MARIA GABRIELA XAVIER DE OLIVEIRA
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MARIA GABRIELA XAVIER DE OLIVEIRA Espécies patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária: identificação molecular, caracterização fenotípica e interação com hospedeiro São Paulo 2019
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MARIA GABRIELA XAVIER DE OLIVEIRA
Espécies patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária: identificação
molecular, caracterização fenotípica e interação com hospedeiro
São Paulo
2019
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MARIA GABRIELA XAVIER DE OLIVEIRA
Espécies patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária: identificação
molecular, caracterização fenotípica e interação com hospedeiro
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Departamento:
Patologia
Área de concentração:
Programa de Pós-Graduação em
Patologia Experimental e Comparada.
Orientador:
Profa. Drª. Terezinha Knöbl
São Paulo
2019
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
Ficha catalográfica elaborada pela bibliotecária Maria Aparecida Laet, CRB 5673-8, da FMVZ/USP.
T. 3877FMVZ
Oliveira, Maria Gabriela Xavier de Espécies patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária: identificação molecular, caracterização fenotípica e interação com hospedeiro / Maria Gabriela Xavier de Oliveira. – 2019.
104 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Patologia, São Paulo, 2019.
Programa de Pós-Graduação: Patologia Experimental e Comparada.
Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada.
Orientadora: Profa. Dra. Terezinha Knöbl.
1. Arcobacter spp. 2. Campylobacteraceae. 3. Toxi-infecção alimentar. 4. Doença de transmissão alimentar. I. Título.
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FOLHA DE AVALIAÇÃO
Autor: OLIVEIRA, Maria Gabriela Xavier de
Título: Espécies patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária:
identificação molecular, caracterização fenotípica e interação com
hospedeiro
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Data: _____/_____/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr.________________________________________________________
Instituição:_______________________
Julgamento:_____________________
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Julgamento:_______________________
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Julgamento:_______________________
Prof. Dr._________________________________________________________
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Dedico a tese à toda minha
família que sempre me ensinou
a priorizar os estudos como
melhor forma de ascensão e
desenvolvimento.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha família pelo apoio e incentivo em todas as etapas da
minha formação e por sempre me fazer acreditar no meu potencial.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – código de
financiamento 001.
Agradeço o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo – projeto 2014/07837-6.
Agradeço o apoio financeiro do Conselho Nacional De Desenvolvimento
Científico E Tecnológico – CNPq.
À Professora Doutora Terezinha Knöbl, por toda dedicação, orientação,
carinho, pelos 10 anos de confiança e por sempre acreditar em nosso trabalho e
me apoiar em tantas decisões que tivemos que tomar ao longo dessa jornada. Te
admiro que entre tantos desafios sempre lutou e conseguiu o seu lugar no
universo da pesquisa.
À professora Doutora Andrea Micke Moreno, por ser a primeira pessoa a
nos acolher e permitir o desenvolvimento de nosso trabalho no Laboratório de
Sanidade Suína. Muito obrigada pelo carinho, atenção, ensinamento e todas as
virtudes de gerenciar um ambiente harmonioso e dedicado à tudo que propõe.
À Doutora Mônica Aparecida Midoli Vieira por todos os ensinamentos e por
me acolher com tanto carinho nos alegres dias de Unifesp.
À Professora Doutora Tânia A. T. Amaral por permitir o desenvolvimento
deste trabalho com tanta tranquilidade em seu laboratório.
À Professora Doutora Cristina O. Massoco pela colaboração e atenção no
desenvolvimento e análise dos dados e mobilização de sua equipe para auxílio do
trabalho.
Á Professora Doutora Cecília M. Abe do Instituto Butantâ pela atenção e
colaboração no trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Medicina Aviária (Jéssica, Letícia, Lilian,
Rosely, Yamê, Maria Flávia, Letícia, Bruna, Felipe, André, Fernanda, Márcia,
Victória e à todos os estagiários) por permitirem a minha participação em uma
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quipe tão dedicada, atenciosa e com enorme potencial de crescimento científico.
Agradeço em especial ao Marcos Cunha e à Mirela Vilela pela parceria de
tantos anos, amizade e compartilhar desde o início tudo o que conquistamos
juntos à professora Terezinha no laboratório de Medicina Aviária.
A toda equipe do Laboratório de Sanidade Suína (Ana Paula, Luisa,
Rosilma, Vasco, Carlos, Bárbara, Pedro, Givago, Alexandre, Thaís, Ketrin, Jucelia,
Maria Roberta, Fabiana, Maria e à todos estagiários) pelo companheirismo e
atitudes de cooperação, que de alguma forma permitiram o perfeito andamento do
trabalho.
À todos os grupos de pesquisa do VPT e VPS pela amizade e
por compartilhar tantos momentos de alegrias, dilemas e desafios ao longo de
tantos anos.
Aos professores, funcionários, alunos e residentes do Departamento de
Patologia e do Departamento de Medicina Preventiva e Saúde Animal, em
especial à Adriana Margarido, Milena Oliveira, Danival, Dona Célia, Dennis,
Mauro, Claúdio, Edson, Celina, Vivian por toda a atenção dispensada e por
sempre me recepcionarem com alegria.
À Juliana Fonseca pela atenção, ensinamentos e toda dedicação que até
aos finais de semana se propôs a me ajudar.
À toda equipe de trabalho da FMU pelos momentos compartilhados e
ensinamentos diários, em especial à minha chefe Ana Claudia Balda que sempre
respeitou minhas decisões e me apoiou para que eu desenvolvesse o doutorado.
À minha amiga e colega de trabalho Vanessa Feijó e Ramon Mesquita pelo auxílio
na análise dos dados e todas disponibilidade e carinho. `
A todos os estagiários e orientados de TCC e Iniciação Científica que
estiveram em minha vida ao longo dessa caminhada e que de alguma forma
colaboraram para a execução do trabalho, compartilhando informação e
conhecimento adquirido em todos esses anos de dedicação.
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Andei! Progredi um centímetro a cada passo, desatei nós e fiz outros laços.
Sempre olhando em frente, não parei. E nesse caminho, desenvolvi planos
mirabolantes, perdi horas, vivi instantes, colhi a flor e o espinho. Se evolui nesse
pequeno salto? Não sei dizer com precisão, mas os meus pés que antes tocavam
o chão, hoje são asas que me levam para o alto.
OLIVEIRA, Maria Cristina Xavier
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RESUMO
OLIVEIRA, M.G.X. Espécies patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária: identificação molecular, caracterização fenotípica e interação com hospedeiro. [Pathogenic species of Arcobacter spp. from birds: molecular identification, phenotypic characterization and interaction with host.]. 2019. 104 p. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2019. Arcobacter spp. é um microrganismo Gram negativo causador de diarreia e sepse
em humanos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados de Arcobacter
spp., provenientes de recortes de carne de frango do Município de São Paulo.
Foram utilizadas 40 estirpes de Arcobacter spp das espécies A. butzleri (27/40) e
A. cryaerophilus (13/40), provenientes de 231 recortes de carnes de frangos (2013
a 2015). Os resultados obtidos no perfil de resistência antimicrobiana determinado
pela concentração inibitória mínima (CIM) revelaram que 62,5% das estirpes eram
resistentes à clindamicina, 45% ao ácido nalidíxico e florfenicol, 7,5% à
azitromicina e ciprofloxacina, 5% à telitromicina, 2,5% à eritromicina e tetraciclina
e 0% à gentamicina. Algumas estirpes foram selecionadas para os ensaios
fenitípicos in vitro e in vivo. A análise da produção de biofilme de 12 expressa pelo
índice de formação de biofilmes (IFB), revelou uma estirpe com padrão
moderado. As demais apresentaram padrão fraco (11/12). Nos testes de
aderência, 4/5 estirpes apresentaram padrão de adesão difusa (3h) sobre a
superfície celular com variação de baixa a alta intensidade. Todas as estirpes
foram positivas no teste de toxicidade com efeito em 24h. Estas estirpes causaram
hemorragia intestinal no teste de alça ligada em coelho, com intenso edema de
submucosa. A inoculação experimental em aves revelou lesões mais acentuadas
no quarto dia após infecção, mas sem sintomas clínicos significativos. Lesões
inflamatórias como espessamento de vilosidades e alteração de criptas intestinais
foram observadas no exame histológico. A avaliação dos parâmetros de
modulação da resposta imune local foi realizada entre indivíduos de cada grupo
experimental de aves, revelando diferenças de expressão da citocinas IL 1 e IL 10
do baço e tonsila cecal.
Palavras-chave: Arcobacter spp.. Campylobacteriaceae. toxi-infecção alimentar.
doença de transmissão alimentar.
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ABSTRACT
OLIVEIRA, M. G. X. Arcobacter spp. pathogenic species of avian origin: molecular identification, phenotypic characterization and interaction with host. [Espécies Patogênicas de Arcobacter spp. de origem aviária: identificação molecular, caracterização fenotípica e interação com hospedeiro]. 2019. 104 p. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2019.
Arcobacter spp. is a Gram negative microorganism causing diarrhea and sepsis in
humans. The aim of this study was to phenotypically characterize arcobacter
spp.isolates from chicken meat cutouts marketed in the city of São Paulo. Forty
strains of Arcobacter spp. of species A. butzleri (27/40) and A. cryaerophilus
(13/40) from 231 chicken meat cutouts collected in butchers and municipal markets
(2013 to 2015). The results obtained in the antimicrobial resistance profile
determined by the minimum inhibitory concentration (MIC) revealed that 62.5% of
the strains were resistant to clindamycin, 45% resistant to nalidyxic acid and
florfenicol, 7.5% to azithromycin and ciprofloxacin, 5% telitermycin, 2.5% to
erythromycin and tetracycline and 0% to gentamycin. The analysis of biofilm
production of 12 strains expressed by the moderate biofilm formation index (IFB)
only 1 strain. The others presented a weak pattern (11/12). In the adhesion tests,
4/5 strains showed diffuse adhesion pattern (3h) on the cellular surface with low to
high intensity variation. All strains were positive in the toxicity test with effect at
24h. These strains caused intestinal hemorrhage in the rabbit-illeal loop test, with
intense submucosal edema. Experimental inoculation in birds revealed more
pronounced lesions on the fourth day after infection, but without significant clinical
symptoms. Inflammatory lesions such as thickening of villi and altered intestinal
crypts were observed on histological examination. The evaluation of the
modulation parameters of the local immune response was performed among
individuals from each experimental group of birds, revealing differences in
expression of cytokines IL 1 and IL 10 the spleen and cecal tonsil.
Keywords: Arcobacter spp.. Campylobacteriaceae. toxi-food infection. food
transmission disease.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Dendrograma ilustrando as relações entre os perfis de
susceptibilidade e virulência dos isolados de Arcobacter spp. ............................ 35
Figura 2 Teste de adesão em células HeLa. ....................................................... 54
Figura 3 Teste de toxicidade em células VERO .................................................. 54
Figura 4 Porção da alça intestinal do coelho desafiado com Arcobacter
butzleri ................................................................................................................... 57
Figura 5 Porção da alça intestinal do coelho. Região sem inoculação de
Arcobacter spp. ..................................................................................................... 57
Figura 6 Histologia de Intestino Delgado de Coelho inoculado com A. butzleri
(estirpe A). ............................................................................................................. 59
Figura 7 - Histologia de Intestino Delgado de coelho inoculado com
Arcobacter butzleri (estirpe B) ............................................................................... 59
Figura 8 - Histologia de Intestino Delgado de Coelho inoculado com A.
cryaerophilus (estirpe C)........................................................................................ 60
Figura 9 Histologia de Intestino Delgado de Coelho. Controle negativo .............. 60
Figura 10 Imagem obtida por microscopia eletrônica de varredura da
porção de amostra de intestino de coelho desafiado com Arcobacter
butzleri. .................................................................................................................. 61
Figura 11 Imagem obtida através de microscopia eletrônica de varredura
de porção da amostra intestinal não desafiada (C-). ............................................. 61
Figura 12 Alterações macroscópicas de aves inoculadas experimentalmente com
Arcobacter butzleri........................................................................................ 62
Figura 13 Alça intestinal de ave SPF inoculada com Arcobacter butzleri. ........... 63
Figura 14 Comparação entre diferentes lesões macroscópicas em intestinos de
aves SPF inoculadas com estirpes de Arcobacter butzleri (A167 e A170). ........... 64
Figura 15 Intestino de ave não desafida (controle negativo) no dia 1 ................. 66
Figura 16 Intestino de ave não desafiada (controle negativo) do dia 7 após
desafio ................................................................................................................... 66
Figura 17 - Intestino de ave desafiada com a estirpe A167 (A. butzleri), 4
dias após desafio ................................................................................................... 67
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Figura 18 Intestino de ave desafiada com a estirpe A170 (A. butzleri), 4
dias após desafio ................................................................................................... 68
Figura 19 Intestino de ave desafiada com a estirpe A178 (A. butzleri), 4 dias
após desafio .......................................................................................................... 69
Figura 20 Intestino de ave desafiada com a estirpe A181 (A. cryaerophilus)
4 dias após desafio ................................................................................................ 70
Figura 21 Distribuição da expressão de IL 1 ......................................................... 72
Figura 22 Distribuição da expressão de IL 10. ...................................................... 73
Figura 23 Distribuição da expressão de INF.......................................................... 74
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Descrição dos genes alvo, sequência dos primers, tamanho dos
produtos dos genes de resistência pesquisados ................................................... 32
Tabela 2 - Valores de amplitude, CIM50, CIM90, taxa de resistência e
pontos de corte para os antimicrobianos estudados (CIM - µg/mL) – N (%) ......... 34
Tabela 3 - Distribuição dos perfis resistência identificados segundo espécie
– N/40. ................................................................................................................... 36
Tabela 4 - Média e Desvio Padrão do Teste de formação de bioflime. ................. 52
Tabela 5 - Perfil das estirpes testadas para os testes de biofilme, adesão e
toxicidade. ............................................................................................................. 56
Tabela 6 Análise comparativa entre os diferentes indivíduos desafiados com
Arcobacter butzleri e Arcobater cryaerophilus. ...................................................... 71
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Sequência de primers de citocinas ........................................................ 50
Quadro 2 Efeito citológico em células HeLa e citotóxico em células VERO
das estirpes de A. butzleri e A. cryaerophilus ........................................................ 53
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................18
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 20
2.1GÊNERO ARCOBACTER ................................................................................... 20
2.2 DOENÇA EM HUMANOS ........................................................................... 23
2.3 DOENÇA NOS ANIMAIS ............................................................................ 24
3 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE ESTIRPES VIRULENTAS DE
Arcobacter butzleri E Arcobacter cryaerophilus ISOLADAS DE
CARNE DE FRANGO. ..................................................................................... 28
3.2 OBJETIVOS ............................................................................................... 29
3.3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 30
3.3.1 Isolados bacterianos ............................................................................. 30
3.2.2 Detecção Da Concentração Inibitória Mínima – CIM .......................... 30
3.4 RESULTADOS ........................................................................................... 33
3.5 DISCUSSÃO .............................................................................................. 37
4 Caracterização Fenotípica e Interação Patógeno-Hospedeiro de
Estirpes Virulentas de Arcobacter butzleri e Arcobacter
cryaerophilus de Origem Aviária .................................................................. 42
4.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 42
4.2 OBJETIVOS ............................................................................................... 44
4.2.1 Objetivos específicos ............................................................................ 44
4.3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 45
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4.3.1 Seleção das estirpes ............................................................................. 45
4.3.2 Ensaios de formação de biofilme ......................................................... 45
4.3.3 Cultivo celular ........................................................................................ 46
4.3.4 Teste de aderência bacteriana ............................................................. 46
4.3.5 Determinação de toxicidade em células VERO ................................... 47
4.3.6 Teste de alça intestinal ligada em coelho ........................................... 47
4.3.7 Inoculação experimental em aves ........................................................ 49
4.4 RESULTADOS ........................................................................................... 52
4.4.1 Teste de biofilme ................................................................................... 52
4.4.2 Teste de adesão (HeLa) e citotoxicidade (VERO). .............................. 53
4.4.3 Teste de alça ligada em coelho ............................................................ 57
4.3.4 Teste de inoculação experimental em aves ........................................ 62
4.3.5 Quantificação das citocinas através da PCR em tempo real ............. 71
4.5 DISCUSSÃO .............................................................................................. 75
5 CONCLUSÔES ............................................................................................. 84
REFERÊNCIAS BiBLIOGRÁFICAS ................................................................ 86
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1 INTRODUÇÃO GERAL
Cerca de 1,5 bilhões de casos de diarreia ocorrem anualmente no mundo,
sendo esta uma das principais causas de mortalidade infantil (UNICEF, 2010). A
diarreia é uma manifestação clínica comum das infecções gastrointestinais, que
pode ter várias causas como a ingestão de alimentos de origem animal crus ou
mal cozidos, a contaminação cruzada de alimentos não cozidos, o consumo de
água contaminada, ou ainda, o contato com o agente em situações de falta de
higiene e de saneamento básico (OLIVEIRA et al., 2014).
Diversos microrganismos podem estar associados à ocorrência de
diarreias; e a presença de patógenos zoonóticos em alimentos de origem animal é
uma preocupação de saúde pública (SANCHEZ-ORTIZ; LEITE, 2011). Estimativas
americanas apontam que a infecção por bactérias da Família Campylobacteracea
é a principal causa de diarreia nos Estados Unidos, com aproximadamente 1,3
milhões de casos de doença ao ano (CDC – CENTER FOR DISEASE AND
CONTROL, 2017). A principal via de transmissão da campilobacteriose é a carne
de frango e 95% das ocorrências são decorrentes da presença de Campylobacter
jejuni e Campylobacter coli, sendo 5% dos casos associados à presença de outras
espécies emergentes de Campylobacter spp. e aos organismos Campylobacter-
like, como Arcobacter spp. e Helicobacter spp. (VANDENBERG et al., 2004).
No Brasil as doenças de transmissão hídrica e alimentares constam na lista
nacional de doenças de notificação compulsória, cujas informações são
gerenciadas pelo Sistema de Informação de Agravos de Notificação
(SINAN/DATASUS) como determina a PORTARIA Nº 204, de 17 DE FEVEREIRO
de 2016. No entanto, na prática, os dados epidemiológicos de ocorrência de
diarreias causadas especificamente por Campylobacter spp. e Arcobacter spp. são
escassos no país, em função das dificuldades de diagnóstico diferencial de
gastroenterites nas unidades básicas de saúde, clínicas e hospitais nacionais.
Arcobacter spp. é um microrganismo Gram negativo, aerotolerante,
pertencente à Família Campylobacteraceae, capaz de causar diarreia aquosa ou
sanguinolenta e sepse em humanos (WEBB et al., 2015). São descritas e
reconhecidas 27 espécies do gênero Arcobacter (LEVICAN et al., 2015; PARK et
al. 2016; RAMEES et al., 2017), sendo as espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e
19
A. skirrowii as únicas consideradas patogênicas para humanos e animais
(VANDENBERG et al., 2004).
Estudos sobre a epidemiologia, caráter zoonótico de Arcobacter spp.e os
fatores envolvidos na patogenia da Arcobacteriose têm se intensificado nos
últimos anos, mas ainda não estão completamente estabelecidos todos os pontos
da cadeia de transmissão (FERREIRA et al., 2016). A infecção de aves
domésticas pelo Arcobacter spp. não cursa sinais clínicos aparentes e por isso é
difícil realizar o diagnóstico nas granjas. Em diversas suposições, a contaminação
ocorre por via horizontal, pelo contato de organismos externos como água de
bebida, manipulação das pessoas, animais sinantrópicos e equipamentos
utilizados na granja (HOUF, 2009). A contaminação da carne no momento do
abate é uma situação frequente e representa um perigo alimentar, principalmente
nos casos de estirpes com fenótipo de virulência e resistência antimicrobiana
(OLIVEIRA et al., 2001).
Técnicas moleculares para identificar e diferenciar a diversidade genética,
assim como as formas de transmissão do agente e a determinação de alguns
fatores de virulência, vem contribuindo significantemente nos estudos
epidemiológicos e são essenciais para o avanço das pesquisas sobre Arcobacter
(FERREIRA et al., 2016; OLIVEIRA et al., 2017). Ensaios experimentais in vivo e
in vitro também vêm fornecendo dados importantes sobre a patogenia e
informações prognósticas de pacientes (ADESIJI, 2010).
Um levantamento epidemiológico em carne de frango comercializada no
município de São Paulo detectou a presença de espécies patogênicas de
Arcobacter spp. em 18,3% das amostras analisadas. As estirpes isoladas
apresentaram uma elevada heterogeneidade genética, sendo positivas para
diversos genes de virulência descritos em isolados de pacientes humanos com
Arcobacteriose (OLIVEIRA, 2015). Diante da importância do agente e da escassez
de dados nacionais, os objetivos deste trabalho foram: estabelecer um perfil de
resistência antimicrobiana das estirpes de A. butzleri e A. cryaerophilus
previamente caracterizadas como virulentas; avaliar as características fenotípicas
destas estirpes; bem como a interação com hospedeiros em ensaios in vitro e in
vivo.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
O Brasil é um país que possui agroindústria desenvolvida no setor de
carne de frango. Os números da Associação Brasileira de Proteína Animal (ABPA)
indicam que a produção brasileira no ano de 2018 atingiu 12,86 milhões de
toneladas de carne de frangos, com distribuição do produto em mais de 150
países de todos os continentes (CAMPOS; GOMES, 2016; ABPA, 2019). Apesar
do grande desenvolvimento em tecnologia e atenção aos cuidados à saúde
animal, todo produto de origem animal pode representar um perigo à população
consumidora, caso essa não tenha acesso à determinadas informações sobre
perigos biológicos, condições higiênico-sanitárias e boas práticas de preparo de
alimentos (BRASIL, 1997).
Intoxicações alimentares apresentam um amplo espectro de manifestações
clínicas. No entanto, a diarreia é a manifestação clínica mais frequentemente
observada nas diferentes formas de infecções e toxi-infecções alimentares.
Segundo FERREIRA et al. (2016), Arcobacter spp. foi identificado como um
patógeno emergente nos últimos anos, contaminando alimentos de origem animal
em todo o mundo. O agente é classificado como um perigo para o ser humano
(FERREIRA et al., 2016).
A seguir serão descritas as características do gênero Arcobacter spp., sua
relação com a doença em humanos e nos animais, além das técnicas para
diagnóstico e caracterização do agente.
2.1 GÊNERO ARCOBACTER
Arcobacter spp. são bactérias curvas, Gram negativas, oxidase-positivas,
não esporuladas, com um flagelo polar associado à motilidade. Pertencem à
família Campylobacteraceae e são considerados patógenos emergentes, com
potencial zoonótico (TRABULSI; ALTERTUM, 2008).
Até a presente data são descritas e reconhecidas 27 espécies do gênero
(RAMEES et al., 2017; DIEGUEZ et al., 2017), sendo que as espécies melhor
caracterizadas são Arcobacter butzleri, Arcobacter cryaerophilus, Arcobacter
21
skirrowii, Arcobacter nitrofigilis, Arcobacter cibarius e Arcobacter halophilus
(FERNANDEZ et al., 2015; GIACOMETTI et al., 2015; HARMON; WESLEY, 1997;
VAN DEN ABEELE et al., 2014).
São capazes de crescer em atmosfera aeróbica e micro aeróbica, com
temperatura ótima de crescimento de 30oC (VANDAMME et al., 1992). A maioria
das espécies de Arcobacter é considerada ubiquitária, estando presentes no meio
ambiente, na água e nas fezes de animais domésticos e selvagens (TALAY et al.,
2016; OLIVEIRA et al., 2017). No entanto, as espécies Arcobacter butzleri,
Arcobacter cryaerophilus e Arcobacter skirrowii são classificadas pela Comissão
Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos como potenciais
patógenos alimentares e aquáticos para os seres humanos e animais (ICMSF,
2002).
Em relação à temperatura mínima de crescimento detectável, foi
demonstrado que A. butzleri é capaz de crescer à 10°C e por outro lado não
apresenta crescimento detectável à 40ºC (KJELDGAARD et al., 2009) Na
temperatura de congelamento A. butzleri mostrou ser capaz de sobreviver a uma
incubação prolongada a 20°C até 6 meses (D'Sa & Harrison, 2005).
Os estudos sobre a presença de genes de virulência e sua
citopatogênicidade em testes genotípicos e fenotípicos, revelam que A. butzleri
representa um "grave perigo" para a saúde humana de acordo com a Comissão
Internacional de Microbiologia e Especificações para Alimentos (ICMSF, 2002).
Os mecanismos de patogenicidade e virulência de Arcobacter ainda são
mal compreendidos (HO et al., 2006). Contudo, sabe-se que a presença de alguns
fatores de virulência caracterizam as espécies como potencialmente patogênicas
(OLIVEIRA et al., 2017). Dentre os genes de virulência encontrados nas espécies
patogênicas de Arcobacter spp. destacam-se: ciaB (codifica o antígeno de
invasão Campylobacter jejuni); mviN (codifica marcador de virulência; proteína da
membrana interna necessária para a biossíntese de peptidoglicanos); pldA
(codifica fosfolipase A da membrana externa associada à lise de eritrócitos); tlyA
(codifica a produção de hemolisina); hecA (codifica uma proteína membro da
família de hemaglutinina filamentosa (FHA) que promove a fixação em células
fagocitárias do hospedeiro); hecB (codifica a ativação de hemolisina); irgA
22
(codifica uma proteína de membrana externa reguladora de ferro, juntamente com
o gene iroE, que codifica uma enzima periplasmática), cadF e cj1349 (codificam
proteínas de ligação à fibronectina e promovem a ligação de bactérias nas células
intestinais) (GRANT et al., 1997; WREN et al., 1998; KONKEL et al., 1999; MEY et
al., 2002; RASHID et al., 2006; MILLER et al., 2007; RUIZ, 2008; TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008; FLANAGAN et al., 2009; DASTI et al., 2010; DOUIDAH et al.,
2012; KARADAS et al., 2013).
Os genomas de Arcobacter disponíveis em bases de acesso podem ser
úteis no estudo sobre a virulência destes microrganismos (MILLER; PARKER,
2011). Em um estudo realizado por MILLER et al., (2007) foi realizado o
sequenciamento genômico de uma estirpe de A. butzlei, proveniente de um
isolado clínico humano (RM4018). Este estudo revelou a presença de genes de
virulência como cadF, ciaB, cj1349, hecA, hecB, irgA, mviN, pldA, tlyA e iroE. Com
base nestes dados, evidenciou-se a homologia dos genes de virulência de A.
butzleri e C. jejuni (MILLER et al., 2007).
As técnicas para identificação do gênero Arcobacter e a diferenciação entre
outras espécies da família podem incluir testes moleculares como sequenciamento
do 16S rRNA, 23S rRNA, DNA girase (gyrA e gyrB), Espectrometria de Massa de
Ionização por Desorção Assistida por Matriz Assistida (MALDITOF MS),
Hibridação in situ por fluorescência (FISH), entre outras (PATYAL et al. 2011;
MOHAN et al. 2014; VAN DEN ABEELE et al., 2016). Tais metodologias são
sensíveis e específicas para identificação de espécies e de marcadores de
virulência. (MILLER et al., 2007). Contudo tais técnicas não são suficientes para
determinar a patogenicidade do agente (HARMON; WESLEY, 1997). Métodos
moleculares devem ser associados ao isolamento e caracterização fenotípica para
avaliação do potencial patogênico das diferentes espécies de Arcobacter
(MAUGERI et al. 2005).
DOUIDAH et al. (2012) e KARADAS et al. (2013) desenvolveram primers
para a detecção de genes de virulência em Arcobacter por PCR, demonstrando
sua presença nas espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii. Desde
então, diversos estudos analisaram a ocorrência de genes de virulência em
espécies de Arcobacter spp. isoladas de humanos, animais e de alimentos de
23
origem animal (LEVICAN et al., 2013; COLLADO et al., 2014; FERREIRA et al.,
2014; TABATABAEI et al., 2014; LEHMANN et al., 2015; OLIVEIRA et al. 2017).
2.2 DOENÇA EM HUMANOS
As espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii estão associadas a
infecções em humanos e animais. Essas espécies são consideradas patógenos
emergentes e foram isoladas de pacientes com bacteriemia, endocardite,
peritonite e diarreia (ALONSO et al., 2014; COLLADO et al., 2014; CORRY;
ATABAY, 2001; GIRBAU et al., 2015; HOUF et al., 2000).
A transmissão do Arcobacter ao homem se dá pela via fecal oral, pela
ingestão de água e alimentos contaminados ou por maus hábitos de higiene
(GONZALEZ et al. 2010; COLLADO et al. 2010; SHAH et al. 2011; LEE; CHOI
2013). A transmissão entre humanos e por contato com animais de estimação,
embora seja menos frequente, já foi reportada em surtos da doença na Itália
(FERREIRA et al., 2016).
Carne de frango, suínos e frutos do mar consumidos crus ou mal cozidos
podem levar à infecção (COLLADO et al., 2009). As manifestações clínicas
incluem dor abdominal, náuseas, febre e fraqueza (VANDAMME et al., 1992). A
enterite causada por Arcobacter pode ter curso agudo, com duração de 3 a 15
dias, contudo a maioria das descrições relata casos persistentes ou recorrentes,
que podem durar de duas semanas a dois meses (VANDENBERG et al., 2004).
A. cryaerophilus foi a primeira espécie identificada em seres humanos
(COLLADO et al., 2011). Atualmente Arcobacter butzleri é a espécie mais
comumente isolada de fezes e sangue de pacientes que apresentam desde
diarreia até quadros sepse (FISHER et al., 2014; ARGUELLO et al., 2015),
enquanto A. cryaerophilus e A. skirrowii são isolados apenas de fezes de
pacientes diarreicos (FIGUERAS et al., 2014; VANDENBERG et al., 2004; WYBO
et al., 2004).
A diarreia é geralmente do tipo aquosa e pode ser mais grave em
pacientes imunossuprimidos, em idosos e crianças (WYBO et al., 2004;
FERREIRA et al., 2014). No entanto, poucos microrganismos produzem os casos
mais graves, com perda significativa de líquidos levando à desidratação e morte
24
(UNICEF, 2009). Diarreias sanguinolentas são menos frequentes (COLLADO et
al., 2011). FIGUEIRAS et al., (2014) relataram um caso de um paciente masculino
na Espanha que apresentou diarreia sanguinolenta. A princípio os sintomas foram
atribuídos a possibilidade de infecção por Campylobacter, contudo o diagnóstico
confirmou a presença de Arcobacter cryaerophilus.
A. cryaerophilus e A. butzleri foram identificados como causas raras de
bacteremia em pacientes com apendicite gangrenosa, cirrose hepática,
pneumonia secundária devido à disseminação hematogênica do organismo e em
um caso de sepse neonatal (LAU et al., 2002). Contudo um homem de 65 anos de
idade, com cardiomiopatia isquêmica e cirrose subjacente, apresentou fraqueza,
calafrios, febre e taquicardia, em em 24h entrou em estado grave com efusão
pleural, levando a uma investigação de sepse. Este havia ingerido frutos do mar,
mais especificamente caranguejo. O diagnóstico de Arcobacteriose foi confirmado
após 14 dias e o paciente apresentou melhora com o uso de doxiciclina e
ciprofloxacina (VASILJEVIC et al., 2019).
ARGUELLO et al. (2015) relataram a forma invasiva da infecção em um
homem imunocomprometido de 85 anos de idade, com leucemia linfocítica crônica
que desenvolveu sepse por A. butzleri. Um estudo na África do Sul mostrou que A.
butzleri foi a terceira espécie mais prevalente em diarreias humanas, enquanto na
Bélgica e na França foi relatado que a espécie é a quarta mais prevalente (VAN
DRIESSCHE et al., 2003; PROUZET-MAULEON et al., 2006; SAMIE et al., 2007;
VAN DEN ABEELE et al. 2014).
2.3 DOENÇA NOS ANIMAIS
O isolamento de Arcobacter em animais teve seu primeiro relato feito por
ELLIS et al. (1977), que descreveram o agente presente em fezes de bovinos.
Atualmente se sabe que é possível realizar o isolamento do agente em amostras
de animais de produção como os bovinos, ovinos, aves, equinos e suínos, sendo
que estes podem ser indivíduos assintomáticos ou portadores, sugerindo que
Arcobacter pode ser um agente comensal presente na microbiota (VAN
DRIESSCHE et al., 2005; HO et al., 2006; AYDIN et al.2007). Entretanto há
25
descrições de diferentes manifestações clínicas em animais infectados por
Arcobacter. De maneira geral as manifestações estão associadas a distúrbios
reprodutivos como abortamentos, mastites e diarreias (NEILL et al., 1985; HO et
al., 2006; LOGAN et al., 1982; VAN DRIESSCHE et al., 2003; COLLADO;
FIGUERAS, 2011).
A infecção por A. butzleri em suínos, bovinos e equinos provoca quadros
de diarreia associado ou não à enterite, enquanto a infecção por A. skirrowii causa
diarreia e/ou colite hemorrágica. (HO et al., 2006; VANDAMME, et al., 1992). A.
cryaerophillus é a espécie predominante isolada de animais abortados, mas
também foi isolada de lavagens de prepúcio de bovinos (GILL 1983; DE OLIVEIRA
et al., 1999; BATH et al., 2013). A. butzleri e A. skirrowii são menos relatados em
animais abortados (DE OLIVEIRA et al., 1997; COLLADO; FIGUERAS, 2011).
Arcobacter spp. também pode ser isolado de pequenos animais, incluindo
cães diarréicos (HOUF et al. 2009). Em um trabalho realizado na República Checa
foram avaliados 108 esfregaços orais de cães e 70 de gatos, resultando em cinco
animais positivos para A. butzleri, sendo quatro amostras provenientes de cães e
uma de gato (PEJCHALOVA et al., 2016). A presença do agente em gatos foi
testada por um grupo no Sul da Itália, com a avaliação de 85 animais com e sem
manifestações clínicas de doença. Foram positivos para A. butzleri 66/85 gatos e
29/85 para A. cryaerophilus. A comparação entre os grupos saudáveis e doentes
revelou que 80% dos animais positivos para Arcobacter apresentavam lesões na
cavidade oral e 76% destes tinham linfadenomegalia (FERA et al., 2009).
Em um trabalho realizado na Índia, sobre a prevalência de Arcobacter
spp. em seres humanos, animais e alimentos de origem animal, foi demonstrado
que as maiores taxas de isolamento eram de fezes de suínos com e sem diarreia
(21,33%), seguido de alimentos do mar (17,33%), fezes de frangos de corte sem
diarreia (14,67%), carne de suíno (16%), carne de frango (12%) e amostras de
fezes de humanos com diarreia (2,67%). Este estudo aponta animais marinhos,
suínos e aves como reservatórios das três espécies com potencial zoonótico (A.
butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowi) e reforça o risco de contaminação dos
produtos de origem animal e o perigo na transmissão aos humanos a partir destes
alimentos (PATYAL et al., 2011).
26
Arcobacter spp. é frequentemente relatado em casos de surtos em
humanos que ingeriram alimentos de origem animal, como frango, suíno, carne
bovina, cordeiro, leite cru e marisco contaminados (HO et al., 2006; LEVICAN et
al., 2014; NIEVA ECHEVARRIA et al., 2013). Segundo VAN DRIESSCHE; HOUF
(2007) a maior prevalência é relatada em frangos de corte, seguida de carne de
suíno e carne bovina.
Várias espécies de répteis incluindo lagartos, serpentes, tartarugas e
jacarés já foram descritas como portadoras de Arcobacter spp. (HSU; LEE 2015;
OLIVEIRA et al., 2017). Enquanto os répteis parecem ser refratários a doença,
existem evidências de que os peixes sejam suscetíveis ao agente. Um estudo
relatou o isolamento de A. cryaerophilus em uma Truta arco-íris (Oncorhynchus
mykiss). A experiência de patogenicidade in vivo da estirpe isolada revelou
infecção do intestino, fígado e rim e também causou a morte dos peixes infectados
(YILDIZ; AYDIN, 2006). AÇIK et al. (2016) relataram pela primeira vez a
inoculação experimental em Zebra fish. Os animais foram inoculados com a dose
infecciosa média (DI50) de A. butzleri de 1,3 × 108 UFC/ mL por imersão e 1 × 105
UFC/mL por injeção intraperitoneal. O exame histopatológico revelou inflamação
aguda caracterizada por neutrófilos e células plasmáticas, necrose e congestão
em vários órgãos. Essas descobertas sugeriram que Zebra fish pode ser usado
como um modelo de animal de laboratório para estudar a patogenicidade de
Arcobacter spp. (AÇIK et al., 2016).
A patogenicidade de A. butzleri pode variar em função da espécie
acometida. Um estudo de inoculação experimental realizado por WESLEY; BAETZ
(1999) demonstrou que a infecção de frangos de corte não induziu nenhuma
sintomatologia. Em contrapartida, a infecção experimental em ratos pela mesma
estirpe causou uma diarreia aquosa em animais adultos e diarreia seguida de
necrose hepática em ratos neonatos (ADESIJI 2010; ADESIJI et al., 2012).
A patogenia da infecção por Arcobacter em animais precisa ser elucidada
adequadamente em diferentes modelos animais e por relatos clínicos,
principalmente aqueles que envolvem estudos in vitro e in vivo, para assim
contribuir para elaboração de novas estratégias de prevenção e controle do
agente (PATYAL et al., 2011).
27
2.4 INFECÇÃO DE AVES
Os primeiros relatos de isolamento de Arcobacter cryaerophilus, A
skirrowii e A. butzleri provenientes de carcaças de frango ocorreu em 1998 por
ATABAY et al. (1988). A maior parte das descrições considera que as aves são
portadoras assintomáticas e atuam como reservatórios potenciais de Arcobacter
spp. (ATABAY; CORRY, 2001; KABEYA et al., 2004; LEHNER et al., 2005; HO et
al., 2008; COLLADO; FIGUERAS 2011; RAHIMI et al., 2014).
Há suposições de que o agente tenha um ciclo transitório nas aves devido
sua alta temperatura corporal (42ºC), que não corresponde com as características
de crescimento à 30ºC do Arcobacter spp. (WESLEY, 1996). Contudo RISDALE et
al., (1998) determinaram a presença de Arcobacter e Campylobacter em cecos e
carcaças de patos em abatedouros, encontrando as espécies A. cryaerophilus, A
skirrowii e A. butzleri.
Um estudo sobre investigação de possíveis fontes de infecção das
espécies patogênicas de Arcobacter em um rebanho leiteiro indicaram ausência
do agente em amostras de intestino de 47 pombos, descartando a participação
destas aves na transmissão de Arcobacter para o gado (GIACOMETTI et al.,
2015).
Vários estudos documentaram o isolamento de Arcobacter spp. em fezes
de frangos de corte com diferentes prevalências, como 12% na Costa Rica, 14%
no Japão e 1,3% da Nigéria (KABEYA et al. 2003; BOGANTES et al. 2015).
ATABAY et al. (2008) relataram 18% de prevalência de Arcobacter provenientes
de gansos na Turquia.
Apesar de poucas informações sobre a Arcobacteriose em aves é
importante ressaltar que as diferentes espécies de Arcobacter podem ser
detectadas e identificadas em diversas espécies aviárias com incidência variáveis,
sendo que os métodos para detecção e diferenciação mais eficazes e rápidos são
os moleculares como a PCR (HASSAN et al., 2017).
28
3 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE ESTIRPES VIRULENTAS DE
ARCOBACTER BUTZLERI E ARCOBACTER CRYAEROPHILUS ISOLADAS DE
CARNE DE FRANGO.
3.1 INTRODUÇÃO
A resistência antimicrobiana é um fenômeno comum por meio do qual as
bactérias conseguem restringir a ação de drogas por diversos mecanismos como:
produção de enzimas que degradam ou alteram as moléculas, alterações do sítio
alvo dos medicamentos, diminuição da absorção ou expulsão do antimicrobiano
por bombas de efluxo (SILVA et al., 2013). A resistência pode ter origem em
mutações pontuais do DNA, conferindo uma vantagem adaptativa ao
microrganismo. Na maioria das vezes, a aquisição de genes de resistência se
dissemina horizontalmente pela transferência de elementos móveis de resistência,
principalmente plasmídeos e integrons (SILVA et al.,2013).
O uso excessivo de antibióticos na medicina humana e na agroindústria
tem contribuído para a seleção, disseminação e emergência de estirpes com
determinantes de resistência. Este fato tornou-se uma preocupação mundial, pois
segundos dados da OMS, estima-se que o número de óbitos associados a
infecções por bactérias multirresistentes ultrapasse 10 milhões/ano, tornando-se a
principal causa de morte em todos os continentes (O’NEILLl, 2014).
Segundo MAGIORAKOS et al. (2012) uma bactéria é considerada
multirresistente (MR) quando apresenta resistência a pelo menos um
antimicrobiano de três ou mais classes distintas. Segundo SON et al. (2007) a
prevalência de estirpes de Arcobacter MR é maior na comparação com
Campylobacter spp., com destaque para A. butzleri, cujos níveis de resistência
múltipla variam entre 72,9% a 80,9% (KABEYA et al., 2004; ABAY et al., 2012). De
acordo com KABEYA et al. (2004), as espécies A. cryaerophilus e A. skirrowii
apresentam frequências menores de MR, com 9,1% e 13,3%, respectivamente.
Elevadas taxas de resistência entre os membros da família
Campylobacteracea têm sido reportadas para ampicilina, penicilinas e
cefalosporinas; e as indicações terapêuticas para tratamento de pacientes com
infecção por Campylobacter spp. e Campylobacter-like incluem macrolídios
29
(Azitromicina) e fluorquinolonas (Ciprofloxacina) (CDC, 2017), e menos
comumente as tetraciclinas e os aminoglicosídeos (FERREIRA et al., 2016). No
entanto, estirpes resistentes a macrolídeos, aminoglicosídeos, tetraciclinas e
fluorquinolonas têm sido reportadas em isolados de ambiente, humanos, animais
de produção e de estimação (FERREIRA et al., 2016).
3.2 OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de susceptibilidade
antimicrobiana de estirpes virulentas de Arcobacter butzleri e Arcobacter
cryaerophilus isolados de carne de frango comercializadas no Município de São
Paulo.
3.2.1 Objetivos específicos
● Determinar a susceptibilidade antimicrobiana de A. butzleri e A.
cryaerophilus por meio da Concentração Inibitória Mínima (CIM);
● Identificar os determinantes de resistência antimicrobiana pela PCR.
30
3.3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.3.1 Isolados bacterianos
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética e Uso de Animais da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo-
CEUA e protocolado sob o número 4686280114. Foram avaliadas 40 estirpes de
Arcobacter spp. pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Sanidade
de Suínos – VPS – FMVZ – USP. As estirpes foram isoladas em um estudo
anterior, a partir de 231 recortes de carnes de frangos procedentes de mercados
municipais e açougues do município de São Paulo. Os estabelecimentos foram
selecionados em uma amostragem por conveniência, em cinco regiões do
município (Norte, Sul, Leste, Oeste e Centro).
O isolamento foi realizado em ágar seletivo Johnson e Murano (1999), com
incubação em aerobiose por 48 a 72 horas a 30°C. A identificação das espécies
foi realizada pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) com os primers
descritos por HARMON; WESLEY (1996); BASTYNS et al., 1995; HOUF et al.,
(2000) e DOUIDAH et al., (2010). Para este estudo foram selecionadas apenas as
estirpes consideradas virulentas, após a detecção dos genes de virulência por
PCR Multiplex, segundo descrição de DOUIDAH et al. (2012).
Após a caracterização molecular de virulência foram selecionadas para este
estudo 27/40 estirpes de A. butzleri e 13/40 de A. cryaerophilus. Os atributos de
virulência permitiram a classificação destes isolados em perfis genotípicos
distintos, conforme ilustra a Figura 1.
3.2.2 Detecção Da Concentração Inibitória Mínima – CIM
O perfil de resistência antimicrobiana foi avaliado por meio da concentração
inibitória mínima, utilizando o método de microdiluição em placa de acordo com o
protocolo descrito no documento M31-A3 do Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI-2009).
31
Para a determinação da CIM foi utilizado o painel Campylobacter MIC-Plate
- Sensititre® (TREK Diagnostic System Inc., Cleveland – OH). Foram testados os
seguintes antibióticos: Azitromicina, Ciprofloxacina, Eritromicina, Gentamicina,
Tetraciclina, Florfenicol, Ácido Nalixidico, Telitromicina e Clindamicina. Foram
utilizadas como controle do teste as estirpes padrão Escherichia coli ATCC 25922
e Staphylococcus aureus ATCC 29213.
Para análise dos dados foi utilizado o programa Bionumerics (AppliedMaths,
Sint-Martens-Latem, Belgica), gerando uma matriz de similaridade com
agrupamento de perfis de resistência antimicrobiana. Os critérios de
multirresistência e a determinação da CIM50 e CIM90 foram determinados
conforme definições de SCHWARZ et al. (2010).
3.3.3 Pesquisa de genes de resistência antimicrobiana
Todos os isolados que apresentaram fenótipo de resistência aos
macrolideos, florfenicol e tetraciclina foram submetidas à caracterização molecular
por PCR, utilizando os primers descritos na Tabela 1. Após a extração do DNA as
amostras foram submetidas à PCR em misturas contendo: 2,5 µL do DNA, tampão
para PCR 1X, MgCl2(1,5 mM), 10 mM de cada desoxiribonucleotídeo (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), 10 de cada primer (Tabela 1), 1 U da enzima HotStart Taq
polimerase (Sinapse Inc.) e água ultrapura autoclavada totalizando 25 µL por
reação. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
(1,5%) a 100 V durante 2 horas e corados com SYBR® Safe DNA Gel Stain
(Invitrogen).
32
Tabela 1 - Descrição dos genes alvo, sequência dos primers, tamanho dos produtos dos genes de resistência pesquisados
Alvo Sequência dos primers (5’-3’) Produto
(pb) Referência
mphA GTGAGGAGGAGCTTCGCGAG
406
Nguyen et al.
(2009)
TGCCGCAGGACTCGGAGGTC
mphB GATATTAAACAAGTAATCAGAATAG
494 GCTCTTACTGCATCCATACG
Erma TCTAAAAAGCATGTAAAAGAAA
533 CGATACTTTTTGTAGTCCTTC
ermB GAAAAAGTACTCAACCAAATA
639 AATTTAAGTACCGTTACT
cfrC GGTGAAACTGTTGTGGAGAT
722 Tang et al. (2017) AGTTTCCGTAACTGTCGTTT
floR CACGTTGAGCCTCTATAT
868 Saenz et al. (2004)
AYGCAGAAGTAGAACGCG
Teto
GGCGTTTTGTTTATGTGCG
559 Pratt et al. (2005) ATGGACAACCCGACAGAAGC
GTTAGCCAGCATCACGATCC
Fonte: OLIVEIRA (2019).
33
3.4 RESULTADOS
O teste de resistência antimicrobiana foi determinado pela técnica de
Concentração Inibitória Mínima (CIM) em microdiluição. Realizou-se CIM das 40
estirpes e os resultados obtidos revelaram que 62,5% (25/40) dos isolados foram
resistentes à clindamicina, 45% (18/40) resistentes ao ácido nalidíxico e florfenicol,
7,5% (3/40) à ciprofloxacina e à azitromicina, 5% (2/40) à telitromicina e 2,5%
(1/40) à eritromicina e tetraciclina. Não foi observada resistência para gentamicina
(Tabela 2).
A análise dos resultados por espécie revelou os seguintes resultados: A.
butzleri (22 estirpes) apresentaram resistência para clindamicina 95,4% (21/22),
florfenicol 77,2% (17/22), ácido nalidíxico 72,7% (16/22), azitromicina 13,6 %
(3/22) telitromicina e ciprofloxacina 9% (2/22), tetraciclina e eritromicina 4,5%
(1/22). Os resultados de A. cryaerophulis (5 estirpes) revelaram que 80% (4/5)
eram resistentes à clindamicina, 40% (2/5) resistentes ao ácido nalídixico, 20%
(1/5) à ciprofloxacina e florfenicol. Não foi observada resistência à gentamicina,
para ambas as espécies. Não foi observada resistência para A. cryaeroplhilus à
azitromicina, eritromicina, tetraciclina e telitromicina.
Estes dados revelam um percentual de 40% (16/40 estirpes testadas) de
multirresistência considerando 3 ou mais classes de antibióticos, como
macrolídeos, cetolídeos, aminoglicosídeos, fenicóis, fluorquinolonas, quinolonas e
lincosamidas. Dessas 16 estirpes multirresistentes, 15 correspondem à espécie A.
butzleri e 1 à A. cryaerophilus.
A Figura 1 ilustra os agrupamentos obtidos pela matriz de similaridade
gerada pelo Bionumerics. Na figura estão representados também os atributos de
virulência individuais das estirpes analisadas em estudo prévio (Oliveira et al.
2018). Na tabela 3 é possível verificar os perfis de resistência (R1 – R11)
distribuídos pelas espécies A. butzleri e A. cryaerophilus.
Apesar de serem encontradas cepas resistentes aos macrolídeos,
florfenicol e tetraciclina, não foram encontrados isolados positivos para os genes
pesquisados.
34
Tabela 2 - Valores de amplitude, CIM50, CIM90, taxa de resistência e pontos de corte para os antimicrobianos estudados (CIM - µg/mL) – N (%)
Antimicrobiano Amplitude1 CIM50 CIM90
Resistência N (%)
Pontos de corte
Sensível Intermediário Resistente
Tetraciclina 0,06 – 64 2 4 2,5 ≤4 8 ≥16
Ácido nalidíxico 4 – 64 32 >64 45 ≤16 32 ≥64
Ciprofloxacina 0,015 – 64 0.06 0,5 7,5 ≤1 2 ≥4
Azitromicina 0,015 – 64 0,5 4 7,5 ≤2 4 ≥8
Eritromicina 0,03 – 6 2 4 2,5 ≤8 16 ≥32
Telitromicina 0,015 – 8 1 2 5 ≤1 2 ≥4
Gentamicina 0,12 – 32 0,25 0,5 0 ≤2 4 ≥8
Florfenicol 0,03 – 64 4 32 45 ≤4 - ≥8
Clindamicina 0,03 – 16 8 >16 62,5 ≤2 4 ≥8
1 – Amplitude das concentrações de antimicrobianos na microplaca Sensititre™ CAMPY. Fonte: Adaptado
RIESENBERG (2017).
Figura 1 - Dendrograma ilustrando as relações entre os perfis de susceptibilidade e virulência dos isolados de Arcobacter spp.
Fonte: Arquivo pessoal (2019).
36
Tabela 3 - Distribuição dos perfis resistência identificados segundo espécie – N/40.
Perfil de resistência A. butzleri A. cryaerophilus Estirpes
(N/40)
R1 Sensível a todos os antimicrobianos testados 5 8 13/40
R2 CLIN 2 3 5/40
R3 NAL / CIP 1 1 2/40
R4 NAL / CIP / CLIN 1 0 1/40
R5 FLOR / CLIN 3 0 3/40
R6 NAL / FLOR / CLIN 10 1 11/40
R7 NAL / FLOR / CLIN / TELI 1 0 1/40
R8 TET / NAL / FLOR / CLIN 1 0 1/40
R9 NAL / AZI / CLIN 1 0 1/40
R10 NAL / AZI / FLOR / CLIN 1 0 1/40
R11 AZI / ERI / TELI / FLOR / CLIN 1 0 1/40
Legenda: Perfis de resistência. AZI - Azitromicina, CIP - Ciprofloxacina, CLIN - Clindamicina, ERI - Eritromicina, GEN -
Gentamicina, FLOR - Florfenicol, NAL - Ácido nalidíxico, TELI - Telitromicina, TET - Tetraciclina. Fonte: OLIVEIRA (2019)
37
3.5 DISCUSSÃO
O uso indiscriminado de antibióticos na população humana e nas criações
animais contribuiu para o aumento de infecções resistentes aos diferentes
antimicrobianos. No entanto, informações sobre a resistência antimicrobiana de
Arcobacter spp. ainda são limitadas, sendo a maioria dos dados disponíveis sobre
A. butzleri (ATABAY et al. 2001; HOUF et al. 2001; FERA et al. 2003; KABEYA et
al. 2004). Uma dificuldade adicional para a interpretação de dados de resistência
do gênero Arcobacter é a falta de padronização de metodologias e dos critérios de
interpretação, o que pode resultar em comparações equivocadas. Em nosso
trabalho utilizou-se a conferência com os dados de uma pesquisa realizada com
Arcobacter butzleri para determinar a distribuição de resistência entre as estirpes
(RIESENBERG et al., 2017).
De acordo com os nossos dados o maior percentual de resistência refere-se
às classes de antimicrobianos licosamidas, quinolonas e fenicóis, sendo que as
estirpes apresentaram 62,5% (25/40) de resistência à clindamicina (licosamidas) e
45% (18/40) de resistência ao ácido nalidixico (quinolona) e ao florfenicol
(fenicóis).
O percentual de estirpes resistentes de A. butzleri foi de 67,5% (27/40)
comparado ao percental de A. cryaerophilus 32,5% (13/40), sendo que A. butzleri
não apresentou resistência apenas à gentamicina (aminoglicosídeo), enquanto A.
cryaerophilus foi sensível à azitromicina (macrolídeo), eritromicina (macrolídeo),
tetraciclina, telitromicina (cetolídeo) e gentamicina (aminoglicosídeo).
Considerando resistência à 3 ou mais classes de antimicrobianos, o percentual de
estirpes multirresistentes foi de 42,5% (17/40 estirpes testadas), sendo que 16
correspondem com A. butzleri e 1 à A. cryaerophilus.
Um trabalho semelhante ao nosso foi realizado por SON et al. (2007) com
174 isolados de carcaças de frangos em um abatedouro dos Estados Unidos. Os
autores destacaram que as estirpes de A. butzleri foram resistentes à clindamicina
(90%), seguido de azitromicina (81,4%) e ácido nalidíxico (23,6%). Nossos
resultados também apontam a clindamicina como o medicamento menos efetivo,
mas o percentual de estirpes resistentes foi de 62,5%. Em contrapartida, a
resistência ao ácido nalidíxico encontrada em nosso estudo foi de 45%, superando
38
os resultados do estudo americano. Para a azitromicina, também houve
discordância, pois identificamos níveis menores de resistência (7,5%).
O tratamento com antibióticos na Arcobacteriose é recomendado somente
para as formas mais severas de doença, sendo dispensado nos casos brandos
(DEBRUYNE et al., 2008). As drogas de escolha utilizadas na terapia clínica de
humanos com campilobacteriose são macrólideos, tais como azitromicina e
eritromicina ou as fluoroquinolonas, como a ciprofloxacina (CDC, 2017). Não
existem diretrizes específicas de tratamento estabelecidas para Arcobacter spp.;
no entanto, dados de literatura apontam uma suscetibilidade confiável à
fluoroquinolonas e tetraciclinas (FIGUERAS et al, 2014).
Segundo dados do Sistema Nacional de Monitoramento de Resistência
Antimicrobiana nos Estado Unidos (NARMS/USA. 2017), no ano de 2014 a taxa
de resistência à azitromicina era de 2% para C. jejuni e 10% para C. coli. Neste
mesmo ano, 27% das estirpes de C. jejuni e 36% das estirpes de C. coli
apresentavam resistência à ciprofloxacina. A emergência de estirpes de
Campylobacter spp. resistentes às fluorquinolonas foi atribuída ao uso destas
como melhoradores de desempenho em criações de aves nos Estados Unidos.
Esta relação epidemiológica resultou no banimento das quinolonas como
promotores de crescimento no território americano em 2005, mas os níveis de
resistência das bactérias Campylobacter e Campylobacter-like não recuaram após
a proibição do uso na avicultura (CDC, 2017).
VAN DEN ABEELE et al. (2016) mencionam o fato de 51% das estirpes de
A. cryaerophilus e 13% de A. butzleri apresentarem resistência à ciprofloxacina,
com valores de MIC 90 > 32 mg/L. No entanto, os nossos dados relativos à
ciprofloxacina diferem dos obtidos pelos autores, uma vez que apenas 3/40 (7,5%)
isolados de frango apresentaram MIC≥8mg/L, sendo 92.5% das estirpes do
presente estudo classificadas abaixo do ponto de corte (≥4 mg/L). No Brasil, as
fluorquinolonas nunca foram utilizadas como promotores de crescimento em
avicultura, sendo destinadas apenas ao tratamento terapêutico de aves em
situações específicas, como nas infecções por Salmonella spp. Este fato pode
estar relacionado às diferenças epidemiológicas encontradas entre os dados deste
estudo e de outros países. Em contrapartida, nosso estudo demonstrou uma
elevada taxa de resistência ao florfenicol (45%), provavelmente resultante do uso
39
preventivo deste medicamento nas fases iniciais de criação de aves nas granjas
brasileiras, com pressão de seleção sobre a microbiota intestinal. Não
encontramos na literatura, até o presente momento, trabalhos que permitam a
comparação dos níveis de resistência de Arcobacter spp. ao florfenicol (45%) e à
telitromicina (5%).
Há evidências para apoiar a hipótese de que padrões de resistência em
aves de produção são os mesmos encontrados em isolados humanos e, por esta
razão as quinolonas são consideradas alvo de maior preocupação por ser uma
classe de medicamentos compartilhada. Em trabalho realizado por VAN BOVEN
et al. (2003) foram realizadas coletas de suabes de cloaca de frangos que
receberam tratamento com enrofloxacina. Para determinar a resistência buscou-se
o gene gyrA que codifica resistência a esse antimicrobiano. Os resultados
apresentaram alta freqüências de estirpes resistentes a fluoroquinolonas por
mutações no gene gyrA (VAN BOVEN et al., 2003). Em geral, os dois alvos
enzimáticos intracelulares de fluorquinolonas são DNA gyrase (codificado por gyrA
e gyrB) (DRLICA et al, 1997). VAN DEN ABEELE et al. (2016) relataram a
susceptibilidade antimicrobiana de A. butzleri e A. cryaerophilus isolados de
pacientes belgas. A maioria das estirpes de A. butzleri eram suscetíveis à
ciprofloxacina (87%), enquanto os isolados de A. cryaerophilus (51%)
apresentaram resistência de alto nível (MIC> 32mg/L). A análise do genoma das
estirpes resistentes revelou uma mutação idêntica em gyrA. e sugeriu que A.
cryaerophilus adquiriu resistência à fluoroquinolonas (VAN DEN ABELLE et al.,
2016).
As tetraciclinas e a gentamicina também são medicamentos efetivos
contra o agente, mas na prática não são utilizados (ACHESON, 2001; BLASER,
2008). VAN DEN ABEELE et al. (2016) avaliaram a susceptibilidade de estirpes de
A. butzleri e A. cryaerophilus em pacientes humanos. Segundo os autores, a
tetraciclina é o medicamento com maior eficiência clínica. Este dado concorda
com os obtidos no presente estudo em que observamos ausência de resistência à
gentamicina e níveis baixos de resistência para eritromicina e tetraciclina (2,5%).
A resistência à tetraciclina em Campylobacter ocorre por alteração
ribossômica e por bombas de efluxo (CHOPRA et al., 2001). De acordo com os
dados do Sistema Nacional de Monitoramento da Resistência Antimicrobiana para
40
Bactérias Entéricas, 43% de C. jejuni e 49% de C. coli são resistentes à
tetraciclina, fazendo com que essa classe de antibiótico seja pouco utilizada no
tratamento de diarreias (NARMS, 2010). Dados registrados no NARMS, >99% de
C. jejuni e 88% de isolados de C. coli são suscetíveis aos aminoglicosídeos
(NARMS, 2010). Embora estes medicamentos sejam efetivos do ponto de vista
terapêutico, o tratamento de pacientes desidratados com drogas nefrotóxicas pode
ser contraindicado na prática médica. O principal mecanismo de resistência de
Campylobacter frente aos aminoglicosídeos é por modificações enzimáticas. A
resistência a aminoglicosídeos foi detectada pela primeira vez em C. coli, mediada
por uma 3'-aminoglycoside phosphotransferase (codificada por aphA-3) que tinha
sido anteriormente descrito como gene de resistência em Streptococcus e
Staphylococcus, sugerindo assim a transferência plasmidial (LAMBERT, 1985).
A utilização preventiva de macrolídeos também tem resultado em seleção
de estirpes resistentes da família Campylobacteracea (HOUF et al., 2001). Um
estudo com perus de produção demonstrou a resistência aos macrolídeos ao
abate em um lote no qual foi utilizada tilosina com a finalidade de promotor de
crescimento por período de quatro semanas (LOGUE et al., 2010).
Os mecanismos de resistência de Arcobacter são normalmente de
natureza cromossômica (ABDELBAQI et al., 2007; MILLER et al., 2007; DOUIDAH
et al. 2014; FERREIRA et al. 2016). A. butzleri é comparativamente mais
resistente que A. cryaerophilus (KABEYA et al., 2004; ABAY et al. 2012). SHAH et
al. (2013) mostraram que A. butzleri era resistente à ampicilina (56%), seguido por
cefotaxime (33%) e ciprofloxacina (33%), mas susceptíveis à enrofloxacina e
gentamicina, drogas de escolha para o tratamento da infecção por Arcobacter.
Em nosso trabalho foram revelados 11 perfis de resistência (R1-R11),
sendo que 13/40 (32,5%) estirpes apresentaram sensibilidade à todos
antimicrobianos testados e 25/40 (62,5%) foram resistentes à clindamicina. A partir
de dendograma gerado pelo Bionumerics é possível verificar a combinação dos
antimicrobianos em relação às estirpes testadas, nas quais 18/40 (45%) estirpes
apresentaram resistência à florfenicol e clindamicina, 15/40 (37,5%) foram
resistentes à clindamicina, florfenicol e ácido nalidixico, 3/40 (7,5%) resistente à
ciprofloxacino e ácido nalidixico, 2/40 (5%) à clindamicina, azitromicina e ácido
nalidixico. As combinações de ácido nalidixico, ciprofloxacino e clidamicina; ácido
41
nalidixico, florfenicol, clindamicina e telitromicina; tetraciclina, ácido nalidixico,
florfenicol e clindamicina; ácido nalidixico, azitromicina, florfenicol e clindamicina e
a relação entre azitromicina, eritromicina, telitromicina florfenicol e clindamicina,
foram representados por 1/40 (2,5%) estirpe em cada uma das combinações.
Observou-se 1 estirpe de A. cryaerophilus e 14 estirpes de A. butzleri
multisistentes à florfenicol, ácido nalidixico e clidamicina. Nossos dados não
corroboram com o descrito por SON et al. (2007), no qual descreveram 28/116
(24,1%) de estirpes testadas com perfil de multiresistência único à azitromicina,
clindamicina e ácido nalidixico e nenhuma estirpe de A. cryaerophilus
multiresristente. No trabalho realizado por GOBBI (2013), não foram observadas
estirpes multiresistentes de A. cryaerophilus em isolados de suínos.
Apesar de serem encontradas cepas resistentes, nenhum isolado foi
positivo para qualquer gene de resistência pesquisado. Existem poucos trabalhos
que avaliaram a presença de genes de resistência em Arcobacter spp., e nos
trabalhos pesquisados, os autores utilizaram como referência genes encontrados
em Campylobacter spp. (SAÉNZ et al., 2004; PRATT & KOROLIK, 2005,
NGUYEN et al., 2009; TANG et al., 2017). Atribuímos nossos resultados
negativos a esse fato, pois no nosso trabalho foram utilizados primers para genes
encontrados em Campylobacter spp., e levando em conta que existem centenas
de alelos para esses genes de resistência, esse resultado era esperado.
42
4 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E INTERAÇÃO PATÓGENO-HOSPEDEIRO
DE ESTIRPES VIRULENTAS DE ARCOBACTER BUTZLERI E ARCOBACTER
CRYAEROPHILUS DE ORIGEM AVIÁRIA
4.1 INTRODUÇÃO
O gênero Arcobacter possui 27 espécies e três delas (Arcobacter butzleri,
Arcobater cryaerophilus e Arcobacter skirowii) são consideradas potencialmente
zoonóticas (RAMEES et al., 2017). A veiculação do agente envolve com maior
frequência a ingestão de carne de aves e de suínos contaminadas. Embora estes
organismos, com especial ênfase para A. butzleri, sejam reconhecidos como
patógenos clínicos, ainda há diversos aspectos de sua epidemiologia e
patogenicidade a serem esclarecidos (FERREIRA et al., 2015).
Um estudo prévio realizado por nosso grupo de trabalho revelou a
contaminação de 18,3% de carcaças de aves comercializadas eno Município de
São Paulo, com 63,6% para Arcobater butzleri e 36,3% para A. cryaerophilu
(OLIVEIRA et al., 2018). Um trabalho realizado na Costa Rica demonstrou a
presença de Arcobacter spp. em carcaças de aves em um abatedouro e em carne
de aves de lojas de varejo, com um percentual de contaminação de 6,5%. As
espécies isoladas incluíram A. thereius (30,4%), A. butzleri (21,7%), A. skirrowii
(4,3%) e A. cibarius (4,3%) (BARBOZA et al., 2017).
Os mecanismos de patogenicidade e virulência de Arcobacter ainda são
mal compreendidos. Contudo sabe-se que há alguns fatores de virulência que
caracterizam as espécies como potenciais patogênicos: ciaB (codifica o antígeno
de invasão Campylobacter jejuni); mviN (codifica marcador de virulência; proteína
da membrana interna necessária para a biossíntese de peptidoglicanos); pldA
(codifica fosfolipase A da membrana externa associada a lise de eritrócitos); tlyA
(o gene da hemolisina); hecA codifica uma proteína membro da família de
hemaglutinina filamentosa (FHA) que promove a fixação em células fagocitárias do
hospedeiro; hecB, codifica a ativação da hemolisina proteína; irgA gene, que
codifica uma proteína de membrana externa regulada pelo ferro, juntamente com o
gene iroE, que codifica uma enzima periplasmática, são componentes funcionais
para aquisição de ferro e são necessários para estabelecimento e manutenção de
infecção; e cadF e cj1349 (codifica ligação de fibronectina proteínas que
43
promovem a ligação de bactérias para células intestinais) (GRANT et al., 1997;
WREN et al., 1998; KONKEL et al., 1999; MEY et al., 2002; RASHID et al., 2006;
MILLER et al., 2007; RUIZ, 2008; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008. FLANAGAN et
al., 2009; DASTI et al., 2010; DOUIDAH et al., 2012, KARADAS et al., 2013).
Em estudo anterior, nosso grupo de pesquisa avaliou a virulência de 40
estirpes de Arcobacter spp., que foram submetidas à pesquisa de genes de
virulência descritos por Douidah et al. (2012), demonstrando positividade de 100%
para cj1349, 99% (39/40) para o ciaB e mviN, 95% para tlyA e pldA (38/40),
87,5% de cadF (35/40), 50% para irgA e hecA (20/40) e 32, 5% para hecB
(13/40) (OLIVEIRA, 2015). Estes dados sugerem que tais estirpes apresentam
potencial risco para os consumidores. No entanto, novos estudos são necessários
para confirmar a expressão destes genes e avaliar as características fenotípicas
destas estirpes, bem como a interação do patógeno com hospedeiros mamíferos e
aves.
44
4.2 OBJETIVOS
Determinar as características fenotípicas de estirpes virulentas e resistentes
de Arcobacter butzleri e Arcobacter cryaerophilus de origem aviária e avaliar a
interação patógeno/hospedeiro por meio de testes in vitro e in vivo.
4.2.1 Objetivos específicos
● Analisar o potencial de formação de biofilme.
● Verificar a capacidade de aderência in vitro das estirpes virulentas de
Arcobacter butzleri e Arcobacter cryaerophilus em células HeLa.
● Verificar a produção de toxinas in vitro em cultura de células VERO.
● Avaliar a capacidade de acumular líquido intestinal e lesar tecidos no
modelo de alça intestinal ligada em coelho.
● Avaliar a excreção do agente, manifestação clínica e capacidade de
invasão de órgãos de aves experimentalmente infectadas.
● Verificar a resposta imunológica local por meio de imunofenotipagem
das tonsilas cecais, baço e fígado de aves SPF experimentalmente
infectadas.
45
4.3 MATERIAIS E MÉTODOS
4.3.1 Seleção das estirpes
Após a caracterização de virulência e resistência de 40 isolados de Arcobacter
spp. foram selecionadas algumas estirpes para os ensaios fenotípicos e estudos
“in vivo”. Os critérios de escolha foram adotados no agrupamento destes isolados
após análise genotípica, considerando o perfil virulento das espécies de
importância em Saúde Pública e o perfil de resistência revelado no teste de
concentração inibitória mínima (CIM).
Utilizou-se 12 estirpes para observação da formação de biofilme, 5 estirpes
para verificar adesão e toxicidade, 4 para avaliar lesões intestinais no teste de alça
ligada no coelho, 4 estirpes na avaliação da relação patógeno hospedeiro das
aves desafiadas e a resposta imunológica..
4.3.2 Ensaios de formação de biofilme
A capacidade de formação de biofilme foi avaliada comparando-se os
valores de absorbância dos biofilmes formados aos de estirpes padrão que
formam ou não biofilmes. A técnica empregada foi a de cristal violeta em
superfície de poliestireno (MCLENNAN et al., 2008; GAYNOR et al., 2007).
As culturas foram incubadas durante a noite em caldo MH a 37°C e diluída
a uma densidade óptica (OD) a 620 nm de 0.20 (~ 109 UFC/mL) e 0,02 (~ 108
UFC/mL). Destas diluições, 100 μL foram inoculadas em placas de poliestireno de
96 poços e incubadas durante 48 h a 37°C, em microaerofila e em condições
aeróbias. Caldo MH foi usado como controle negativo. Após a incubação, 25 μL de
uma solução de cristal violeta (CV) de 1% em etanol 100% foram adicionadas aos
poços e incubadas à temperatura ambiente por 15 min. Os poços foram
enxaguados completamente cinco vezes com água destilada.
A formação de biofilme foi quantificada, dissolvendo o restante CV com
uma solução composta de 30% de metanol e ácido acético à 10%, e a
absorbância com mensuração de 570 nm. A análise foi expressa pelo índice de
formação de biofilmes (IFB) que mede o acúmulo de biofilme normalizado pelo
46
crescimento usando uma fórmula matemática que inclui DO de bactérias
anexadas e coradas, DO de controles corados contendo apenas meio livre de
bactérias e DO de crescimento celular em caldo. O IFB foi categorizado de acordo
com Naves et al. (2008) e resultou na classificação semi quantitativa da formação
do biofilme em quatro categorias: forte (≥1.10), moderada (0.70 a 1.09), fraca
(0.35 a 0.69) e nenhuma (<0.35). Cada isolamento foi examinado em três
repetições.
4.3.3 Cultivo celular
Células HeLa, derivadas de adenocarcinoma de colo de útero (atcc. Ccl-2)
e células vero derivadas de células epiteliais de rim de um macaco verde
africano (Chlorocebus sp) (atcc. Ccl-8) foram cultivadas em garrafas de cultura
celular de 15 cm².
As células foram cultivadas em estufa com atmosfera de 5% de CO2 em
meio Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, EUA), contendo 10% de
soro fetal bovino (SFB) (Gibco, EUA) e 1% de mistura de antibióticos (penicilina e
estreptomicina, Gibco, EUA).
Para o repique, foi utilizada a solução de Tripsina e Versene (ATV – Anexo
2) para destacar as células aderidas às garrafas e as células foram distribuídas
em microplacas plásticas de 24 poços. Para proceder aos testes, células HeLa e
VERO foram cultivadas por 48h para ocorrência de polarização e diferenciação da
monocamada.
4.3.4 Teste de aderência bacteriana
Células HeLa (~105 por poço) foram cultivadas em lamínulas de vidro, em
placas de 24 poços, por 48h, em meio DMEM contendo 10% de SFB, mantido a
37ºC em estufa com atmosfera de 5% de CO2. As células foram lavadas 3 vezes
com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após as lavagens, as
suspensões bacterianas cultivadas durante a noite em meio LB, diluídas 1:50
(~108 bactérias/mL) foram inoculadas em meio DMEM contendo 2% de SFB e 2%
47
de D-manose, sem antibióticos, sendo incubadas à 37ºC por 3 h, em atmosfera de
5% de CO2.
Após esse período, os poços foram lavados 3 vezes com PBS e adicionou-
se meio fresco, sendo incubado por mais 3h. Ao final de tal período, as
preparações foram lavadas e então fixadas de acordo com o teste a ser realizado.
As preparações nas lamínulas do teste de adesão foram fixadas com
metanol por 24h a 4ºC. Após este período, foram lavadas 3 vezes com água
destilada, coradas com May Grünwald (Dinâmica, Brasil) por 5 min. Em seguida, o
corante foi retirado e adicionou-se solução corante de Giemsa (Merck, Alemanha)
por 20 min. Após esse período, as preparações foram lavadas com água
destilada, para retirar o excesso de corante, e secar ao ar. As lamínulas foram
fixadas sobre lâminas de microscopia para observação. A estirpe tEPEC E2348/69
foi utilizada como controle de adesão localizada (AL), a estirpe JPN15 como
controle de adesão localizada like (Al-like), a estirpe EAEC O42, como controle de
adesão agregativa (AA) e a estirpe DAEC C1845 como controle de adesão difusa
(AD). As lamínulas foram examinadas em microscopia óptica.
4.3.5 Determinação de toxicidade em células VERO
No ensaio de toxicidade foi utilizada a técnica de cultivo celular em
microplacas com células VERO com 24h de repique. Foram semeadas 150 uL de
uma suspensão de células por poço contendo 1.105 cel/mL e meio de manutenção
Eagle em microplaca e incubadas a 37ºC por 24h.
Foram adicionados 50 ul do filtrado obtido em cada poço obtendo-se uma
diluição de 1:4. este procedimento foi realizado em cabine de segurança biológica.
as microplacas foram incubadas à 37ºc, 24h e 48h em estufa a 5% de co2. a
leitura foi realizada em microscópio óptico invertido após 24h e 48h com
observação da destruição ou não da monocamada celular.
4.3.6 Teste de alça intestinal ligada em coelho
O protocolo para o teste de acúmulo de fluido em alça ligada em coelho foi
o descrito por Bergdoll (1988), com algumas modificações. Utilizou-se um coelho
48
macho da raça New Zeeland, pesando ~1,7 Kg e mantido em jejum durante 24
horas antes do ensaio.
Os isolados foram repicados em caldo nutriente e incubados à 30oC por 18
horas. Uma aliquota desse cultivo foi repicada em caldo de infusão de cerebro e
corac ão (BHI) adicionado de 0,1% de glicose, e novamente incubada a 30oC por
18 horas, sob moderada agitac ão (200rpm). Ao termino desse periodo, a cultura
foi centrifugada a 8000 rpm por 20 minutos, sob refrigerac ão, o sobrenadante
filtrado em filtros com poro 0,45μm. O volume de 1 mL de filtrado e de 1 mL de
cultura bacteriana padronizada na concentracão de 1 x 106 UFC foram inoculados
em segmentos de ileo de coelho.
Para a cirurgia, o animal foi sedado por via intramuscular utilizando-se
Fentanil na dose de 0.2 mL/kg (0.0785 mg/mL) e para o procedimento utilizou-se
anestésico dissociativo – Quetamina na dose de 22 mg/Kg (100 mg/mL) e Xilazina
na dose de 2 mg/Kg (20 mg/mL) por via intramuscular e por fim, para manutenção
da analgesia, foram utilizados bolus intravenosos de Fentanil a cada 30 minutos
na dose de 0.008 mg/Kg.
Após a tricotomia da região abdominal, foi feita incisão na região mediana
com exteriorização do intestino. Foi efetuada a lavagem do lúmen intestinal por
três vezes com solução salina, seguida da ligadura de segmentos de intestino com
cinco cm de comprimento, separados por inter-alças de três cm de comprimento e
posteriormente inoculado em cada alça 1 mL da solução da amostra.
Após 12 horas, o coelho foi eutanasiado e a alc a intestinal do intestino
delgado examinada quanto a presenc a de acumulo de liquido e de muco.
PBS e E. coli K 12 foram utilizados como controles negativos do teste.
Fragmentos de 0,5 mm de intestino foram fixados em paraformaldeido 4% em
tampão fosfato, e posteriormente desidratados, diafanizados e incluidos em
parafina. Os blocos foram cortados em micrótomo LEICA RM2145 e corados com
Giemsa e hematoxilina-eosina. A observac ão dos cortes histológicos foi realizada
em microscópio optico.
Para o estudo ultra-estrutural dos enterócitos foi utilizada a técnica de
microscopia eletrônica. A fixação do intestino foi realizada em solução gelada de
glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0.1M de pH 7,2 à 0°C com fragmentos de
cerca de 1 a 2 mm de espessura. A pós-fixação, as peças forma incluídas em
49
resina pura à 37°C, depositadas em moldes e levadas à estufa à 70°C, durante 5
dias. Para a microtomia de corte semi-fino, da ordem de 0,5 mm de espessura,
empregaremos o ultramicrótomo LKB Porter Blum MT-1; para cortes ultrafinos de
aproximadamente 70 nm utilizaremos o ultramicrótomo LKB Porter Blum MT 2,
cujos cortes foram coletados em telas de cobre, corados com acetato de uranila a
2% em água destilada durante 1 hora e lavados em água destilada durante 30
minutos. Para as análises das telas e obtenção de micrografias eletrônicas,
utilizaremos os microscópios eletrônicos do Instituto Butantan.
4.3.7 Inoculação experimental em aves
Foram utilizadas 30 aves SPF de 11 semanas de idade, alojadas em
ambiente com controle de temperatura, umidade e luminosidade. Estas foram
alocadas em gaiolas em 5 grupos de 6 animais, no qual 4 grupos foram
submetidos a inoculação de estirpes de Arcobacter e 1 grupo representou o
controle negativo (C-).
Os grupos desafiados receberam no 1º. dia, 0,1 mL de caldo LB com
Arcobacter butzleri ou de Arcobacter cryarophilus por via oral (gavagem) de caldo
contendo de caldo contendo 1,0 x 109 UFC/mL. O grupo C- não foi desafiado e
realizou-se a coleta de fezes para verificar se eram negativas para o agente
pesquisado. Uma ave do C- foi eutanasiada no primeiro dia do experimento para
padronização de normalidade histológica, bacteriológica e imunológica do lote.
As aves foram mantidas vivas em um período gradativo de 6 dias após a
inoculação (7 dias no total). Realizou–se a coleta de fezes diária para
acompanhamento de excreção do agente. Um grama de fezes de cada ave foi
semeado em 9 mL no caldo de enriquecimento seletivo descrito por Johnson;
Murano, (1999) e os tubos de ensaio agitados por 15 segundos. Os tubos foram
incubados em aerobiose por 48 horas a 30°C. Após o período de incubação, uma
alíquota de 10µL do caldo foi depositada sobre uma membrana estéril de celulose
(0,45µm) colocada na superfície do ágar seletivo Johnson e Murano (1999). Após
uma hora, os filtros foram removidos e a placas de ágar estriadas e incubadas em
aerobiose por 48 a 72 horas a 30°C.
50
Durante esses 7 dias realizou-se o abate de 1 ave por dia a partir do 1º dia
após o procedimento, para observação de lesões macroscópicas e coleta de
material para análise histológica, bacteriológica e imunológica. As aves foram
avaliadas para verificação de manifestações clínicas e presença de lesões
macroscópicas, com coleta de baço, fígado e intestino para isolamento do agente
e identificação de lesões patológicas pela histologia e microscopia eletrônica do
intestino. Os dados obtidos foram analisados para comparação da patogenicidade
do grupo controle em relação aos grupos desafiados.
4.3.8 Quantificação das citocinas através da PCR em tempo real
A imunidade local foi avaliada pelo teste de imunofenotipagem das tonsilas
cecais, fígado e do baço das aves através da PCR em tempo real. Para este
procedimento utilizamos os seguintes primers na PCR em tempo real (Quadro 1):
Quadro 1 Sequência de primers de citocinas
Gene
alvo Senso Antisenso
Tamanho do
fragmento
amplificado
IFN-
alpha 5'-ATCCTGCTGCTCACGCTCCTTCT-3' 5'-GGTGTTGCTGGTGTCCAGGATG-3' 198
IL-1 GTGAGGCTCAACATTGCGCTGTA TGTCCAGGCGGTAGAAGATGAAG 214
IL-10 5'-AGCAGATCAAGGAGACGTTC-3' 5'-ATCAGCAGGTACTCCTCGAT-3' 103
B-actin 5'-CAACACAGTGCTGTCTGGTGGTA-3' 5'-ATCGTACTCCTGCTTGCTGATCC-3' 205
Fonte: OLIVEIRA (2019).
Para a quantificação dos tecidos pela RT- PCR, o RNA total foi extraído de
amostras usando TRIZOL® (Invitrogen®, São Paulo, Brasil), conforme descrito por
Abdul Careem et al. (2006). Rapidamente, cada tecido foi homogeneizada na
presença de TRIZOL®; acrescentou-se clorofórmio (1:5) e obteve-se a fase
aquosa após centrifugação (12.000×g, 15 minutos). O RNA foi precipitado com
isopropanol por 15 minutos em temperatura ambiente, seguido por centrifugação a
12.000×g por 10 minutos. Os pellets foram novamente suspensos em água tratada
com 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) e o RNA foram quantificados por
espectrofotometria.
51
A concentração total de RNA foi determinada pela mensuração da
densidade óptica a 260nm. Para a transcrição reversa, 1μg de RNA total foi usado
como molde para sintetizar cDNA. RNA foi incubado com 1μL de oligo(dT)
(0,5μg/μL, Invitrogen®, São Paulo, Brasil), 1μL de desoxirribonucleotideo trifosfato
(dNTPs) (10mM) e água-DEPC para um volume final de 12μL, por 5 minutos a
65°C e, depois, por 1 minuto em gelo. Os seguintes reagentes foram então
adicionados para atingir um volume final de 19μL:4μL de tampão RT-PCR (50mM
TrisHCl, pH 8,3, 75mM KCl, 3mM MgCl2) e 2μL de DTT® (0,1M). Após 2 minutos
de incubação a 37°C, 1μL da transcriptase reversa foi adicionado e a sintese de
cDNA foi feita a 50°C por 1 hora. A reação foi inativada por incubação a 70°C por
15 minutos.
A amplificação dos genes de referência citados no quadro 1, foi feita
usando 9,5μL de SYBR® green polymerase chain reaction (PCR) master
mix (Applied Biosystems®, São Paulo, Brasil), 0,5μL de primers
forward e reverse (0,33µM cada), 100 ng de cDNA e água livre de nuclease, em
um volume total de 15μL. As reações foram feitas em uma placa óptica de 96
poços, usando um termociclador StepOnePlus® (Applied Biosystems®, Foster City,
CA, EUA). As condições de amplificação empregadas consistiram de pré-
incubação por 10 min a 94º C, seguido de 60 ciclos de 95ºC por 10 s; 54º a 64ºC
para anelamento por 5 s e aquisição e elongação a 72ºC por 10 s. A análise da
curva de melting foi realizada em três etapas: 95ºC por 10 s, resfriamento até 55º
C por 1 min e aquecimento a 97º C. A média geométrica foi utilizado um gene de
controle endógeno (β-actina) para analisar a expressão relativa do gene. Utilizou-
se um ciclo limiar relativo (CT) para determinar a expressão do gene alvo em
relação ao controle sem tecido (calibrador).
A expressão do gene da β-actina foi quantificada por RT-PCR para
normalização. Os dados de expressão gênica dos animais infectados e não
infectados foram avaliados pelo método 2-ΔΔCt.
A comparação entre os animais selecionados foi realizada de forma apenas
descritiva e utilizou-se o software SPSS Base 9.0 para citar os resultados
comparativos.
52
4.4 RESULTADOS
À seguir serão descritos os resultados referentes ao capítulo 2.
4.4.1 Teste de biofilme
Realizou-se o teste de biofilme com 12 estirpes que apresentam
diferentes características de virulência e resistência, A estirpe de Escherichia coli
enteroagregativa (O42) foi utilizada como controle positivo do teste e a estirpe
Escherichia coli C600 foi o controle negativo, além de um controle apenas com
água destilada (branco). Os resultados revelam que os índices de formação de
biofilme variaram dentro do padrão de fraco a moderado, considerando a média de
forte (≥1.10), moderada (0.70 a 1.09), fraca (0.35 a 0.69) (Tabela 4).
Tabela 4 - Média e Desvio Padrão do Teste de formação de bioflime.
Estirpe Teste 1 Teste 2 Teste 3 Média Desvio Padrão A181 0,537 0,488 0,629 0,551 0,072 A167 0,897 0,931 0,950 0,926 0,027 A170 0,741 0,781 0,515 0,679 0,143 A178 0,400 0,454 0,787 0,547 0,210 A188 0,519 0,577 0,683 0,593 0,083 A165 0,737 0,632 0,715 0,695 0,055 A149 0,729 0,649 0,620 0,666 0,056 A156 0,283 0,403 0,317 0,334 0,062 A51 0,651 0,704 0,645 0,667 0,032
A214 0,536 0,555 0,242 0,444 0,175 A106 0,577 0,539 0,764 0,627 0,120 A156 0,257 0,293 0,309 0,286 0,027 C600 0,637 0,535 0,675 0,616 0,072 O42 1,042 0,915 1,050 1,002 0,076
Branco 0,050 0,051 0,052 0,051 0,001 Legenda: C+ (controle positivo 042 EAEC), C- (controle negativo C600) e água destilada (branco).
Análise realizada por Densidade Ótica. Fonte: OLIVEIRA (2017).
53
4.4.2 Teste de adesão (HeLa) e citotoxicidade (VERO).
A expressão dos genes de adesão foi avaliada em cultivo celular em células
HeLa com observação em 3h, enquanto a produção de toxinas foi avaliada em
células vero com resultado em 24h (Quadro 2). No teste de adesão em células
HeLa, 4/5 estirpes testadas apresentaram adesão de baixa à média intensidade e
apenas uma estirpe não apresentou aderência. As estirpes não apresentaram
padrões específicos de adesão (Figura 2).
Quadro 2 Efeito citológico em células HeLa e citotóxico em células VERO das estirpes de A. butzleri e A. cryaerophilus
Estirpes HeLa (3h) VERO (24h)
A170 Adesão de média à
intensa.
Alongamento e
vacuolização alta.
A167 Sem aderência. Arredondamento e/ou
alongamento alta.
A165 Adesão de média à
baixa. Arredondamento fraco.
A188 Adesão de média à
baixa. Alongamento médio.
A181 Adesão de média à
baixa. Alongamento médio.
Contole Negativo Células preservadas Células preservadas
Controle Positivo
Adesão alta com
clusters compactos e
diferentes padrões de
adesão.
Alongamento e intensa
vacuolização.
Fonte: OLIVEIRA (2019).
Todas as estirpes testadas apresentaram efeito citotóxico no cultivo em
células VERO de baixa à alta intensidade (Quadro 2), revelando alongamento,
arredondamento e vacuolização celular (Figura 3).
54
Figura 2 Teste de adesão em células HeLa.
Legenda: A seta preta indica a presença de Arcobater butzleri. Células. HeLa
apresentando alteração de média à alta intensidade de Arcobacter butzleri. Fonte: OLIVEIRA
(2018)
Legenda: Células VERO apresentando alongamento, arrondamento e vacuolização,
após adição de sebrenadante de cultura de A. butzleri. Fonte: OLIVEIRA (2018).
Figura 3 Teste de toxicidade em células VERO
55
Para melhor comparação apenas os dados de 5 estirpes em comum,
testadas para o teste in vitro de adesão e invasão, biofilme e virulência, foram
agrupados as estirpes testadas representam as seguintes combinações (Tabela
5):
56
Tabela 5 - Perfil das estirpes testadas para os testes de biofilme, adesão e toxicidade.
.Fonte: OLIVEIRA (2019).
Estirpe Espécie Fator de virulência Hela (3h) VERO (24h) Biofilme
A170 A. butzleri ciaB, cj1349, hecA, irgA, mviN, cadF, hecB, pldA, tlyA Adesão de média à
intensa.
Alongamento e
vacuolização alta. Padrão fraco
A167 A. butzleri ciaB, cj1349, hecA, irgA, mviN, cadF, hecB, pldA, tlyA Sem aderência.
Arredondamento
e/ou alongamento
alta.
Padrão
Médio
A165 A. butzleri ciaB, cj1349, hecA, irgA, mviN, cadF, hecB, pldA, tlyA Adesão de média à
baixa.
Arredondamento
fraco.
Padrão
Fraco
A188 A. cryaerophilus ciaB, cj1349, mviN, pldA, tlyA Adesão de média à
baixa.
Alongamento
médio.
Padrão
Fraco
A181 A. cryaerophilus ciaB, cj1349, hecA, irgA, mviN, cadF, pldA Adesão de média à
baixa.
Alongamento
médio. Padrão fraco
4.4.3 Teste de alça ligada em coelho
No teste de alça ligada em coelho todas as estirpes causaram lesões
hemorrágicas (Figura 4). Utilizou–se uma alça com controle negativo (solução
fisiológica estéril) (Figura 5).
Figura 4 Porção da alça intestinal do coelho desafiado com Arcobacter butzleri
Legenda: Lesão hemorrágica induzida por A. butzleri após 12h de inoculação. Fonte: OLIVEIRA (2019).
Figura 5 Porção da alça intestinal do coelho. Região sem inoculação de Arcobacter spp.
Legenda: Sem alterações macroscópicas. Fonte: OLIVEIRA (2019).
57
58
A análise histologia dos fragmentos de intestino delgado foi realizada no
Centro Veterinário de Anatomia Patológica - CVAP e as descrições correspondem
à duas estirpes de A. butzleri (A - A167 e B - A170), uma estirpe de A.
cryaerophilus (C - A181), um controle positivo (D) e um controle negativo (E):
As estirpes A e B de A. butzleri causaram um edema discreto a moderado
difuso na lâmina própria e na submucosa. Na submucosa notou-se dilatação
discreta multifocal de vasos linfáticos. No lúmen do órgão observou-se moderada
quantidade de hemácias associadas a debris celulares. As demais estruturas
apresentam-se íntegras (Figuras 6 e 7)
A análise microscópica dos fragmentos de intestino delgado inoculado com
A. cryaerophilus (C) revelou área focal de hemorragia na submucosa, associado à
debris celulares e moderado infiltrado inflamatório misto composto por linfócitos,
plasmócitos e heterófilos (íntegros e degenerados). Na serosa adjacente a essa
área notou-se infiltrado inflamatório linfoplasmocítico nodular a difuso multifocal
associado a debris celulares. Na submucosa verificou-se ectasia discreta
multifocal de vasos linfáticos. No lúmen do órgão observou-se moderada
quantidade de hemácias associadas à debris celulares. Demais estruturas
permaneceram íntegras (Figura 8).
Realizou-se também a análise do fragmento de intestino delgado inoculado
com solução fisiológica estéril (controle negativo). As estruturas apresentam-se
íntegras (Figura 9).
59
Figura 6 Histologia de Intestino Delgado de Coelho inoculado com A. butzleri (estirpe A).
Legenda: Alterações na submucosa nota-se ectasia discreta multifocal de vasos linfáticos. No lúmen do órgão observa-se moderada quantidade de hemácias associados a debris celulares. Coloração HE X 100. Fonte: OLIVEIRA (2019).
Figura 7 - Histologia de Intestino Delgado de coelho inoculado com Arcobacter butzleri (estirpe B)
Legenda: Alterações na submucosa nota-se ectasia discreta multifocal de vasos linfáticos. No lúmen do órgão observa-se moderada quantidade de hemácias associados a debris celulares. Coloração HE X 100. Fonte: OLIVEIRA (2019).
60
Figura 8 - Histologia de Intestino Delgado de Coelho inoculado com A. cryaerophilus (estirpe C).
Legenda: Submucosa área focal de hemorragia associado a debris celulares e moderado infiltrado inflamatório Na serosa adjacente a essa área nota-se infiltrado inflamatório linfocitário. Coloração HE X 100. Fonte: OLIVEIRA (2019).
Figura 9 Histologia de Intestino Delgado de Coelho. Controle negativo
Legenda: Criptas sem alteração; células caliciformes normais. Coloração HE X 200. Fonte: OLIVEIRA (2019).
Através da microscopia eletrônica de varredura observamos que as estirpes
aderiram de maneira fraca à mucosa intestinal, sem apresentar padrões de
aderência específicos. Estruturas em forma de bacilos foram encontradas no meio
extracelular. Observa-se destruição das criptas intestinais (Figura 10) na
comparação com o controle negativo (Figura 11).
61
Figura 10 Imagem obtida por microscopia eletrônica de varredura da porção de amostra de intestino de coelho desafiado com Arcobacter butzleri.
Legenda: As imagens revelam destruição de vilosidades com a presença de alguns bacilos
dispersos na matriz extracelular (setas vermelhas). Fonte: OLIVEIRA (2019).
Figura 11 Imagem obtida através de microscopia eletrônica de varredura de porção da amostra intestinal não desafiada (C-).
Legenda: As imagens revelam porção da alça intestinal do coelho que não houve desafios
(Controle negativo). Nas imagens vemos a preservação das criptas intestinais. Fonte: OLIVEIRA
(2019).
62
4.3.4 Teste de inoculação experimental em aves
Realizou-se a inoculação experimental em aves SPF com 4 estirpes
selecionadas a partir da observação dos testes de resistência, de formação de
biofilme e de adesão. O projeto foi aprovado pela CEUA nº 7843030717.
O experimento foi realizado no Centro Experimental de Patologia Animal
pertencente ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia – USP.
Observou-se que as aves desafiadas com uma estirpe com características
genéticas de alto índice de virulência (A170) apresentaram hiperemia em intestino
delgado e formação de gás em alças intestinais (Figura 12). As lesões foram mais
evidentes no 4º dia após a inoculação. Contudo os animais apresentaram apenas
diarreia leve sem outras manifestações clínicas aparentes.
Figura 12 Alterações macroscópicas de aves inoculadas experimentalmente com Arcobacter butzleri.
Legenda: A: apontado pela seta laranja indica-se fezes diarreinogênicas no ambiente
experimental. B: alça intestinal apresentando hiperemia e distensão gasosa C: Distenção
gasosa dos cecos. D: presença de conteúdo alimentar pastoso e acúmulo de muco em
alça intestinal. Fonte: OLIVEIRA (2019).
63
Em outra estirpe (A167) com características genéticas de resistência foi
possível observar palidez de todos os órgãos. Essa característica foi observada a
partir do 4º dia após a inoculação. Notou-se também a presença de gás nas alças
intestinais (Figura 13). Na Figura 14 é possível observar a comparação entre as
características de hiperemia e palidez dos intestinos dos animais inoculados com
as diferentes estirpes descritas.
Figura 13 Alça intestinal de ave SPF inoculada com Arcobacter butzleri.
Legenda. A: Distensão de alça intestinal pela presença de gás e palidez; B: mucosa pálida de alça
intestinal de animal no 4º dia após inoculação. Fonte: OLIVEIRA (2019).
64
Figura 14 Comparação entre diferentes lesões macroscópicas em intestinos de aves SPF inoculadas com estirpes de Arcobacter butzleri (A167 e A170).
Legenda: A: palidez no intestino de aves SPF inoculada com a estirpe A167 com
características de multiresistência à antimicrobianos (MDR). B: hiperemia e hemorragia no intestino
de ave SPF inoculada com a estirpe (A170) com características de elevado grau de virulência.
Fonte: OLIVEIRA (2019).
A análise bacteriológica foi realizada através da coleta das fezes dos
animais durante a vida e após o óbito de cada uma delas. Diariamente além da
coleta das fezes do fundo das gaiolas e diretamente do intestino das aves
eutanasiadas, coletou-se também fragmentos de fígado e baço para bacteriologia,
para verificar a invasibilidade das estirpes.
Foram coletados de todos os animais necropsiados fígado, baço, intestino,
inglúvio, proventrículo, pâncreas, tonsilas cecais e Bursa de Fabricius. Os
fragmentos dos tecidos foram separados para PCR e assim investigar a presença
do gênero Arcobacter. Porções de fígado, baço, pâncreas e intestino, foram
separados para histologia e análise imunológica (fígado, baço e tonsilas cecais).
O resisolamento de Arcobacter spp. só foi observado em uma das
repetições do grupo A167 (A. butzleri), a partir de fezes coletadas após 2 dias do
desafio. As demais amostras foram negativas. Do mesmo modo a PCR para o
gênero Arcobacter foi negativa, com exceção da segunda repetição com a estirpe
A167 no 4ºdia após desafio.
A B
65
A análise histológica foi realizada no Centro Veterinário de Anatomia
Patológica – CVAP. O controle negativo foi representado por uma ave eutanasiada
antes da inoculação experimental e uma ave eutanasiada no final do experimento.
Os animais dos grupos desafiados revelaram lesões mais intensas no 40
dia após a inoculação experimental.
Nenhuma amostra de fígado apresentou alterações com a inoculação de
Arcobacter. Em comparação com os controles negativos, os animais
apresentaram uma hepatite portal linfoplasmocítica multifocal discreta ou estavam
livre de alterações patológicas apreciáveis. Tais lesões podem ter desenvolvido
durante o transporte devido ao estresse.
O baço dos dois C- revelam estruturas morfológica preservadas e livre de
alterações dignas de nota. Observou-se que a estirpe A (A167), B (A170) (A.
butzleri) e D (A181) (A.cryaerophilus) apresentaram lesões compatíveis com
hiperplasia linfoide discreta. A análise microscópica da estirpe C (A178)
(A.butzleri) revela discreto aumento de celularidade de polpa branca, com
aproximação entre os folículos.
Os resultados da análise do intestino revelaram que o C- do dia 1
apresentava diminuição acentuada do comprimento das vilosidades, por vezes
associados à discreta fusão de vilos e discreto infiltrado inflamatório
linfoplasmocítico multifocal (Figura 15). A análise microscópica do C- do último dia
de experimento revela discreto infiltrado inflamatório composto por linfócitos e
plasmócitos, localizados em lâmina própria multifocal, contudo não revelam a
presença de colônias bacterianas semelhantes aos grupos experimentais (Figura
16).
A análise microscópica dos fragmentos de intestino das estirpe A167,
A,170, A178 (A. butzleri) e A181 (A. cryaerophilus) revelam lesões semelhantes de
inflamação nas criptas intestinais no qual apresentam discreto aumento de figuras
de mitose, dilatação focal com acúmulo de debris celulares, macrófagos e
espessamento dos vilos, devido à infiltração de linfócitos, plasmócitos e
heterófilos, além de macrófagos encontrados em região de lâmina própria.
Algumas vilosidades, apresentam achatamento, diminuição do
comprimento ou destruição das mesmas, além da observação de múltiplas
colônias bacterianas com unidades formadas por bacilos, sugestivos de
66
Arcobacter. A descrição específica de cada estirpe encontra-se na legenda das
fotos (Figura 17, 18, 19 e 20).
Figura 15 Intestino de ave não desafida (controle negativo) no dia 1
Legenda: Criptas intestinais do C- aviário do animal eutanasiado no dia 1. Diminuição acentuada
do comprimento das vilosidades e discreta inflamação. Coloração HE X 100 Fonte: OLIVEIRA
(2019).
Figura 16 Intestino de ave não desafiada (controle negativo) do dia 7 após desafio
Legenda: A estirpe A167 (A. butzleri) revela discreto infiltrado inflamatório composto por linfócitos e
plasmócitos, localizados em lâmina própria, mas sem a presença de agentes bacterianos.
Coloração HE X 100 Fonte: OLIVEIRA (2019).
67
Figura 17 - Intestino de ave desafiada com a estirpe A167 (A. butzleri), 4 dias após desafio
Legenda: Aumento de figuras de mitose, discreta dilatação focal de criptas devido ao acúmulo de
debris celulares e macrófagos, e moderado espessamento dos vilos devido à infiltração de
moderados linfócitos, plasmócitos e heterofilos, e discretos macrófagos encontrados em região de
lâmina própria. No lúmen observa-se conteúdo alimentar associado a múltiplas colônias
bacterianas com unidades formadas por bacilos. Coloração HE X 100 Fonte: OLIVEIRA (2019).
68
Figura 18 Intestino de ave desafiada com a estirpe A170 (A. butzleri), 4 dias após desafio
Legenda: A estirpe revela discreto aumento de figuras de mitose na região de criptas associados a
moderado espessamento dos vilos devido à infiltração de moderados linfócitos, plasmócitos,
macrófagos e heterofilos encontrados em região de lâmina própria. No lúmen observa-se conteúdo
alimentar associado a múltiplas colônias bacterianas com unidades formadas por bacilos.
Coloração HE X 100 Fonte: OLIVEIRA (2019).
69
Figura 19 Intestino de ave desafiada com a estirpe A178 (A. butzleri), 4 dias após desafio
Legenda: A estirpe A178 (A. butzleri) revela discreto aumento de figuras de mitose na região de
criptas e discreto espessamento dos vilos devido à infiltração de moderados linfócitos e
plasmócitos, discretos macrófagos e raros heterofilos em região de lâmina própria. Um dos
fragmentos apresentam vilosidades com achatamento e diminuição do comprimento, com apenas
remanescentes de criptas. No lúmen observa-se conteúdo alimentar associado a múltiplas colônias
bacterianas com unidades formadas por médios e longos bacilos. Coloração HE X 100 Fonte:
OLIVEIRA (2019)..
70
Figura 20 Intestino de ave desafiada com a estirpe A181 (A. cryaerophilus) 4 dias após desafio
Legenda: A estirpe A181 (A. cryaerophilus) revela infiltração de discretos linfócitos e plasmócitos,
discretos macrófagos em região de lamina própria distribuídos de forma multifocal. No lúmen
observa-se conteúdo alimentar associado a múltiplas colônias bacterianas com unidades formadas
por médios e longos bacilos. Coloração HE X 100 Fonte: OLIVEIRA (2019).
71
4.3.5 Quantificação das citocinas através da PCR em tempo real
Realizamos a quantificação de citocinas pela técnica de PCR em tempo
real de amostras de fígado, baço e tonsilas cecais dos grupos experimentais.
Nossos resultados não apresentaram expressão de beta actina, IL 1,
IL 10 e INF para fígado. Contudo para as tonsilas cecais e baço, houve expressão
das citocinas citadas e foram observadas algumas diferenças.
Realizou-se a análise de 7 indivíduos representativos de cada grupo para
verificar as diferenças de expressão de IL-1, IL-10 E INF em baço e tonsilas
cecais, utilizando a expressão gênica dos animais infectados e não infectados pelo
método 2-ΔΔCT.
Os resultados revelaram diferenças da expressão das citocinas IL 1 e IL 10.
em baço e tonsila cecal. A análise estatística inferencial foi conduzida com o
objetivo de comparar as distribuições de IL1, IL10 e INF segundo o tipo de tecido
(baço e tonsila cecal). Inicialmente, o teste de Kolgomorov-Smirnov foi realizado
buscando verificar aderência à distribuição Normal, de forma que não foi
observada Normalidade (p>0,05; α=0,05). Por esse motivo, optou-se pelo teste
não paramétrico de Wilkoxon, uma vez que as amostras são dependentes
(α=0,05) (Tabela 6)
Tabela 6 Análise comparativa entre os diferentes indivíduos desafiados com Arcobacter butzleri e Arcobater cryaerophilus.
Tipo de molécula Tecido Média
Desvio padrão Mediana
Intervalo interquartil Valor de p
IL1 Baço 0,95 0,25 0,98 0,42
0,028 Tonsila 0,25 0,76 0,60 1,58
IL10 Baço 0,00 0,42 0,20 0,80
0,018 Tonsila 0,43 0,48 0,56 0,67
INF Baço 0,50 0,32 0,30 0,65
0,398 Tonsila 0,57 0,29 0,50 0,43
Legenda: Comparação entre os diferentes indivíduos desafiados por Arcobacter butzleri e
Arcobacter cryarephilus a partir da média, desvio padrão, mediana e intervalo interquartil do total
dos tecidos analisados dos indivíduos selecionados. Os valores de p representam diferenças
significativas apenas entre IL 1 e IL 10. Fonte: OLIVEIRA (2019).
A partir dos dados coletados, foram obtidos os valores padronizados de
cada indivíduo para a confecção dos gráficos, que comparam as medidas de baço
e tonsila em 7 dias após desafio (D7).
72
Na figura 21 temos a comparação entre baço e tonsila dos animais
desafiados e analisadas a expressão de IL 1. Verifica-se que a reação
inflamatória nas tonsilas, representada pela citocina citada é elevada nos animais
até o dia 5 (D5). Já no baço, houve aumento da expressão apenas no D6 e D7,
sendo que a queda da expressão da IL1 nas tonsilas foram inversamente
proporcionais no mesmo período (D 6 e D7).
Figura 21 Distribuição da expressão de IL 1
Legenda: Distribuição da expressão de IL 1 de baço (barra azul) e tonsila cecal (barra verde) dos
animais desafiados com Arcobacter butzleri e Arcobacter cryarophilus em 7 dias (D1 - D7). Fonte:
OLIVEIRA (2019).
O fenômeno observado para IL 10, para os mesmos tecidos, revelou que a
citocina não foi representativa no D1 paras a tonsila, mas no baço houve
evidências de sinalização. Entretanto pode-se verificar que a IL10 tanto o baço
quanto a tonsila desde o D2 até D5, foram expressas positivamente, sendo que no
D2 e D3 os maiores valores foram da tonsila cecal e no D4 e D5 foram o do baço.
73
Em D6 e D7, IL10 de ambos os tecidos reduziram negativamente a expressão
(Figura 22).
Figura 22 Distribuição da expressão de IL 10.
Legenda: Distribuição da expressão de IL 10 de baço (barra azul) e tonsila cecal (barra verde) dos
aves desafiadas com Arcobacter butzleri e Arcobacter cryarophilus em 7 dias (D1 - D7). Fonte:
OLIVEIRA (2019).
Na análise de INF verificamos níveis negativos do D1 ao D4 do baço e no
D5 houve expressão. Para tonsilas verificamos níveis baixos no D2, mas no D1,
D3, D4 e D5 os níveis foram negativos. Apenas do D6 e D7 verificou-se aumento
de expressão dos tecidos testados para INF (Figura 23).
74
Figura 23 Distribuição da expressão de INF.
Legenda: Distribuição da expressão de INF de baço (barra azul) e tonsila cecal (barra verde) dos
animais desafiados com Arcobacter butzleri e Arcobacter cryarophilus em 7 dias (D1 - D7). Fonte:
OLIVEIRA (2019).
Todas as análises foram conduzidas com o auxílio do pacote estatístico
IBM SPSS v. 23.
4.5 DISCUSSÃO
Nos últimos anos, a ocorrência de infecções provocadas por Arcobacter,
vem aumentando significativamente em diversas situações de ambiente hospitalar,
sendo descritos casos de toxinfecções alimentares, diarreias, sepses, entre outras
manifestações clínicas. O isolamento e a identificação das espécies de Arcobacter
não fazem parte da rotina dos laboratórios clínicos; dessa forma, a real incidência
da infecção em humanos é subestimada (COLLADO; FIGUEIRAS, 2011; GOBBI
et al., 2018).
Os estudos do agente em questão na veterinária mostra o patógeno
presente no processo de doença em diferentes animais como bovinos e suínos, e
a busca pelo esclarecimento da relação patógeno e hospedeiro vem se
acentuando nos diferentes setores da Medicina humana e veterinária (HO et al.,
2006; MELLA et al., 2016). A presença deste patógeno em produtos de origem
animal representa um risco à saúde dos consumidores, sendo uma preocupação
para o setor de produção (OLIVEIRA et al, 2015).
Diante as análises fenotípicas das estripes, o teste de biofilme demonstrou
que das 12 estirpes analisadas, apenas uma estirpe apresentou padrão
moderado, com média de 0,926. As outras 11 estirpes apresentaram padrão fraco
com valores entre 0,444 ≥0,679. A capacidade de Arcobacter em aderir a
superfícies inertes e formar biofilme juntamente com a alta prevalência de
isolamento de Arcobacter spp. em equipamentos e instalações de abatedouros
torna o tema relevante, pois a presença do biofilme favorece a sobrevida do
agente, protegendo-o contra a ação de desinfetantes, aumentando as chances de
contaminação das carcaças (KJELDGAARD et al., 2009). Entretanto nosso índice
de biofilme foi abaixo do esperado.
O desenvolvimento de biofilme em tubulações de água em ambiente de
frigorífico, demonstra a capacidade de o agente resistir à diferentes desafios como
pressão das tubulações e a exposição à desinfetantes (ASSANTA et al., 2002).
Assim é possível também considerar que a presença de Arcobacter spp., ocorra
devido à alta concentração ou à falhas nos processos desinfecção do ambiente
(HAUSDORF et al., 2013).
75
76
Phillips & Bates (2004), relataram que 5% das estirpes testadas resistiam
no ambiente de aço inoxidável desinfetado com etanol. Rasmussen et al. (2013)
identificaram que 31/32 frigoríficos analisados estavam contaminados por A.
butzleri. Os autores determinaram a concentração inibitória mínima (CIM) do
hipoclorito de sódio e observaram uma sobrevida superior a 20 horas em uma
concentração de 0,2% do produto. Além disso, foi demonstrado que A. butzleri foi
capaz de formar biofilmes a 5ºC, bem como a 10ºC e 21ºC (KJELDGAARD et al.,
2009FERREIRA 2015).
Em trabalho realizado por Girbau et al. (2017), 9 (21,4%) dos 42 isolados
de Arcobacter butzleri foram capazes de formar biofilmes na superfície do placas
de microtitulação de poliestireno. A proporção de aderência não é tão grande
como a relatada por Ferreira et al. (2015), que sob as condições de microaerofilia,
26 dos 36 (72,2%) isolados analisados formaram biofilmes. Vinte e um (58,3%)
isolados foram categorizados como fracamente aderentes e cinco (13,9%) foram
incluídos na categoria de moderadamente aderente. Contudo quando estas
mesmas estirpes foram submetidas às condições aeróbicas, nenhum dos 36
isolados apresentaram capacidade de formação de biofilmes (FERREIRA et al.,
2015).
Um ponto de extrema importância para a compreensão da patogenia da
doença é verificar a capacidade de adesão e de expressão de toxinas do agente.
Estes estudos são frequentemente realizados in vitro, em culturas celulares de
HeLa com observação em 3h e células VERO com resultado em 24h. Os
resultados deste trabalho revelaram que tanto as estirpes de A. butzleri quanto as
de A. cryaerophilus possuem capacidade de aderir difusamente em células e são
produtoras de toxinas.
A carência de informações específicas sobre a patogenia das infecções
por Arcobacter spp. levou muitos autores a uma comparação com Campylobacter,
uma vez que estes microrganismos pertencem à mesma família e possuem
similaridades genéticas. A adesão às células epiteliais do trato gastrintestinal do
hospedeiro é um importante fator de colonização por Campylobacter jejuni. Esta
etapa é assegurada pela presença de genes de adesinas específicos como cadF e
cj1349 (KONKEL et al., 1999). A adesina cadF é requerida por C. jejuni para a
máxima aderência e invasão às células do epitélio intestinal do hospedeiro, a
77
aderência de cadF é o primeiro passo para a internalização bacteriana (KONKEL
et al., 2001). A ligação de cadF, promove a interação entre o patógeno e a célula
do hospedeiro, facilitando a colonização do microrganismo (KRAUSE-
GRUSZCZYNSKA et al., 2007).
Apesar da estreita relação entre o Arcobacter e o gênero Campylobacter,
existem algumas diferenças nos possíveis efeitos citotóxicos desses dois gêneros.
Em um trabalho que buscou analisar a expressão de virulência de estirpes
provenientes de água de rio, no qual foram utilizados células HeLa e de intestino
para testar adesão e invasão, apenas uma estirpe aderiu à células e a invasão
não foi observada. Todas as estirpes induziram efeitos citotóxicos nas células,
apresentando alongamento (MUSMANNO et al., 1997).
Alguns estudos demonstram que estirpes Campylobacter são capazes de
produzir uma toxina que é responsável pela hipertrofia e morte celular in vitro ,
contudo quando se compara os efeitos de Arcobacter spp., nenhuma atividade
distensora citoletal é observada (MUSMANNO et al., 1997). Nossos resultados
revelam padrões de fraca à moderada adesão, contudo todos apresentaram algum
efeito citoletal, como vacuolização, diferentemente da descrição realizada por
Musmanno et al. (1997).
Organismos como o V. cholerae e Helicobacter pylori produzem uma
citotoxina, conhecida como VacA, que induz a formação de vacúolos ácidos nos
citoplasmas de diferentes linhas celulares. Esses agentes já foram utilizados como
referência para reportar diferentes mecanismos de virulência de Arcobacter spp. e
a ação citoteletal pode ser explicada pela possível presença desta toxina
(VILLARRUEL-LOPEZ et al., 2003).
Nossos resultados não corroboram com o descrito e nossas estirpes
mostram uma heterogeneidade fenotípica quanto à capacidade de aderência,
variando de fraca à forte. Sobre os padrões de citotoxicidade, nossas estirpes
também apresentaram alterações variadas quanto aos efeitos citotóxicos e
alterações da morfologia do cultivo celular, revelando células com aspecto
alongado, arredondados e ainda a formação de vacúolos. Os resultados dos
testes fenotípicos de aderência e toxicidade das estirpes previamente
caracterizadas como portadoras de fatores de virulência confirmam o potencial de
patogenicidade.
78
Em um estudo realizado em Grigliasco (Itália), utilizou-se dois modelos de
células intestinais humanas in vitro, sendo uma produtora de muco (HT29 - MTX)
e outra não produtora de muco (HT29, Caco-2), no qual foram incubadas com uma
estirpe de Arcobacter butzleri. Em 90 min após a incubação, a estirpe apresentou
uma alta capacidade de colonização e adesão em HT29 – MTX e expressiva
invasão tanto em HT29–MTX quanto em Caco–2. Em um período de 24h, A.
butzleri, conseguiu atravessar a barreira epitelial de Caco-2, representando um
passo para a compreensão da patogenicidade do agente e sua importância para
explicar seu papel nas doenças gastrointestinais (BUZZANCA et al, 2019).
Com o objetivo de verificar a capacidade patogênica de Arcobacter spp. em
organismos vivos e determinar a expressão dos fatores de virulência previamente
detectados em teste de PCR e verificados in vitro em cultivo celular, optamos pela
utilização do modelo de alça ligada em coelho. A análise macroscópica revelou
hemorragia severa dos fragmentos inoculados. A microscópica dos fragmentos de
intestino delgado revelou que as estirpes de A. butzleri provocaram dilatação focal
de vasos linfáticos e no lúmen do órgão observou-se moderada quantidade de
hemácias. A. cryaerophilus também causou dilatação de vasos linfáticos, contudo
este estava associado às áreas focais de hemorragia com presença de infiltrado
inflamatório mista (linfócitos, plasmócitos e heterofilos, integros e degenerados). A
presença de células inflamatórias linfoplasmocíticas foi detectada também na
serosa adjacente a área de inoculação.
O potencial toxigênico de A. cryaerophilus foi demonstrado in vivo (ratos
Wistar adultos) por FERNANDEZ et al. (1995) que utilizaram sobrenadante de dois
isolados de A. cryaerophilus. Os autores observaram que o agente provocou
distensão do íleo e acúmulo de líquidos nas alças intestinais. Em pesquisa
realizada por CARTER (1996) foram testadas estirpes de A. butzleri em testes de
alça ligada em coelho e em suínos. Dos 60 coelhos testados 13% (8/60)
produziram fluído. O suíno também testado com a estirpe 4056, apresentou fluído
e todos os animais do experimento apresentaram infiltração leucocitária no
intestino (CARTER, 1996). Estes dados não corroboram com os nossos, pois
destaca-se a capacidade inflamatória e hemorrágica das estirpes de A. butzleri e
A. cryaerophilus testadas, com ausência acúmulo de fluído.
79
Em grande parte dos estudos, a interação de Arcobacter com os
hospedeiros é revelada como principal sinal clínico a diarreia aquosa, contudo em
2013, foi relatado um caso de um homem de 85 anos, com histórico de febre,
hipotensão, diarreia crônica e bacteremia. Através da amostra de sangue e uso de
16S, revelou como agente causador da doença Arcobacter butzleri. O paciente
internado fez uso de Vancomicina e Piperazilina- tazobendam e apresentou
melhora da bacteremia após 3 dias de tratamento (ARGUELLO et al., 2015). Estes
resultados comprovam que a capacidade de gerar estados de sepse através de
uma intensa inflamação, são características do agente. No teste de alça ligada o
efeito hemorrágico observado sugere uma capacidade de evolução o agente na
relação patógeno-hospedeiro para uma situação mais grave como a sepse.
Outros modelos animais têm sido empregados para elucidar a
patogenicidade e mecanismos de virulência de Arcobacter. O Zebra Fish (Danio
rerio) é um modelo de laboratório importante para estudos de toxicologia,
imunologia, câncer e doenças infecciosas (LU et al., 2015; ZHANG et al., 2016).
Em trabalho pioneiro realizado por AÇIK et al., (2016) foi verificada a
patogenicidade de A. butzleri, demonstrando alterações clínicas e patológicas no
Zebra Fish. A doença foi observada nos grupos de peixes infectados com o ID50
que apresentaram no exame histopatológico, inflamação aguda caracterizada por
neutrofilia, necrose e congestão focal de fígado, rim e baços. Os autores relataram
também a presença de peritonite, infiltração de leucócitos, atrofia de vilos e sepse
(AÇIK et al., 2016).
Em um estudo de revisão realizado na Nigéria, comparou o efeito
histopatológico de animais que apresentavam infecção por Arcobacter butzleri ou
Arcobacter cryareophilus (ADESIJI et al., 2014). Em ratos albinos desafiados com
A. butzleri que apresentavam diarreia e intensa inflamação, os animais revelaram
lesões intestinais de necrose, descamação, atrofia das vilosidades e hipertrofia de
células caliciformes, sendo que este último achado corresponde que os animais
apresentavam diarreias do tipo aquosas ou mucoide (ADESIJI et al., 2009).
Nossos achados histopatológicos das alças intestinais do coelho
apresentaram lesões diferentes das descritas no artigo citado anteriormente, visto
que nós observamos lesões de intensa hemorragia. O tempo de exposição ao
Arcobacter butzleri e a virulência do mesmo em nosso teste, são fatores que
80
devem ser considerados, pois em comparação com outras pesquisas tais variáveis
não foram descritas até o presente momento.
A microscopia eletrônica de varredura revelou que não há um padrão de
adesão definido para Arcobacter, mas auxiliou na comprovação da presença do
agente na mucosa intestinal e na destruição das criptas, descritas no estudo
histológico.
A interação de Arcobater com as aves revelaram perfis diferenciados
entre os grupos testados. Os animais não apresentaram severas manifestações
clínicas, apenas uma discreta diarreia pastosa. As aves foram mantidas por 7 dias
sob observação e nas necropsias realizadas diariamente, identificamos um padrão
de lesões de acordo com os grupos, sendo que no dia 4 foi revelado a maior
exacerbação de tais lesões intestinais
Na análise microscópica, observou-se que todos os grupos apresentaram
padrão de inflamação aguda com a presença tanto de polimorfonucleares, como
mononucleares. A lesão tecidual acompanhada de macrófagos, diminuição de
vilosidades e presença de bactérias na lâmina própria, comprova o poder de
invasão do agente. Estes efeitos foram observados também em pesquisa
realizada em Berlin, no qual em um período de 16 dias, observou-se lesões
macroscópicas e microscópicas em ratos. Os animais não tiveram qualquer
diferença de padrão macroscópico, mas o encurtamento de vilos e celularidade
indicativa de inflamação, também foram descritas pelos autores (HEIMISAAT et
al., 2015).
Na comparação dos animais desafiados e dos controles negativos diante
à verificação do gene B-actina, IFN alpha, IL1 e IL10, não houve diferenças
quantitativas. A análise das citocinas é apenas descritiva e observou-se diferenças
de expressão entre baço e tonsila para IL 1 e IL10.
A beta-actina, também conhecida como proteína "housekeeping", é
geralmente usada como controle uma vez que são consideradas proteínas
altamente conservadas e que estão envolvidas na motilidade, estrutura e
integridade das células (HANUKOGLU et al., 1983). IFN alpha é uma citocina pró-
inflamatória correlacionada com infecções virais, além de atuar na imunidade
inata, adquirida e controlar múltiplos efeitos fenotípicos (IMANISHI et al., 1994),
assim como a IL 1, que são liberadas a partir de inflamação intestinal . IL- 10 atua
81
como citocina anti-inflamatória que inibe a resposta de macrófagos e de citocinas
pró inflamatórias (COSTA PINTO; PALERMO – NETO, 2010).
Nossos dados não corroboram com o de GOLZ et al. (2015), quanto a
expressão das citocinas em tecidos extra intestinais. No trabalho citado foram
desafiados ratos com uma dose de 109 UFC de duas estirpes de A. butzleri:
isolada de um paciente com diarreia e outra isolada de carne de frango fresco.
Para análise da infecção foram coletados sangue cardíaco e amostras de tecido
de cólon, fígado e rim. A infecção por A. butzleri induziu não apenas respostas
imunes intestinais, mas também extra-intestinais e sistêmicas em camundongos.
Esses achados apontam para um potencial imunopatogênico de A. butzleri (GOLZ
et al., 2015).
Em trabalhos semelhantes desenvolvidos com Campylobacter jejuni, foi
verificado que existe um equilíbrio entre as atividades de citocinas para gerar uma
resposta imune em benefício do hospedeiro ou a sobrevivência da bactéria. A
produção de citocinas pró-inflamatórias como INF alpha, tem sido associada a
diferentes aspectos da virulência de C. jejuni, sendo que elas podem
desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento de uma reação para
controlar a infecção e provocar uma imunidade adaptativa. Eles também podem
desempenhar um papel na promoção de doenças extra-intestinais (AL-BANNA et
al., 2018).
Pode-se verificar que a expressão da citocinas inflamatórias IL-1,
importante na resposta anti humoral. De acordo com a literatura após lesões ou
infecções graves, a resposta exacerbada e persistente de citocinas Th1
(aumentam a resposta inflamatória) podem contribuir para lesões em órgão-alvo,
levando à insuficiência de múltiplos órgãos e à morte. A IL-1 é primariamente
produzida por macrófagos e monócitos, assim como por células não imunológicas,
tais como fibroblastos e células endoteliais ativadas durante lesão celular,
infecção, invasão e inflamação. São responsáveis também pela estimulação de
células CD4+ (VARELLA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2011).
Verificou-se também a expressão de IL-10 (facilitador de sinalização de
mastócitos) sendo tal citocina produzida principalmente por células CD8+ ativadas,
realizando a inibição da síntese de outras citocinas ou ainda diminuindo a função
citolítica e secretora de citocinas por Th1 (ex. IL-1) e facilitando o desenvolvimento
82
de respostas Th2 (VARELLA et al., 2001). Não houve resultados significativos
para INF.
Em nosso estudo não podemos relacionar os achados de IL-1 e IL10, pois
trata-se de uma pesquisa realizada em indivíduos, cujo objetivo foi verificar se
realmente os animais apresentaram reação inflamatório diante o desafio com
Arcobacter. Contudo verificou-se que existem diferenças entre os tecidos
analisados (baço e tonsila), no qual os animais de um modo geral tem maior
reação inflamatória nas tonsilas cecais, na comparação com o baço. Relação
esperada visto que o agente gerou lesões mais acentuadas em trato
gastrointestinal.
Em um estudo realizado com ratos gnobióticos, desafiados com
Escherichia coli, Campylobacter jejuni e Arcobacter butzleri, e testados para as
citocinas IFN-γ, TNF, IL-6 e MCP-1, verificou-se que A. butzleri induzem a
resposta pró-inflamatória de forma menos distinta em comparação com C. jejuni,
contudo as respostas imunes locais e sistêmicas são mais evidentes se
comparadas com E. coli. Assim, os dados apontam para que A. butzleri é mais do
que um comensal em hospedeiros vertebrados, indicando seu potencial
patogênico (GOLZ et al., 2016).
A alta produtividade da avicultura brasileira se deve aos avanços nas áreas
de genética, sanidade e nutrição. Este desenvolvimento tecnológico permitiu que
as redes de distribuição de produtos de origem animal se expandissem. Contudo
tornaram-se mais centralizadas e complexas, afetando as características
epidemiológicas dos surtos e introduzindo novos desafios sanitários, possibilitando
a contaminação cruzada e a emergência de novos patógenos (BELUSSO;
HESPANHOL, 2010). A presença de certas espécies de bactérias do gênero
Arcobacter spp. em alimentos de origem animal pode representar um perigo
biológico para os consumidores, em determinadas circunstâncias que favorecem a
ocorrência de infecções alimentares. Embora o potencial do agente em causar
doenças de transmissão alimentar seja conhecido, existem poucos estudos de
patogenia envolvendo este gênero bacteriano no Brasil (NEUBAUER; HESS,
2006).
83
Os dados deste estudo confirmam a patogenicidade das estirpes
isoladas, contudo os estudos de interação do patógeno com grupos experimentais
desafiados e submetidos em diferentes tempos e concentrações de inóculo podem
contribuir para melhores esclarecimentos e contribuição científica sobre
Arcobacter.
84
5 CONCLUSÔES
✔ Os dados obtidos no presente estudo sugerem que Arcobacter spp. é mais
do que um comensal em hospedeiros vertebrados, indicando o potencial
patogênico dessas bactérias.
✔ Os dados dos perfis de resistência reforçam que estratégias de controle são
necessárias para impedir a transmissão estirpes resistentes, assim como a
possibilidade da transmissão de seus genes para outros agentes, que
podem causar infecções humanas, principalmente pelo consumo de carne
de frango contaminadas, sendo esse um reservatório subestimado.
✔ A determinação da suscetibilidade antimicrobiana pelo MIC revelou
resistência à determinadas classes de antibióticos, como lincosamidas e
quinolonas, sendo necessária atenção especial pois o uso de ambas as
classes são compartilhadas tanto na Medicina quanto na Medicina
Veterinária.
✔ O fato de não termos encontrado genes de resistência na PCR,é um indício
que a sequência de alelos pode ser diferente dos primers utilizados, uma
vez que não tínhamos nenhum primer desenhado diretamente para
Arcobacter, mas sim para Campylobacter.
✔ Os ensaios in vitro demonstraram baixa capacidade das estirpes em formar
biofilme, apontando uma fragilidade de sobrevivência do agente no
ambiente.
✔ As estirpes revelaram capacidade de aderir em células e produzir toxinas, o
que ressalta a possibilidade de ocorrência de lesões decorrentes da
interação patógeno-hospedeiro.
✔ No teste de alça ligada as estirpes provocaram intensa inflamação e lesões
hemorrágicas. Esse resultado se diferencia dos descritos na literatura que
associa o agente aos quadros de diarreia aquosa.
✔ As aves apresentaram manifestações clínicas brandas com
comprometimento da saúde intestinal após o desafio com dose elevada
(109 UFC/mL). Na análise histológica verificou-se a presença de intensa
inflamação com diminuição de vilosidades do intestino delgado e grosso.
85
Para verificação de outros efeitos macro e microscópicos seria necessário
outras repetições com variação de tempo e quantidade de inóculo.
✔ A resposta imunológica foi feita de forma descritiva com observação de
apenas alguns indivíduos representativos de cada grupo experimental de
aves. Foram observadas diferenças de expressão para IL 1 e IL10 em baço
e tonsilas cecais. A presença desta citocina indica que houve um processo
inflamatório de caráter agudo e auxilia na explicação da destruição de
criptas intestinais nos animais.
✔ Os dados obtidos neste estudo apontam que A. butzleri e A. cryaerophilus
são patógenos que podem comprometer a saúde intestinal das aves,
causando manifestações clínicas leves, com inflamação intestinal e
ativação da resposta imunológica do hospedeiro.
✔ A interação destes patógenos com hospedeiros mamíferos sugere a
possibilidade de ocorrência de doença intestinal grave, e reforça o risco
zoonótico destas estirpes.
86
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