD161high (A) e nas células T CD8+ totais (B).

Ao se analisar a intensidade de expressão do principal receptor

celular do HCV no hospedeiro (CD81) em células CD8+, foi possível notar,

como esperado, que esta é expressa por todas elas (Figura 13A). Porém

notou-se que a intensidade de expressão foi bimodal no que diz respeito aos

linfócitos CD8+, estando agrupadas em dois grupos distintos, um com alta

(CD81high) e o outro com baixa expressão (CD81low) (Figura 13 A e B).

Figura 8: Expressão de CD81 pelas células T CD8 totais (A) e por células CD8+CD161+ (B).

Em relação à freqüência de células CD8+CD81high nota-se que o

grupo de pacientes infectados apresentou um média maior desta

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

MCA FRESH L.005…Linfócitos CD8


FL

2-H

: F

L2

-CD

16

1 P

E

0 15.4

84.60

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

MCA FRESH L.005…Linfócitos CD8


FL1

-H:

FL

1-C

D8

1 F

ITC

0 65.9

34.10

A B

CD8+CD69+

Pacientes (n-23)

Controles (n-13)0

1

2

3

4

5

%

p=0,0057

CD8+CD161high CD69+

Pacientes (n-23)

Controles (n-14)0

20

40

60%

p=0,0074

A B

45

subpopulação de células CD8+CD81high em relação aos os controles (Figura

14 A).

Além disso, quando analisada a mediana de intensidade de

fluorescência para CD81 (expressão de CD81) por células CD8+CD161-

verificou-se que as células dos pacientes infectados apresentam níveis mais

elevados de expressão que os indivíduos controles, sugerindo que os

pacientes infectados possam ter uma tendência maior à proliferação da

subpopulação de células CD8+CD81high ou mesmo que a infecção possa

determinar o aumento destas células (Figura 14 B).

Figura 9: Freqüências de células CD8+CD81high em pacientes e controles(A). Expressão de CD81 medida pela mediana de fluorescência em células CD8+CD161- de pacientes e controles (B).

4.4. Linfócitos T CD4+

Foram classificadas como linfócitos T CD4+ todas as células com

alta expressão de CD4 com tamanho e granulosidade compatíveis com

linfócitos (Figura 15-A e B). As células T CD4+ foram analisadas em relação

à sua freqüência e expressão de CD81 (Figura 15-C). Além disso, verificou-

se freqüência de células T CD4+ ativadas e regulatórias , que podem ser

subdivididas nestes grupos pela expressão de CD25 e CD127. O subtipo

especializado na regulação da resposta imune inflamatória conhecido como

células T reguladoras (Treg) é caracterizado pela alta expressão do marcador

de ativação CD25 e pela baixa expressão do marcador CD127 (receptor de Il-

7). Por outro lado, as células que expressam concomitantemente altos níveis

Mediana de CD81 em células CD8+CD161-

Pacientes (n-15)

Controles (n-12)0

100

200

300In

ten

sid

ad

e d

e F

luo

rescê

ncia

p=0,0078

Frequência de célulasCD8+CD81high

Pacientes (n-17)

Controles (n-12)0

20

40

60

80

100

%

p<0,0001

A B

46

de CD25 e CD127 determinam os linfócitos T CD4+ ativados que possuem

funções efetoras (Figura 15-D).

Figura 10: Freqüência de células CD4+ (A) em relação ao tamanho e granulosidade compatíveis com Linfócitos (B). Análise comparativa da intensidade de fluorescência de CD81 (C) em pacientes (azul) e controles (Vermelho). Divisão das subpopulações de células T CD4+ Reguladoras (Treg) (CD25+CD127low) e Ativadas (CD25+CD127high) (D).

As análises não mostraram diferença significante entre as

populações de células T CD4 ativadas (CD25+CD127+) ou reguladoras

(CD25+CD127-) de pacientes infectados quando comparadas às dos

controles saudáveis, havendo porém, uma grande variância dessas

populações dentro dos grupos estudados (Figura 16-A e B). Já a expressão

do CD81 foi significantemente mais intensa em pacientes infectados pelo

HCV (Pacientes: 91,2 ± 4,95; N=20 / Controles: 67 ± 5,8; N=15) do que nos

controles (Figura 16-C).

Linfócitos CD4

100

101

102

103

104


0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

BIA CTRL FRESH K.001 99.1

LCS FRESH K.002 99.5

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

ICPP FRESH B .001…Linfócitos T CD4

FL2-H: FL2-CD25 PE

FL

1-H

: F

L1

-CD

12

7 F

ITC

19.6

4.55

0 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

1000

ICPP FRESH B .001…CD4+

FSC-H: FSC-Height

SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

99.8

100

101

102

103

104

0

200

400

600

800

1000

ICPP FRESH B .001


SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

0.52

5.76

A B

C D

47

Figura 11: Freqüência de células T CD4+ Regulatórias (Treg) (A) e Ativadas (B) nos portadores crônicos de HCV e controles. Expressão de CD81 por células T CD4+ nos portadores crônicos de HCV e controles (C).

4.5. Linfócitos B

Para a análise dos linfócitos B, foram selecionadas células

CD19+CD14- com tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos, as

quais foram analisadas pela intensidade de expressão de CD81 (Figura 17).

Intensidade de expressão de CD81 em Linfócitos TCD4

Pacientes (n-20)

Controles (n-15)0

50

100

150

Inte

nsid

ad

e d

e F

luo

rescê

ncia

p=0,0031

Frequência de Linfócitos T CD4 Ativados

Pacientes (n-27)

Controles (n-14)0

5

10

15

%p=0,5814

Frequências de CélulasT Regulatórias

Pacientes (n-27)

Controles (n-14)0

5

10

15

20

%

p=0,2114

A B C

48

Figura 17: Seleção de células CD19+ (A), CD14- (B). Expressão do TLR2 (C) e TLR4 (D) em linfócitos B (CD19+). Análise comparativa da intensidade de fluorescência de CD81 (E) entre Paciente (vermelho) e controle (Azul).

Constatou-se um aumento significante na freqüência relativa de

linfócitos B (Pacientes: 3,41 ± 0,45; N=22 / Controles: 1,52 ± 0,24; N=9).

Além disso, verificou-se uma expressão mais intensa do receptor viral CD81

(Pacientes: M ± EP = 70,38 ± 3,941 N=19 / Controles: M ± EP = 53,60 ±

3,516 N=11) (Figura 18).

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

MRPF FRESH E.004…Linf B


FL

3-H

: F

L3

-CD

19

PE

CY

5

95.1

100

101

102

103

104

0

200

400

600

800

1000

MRPF FRESH E.004


SS

C-H

: S

SC

-He

igh

t

27.7 1.32

6.5264.4

A B

Linf B

100

101

102

103

104


0

20

40

60

80

100

% o

f Max

LCS FRESH J.002 122

BIA CTRL FRESH J.001 33.7

C

49

Figura 18: Freqüências relativas (A) e expressão de CD81 (B) em Linfócitos B no grupo de pacientes e controles.

Frequência de Linfócitos B Totais

Pacientes (n-22)

Controles (n-9)0

5

10

15%

p=0,0148

Mediana da expressão deCD81 em Linfócitos B

Pacientes (n-19)

Controles (n-11)0

50

100

150

Inte

nsid

ad

e d

e F

luo

rescê

ncia

p=0,0077

A B

50

5. DISCUSSÃO

Este estudo teve como objetivo principal identificar eventuais

modificações ocorridas no sistema imune do portador crônico do HCV, com

foco principal nas freqüências e estado de ativação do subgrupo de linfócitos

T CD8 com alta expressão da molécula de CD161, grupo este recentemente

identificado como possível modulador de uma resposta imune no padrão

Th17 no tecido hepático. Além disso, pesquisou-se a expressão de outros

marcadores de membrana em linfócitos T e B, que nos últimos tempos vêm

apresentando algum grau de importância na fisiopatologia e na evolução da

doença, porém ainda não tem seu comportamento nos diferentes estágios da

infecção totalmente descrito. Para tanto, utilizou-se a comparação de um

grupo de pacientes cronicamente infectados pelo HCV e ainda não tratados,

com um grupo de pacientes não infectados.

Inicialmente identificou-se que os pacientes infectados pelo HCV

têm freqüências menores do subgrupo de Linfócitos T CD8 que expressam

grandes quantidades da molécula de CD161 e que, apesar de em menor

número, estas células encontram-se bem mais ativadas nestes pacientes,

que em controles saudáveis, levando em conta a expressão do marcador de

ativação precoce CD69. Este subtipo celular foi identificado por Takahashi et

al. (2006) inicialmente como grupo de células anérgicas, porém esta

conclusão foi tomada por não terem se proliferado ou produzido citocinas no

padrão Th1 ou Th2, não sendo investigados outros padrões de resposta. Já

em um estudo posterior (BILLERBECK et al., 2010), estas células foram

caracterizadas como secretoras de IL-17, apresentando um fenótipo

compatível com o padrão.

Em um estudo ainda não publicado deste laboratório (PEREIRA,

2011), encontrou-se uma correlação positiva entre a freqüência de células T

CD8 expressando altos níveis de CD161 e a resposta viral sustentada ao

tratamento da hepatite C, quando o paciente apresenta anti-HCV negativo 6

meses após o tratamento, e por este motivo, no presente estudo avaliou-se a

freqüência dessas células no paciente cronicamente infectado, porém ainda

virgem de tratamento, com o intuito de averiguar a influência da infecção viral

na freqüência desse subgrupo. Curiosamente, como citado anteriormente, as

51

análises feitas mostraram uma tendência global dos pacientes cronicamente

infectados a apresentarem baixas freqüências de células T CD8+CD161high

quando comparados aos controles saudáveis, o que corrobora com o

observado por Northfield et al. (2008), que encontrou uma alta freqüência

dessas células apenas no tecido hepático em si, e não na periferia. Como

não foi possível neste estudo averiguar a freqüência intra-hepática destas

células, não é possível concluir se o próprio vírus é responsável pela

diminuição direta de sua freqüência no sangue periférico como uma maneira

de subverter a resposta imune do paciente ou se, ao levar em conta a

tendência ao direcionamento quimiotático de tais células ao tecido hepático

inflamado pelo CXCR6, tal diminuição de freqüência em pacientes crônicos

não tratados e em pacientes não respondedores deva-se à grande captura

dessa população pelo fígado em atividade inflamatória crônica, o que não

mais acontece no paciente com infecção resolvida após o tratamento, que

então normaliza a freqüência periférica de células CD8+CD161high,

equiparando-se a controles saudáveis.

Tanto Takahashi et al. (2006) quanto Northfield et al. (2008)

identificaram as células T CD8+CD161int como produtoras de IFN- sob

estímulo in vitro, sendo então também de grande importância na resposta

imune contra o HCV. Neste estudo porém, verificou-se que os pacientes

crônicos não-tratados, quando comparados a controles saudáveis têm um

nível de ativação periférica marcado pela expressão de CD69 superior

unicamente nas células do subgrupo CD161high, que como exposto por

Billerbeck et al. (2010), é responsável por uma resposta Th17, estando o

grupo CD8+CD161int sem sinais de ativação. Nenhum dos dois estudos

averiguou o estado de ativação das células periféricas, sendo que este

aspecto permanece por ser investigado. Os únicos resultados semelhantes

encontrados na literatura apontam para o outro direcionamento destes

subgrupos celulares, mostrando exatamente a grande expressão de CD69

por parte de linfócitos T CD4 e CD8 periféricos com expressão intermediária

de CD161 na crise de asma aguda (GONZALEZ-HERNANDEZ et al., 2007),

havendo grande produção de IFN- o qual mantém o equilíbrio da resposta

Th1/Th2, indicando a grande importância de tais células nas respostas

52

inflamatórias de tecidos específicos expressando o CXCL16, como o

pulmonar e o hepático. A demonstração de tal ativação é mais um indício da

crescente importância que vem sendo dada a este grupo celular na resposta

imune ao HCV, levantando mais indícios de que uma resposta Th17 mais

intensa possa ser decisiva na resposta sustentada ao tratamento, ou mesmo

à resolução espontânea após a infecção aguda pelo vírus.

Mais recentemente, tem-se verificado ainda o papel fundamental

do grau de ativação das células NK durante a resposta aguda ao vírus, e sua

correlação com a resolução espontânea da doença. Nas análises realizadas

no presente trabalho, os pacientes cronicamente infectados apresentaram

baixas freqüências de células NKT expressando CD161

(CD8+CD56+CD161high), quando comparados a controles saudáveis,

resultado similar ao encontrado em um estudo recente realizado por Alter et

al. (2011), porém na infecção aguda. Nele, também verificou-se uma

correlação inversa ao padrão linfocitário de expressão do CD161 em células

NK e NKT de pacientes com infecção aguda, sendo a resolução espontânea

relacionada a uma menor expressão desta molécula em células NK nesta

fase (ALTER, G. et al., 2011). Tal correlação inversa deve-se possivelmente

ao fato de a molécula do CD161 desencadear sinais opostos em células T e

células NK, agindo com ativador das primeiras e inibidor das últimas

(ALDEMIR et al., 2005). Curiosamente, o mesmo fenômeno ocorre com a

interação entre a proteína E2 viral e seu principal receptor na célula

hospedeira, o CD81 (CROTTA et al., 2002; TSENG; KLIMPEL, 2002).

O CD81, como esperado, foi encontrado na membrana de todas

subpopulações celulares estudadas, nas amostras de pacientes e controles.

Interessantemente, os linfócitos T CD8 apresentaram uma clara divisão em 2

subgrupos distintos, um com grande expressão de CD81 (high) e outro com

expressão positiva, porém intermediária (low), estando todo o grupo de

células CD8+CD161high dentro do subgrupo CD81high, tanto em pacientes

quanto em controles. Verificou-se ainda que os pacientes apresentaram

freqüências médias das células CD81high maiores que os controles, estando

este aumento relacionado ao grupo de células CD161-. Tais observações

aparentemente são inéditas, levando em conta a completa falta de estudos

publicados na literatura científica fazendo referência a esta dicotomia de

53

expressão do receptor do HCV nos linfócitos TCD8, podendo este ser um

fator importante no processo de infecção viral ou ainda um reflexo do mesmo.

Sendo assim, estudos mais aprofundados devem ser realizados para que

qualquer conclusão sobre a causa desta distribuição bimodal seja tomada,

porém levando em conta tanto a conhecida capacidade do HCV de aumentar

a expressão de CD81 em células infectadas (HOFMANN et al., 2004;

KRONENBERGER et al., 2001; ZUCKERMAN et al., 2002), quanto à

possibilidade viral de também invadir linfócitos (CROTTA et al., 2002; PILERI

et al., 1998; WACK et al., 2001), é possível entender a causa do aumento de

células TCD8 expressando fortemente o CD81 encontrado nos resultados.

Tendo em vista ainda que neste estudo verificou-se uma menor freqüência da

subpopulação de células CD8+CD161high nos pacientes infectados,

subgrupo este especializado na resposta inflamatória direcionada ao fígado,

e que todas estas células encontram-se no grupo com forte expressão de

CD81, pode-se levantar a hipótese de que o vírus interage diretamente com

essa célula, possivelmente subvertendo uma resposta adequada do sistema

imune e ajudando assim no processo de cronificação da infecção.

Analisando linfócitos T CD4 por sua vez, observa-se um quadro

um tanto diferente, tendo em vista a pouca alteração fenotípica encontrada

nos resultados. Os pacientes cronicamente infectados pelo HCV estudados

não apresentaram qualquer diferença do grupo controle em relação à

freqüência de células TCD4 regulatórias circulantes (CD4+CD25+CD127-) ou

à freqüência de células TCD4 efetoras ativadas (CD4+CD25+CD127+). A

única alteração encontrada neste subgrupo, mais uma vez foi o aumento da

expressão de CD81 por parte dessas células, novamente indicando a

possível interação do HCV com os linfócitos dos pacientes.

Alguns estudos já correlacionaram uma resposta Th1 vigorosa por

parte das células CD4, baseada na produção de IL-2 e IFN- com a resolução

espontânea infecção aguda no paciente infectado pelo vírus (TSAI et al.,

1997). Tais estudos, avaliando tanto as células no ambiente hepático de

chimpanzés, quanto na circulação de pacientes recém infectados apontam a

necessidade dessa resposta rápida e eficiente das células CD4 para que haja

um “clearance” total do vírus, apontando a falha desta como uma das

54

principais causas para o processo de cronificação da doença (GERLACH et

al., 1999; THIMME et al., 2002). Sendo assim, como é de se esperar, nos

pacientes cronicamente infectados, as células T CD4 não apresentam sinais

de ativação significativos, indo de acordo com a literatura, que sugere a

existência de uma resposta T CD4 específica no paciente cronicamente

infectado, porém com capacidade proliferativa reduzida (SEMMO et al.,

2007). Tal status é associado ainda com a produção de IFN- sob

estimulação antigênica, mas com muito pouca ou mesmo nula expressão de

IL-2 (SEMMO et al., 2005).

Por ser o CD25 a cadeia do receptor de IL-2, um marcador de

ativação precoce dos linfócitos T CD4+ ou também um marcador de células T

regulatórias quando da expressão concomitante do fator nuclear FoxP3,

como era de se esperar, as análises deste estudo encontraram resultados

similares a estudos anteriores da literatura (ULSENHEIMER et al., 2006), os

quais apontaram para a pouca ativação destas células no paciente

cronicamente infectado. Da mesma maneira, devido à pouca ativação do

sistema, que contribui para que a hepatite C seja uma doença silenciosa na

grande maioria dos casos crônicos, vê-se também um baixo nível de células

T regulatórias que poderiam atuar como reguladoras da ativação excessiva

do sistema.

Muito tem sido investigado para se entender a causa desta falha

na resposta dos linfócitos T CD4, havendo numerosos estudos apontando

para um possível mecanismo de escape viral através de mutações em

epítopos reconhecidos pelos linfócitos (ERICKSON et al., 2001), o que

possivelmente leva também a uma exaustão dessas células gerada pelo

escape de anticorpos neutralizantes e conseqüente ao aumento da viremia

(VON HAHN et al., 2007). Nos anos recentes, a atenção dos pesquisadores

tem se voltado à ação da regulação exercida pelo próprio sistema imune

nestas respostas antivirais, sendo plausível imaginar que o excesso de

regulação possa levar a uma resposta Th1 ineficaz com conseqüente

cronificação da infecção pelo HCV (CABRERA et al., 2004). As células T

reguladoras também expressam o marcador de ativação CD25, sendo

diferenciadas das células T efetoras ativadas pela expressão de FoxP3, ou

55

ainda pela ausência da expressão de outro marcador de ativação precoce, o

CD127. Tais células poderiam, particularmente no fígado em atividade

inflamatória, suprimir respostas tanto de células CD4, quanto de células CD8.

Em um estudo recente, averiguou-se a presença de FoxP3 em cerca de 30%

das células CD4+ do tecido hepático de pacientes portadores de hepatite C

crônica (WARD et al., 2007). Em outro estudo inédito publicado há cerca de 1

ano, múltiplas biópsias foram coletadas antes, durante e após o tratamento

com interferon alfa e ribavirina, e foi constatado um aumento da atividade das

células T regulatórias no fígado, induzido pela terapia, e que a presença de

grandes quantidades destas células no tecido hepático persiste mesmo 6

meses após a terapia bem sucedida, indicando uma continua atividade

regulatória mesmo sem presença detectável do vírus (CLAASSEN et al.,

2011).

Em 2010, um estudo correlacionou a baixa freqüência das células

T regulatórias no fígado com a resolução espontânea após a infecção aguda

pelo HCV (LANGHANS et al., 2010). Já mais recentemente, a alta freqüência

de Tregs no tecido hepático de pacientes cronicamente infectados se

correlacionou positivamente com células CD4 efetoras HCV específicas

ativadas na circulação periférica, e negativamente com o grau de agressão

hepática, sugerindo então que, apesar de serem possíveis responsáveis pela

cronificação da doença, como citado no estudo anterior, no paciente já

cronificado elas exercem um papel protetor para o tecido hepático

(AMOROSO et al., 2012). Vale ressaltar que no estudo aqui realizado, não foi

encontrada uma correlação entre células T regulatórias circulantes ou células

TCD4 ativadas; e o grau de inflamação ou fibrose da biópsia hepática pré-

tratamento dos pacientes.

Tais estudos apontam tanto a importância quanto a dificuldade

existente em se analisar as células no local específico da infecção, o tecido

hepático. Nas analises realizadas no presente estudo, nada foi encontrado de

relevante em relação à freqüência de células T regulatórias no sangue

periférico dos pacientes quando comparados a controles saudáveis, a não

ser a grande variação dessas freqüências que acontecem em ambos os

grupos, sendo necessária a investigação de biópsias hepáticas dos mesmos

56

para melhor entender a relação entre a intensidade expressão dessas células

e o grau de acometimento hepático causado pela atividade inflamatória.

Identificou-se ainda neste estudo um aumento na expressão de

CD81 por parte dos linfócitos T CD4 totais, provavelmente induzida pela

própria interação do vírus com as células como citado no caso das células

CD8, e indo de encontro a um estudo similar, que além de identificar este

aumento na expressão do receptor para o vírus, viu que, ao contrário dos

linfócitos T CD8, esta expressão não diminui com o tratamento da doença e

também não decai após este, mesmo nos pacientes que resolvem a infecção,

fato que ainda necessita de investigação para melhor entendimento

(KRONENBERGER et al., 2006).

Ao se analisar a população de linfócitos T como um todo (CD3+)

bem como seus níveis de ativação pela expressão de HLA-DR, encontrou-se

um aumento tanto na freqüência total destes, com uma tendência maior à

linfocitose nos portadores crônicos do HCV, quanto à freqüência destas

células expressando HLA-DR. As proteínas do HLA são as correspondentes

humanas das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade

(MHC) observadas na maioria dos vertebrados, que no homem são

codificadas por um grupo de genes presentes no cromossomo 6. Estas

moléculas são responsáveis pela apresentação de antígenos em células APC

porém foram originalmente descritas como marcador de ativação em

linfócitos T. Observou-se um aumento da expressão de HLA-DR por células

CD3+, indicando aumento de ativação no compartimento de linfócitos T,

resultados estes similares porém não iguais aos de Neau-Cransac et al., que

em 2005 encontrou contagens de linfócitos similares entre pacientes e

controles, porém freqüências maiores de linfócitos CD4 e não de CD8, e

também um aumento na expressão de HLA-DR por linfócitos T Totais, tanto

às custas de células CD4 e CD8 (NEAU-CRANSAC et al., 2005).

Ao verificar células usualmente consideradas como efetoras da

imunidade adquirida, apresentando em sua superfície o MHC de classe II,

novamente adentra-se campos ainda não muito elucidados tanto da

imunologia quanto da fisiopatologia do HCV, levantando-se então várias

questões quanto a razão e a importância deste aumento de expressão do

HLA-DR nos linfócitos dos pacientes infectados.

57

Atualmente sabe-se que os linfócitos T, além de células efetoras,

também podem agir como apresentadores não-convencionais de antígenos,

havendo evidências de que, além da molécula de MHC classe II, estas

células também expressam, tanto constitutiva como induzidamente, as

moléculas coestimulatórias CD80 e CD86, que acabam por realizar a

interação com o TCR e as moléculas de CD28 e CD152 de outras células T,

ocorrendo assim uma interação T-T com conseqüente ativação da célula

latente. Acontece que esta estimulação, acaba por gerar células T anérgicas,

possivelmente devido ao baixo influxo de Ca++ gerado por esta interação na

célula T receptora do sinal. Tal influxo diminuído acaba por interferir na

produção de IL-2 pela célula, porém não altera a produção de IL-4, causando

assim a perda do padrão de resposta Th1 que seria gerado caso a

estimulação fosse adequada (HOLLING; SCHOOTEN; VAN DEN ELSEN,

2004), havendo também evidências de que essas células T anérgicas teriam

ação reguladora tanto sobre células T quanto sobre APCs (CHAI et al., 1999;

TAAMS et al., 1998).

O fato de pacientes com Hepatite C crônica apresentarem

aumento na expressão de HLA-DR nos linfócitos T demonstrado tanto neste

quanto em outros estudos, junto com a já conhecida e citada anergia

encontrada nas células T destes pacientes, decorrida de uma falha em uma

resposta Th1 vigorosa no momento da infecção aguda, levanta a

possibilidade de que tal interação de células T apresentando antígenos por

MHC de classe II para células T imaturas tenha papel efetivo no processo de

cronificação da infecção, sendo então necessária uma investigação

adequada para melhor elucidação da fisiopatologia do HCV.

No presente estudo, quando comparados a controles saudáveis,

os pacientes cronicamente infectados pelo HCV apresentaram maiores

freqüências de linfócitos B. Além disso, dentro deste grupo de linfócitos

houve uma maior intensidade de expressão da molécula de CD81 em suas

membranas.

O aumento das freqüências de células B nos pacientes

cronicamente infectados já foi descrito por vários autores que comprovaram a

existência de um aparente processo linfoproliferativo benigno, possivelmente

associado à capacidade de infecção direta destas células pelo HCV, e sua

58

replicação dentro delas, mais especificamente em pacientes que

desenvolvem crioglobulinemia mista (SANSONNO et al., 2007), havendo

ainda possibilidade de desenvolvimento de malignidade a partir de tal

processo (ZIGNEGO; PILUSO; GIANNINI, 2008).

A expansão dos linfócitos B deriva principalmente poucas células

intra-hepáticas encontradas em focos específicos de expansão, cada foco

derivando de um único progenitor (RACANELLI et al., 2001), sendo

diretamente relacionada a altas concentrações virais no tecido hepático

(DAMMACCO et al., 2000) e também a manifestações extra-hepáticas da

hepatite C, como o franco linfoma não-Hodgkin de células B (SANSONNO et

al., 2004), sendo interessante então, a investigação futura da influência da

intensidade de replicação das células B nos pacientes cronicamente

infectados para o aparecimento de complicações linfóides, assim como o

melhoramento dos protocolos de acompanhamento dos portadores do vírus.

Assim como este, outros estudos também evidenciaram um

aumento na intensidade de expressão do CD81 em linfócitos B

(KRONENBERGER et al., 2006; KRONENBERGER et al., 2001;

ZUCKERMAN, 2003), sendo que em um estudo de 2011, ao contrário do

encontrado nos já citados, houve a relação entre a intensidade de expressão

dessa molécula no linfócito B e a resposta ou não do paciente ao tratamento

com interferon e ribavirina (SOLDEVILA et al., 2011).

59

CONCLUSÕES

Quando comparados a controles saudáveis, os pacientes

portadores de hepatite C crônica apresentam:

Menores freqüências de células CD8+CD161high tanto

CD56+ quanto CD56-;

Maiores freqüências de células CD8+CD161high

expressando marcador de ativação CD69;

Maiores freqüências de linfócitos T CD8+ ativados;

Maiores freqüências de células CD8+CD81high

Maior expressão de CD81 (mediana de fluorescência) em

linfócitos T CD4+, CD8+ e linfócitos B (Cd19+);

Maior tendência à linfocitose (CD3+) com freqüências

relativamente aumentadas tanto de linfócitos B quanto T;

Maiores freqüências de linfócitos T ativados medidos pela

expressão de HLD-DR;

Maiores freqüências de linfócitos B expressando TLR2 e;

Maiores freqüências de Monócitos expressando HLA-DR.

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ANEXOS

Anexo A - Termo de Consentimento livre e esclarecido aplicado aos

pacientes

CENTRO UNIVERSITÁRIO DO MARANHÃO

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO

MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO

Eu, ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------------

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

------------------------------------------------------------------------- (nome do sujeito da pesquisa,

nacionalidade, idade, estado civil, profissão, endereço, RG), estou sendo convidado a participar de

um estudo denominado Aspectos Imunofenotípicos e Epidemiológicos Envolvidos na Resposta

ao Tratamento da Hepatite C, cujos objetivos e justificativas são: Pesquisar os aspectos

imunofenotípicos, funcionais e epidemiológicos envolvidos na resposta ao tratamento da

hepatite C no Maranhão. Através de exames de sangue (citometria de fluxo) serão estudados os

marcadores fenotípicos e a freqüência de células T CD4+ CD8+, CD161, CD81, HLA-DR, em

pacientes respondedores e não respondedores ao tratamento para a hepatite C, fazendo um

estudo comparativo para verificar se há relação entre a resposta imunológica e carga viral. O

estudo pretende contribuir para melhorar o entendimento dos aspectos da resposta

imunológica envolvidos na patogenia da hepatite C, oferecendo novas alternativas para o

controle da doença, melhoria no diagnóstico e prognóstico dos pacientes infectados pelo vírus

HCV.

A minha participação no referido estudo será no sentido de: permitir a coleta de sangue

para o exame de citometria de fluxo. Fui alertado de que, da pesquisa a se realizar, posso esperar

alguns benefícios, tais como: avaliar através de exame específico como esta minha resposta

imunológica às doenças virais, especificamente hepatite C, contribuindo assim para fornecer

material de estudo à ciência para que no futuro novas alternativas e propostas de tratamento

estejam disponíveis para outras pessoas contaminadas pelo vírus.

Recebi, por outro lado, os esclarecimentos necessários sobre os possíveis desconfortos e

riscos decorrentes do estudo, levando-se em conta que é uma pesquisa, e os resultados positivos ou

negativos somente serão obtidos após a sua realização. Assim, o desconforto corresponde a uma

picada de agulha em veia do braço para realização do exame de sangue, sendo que não há

riscos previsíveis.

Estou ciente de que meu nome ou qualquer outro dado ou elemento que possa, de qualquer

forma, me identificar, será mantido em sigilo.

70

Também fui informado de que posso me recusar a participar do estudo, ou retirar meu

consentimento a qualquer momento, sem precisar justificar, e de, por desejar sair da pesquisa, não

sofrerei qualquer prejuízo à assistência que venho recebendo. Foi-me esclarecido, igualmente, que

não existem métodos alternativos de exames para esta pesquisa.

Os pesquisadores envolvidos com o referido projeto são Marcos Vinicius de Oliveira

Queiroga (Mestrando em Biologia Parasitária) eProf. Dr. Marcos Grisotto (Orientador), e com eles

poderei manter contato pelo telefone: (98) 3214-4277 ramal 4336. A apresentação deste termo e a

obtenção do consentimento serão realizadas pelo pesquisador Marcos Vinicius de Oliveira

Queiroga.

É assegurada a assistência durante toda pesquisa, bem como me é garantido o livre acesso

a todas as informações e esclarecimentos adicionais sobre o estudo e suas conseqüências, enfim, tudo

o que eu queira saber antes, durante e depois da minha participação. Os contatos serão estabelecidos

por telefone entre o pesquisador e o sujeito da pesquisa e/ou seu responsável, para as informações

que se fizerem necessárias. Caso haja necessidade de exame confirmatório, o sujeito da pesquisa será

encaminhado pelo pesquisador por transporte particular até o laboratório do CTA-Lira.

Enfim, tendo sido orientado quanto ao teor de tudo aqui mencionado e compreendido a

natureza e o objetivo do já referido estudo, manifesto meu livre consentimento em participar, estando

totalmente ciente de que não há nenhum valor econômico, a receber ou a pagar, por minha

participação. Fica estabelecido que receberei uma cópia deste documento.

No entanto, caso eu tenha qualquer despesa decorrente da participação na pesquisa, haverá

ressarcimento na forma seguinte: em dinheiro ou depósito em conta corrente médiante comprovação

material de eventual despesa. O ressarcimento inclui as despesas que o voluntário tem com a

participação na pesquisa e que não teria se não participasse. De igual maneira, caso ocorra algum

dano decorrente da minha participação no estudo, serei devidamente indenizado, conforme determina

a lei.

Nome e assinatura do sujeito da pesquisa

Contatos:

Endereço:

Telefone:

E-mail:

Local e data

------------------------------------------------ --------------------------------------------------------------

Marcos Vinicius de Oliveira Queiroga Prof. Dr. Marcos Grisotto

71

Anexo B – Questionário Laboratorial e Epidemiológico

Nome:________________________________________________________

Endereço:_____________________________________________________

Sexo: o ( ) Masculino o ( ) Feminino

Idade: _______ anos

Cor da pele: o Branca o Parda o Negra

Dosagem de ALT: o T1: ______ o T2: ______ o T3: ______ o T4: ______ o T5: ______

Anti-HIV: o T1: o T4 ou T5:

HBsAg o T1: ______ o T4 ou T5: ______

Anti-HBc: o T1: ______ o T4 ou T5: ______

Estadiamento de lesão hepática e:

72

Descrição: _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Genótipo do HCV: o ( ) 1 o ( ) 2 o ( ) 3 o ( ) Outro

73

Anexo C – Parecer de Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

76

Anexo D – Comprovante de submissão

77

Anexo E – Manuscrito submetido a Revista Brasileira de Medicina Tropical

MARCOS VINÍCIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA AVALIAÇÃO DA ... · Os linfócitos T totais também...

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