Maria Machado

CRISTINA MARIA MONTEIRO MACHADO

DDEESSEENNVVOOLLVVIIMMEENNTTOO DDEE BBIIOOPPRROOCCEESSSSOO PPAARRAA PPRROODDUUÇÇÃÃOO DDEE

HHOORRMMÔÔNNIIOO VVEEGGEETTAALL ((ÁÁCCIIDDOO GGIIBBEERRÉÉLLIICCOO –– GGAA33)) PPOORR

FFEERRMMEENNTTAAÇÇÃÃOO NNOO EESSTTAADDOO SSÓÓLLIIDDOO EEMM RREESSÍÍDDUUOOSS

AAGGRROOIINNDDUUSSTTRRIIAAIISS BBRRAASSIILLEEIIRROOSS:: RREELLAAÇÇÃÃOO DDAA PPRROODDUUÇÇÃÃOO

DDEE GGAA33 EEMM BBIIOORRRREEAATTOORR PPIILLOOTTOO EE BBIIOOEENNSSAAIIOOSS EEMM MMUUDDAASS

DDEE TTOOMMAATTEEIIRROO ((LLyyccooppeerrssiiccuumm eessccuulleennttuumm))

Tese aprovada como requisito parcial àobtenção do título de Doutor no Curso deDoutorado em Processo Biotecnológicos,área de concentração Agroindústria, daUniversidade Federal do Paraná.

Orientador: Dr. Carlos Ricardo Soccol

CURITIBA2002

CRISTINA MARIA MONTEIRO MACHADO

DDEESSEENNVVOOLLVVIIMMEENNTTOO DDEE BBIIOOPPRROOCCEESSSSOO PPAARRAA PPRROODDUUÇÇÃÃOO DDEE

HHOORRMMÔÔNNIIOO VVEEGGEETTAALL ((ÁÁCCIIDDOO GGIIBBEERRÉÉLLIICCOO –– GGAA33)) PPOORR

FFEERRMMEENNTTAAÇÇÃÃOO NNOO EESSTTAADDOO SSÓÓLLIIDDOO EEMM RREESSÍÍDDUUOOSS

AAGGRROOIINNDDUUSSTTRRIIAAIISS BBRRAASSIILLEEIIRROOSS:: RREELLAAÇÇÃÃOO DDAA PPRROODDUUÇÇÃÃOO

DDEE GGAA33 EEMM BBIIOORRRREEAATTOORR PPIILLOOTTOO EE BBIIOOEENNSSAAIIOOSS EEMM MMUUDDAASS

DDEE TTOOMMAATTEEIIRROO ((LLyyccooppeerrssiiccuumm eessccuulleennttuumm))

CURITIBA2002

i

Ao Fred, com todo meu amor

ii

AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS

Ao Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol, pela dedicação e orientação científica e

profissional nos últimos seis anos.

Aos professores Dr. Carlos Gontarski, Dr. Eduardo Dechechi, Dr. Flávio Faria de

Moraes, Dra. Luciana Vandenberghe e Dra. Maria Helena Santana, pela participação na

banca de avaliação deste trabalho e sugestões para o aprimoramento do mesmo.

Á Embrapa Hortaliças, na figura de seu chefe geral Dr. Ruy Rezende Fontes pela

compreensão da importância do término deste trabalho. Ao Chefe Adjunto de Pesquisa e

Desenvolvimento Dr. Welington Pereira, ao pesquisador Dr. Warley Marcos Nascimento e ao

técnico do laboratório de sementes Karlão, pelas sugestões e auxílio no experimento de

bioensaios com o produto fermentado.

Aos amigos do Laboratório de Processos Biotecnológicos, pelas experiências

compartilhadas e incentivo recebido. Aos novos amigos da Embrapa Hortaliças, pela

disponibilidade a ajudar em qualquer situação que se fizesse necessária.

À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), à

Universidade Federal do Paraná e à EMBRAPA pelo auxílio financeiro e recursos materiais

disponibilizados.

E finalmente, aos meus pais, sogros, irmãs, sobrinhos e cunhados, pelas orações,

hospedagens e constante estímulo, mesmo à distância. Amo vocês!

iii

SSUUMMÁÁRRIIOO

AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................................ii

SUMÁRIO............................................................................................................................................................. iii

LISTA DE QUADROS ..........................................................................................................................................vi

LISTA DE TABELAS............................................................................................................................................vi

LISTA DE FIGURAS............................................................................................................................................vii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS......................................................................................iix

RESUMO................................................................................................................................................................xi

ABSTRACT ..........................................................................................................................................................xii

INTRODUÇÃO.......................................................................................................................................................1

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................................................4

1. ÁCIDO GIBERÉLICO....................................................................................................................................4

1.1 HISTÓRICO..................................................................................................................................................4

1.2 PROPRIEDADES FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS ......................................................................................51.2.1 Interações com plantas ......................................................................................................................61.2.2 Interações com o microrganismo produtor ........................................................................................61.2.3 Utilização comercial e potencial .......................................................................................................7

1.3 EFEITOS FISIOLÓGICOS DE GIBERELINAS EXÓGENAS NAS PLANTAS.............................................................71.3.1 Floração.............................................................................................................................................71.3.2 Expressão sexual ...............................................................................................................................71.3.3 Partenocarpia.....................................................................................................................................81.3.4 Senescência e abcisão........................................................................................................................81.3.5 Germinação e quebra de dormência ..................................................................................................81.3.6 Crescimento.......................................................................................................................................8

1.4 PROCESSOS DE PRODUÇÃO..........................................................................................................................91.4.1 Fermentação em superfície líquida....................................................................................................91.4.2 Fermentação Submersa......................................................................................................................91.4.3 Outros tipos de fermentação............................................................................................................10

1.5 GIBBERELLA FUJIKUROI............................................................................................................................10

1.6 ROTAS DE BIOSSÍNTESE ............................................................................................................................11

1.7 FISIOLOGIA DA FORMAÇÃO DE GA3 NO PROCESSO FERMENTATIVO ..........................................................13

1.8 CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO.................................................................................................................141.8.1 Razão C:N .......................................................................................................................................141.8.2 Sais minerais e elementos-traço ......................................................................................................151.8.3 pH....................................................................................................................................................151.8.4 Temperatura ....................................................................................................................................161.8.5 Aeração ...........................................................................................................................................16

1.9 ANÁLISE DE GIBERELINAS ........................................................................................................................16

2. FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO ..................................................................................................17

2.1 APLICAÇÕES ATUAIS E FUTURAS...............................................................................................................18

2.2 MICRORGANISMOS E SUBSTRATOS............................................................................................................19

iv

2.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DA FES........................................................................................................21

2.4 ESTIMATIVA DA BIOMASSA.......................................................................................................................212.4.1 Estimativa direta.............................................................................................................................222.4.2 Componentes da biomassa ..............................................................................................................222.4.3 Medida metabólica da biomassa......................................................................................................22

2.5 FES EM COLUNAS AERADAS .....................................................................................................................23

2.6 FES EM BIORREATORES EM ESCALA PILOTO .............................................................................................24

2.7 CÁLCULOS CINÉTICOS ..............................................................................................................................24

2.8 CÁLCULOS RESPIROMÉTRICOS ..................................................................................................................27

3. SUBSTRATOS .............................................................................................................................................31

3.1 CAFÉ ........................................................................................................................................................313.1.1 Panorama da produção ....................................................................................................................323.1.2 Processamento do café ....................................................................................................................333.1.3 Casca de café...................................................................................................................................34

3.1.3.1 Potenciais utilizações............................................................................................................................. 35

4. MANDIOCA.................................................................................................................................................36

4.1.1 Panorama da produção ....................................................................................................................384.1.2 Processamento da mandioca............................................................................................................384.1.3 Bagaço de mandioca........................................................................................................................39

4.1.3.1 Utilizações potenciais ............................................................................................................................ 40

MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................................................41

5. MICRORGANISMO E SUBSTRATOS.......................................................................................................41

5.1 MICRORGANISMO .....................................................................................................................................41

5.2 SUBSTRATOS ............................................................................................................................................42

6. ANÁLISES DO FERMENTADO.................................................................................................................42

7. PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA..........................................................43

7.1 SISTEMA DE FERMENTAÇÃO .....................................................................................................................44

7.2 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA..............................................447.2.1 Primeira otimização em colunas aeradas.........................................................................................457.2.2 Segunda otimização em colunas aeradas.........................................................................................457.2.3 Terceira otimização em colunas aeradas .........................................................................................45


7.4 RESPIROMETRIA .......................................................................................................................................47

7.5 CORRELAÇÃO ENTRE A BIOMASSA E O CO2 PRODUZIDO ...........................................................................48

8. PRODUÇÃO DE GA3 EM REATOR ESCALA PILOTO ...........................................................................48

8.1 SISTEMA DE FERMENTAÇÃO .....................................................................................................................49

8.2 CONDIÇÕES ESTUDADAS ..........................................................................................................................508.2.1 Fermentação em batelada com condições semelhantes à coluna aerada .........................................508.2.2 Fermentação em batelada-alimentada .............................................................................................508.2.3 Fermentação em batelada com aeração baixa..................................................................................50


8.4 RESPIROMETRIA .......................................................................................................................................51

8.5 CORRELAÇÃO ENTRE A BIOMASSA E O CO2 PRODUZIDO ...........................................................................51

9. BIOENSAIOS COM O METABÓLITO PRODUZIDO...............................................................................51

9.1 INIBIÇÃO DO GA3 ENDÓGENO ...................................................................................................................51

v

9.2 BIOENSAIO................................................................................................................................................52

RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................................................................53

10. PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA..........................................................53

10.1 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO ....................................................................................................................5310.1.1 Primeira otimização em colunas aeradas.........................................................................................5410.1.2 Segunda otimização em colunas aeradas.........................................................................................5710.1.3 Terceira otimização em colunas aeradas .........................................................................................58

10.2 CINÉTICA DA PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA...................................................6010.2.1 Fases da evolução da biomassa .......................................................................................................6210.2.2 Consumo de substrato .....................................................................................................................6310.2.3 Produção de ácido giberélico ..........................................................................................................64

10.3 RESPIROMETRIA .......................................................................................................................................6510.3.1 Modelagem matemática da produção de biomassa .........................................................................6610.3.2 Correlação entre biomassa e produção de CO2................................................................................6710.3.3 Cálculos cinéticos com a biomassa estimada ..................................................................................68

11. PRODUÇÃO DE GA3 EM REATOR AERADO ESCALA PILOTO..........................................................70

11.1 PRODUÇÃO EM CONDIÇÕES SEMELHANTES ÀS COLUNAS AERADAS...........................................................7011.1.1 Cinética da produção de GA3 ..........................................................................................................70

11.1.1.1 Produção de biomassa ........................................................................................................................... 7111.1.1.2 Produção de ácido giberélico ............................................................................................................... 72

11.1.2 Correlação entre biomassa e produção de CO2................................................................................7211.1.2.1 Modelagem matemática da produção de biomassa ........................................................................... 7311.1.2.2 Correlação entre biomassa e produção de CO2.................................................................................. 73

11.2 PRODUÇÃO EM BATELADA-ALIMENTADA (FED-BATCH)............................................................................7411.2.1 Cálculos respirométricos e cinéticos ...............................................................................................75

11.2.1.1 Produção de biomassa ........................................................................................................................... 7511.2.2 Produção de ácido giberélico ..........................................................................................................76

11.3 FERMENTAÇÃO COM AERAÇÃO BAIXA ......................................................................................................7711.3.1 Cálculos respirométricos e cinético.................................................................................................78

11.3.1.1 Produção de biomassa ........................................................................................................................... 7811.3.2 Produção de ácido giberélico ..........................................................................................................79

12. COMPARAÇÃO ENTRE OS SISTEMAS ESTUDADOS ..........................................................................80

12.1 CO2 ACUMULADO .....................................................................................................................................80

12.2 BIOMASSA ESTIMADA ...............................................................................................................................81

12.3 PRODUÇÃO DE GA3 ..................................................................................................................................82

13. ENSAIOS BIOLÓGICOS COM O EXTRATO............................................................................................83

CONCLUSÃO.......................................................................................................................................................86

SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS.......................................................................................................88

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................................................89

vi

LLIISSTTAA DDEE QQUUAADDRROOSS

QUADRO 1 - Algumas das maiores aplicações das GA3 .................................................................7

QUADRO 2 - Alguns dos usos potenciais importantes do GA3 .........................................................7

QUADRO 3 - Fermentações alternativas para produção de GA3 .....................................................10

QUADRO 4 - aplicações de FES em diferentes setores econômicos ................................................19

QUADRO 5 - Diferentes resíduos agroindustriais utilizados em FES...............................................20

QUADRO 6 - Produção de ácido giberélico em colunas aeradas .....................................................24

QUADRO 7 - Processos fermentativos utilizando bagaço de mandioca ............................................40

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Composição química média de partes do café (em base seca). ..............................................35

TABELA 2 - Composição mineral da polpa de café..............................................................................36

TABELA 3 - Compostos antifisiológicos da polpa de café .....................................................................36

TABELA 4 - Composição média de raízes de mandioca (em base de 100 g) ..............................................37

TABELA 5 - Composição fisico-química do bagaço de mandioca ...........................................................39

TABELA 6 - Condições de fermentação – primeira otimização...............................................................45

TABELA 7 - Condições de fermentação – segunda otimização ...............................................................45

TABELA 8 - Condições de fermentação – terceira otimização ................................................................46

TABELA 9 - Anova da primeira otimização em colunas, 3(2-0) ................................................................56

TABELA 10 - Anova da segunda otimização em colunas, 3(2-0)...............................................................58

TABELA 11 - Anova da terceira otimização em colunas, 3(2-0)................................................................60

TABELA 12 - Parâmetros cinéticos na FES para produção de GA3..........................................................61





TABELA 17 - Resultados de peso seco das mudas de tomateiro..............................................................84

vii

LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS

FIGURA 1 - Fórmula estrutural do ent-giberelano .................................................................................4

FIGURA 2 - Fórmula estrutural do ácido giberélico ...............................................................................6

FIGURA 3 - Esquema da biossíntese de GA12 – aldeído a partir da acetil coenzima ...................................12

FIGURA 4 - Corte longitudinal de uma cereja de café (C. arabica).........................................................32

FIGURA 5 - Maiores produtores mundiais de café, safra de 2001/02.......................................................32

FIGURA 6 - Esquema das principais etapas do beneficiamento do café ....................................................34

FIGURA 7 - Planta de mandioca ......................................................................................................37

FIGURA 8 - Principais países produtores de mandioca (safra de 1998)....................................................38

FIGURA 9 - Fluxograma de processamento de raízes de mandioca .........................................................39

FIGURA 10 - Esquema da produção de inóculo para fermentação ..........................................................41

FIGURA 11 - Extração e análise do ácido giberélico............................................................................43

FIGURA 12 - Esquema do sistema de fermentação em colunas de aeração forçada com respirometria utilizado

neste trabalho ........................................................................................................................44

FIGURA 13 - Fotografia do biorreator em escala piloto utilizado nos experimentos ...................................49

FIGURA 14 - Desenho esquemático do funcionamento do biorreator com respirometria ............................50

FIGURA 15 - Caixas teste com as mudas de tomateiro .........................................................................52

FIGURA 16 - Diagrama de Pareto, primeira otimização em colunas, 3(2-0) ................................................55

FIGURA 17 - Contorno de Resposta, primeira otimização em colunas, 3(2-0) .............................................55

FIGURA 18 - Diagrama de Pareto, segunda otimização em colunas, 3(2-0) ................................................57

FIGURA 19 - Contorno de Resposta, segunda otimização em colunas, 3(2-0) .............................................58

FIGURA 20 - Diagrama de Pareto, terceira otimização em colunas, 3(2-0) .................................................59

FIGURA 21 - Contorno de Resposta, terceira otimização em colunas, 3(2-0) ..............................................60

FIGURA 22 - Fases da evolução da biomassa .....................................................................................62

FIGURA 23 - Evolução dos carboidratos ao longo da fermentação .........................................................63

FIGURA 24 - Produção de ácido giberélico .......................................................................................64

FIGURA 25 - Biomassa estimada a partir do CO2 acumulado e experimental............................................68

FIGURA 26 - Fases de evolução da biomassa .....................................................................................69



FIGURA 29 - Biomassa estimada a partir do CO2 acumulado e experimental............................................74


viii




FIGURA 34 - CO2 acumulado em colunas e reator ..............................................................................80

FIGURA 35 - CO2 acumulado em reator nos diferentes sistemas estudados ..............................................81

FIGURA 36 - Biomassa estimada nos diferentes sistemas estudados .......................................................82

FIGURA 37 - Produção de GA3 nos diferentes sistemas estudados .........................................................82

FIGURA 38 - Resultado após 4 dias da aplicação de GA3 .....................................................................83

FIGURA 39 - Médias de comprimento das mudas de tomateiro..............................................................84

FIGURA 40 - Peso seco da raiz e parte aérea dos tratamentos ................................................................84

ix

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS,, SSIIGGLLAASS EE SSÍÍMMBBOOLLOOSS

µ: taxa de crescimento específico

µmax: taxa máxima de crescimento específico

(NH4)2SO4: sulfato de amônia

ABECAFÉ: Associação Brasileira dos Exportadores de Café

ABIC: Associação Brasileira da Indústria do Café

ANOVA: análise de variância

atm: atmosfera

aw: atividade de água

CLAE: cromatografia líquida de alta eficiência

CNTP: condições normais de temperatura e pressão

CO2acum: gás carbônico acumulado

CoA: coenzima A

EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

EUA: Estados Unidos da América

FAO: Food and Agriculture Organization of United Nations

Fcorr: fluxo de ar corrigido na saída do fermentador

Fe: fluxo na entrada do fermentador

FES: fermentação no estado sólido

FeSO4: sulfato de ferro

Fs: fluxo de ar na saída do fermentador

FSm: fermentação submersa

GA3: ácido giberélico

GA: giberelina

GGPP: geranilgeranilpirofosfato

H2O: água

IAL: Instituto Adolfo Lutz

IAPAR: Instituto Agronômico do Paraná

ICI: Imperial Chemistry Industries

KOH: hidróxido de potássio

L: interação linear

x

MR: marca registrada

MS: matéria seca

P: quantidade de produto

PDA: ágar batata dextrose

ppm: partes por milhão

Q: interação quadrática

Qr: coeficiente respirométrico

Rf: relação de frente

rpm: rotações por minuto

S: quantidade de substrato

SEAB: Secretaria do Abastecimento do Estado do Paraná

T: temperatura

t: tempo

TECPAR: Instituto de Tecnologia do Paraná

UFPR: Universidade Federal do Paraná

US$: dólares americanos

X: quantidade de biomassa

YP/S: rendimento produto/substrato consumido

YP/X: rendimento produto/biomassa

YX/S: rendimento biomassa/substrato consumido

xi

RREESSUUMMOO

A casca de café e o bagaço de mandioca são resíduos agroindustriais muito abundantes no Brasil econstituem um grave problema ambiental para este país. Por sua rica composição, estes resíduosconstituem-se de substratos potenciais para a produção de inúmeros bioprodutos celulares de interessecomercial. Neste trabalho comprovou-se a possibilidade de se produzir a baixos custos um metabólitode alto valor agregado com eficiência similar ao produto comercial importado, aproveitando osresíduos agroindustriais acima citados. O ácido giberélico (GA3) é um hormônio natural em plantas eimportante promotor e regulador de seu crescimento. É produzido comercialmente apenas por grandesindústrias multinacionais por fermentação submersa, com altos custos de produção e valor de venda. Atécnica de fermentação no estado sólido (FES) é conhecida pela produção de metabólitos na maioriados casos em níveis muito maiores que a fermentação submersa. Além disso, é caracterizada porprocessos de custos menores, uma vez que possibilita o aproveitamento de resíduos agroindustriais.Neste trabalho foram estudados diferentes sistemas para a produção de GA3 por FES do fungoGibberella fujikuroi em um substrato misto constituído de casca de café e bagaço de mandioca, numarazão 7:3. Em colunas de aeração forçada atingiu-se uma produção de 0,925 g GA3.(kg MS)-1 após seisdias de fermentação, com uma aeração nas primeiras 72 h de 0,24 l ar.h-1.(g MS)-1 e após este períodode 0,72 l ar.h-1.(g MS)-1. A partir da respirometria do processo foi possível determinar-se umacorrelação logarítmica entre o CO2 e a biomassa produzidos ao longo da fermentação. Uma correlaçãosemelhante foi obtida na fermentação no reator em escala piloto. Neste sistema atingiu-se umaprodução de 1,19 g GA3.(kg MS)-1 após cinco dias de fermentação, utilizando-se o mesmo substrato,com umidade e pH iniciais de 77% e 5,2, respectivamente, e vazão de ar inicial de 0,12 l ar.h-1.(g MS)-

1, e após três dias, de 0,48 l ar.h-1.(g MS)-1. Fez-se um bioensaio em mudas de tomateiro paracomparação da eficiência do GA3 produzido por FES e o produto comercial. Não foi constatadadiferença significativa na altura das mudas após quatro e oito dias de aplicação.

Palavras-chave: ácido giberélico, fermentação no estado sólido, casca de café, bagaço de mandioca,respirometria

xii

AABBSSTTRRAACCTT

Coffee husk and cassava bagasse are two of the most important byproducts of Brazilian agricultureindustrialization and constitute an environmental problem for this country. Because of its richcomposition they are potential substrates for the production of many cellular bioproducts ofcommercial interest. In this work, it was proved that is possible to produce, at low cost, a high valuedmetabolite as efficient as the commercial imported product. The gibberellic acid (GA3) is a naturalplant growth hormone used extensively in agriculture, nurseries, greenhouses, viticulture etc. It istraditionally produced by multinational industries using submerged fermentation process, with highproduction costs and prices. The solid-state fermentation (SSF) technique has shown economicadvantages over the submerged fermentation for the production of microbial metabolites. In addition,SSF is known for its cheaper processes and the possibility of using agroindustrial residues. In thiswork, different fermentative systems were studied for the production of GA3 by SSF of the fungusGibberella fujikuroi, using a mixture of coffee husk and cassava bagasse as substrate. In airedcolumns, a production of 0.925 g GA3.(kg substrate)-1 was achieved after 6 days of fermentation, withan aeration rate of 0.24 l air.h-1.(g substrate)-1, in the first three days, and of 0.72 l air.h-1.(g substrate)-1

in the remaining period. With the respirometric data, a logarithmic correlation between CO2 andbiomass production was determined. The pilot-scale bioreactor yielded the same kind of correlation.This system showed the best results, reaching 1.19 g GA3.(kg substrate)-1, with an initial moisture of77% and pH 5.4. Initial air flow was 0.12 l air.h-1.(g substrate)-1, and after three days, 0.48 l air.h-1.(gsubstrate)-1. A bioassay using tomato seedlings was carried out in order to compare the GA3 producedby SSF to the commercial product. No significant difference in the height of the seedlings wasobserved.

Key-words: gibberellic acid, solid state fermentation, coffee husk, cassava bagasse, respirometry

1

IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

O ácido giberélico (GA3) é um hormônio natural em plantas e importante promotor e

regulador de seu crescimento. Nos últimos anos este metabólito tem sido produzido apenas

por grandes indústrias multinacionais pelo processo de fermentação submersa (FSm), com

alto custo de produção (KUMAR & LONSANE, 1989). Assim, apesar de possuir um grande

número de aplicações, sua utilização ainda é limitada principalmente por seu preço (US$ 1 a

3/grama dependendo da pureza e potência). A redução deste valor levará suas diversas

aplicações a uma utilização mais extensa trazendo benefícios econômicos à agricultura. Uma

possibilidade de diminuição dos custos está na pesquisa de novas técnicas de fermentação.

A técnica de fermentação no estado sólido (FES) é conhecida pela produção de

metabólitos na maioria dos casos em níveis muito maiores que a fermentação submersa. Além

disso, é caracterizada por processos mais baratos, além da possibilidade de aproveitamento de

resíduos agro-industriais. De fato, nos últimos anos estudos deram origem a uma série de

novos processos, bem como muitas publicações científicas demonstrando as vantagens desse

método de fermentação, especialmente quando se trabalha com fungos filamentosos

(SOCCOL, 1997a, 1997b; SOCCOL & VANDENBERGHE, 2002).

O Brasil é o maior produtor mundial de café, tendo produzido na safra 2001/02, 33,7

milhões de sacas (ABECAFÉ, 2002). A casca de café é o principal resíduo de seu

processamento, representando cerca de 50% em massa do mesmo. Esse resíduo, praticamente

não é aproveitado, sendo deixado em pilhas perto das fazendas e causando um grande

problema ambiental. Uma possibilidade de aproveitamento da casca de café é como meio de

cultivo para microrganismos, na produção de diferentes metabólitos ou biomassa (SOARES,

1998; LEIFA, 1999; WOICIECHOWSKI, 1999; SOCCOL, 2002).

A mandioca constitui um dos principais alimentos energéticos para cerca de 500

milhões de pessoas sobretudo nos países em desenvolvimento. Além da destacada

importância na alimentação humana e animal, as raízes de mandioca são também utilizadas

como matéria-prima em inúmeros produtos industriais (EMBRAPA, 2002). O bagaço de

mandioca é um dos resíduos de seu processamento e possui atualmente poucas aplicações. Por

sua composição (contém entre 40 e 70% de amido), constitui-se um substrato interessante

para processos fermentativos, tendo sido estudado para produção de ácido cítrico, ácido

fumárico, aromas, cogumelos, entre outros produtos (BEUX, 1996; BRAMORSKI et al.,

2

1998a; MEDEIROS, 1998; CARTA, et al., 1999; PANDEY et al., 2000; SOCCOL &

VANDENBERGHE, 2002.

Em trabalhos anteriores, (MACHADO et al., 2002; MACHADO et al., 2001;

MACHADO, 2000) demonstrou-se que a mistura de casca de café e bagaço de mandioca é

uma alternativa viável para a produção de GA3 por FES utilizando-se o fungo Gibberella

fujikuroi LPB-06. A tecnologia desenvolvida empregando frasco erlenmeyer como biorreator

alcançou bons resultados, tendo inclusive, sido patenteada pelos autores (SOCCOL et al.,

2000).

A melhor produção alcançada foi de 494,3 mg GA3kg-1substrato, utilizando-se como

substrato uma mistura de bagaço de mandioca e casca de café pré-tratada em proporção 3:7,

adicionada de solução salina constituída de 30 mg FeSO4 e 10 mg de (NH4)2SO4/100 ml de

H2O. As condições de fermentação foram temperatura 29 ºC, pH 5,3 e umidade de 77%

(MACHADO, 2000; SOCCOL et al., 2000).

Uma vez que a produção de GA3 apresentada foi a maior encontrada na literatura para

FES conduzida em frascos erlenmeyer e que os substratos utilizados são resíduos agro-

industriais abundantes no país, considerou-se de grande importância que houvesse

continuidade no trabalho desenvolvido.

Esta tese trata, portanto, do estudo da produção de GA3 por FES em biorreatores de

colunas aeradas em escala de laboratório (20 g substrato/coluna) e em biorreator escala piloto

(3 kg substrato). Também são feitos estudos cinéticos e respirométricos do processo em

diferentes sistemas fermentativos e bioensaios com o produto obtido, para comprovação de

sua eficiência.

3

OBJETIVO GERAL

Estudo da produção de ácido giberélico em diferentes sistemas fermentativos,

utilizando-se o fungo Gibberella fujikuroi, num processo de fermentação no estado sólido

(FES), empregando-se a mistura casca de café – bagaço de mandioca como substrato.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Otimização do processo de fermentação no estado sólido em colunas de aeração

forçada, a partir das condições utilizadas em frasco erlenmeyer (MACHADO,

2000) variando-se aeração e umidade inicial do meio de cultivo;

b) Determinação da cinética de crescimento microbiano a partir de cálculos cinéticos

e de respirometria do processo otimizado, comparando-o com dados existentes para

Fermentação Submersa e FES com diferentes substratos;

c) Estudos cinéticos e respirométricos do processo de fermentação no estado sólido

em biorreator escala piloto com variação do modo de alimentação e da aeração, e

comparação com o sistema em colunas de aeração forçada;

d) Determinação da eficiência do bioproduto obtido através de ensaios biológicos do

extrato bruto da fermentação.

4

RREEVVIISSÃÃOO BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAA

1. ÁCIDO GIBERÉLICO

As giberelinas (GAs) constituem uma grande família de ácidos diterpenóides

estreitamente relacionados, representando um grupo importante de potentes hormônios de

crescimento de plantas. As giberelinas conhecidas se identificam pelos números subscritos

GAn, onde n é o número que corresponde, aproximadamente, à ordem cronológica em que

foram descobertas (HILL, 1977; ARTECA, 1995).

Todas as giberelinas possuem um esqueleto ent-giberelano, e são divididas em dois

grupos baseados no número de carbonos. Um grupo possui 19 carbonos e o outro, 20.

Entretanto, a estrutura básica de todas as giberelinas e a numeração é similar, como mostrado

na figura 1 (KUMAR & LONSANE, 1989).

FIGURA 1 - FÓRMULA ESTRUTURAL DO ENT-GIBERELANO

FONTE: ARTECA, 1995

As giberelinas estão presentes em plantas gimnospermas angiospermas e pteridófitas

(samambaias). Também foram isoladas de microrganismos inferiores como fungos e algas.

Das mais de 120 GAs isoladas, o ácido giberélico (GA3) tem recebido a maior atenção. O

GA3 regula a taxa de crescimento das plantas sendo extensivamente utilizado para produzir

uma série de efeitos benéficos. Tais propriedades tornaram as giberelinas uma ferramenta

valiosa na agricultura (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991; CROKER, 2000).

1.1 HISTÓRICO

A primeira publicação científica sobre as giberelinas deu-se em 1898 com um artigo

de Shotaro Hory sobre a doença “bakanae”, ou “doença da plantinha boba”. Esta é uma das

mais antigas enfermidades que afetam o arroz no oriente, especialmente no Japão. As plantas

doentes tornam-se mais delgadas e longas e com uma cor amarelada nas partes afetadas. Após

um crescimento muito rápido, as plantas infectadas morrem. Hory demonstrou que os

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sintomas eram induzidos pela infecção de um fungo do gênero Fusarium provavelmente

Fusarium heterosporium Ness. (TAMURA, 1991, TAKAHASHI, 1986; METIVIER, 1979).

Entre 1927 e 1940 houve mais de 50 publicações relativas às propriedades químicas e

biológicas da “toxina” descoberta por Kurosawa. Uma das mais importantes deste período

aconteceu em 1938 quando Yabuta e Sumiki finalmente cristalizaram dois compostos

chamados “giberelinas A e B” . Ambas substâncias eram biologicamente ativas, mas tinham

propriedades químicas diferentes. Com o início da Segunda Guerra Mundial a investigação a

respeito das giberelinas parou no Japão. Após a guerra inicia-se uma nova fase, onde as

pesquisas chamaram atenção do ocidente, em especial EUA e Grã-Bretanha (TAMURA,

1991, TAKAHASHI, 1986; METIVIER, 1979).

Na década de 50, a empresa inglesa ICI iniciou um programa de seleção de cepas

produtoras de giberelinas, dado início aos estudos de fermentação. Após etapas de purificação

uma giberelina foi isolada e chamada de “ácido giberélico”. Esta giberelina tinha a fórmula

molecular C19H22O6, e possuía propriedades fisiológicas diferentes da giberelina A, japonesa.

Isto levou os pesquisadores japoneses a investigarem novamente a preparação da giberelina

A, separando-a em três produtos chamando-os de giberelinas A1, A2 e A3. A giberelina A3 foi

identificada como o ácido giberélico produzido pela ICI (TAMURA, 1991, TAKAHASHI,

1986).

As giberelinas começaram a ser aplicadas na agricultura no início dos anos 50.

Inicialmente, fermentações em escala de laboratório com G. fujikuroi foram conduzidas pela

ICI, provendo pequenas quantidades de giberelinas para cientistas ao redor do mundo. O

interesse pela produção de giberelinas aumentou consideravelmente, e laboratórios como

Abbott, Merck, Eli Lilly e Pfizer nos EUA e Takeda Chemical Industries no Japão, tiveram

licença de fabricação do produto, concedida pela ICI (TAMURA, 1991, TAKAHASHI, 1986;

METIVIER, 1979).

1.2 PROPRIEDADES FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS

O ácido giberélico (C19H22O6) é um sólido cristalino, pouco solúvel em água (5 g/L) e

facilmente solubilizado em solventes orgânicos como metanol, etanol, acetato de etila, acetato

de butila e acetona. É estável quando seco mas instável em soluções aquosas. A meia vida em

soluções aquosas diluídas é da ordem de 14 dias a 20 ºC e 2 horas a 50ºC. Em soluções

aquosas o ácido giberélico tem pH de 3 a 4 (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991,

MERCK INDEX,1983) .

6

É quimicamente caracterizado como um ácido tetracíclico dihidroxi-γ-lactônico

contendo duas ligações duplas C–C e uma carboxila livre (figura 2). Sua estrutura foi obtida

pelo estudo da decomposição de produtos ácidos e sua estereoquímica absoluta foi deduzida

de dispersão rotatória, dicroísmo circular e análises de raio X. Ele produz uma coloração azul

intensa e forte fluorescência azulada após reação com ácido sulfúrico (KUMAR &

LONSANE, 1989).

FIGURA 2 - FÓRMULA ESTRUTURAL DO ÁCIDO GIBERÉLICO

FONTE: ARTECA, 1995

1.2.1 Interações com plantas

Tecidos de plantas geralmente contêm apenas cerca de 0,001 a 1,0 mg de GAs por kg

de peso fresco. Giberelinas diferentes podem ser usualmente encontradas na mesma planta, e

a proporção entre elas pode mudar dependendo do estágio de desenvolvimento. Os efeitos

causados pelas giberelinas dependem do gênero, órgãos e estágio de desenvolvimento da

planta. Dentro do sistema hormonal das plantas, as giberelinas interagem com outros

hormônios reguladores de crescimento como auxinas, citoquininas, e ácido abcíssico

(BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991; TAKAHASHI, 1986).

1.2.2 Interações com o microrganismo produtor

O fungo G. fujikuroi produz grandes quantidades de GA3 e algumas outras giberelinas

como metabólitos secundários, se comparado com a quantidade existente em plantas

superiores. Existem controvérsias da importância do ácido giberélico para os fungos

produtores. Alguns pesquisadores acreditam que as giberelinas não têm nenhuma ação

regulatória de crescimento dos microrganismos. Por outro lado, cientistas japoneses

encontraram estímulo na germinação de esporos e alongamento das hifas pela ação do ácido

giberélico, afirmando, desta forma, que a função deste metabólito é a mesma nos fungos que

nas plantas (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).

7

1.2.3 Utilização comercial e potencial

O uso corrente de GA3 em escala comercial é limitado à agricultura, viveiros,

viticultura, estufas de flores, entre outros. GA3 é utilizado a níveis de ppm e seu uso resulta

em uma série de efeitos fisiológicos. Os maiores usos comerciais são apresentados no quadro

1, enquanto que as principais aplicações em potencial são listadas no quadro 2.

QUADRO 1 - ALGUMAS DAS MAIORES APLICAÇÕES DAS GA3

CULTURA/ MERCADORIA EFEITO BENÉFICOUvas Aumento do tamanho das bagas/cachos, controle da safraLaranja (com umbigo) Controle da safraMalte Melhora na malteação, redução do tempoSementes Superação da dormênciaManga Atraso no florescimentoAlcachofra Maturação precoceCana-de-açúcar Melhora na produtividade

FONTE: KUMAR & LONSANE, 1989

QUADRO 2 - ALGUNS DOS USOS POTENCIAIS IMPORTANTES DO GA3

ASPECTO EFEITO BENÉFICOPlantas bienais Aceleração do florescimentoErvilha Porte e crescimento dos frutosInfecção das folhas de batatas por P. infestans Inibição dos esporangiosporos do parasitaBacillus subtilis Aumento da produção de alfa-amilaseSaccharomyces carlsbergensis Estimulação da respiração

FONTE: KUMAR & LONSANE, 1989

1.3 EFEITOS FISIOLÓGICOS DE GIBERELINAS EXÓGENAS NAS PLANTAS

1.3.1 Floração

As giberelinas podem induzir floração em plantas mantidas em condições não

indutivas. Assim, elas podem substituir uma condição específica do meio ambiente, sem a

qual uma espécie pareceria vegetativa. Os maiores efeitos são encontrados em dois tipos de

planta, as que precisam de dias longos (DL) para indução floral, e as que requerem em

período de frio (vernalização) (TAKAHASHI, 1986; METIVIER, 1979; WEAVER, 1972).

1.3.2 Expressão sexual

As giberelinas induzem a formação de flores masculinas em determinadas condições.

Normalmente, em dias curtos são produzidas flores pistiladas (femininas), enquanto os dias

longos estimulam o crescimento de flores masculinas. Assim as giberelinas substituem os dias

longos (como no caso anterior). Este efeito é de uso potencial na agricultura, pois somente

flores femininas produzem frutos. Assim, se só forem plantadas variedades femininas, cada

8

terceira fileira poderá ser pulverizada com GA3 que promoverá a formação de um número

suficiente de flores masculinas para polinizar a cultura (TAKAHASHI, 1986; METIVIER,

1979; GALSTON & DAVIES, 1972).

1.3.3 Partenocarpia

As giberelinas, assim como as auxinas, podem induzir a formação de frutos sem o

processo normal de fecundação. Isto está provavelmente relacionado ao fato de que ocorre um

grande aumento da giberelina endógena no embrião e no endosperma após a fertilização e que

este alto nível é mantido através do desenvolvimento do fruto e da semente. O tamanho e a

forma do fruto também podem ser afetados pela aplicação de giberelina à planta-mãe ou ao

fruto isolado (GALSTON & DAVIES, 1972; METIVIER, 1979; TAKAHASHI, 1986).

1.3.4 Senescência e abcisão

As giberelinas podem atrasar a senescência de folhas e frutos de algumas plantas.

Entretanto este efeito não é geral, pois a senescência é acelerada em outros casos. Em citrus ,

como limão, comprovou-se que frutos tratados com giberelinas podem permanecer verdes por

sete meses mais que os controles (GALSTON & DAVIES, 1972; METIVIER, 1979;

TAGAHASHI, 1986).

1.3.5 Germinação e quebra de dormência

Sabe-se hoje que as giberelinas têm um papel chave na germinação de sementes,

estando envolvidas tanto na quebra de da dormência como no controle da hidrólise de

reservas, da qual depende o embrião de crescimento. No caso das sementes, os dois processos

estão interligados, embora seja possível quebrar a dormência sem que ocorra germinação. As

giberelinas também atuam na quebra de dormência de outros órgãos, como no caso das gemas

de inverno nas árvores e arbustos de regiões temperadas ou de órgãos de armazenamento

subterrâneos, como as batatas (TAKAHASHI, 1986; METIVIER, 1979; GALSTON &

DAVIES, 1972).

1.3.6 Crescimento

Os efeitos mais conhecidos das giberelinas aparecem no crescimento, especialmente

no alongamento do caule. O desenvolvimento foliar também pode ser aumentado. Em muitos

capins e pastagens, quando as temperaturas estão baixas, o crescimento é restrito e o gado tem

que ser alimentado com feno armazenado. A aplicação de giberelinas pode, entretanto,

9

estimular o crescimento, reduzindo o custo de alimentação do gado (TAKAHASHI, 1986;

METIVIER, 1979; GALSTON & DAVIES, 1972).

1.4 PROCESSOS DE PRODUÇÃO

A fermentação é o método industrial praticado para a obtenção de GAs. Existe a

possibilidade de produzi-las também por síntese química ou por extração de plantas. Estes

métodos, porém, só possuem interesse acadêmico, devido ao baixo rendimento e conseqüente

alto custo. Ao redor de 1954 a ICI iniciou a produção comercial de ácido giberélico em escala

laboratorial, usando Gibberella fujikuroi para fornecer pequenas quantidades do produto a

cientistas de todo o mundo. Atualmente, diversas indústrias produzem ácido giberélico por

fermentação em vários países, por exemplo, os EUA, Inglaterra, Hungria, Polônia e Japão

(KUMAR & LONSANE, 1989; BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).

1.4.1 Fermentação em superfície líquida

A fermentação em superfície líquida foi empregada nos primeiros anos para a

produção de giberelinas, apresentando vantagens tais como a não formação de espuma, e a

não danificação mecânica do micélio em comparação à fermentação submersa. Porém, devido

à desvantagens tais como a necessidade de grandes espaços, processo trabalhoso, prolongado

período de incubação, facilidade de contaminação, não uniformidade de crescimento, entre

outras, levaram ao abandono desta técnica por volta de 1955 (KUMAR & LONSANE, 1989).

1.4.2 Fermentação Submersa

Em fermentação submersa (FSm), o meio líquido é empregado em grande

profundidade em vasos com razão diâmetro: altura de 1:2 a 1:3. Em muitos casos, todos os

nutrientes são dissolvidos em água, exceto para aquelas fermentações envolvendo sólidos

insolúveis ou líquidos imiscíveis em água. O emprego de meio em camada profunda no

processo confere-lhe diversas vantagens, tais como facilidade operacional, economia,

reduzido espaço, e preciso controle de parâmetros operacionais, se comparada à fermentação

de superfície líquida (KUMAR & LONSANE, 1989, JEFFERYS, 1970).

Porém, apesar do uso da melhor tecnologia de processo, a produção de GA3 é baixa. Já

em 1979, demonstrou-se que o processo de fermentação submersa, utilizado atualmente,

estava muito próximo da saturação, ponto em que a redução de custo tornar-se-ia impossível.

A presença do produto em forma diluída no meio é reconhecida como o maior obstáculo na

manufatura do produto, principalmente devido aos elevados custos no processo de lavagem e

10

na disposição das águas. Além disso, o custo da separação das células por centrifugação ou

microfiltração envolve entre 48 e 76% do custo total de produção do metabólito por FSm.

(JEFFERYS, 1970; KUMAR & LONSANE, 1989).

1.4.3 Outros tipos de fermentação

Diferentes estudos têm sido feitos na tentativa de diminuir os custos de produção do

ácido giberélico, usando diversas técnicas tais como seleção e manipulação genética dos

microrganismos, otimização das condições de cultura e de nutrientes, desenvolvimento de

novos processos fermentativos (como fermentação no estado sólido - FES), minimização do

custo de extração, utilização de substratos mais baratos tais como resíduos industriais

(KUMAR & LONSANE, 1987a). Alguns desses métodos pesquisados, principalmente

aqueles que envolvem a utilização de substratos alternativos ou fermentação no estado sólido,

são mostrados no quadro 3.

QUADRO 3 - FERMENTAÇÕES ALTERNATIVAS PARA PRODUÇÃO DE GA3

SUBSTRATO SISTEMA FERMENTATIVO(TIPO DE REATOR)

PRODUÇÃO(GA3/SUBST.)

AUTORES

Farelo de trigo FES (reator piloto 50 L) 3000 mg/kg BANDELIER et al., 1997

Farelo de trigo FES (reator retro alimentado) 1100 mg/kg KUMAR & LONSANE, 1990Farelo de trigo FES (frasco erlenmeyer) 355 mg/kg KUMAR & LONSANE, 1990Farelo de trigo FSm (frasco erlenmeyer) 218 mg/l KUMAR & LONSANE, 1990Resíduo café/mandioca FES (frasco erlenmeyer) 492 mg/kg MACHADO, 2000Farinha de mandioca FES (colunas) 250 mg/kg TOMASINI et al., 1997

Fibras poliméricas FES (células imobilizadas) 210 mg/kg LU, et al., 1995

Meio artificial FSm (reator leito fluidizado) 3000 mg/l ESCAMILLA et al., 2000Melaço FSm (frasco erlenmeyer) 155 mg/l CIHANGIR & AKSÖZA, 1997Polpa de azeitona FSm (fermentador piloto) 700 mg/l HERNANDEZ & MENDOZA, 1976Polpa de fruta FSm (frasco erlenmeyer) 118,73 mg/l CIHANGIR & AKSÖZA, 1997

Resíduo de beterraba FSm (frasco erlenmeyer) 73 mg/l CIHANGIR & AKSÖZA, 1997

Resíduo de leite FSm (frasco erlenmeyer) 750 mg/L MADDOX & RICHERT, 1977

Soro de leite FSm (frasco erlenmeyer) 120 mg/l CIHANGIR & AKSÖZA, 1997Vinhaço FSm (frasco erlenmeyer) 136,57 mg/l CIHANGIR & AKSÖZA, 1997

1.5 GIBBERELLA FUJIKUROI

Grande número de actinomycetes e culturas de leveduras bem como bactérias são

conhecidas como produtoras de giberelinas. Industrialmente os microrganismos preferidos são

Gibberella fujikuroi (estágio sexuado) e Fusarium moniliforme (estágio assexuado). A

habilidade de várias cepas para produzir giberelinas varia amplamente, e este fato ilustra a

importância da seleção de cepas. Mesmo os rendimentos com G. fujikuroi e F. moniliforme

são baixos, e a otimização do processo bem como o melhoramento da cepa por seleção,

mutação e técnicas de cruzamento são invariavelmente utilizados para produzir giberelinas

com maiores rendimentos e menores custos (KUMAR & LONSANE, 1989).

11

Nas primeiras publicações após o descobrimento e isolamento do fungo causador da

bakanae sua posição taxonômica foi fracamente definida. A falta de nomenclatura

sistemática para o gênero levou a uma confusão considerável na definição do fungo produtor

das giberelinas. Após 1931, quando Wollenweber publicou a taxonomia do gênero Fusarium,

chamando o fungo causador da bakanae de Fusarium moniliforme e seu estágio perfeito de

Gibberella fujikuroi, iniciou-se a classificação deste fungo (JEFFERYS, 1970; BRÜCKNER

& BLECHSCHMIDT, 1991). Atualmente esta é bem estabelecida, como mostrada a seguir:

TAXONOMIA (NCBI, 2002)

Superreino: Eukaryota

Reino: Fungi

Filo: Ascomycota (fungos verdadeiros)

Subfilo: Pezizomycotina (também chamados Euascomycota)

Classe: Sordariomycetes (também chamados Pyrenomycetes)

Subclasse: Pyrenomycetideae (SILVEIRA, 1981)

Ordem: Hypocreales

Família: Nectriceae

Gênero: Gibberella

Espécie: fujikuroi

1.6 ROTAS DE BIOSSÍNTESE

Pela sua alta capacidade de formação de giberelinas a maioria das informações

disponíveis atualmente foi obtida de estudos das culturas de G. fujikuroi, porém acredita-se

que as rotas biossintéticas sejam similares em plantas superiores e nos fungos (BARENDSE,

1976).

As giberelinas são diterpenóides formados a partir do ácido mevalônico (MVA). Este

ácido, por sua vez, é produzido pela condensação de três moléculas da acetil coenzima A

(CoA). O MVA é então convertido via isopentenil, dimetilalil, geranil e farnesil fosfatos em

geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Este é, em seguida, convertido em ent-caureno, o primeiro

intermediário cíclico na biossíntese das giberelinas (BARENDSE, 1976; BRÜCKNER &

BLECHSCHMIDT, 1991).

Inicialmente, GGPP é ciclizado pela ent-caureno sintetase em copalil pirofosfato, que

é ciclizado novamente para formar o ent-caureno, o precursor direto das giberelinas. Ele é

convertido por oxidações sucessivas catalisadas por monooxigenases, em ent-caurenol, ent-

12

caurenal, ácido ent-caurenóico, ácido 7-α-hidroxicaurenóico e finalmente em GA12 – aldeído.

Todas as etapas desta primeira parte da rota biossintética são as mesmas, nos fungos e plantas

e o GA12-aldeído é o ponto de partida de duas rotas biossintéticas paralelas a partir das quais

serão formadas todas as giberelinas em G fujikuroi (figura 3) (BARENDSE, 1976;

BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991;ARTECA, 1995).

FIGURA 3 - ESQUEMA DA BIOSSÍNTESE DE GA12 – ALDEÍDO A PARTIR DA ACETILCOENZIMA (COA) VIA MEVALONATO.

(FONTE: BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991)

Uma das rotas leva à formação das giberelinas via G12 e outras duas giberelinas (GA18

e GA24) em GA9, GA10. GA11 e GA40. A segunda via metabólica leva à formação de diversas

giberelinas C19 3β-hidroxiladas, como GA4, GA7, GA3 e GA1, utilizando-se do GA14-aldeído

como intermediário. Sabe-se, também, que as giberelinas GA1 e GA3 são os metabólitos

13

terminais, uma vez que quando são alimentadas à culturas de G. fujikuroi, os substratos são

recuperados sem modificação alguma (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).

A principal giberelina produzida pelo Gibberella fujikuroi é o ácido giberélico. A

quantidade das outras 24 diferentes giberelinas identificadas depende de constituição genética

do fungo e condições do meio de cultivo, tais como pH e quantidade de nitrogênio inorgânico.

Dessas, 15 também são encontradas nas plantas superiores e 10 estão restritas ao

microrganismo (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).

1.7 FISIOLOGIA DA FORMAÇÃO DE GA3 NO PROCESSO FERMENTATIVO

A produção fermentativa de giberelinas é um exemplo clássico de fermentação de

metabólito secundário. BORROW, et al. (1964a, 1964b) definiram as fases produtoras e não

produtoras do processo fermentativo para produção de ácido giberélico em fermentação

submersa por G. fujikuroi, mostrado, resumidamente, a seguir:

a) Fase lag ou de adaptação

Nessa etapa, quando há uso de meio convencional (com nitrogênio limitado) requer

pouca ou nenhuma adaptação. Desta forma, a fase lag é muito curta, mas poderá ser

aumentada se o meio for rico em carboidratos ou possuir mais de 30% de glucose.

b) Fase balanceada

O crescimento durante esta fase é exponencial, e a utilização de carbono, nitrogênio e

outros compostos mantém-se constante. Ainda não há produção de GA3 nesta fase.

c) Fase de transição

Em meio limitado de fosfato ou magnésio, a limitação de nutrientes ocorre antes do

começo da restrição de oxigênio. Consequentemente, a reserva intracelular de fosfato solúvel

ou magnésio, permite posterior proliferação celular, a absorção dos outros nutrientes continua

e o peso seco do micélio aumenta proporcionalmente, embora a taxa de crescimento e

absorção de nutrientes seja menor.

d) Fase de estocagem

Esta fase inicia-se quando o nitrogênio é exaurido. O peso seco continua a aumentar,

pela acumulação de lipídios (45%), carboidratos (32%). A absorção de fosfato, magnésio,

potássio e glucose continua se estes estiverem presentes no meio. Nesta fase inicia-se a

produção de giberelinas que continua enquanto houver presença de fonte de carbono

disponível.

e) Fase de manutenção

14

Nesta fase é que ocorre a maior produção de giberelinas. Exceto para a continuação

de absorção da fonte de carbono, nenhum outro nutriente é absorvido pela célula e o peso seco

do micélio permanece constante. Mesmo após a exaustão da fonte de carbono no meio, a

produção de GAs continua até a reserva de gordura ser reduzida ao nível que havia na fase

balanceada.

f) Fase terminal

Há um aumento dos vacúolos, perda do conteúdo celular até a decomposição das

células miceliais, devido à não disponibilidade de fonte externa e interna de carbono

utilizável. Consequentemente, isto leva a um retorno da amônia, potássio, magnésio e fosfato

para o meio. O pH do meio também aumenta e leva a um decréscimo no peso micelial seco.

1.8 CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO

1.8.1 Razão C:N

Glucose e sacarose têm sido usadas como fontes de carbono, mas concentrações acima

de 20% de glucose no início da fermentação devem ser evitadas, uma vez que causam

repressão catabólica. Além destas substâncias, muitos outros substratos foram pesquisados,

fazendo-se uma distinção para as fontes de carbono prontamente utilizáveis de outras de

utilização lenta, sendo ambas usadas em diversas proporções. Diversos meios naturais,

provenientes de moagem de plantas ou óleos têm levado a bons resultados, por conterem,

além de carbono, sais e precursores da produção de GA3 (BORROW, 1964a, JEFFERYS,

1970; KUMAR & LONSANE, 1989; BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991,

TUDZYNSKI, 1999).

Diferentes fontes de nitrogênio foram avaliadas por diversos pesquisadores para

estudar seus efeitos sobre a produção de ácido giberélico. Nitrogênio amoniacal tem sido

preferido, além de meios naturais. A qualidade e quantidade da fonte de nitrogênio têm um

importante papel na produção de GA. De qualquer forma, todos os meios de cultivo descritos

como adequados nesse tipo de fermentação possuem limitação de nitrogênio. Esse fenômeno

é explicado por Borrow, et al. (1964a e 1964b) – capítulo 1.7 deste trabalho (JEFFERYS,

1970; KUMAR & LONSANE, 1989; BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991,

TUDZYNSKI, 1999).

A influência da razão C:N está diretamente relacionada com o metabolismo de

produção do ácido giberélico. Por isso, seus valores devem ser tais que proporcionem ativo

15

crescimento inicial do micélio em um meio balanceado com limitação de nitrogênio; início

da produção de GA3 após a exaustão do nitrogênio e produção contínua do metabólito na

presença de substrato com carbono suficientemente disponível. Dessa forma, as razões

utilizadas são normalmente altas, havendo trabalhos com variações entre 6:1 a 95:1. Em

fermentação submersa é comum utilizarem-se processos em dois estágios, onde o estágio

inicial possui razões C:N entre 10:1 a 25:1 e o processo final varia de 25:1 a 200:1

(JEFFERYS, 1970; KUMAR & LONSANE, 1989; BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT,

1991; TUDZYNSKI, 1999).

No uso de resíduos agroindustriais, para que haja um deslocamento da razão C:N

natural do substrato, freqüentemente faz-se necessário o acréscimo de uma fonte de carbono

ou de nitrogênio, que pode ser sintética ou natural. O substrato casca de café possui uma razão

C:N natural de 14:1. Feitos estudos com a adição de bagaço de mandioca (material rico em

carbono) em diferentes concentrações, obteve-se um aumento de 100% na produção de GA3

com uma razão C:N de 43:1, obtida com 30% de bagaço de mandioca (MACHADO, 2000).

1.8.2 Sais minerais e elementos-traço

Apesar dos efeitos pronunciados dos sais minerais e elementos-traço na biossíntese de

metabólitos secundários, poucas informações são disponíveis a respeito de seus efeitos sobre a

produção de ácido giberélico (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991). Os sais

normalmente considerados importantes para sua produção contêm magnésio, fosfato, potássio

e sulfato e segundo KUMAR & LONSANE (1989) a combinação existente nos meios

comercias Czapek Dox, Raulim-Thom e Raulim-Thom modificado é satisfatória.

Elementos-traço como Fe, Cu, Mn, Mo, Zn, B, Al e Ca também são necessários para

produção de GA3, mas normalmente não são adicionados, sendo suficientes aqueles existentes

como impurezas nos meios comerciais (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).

1.8.3 pH

A variação do pH é um dos fatores mais influentes na seleção da giberelina a ser

produzida. Para produção de GA3 o valor inicial de pH geralmente empregado está na faixa de

3,5 – 5,8. O aumento do pH levará a uma maior produção de GA4,7 e meios fortemente ácidos

(pH < 3,5) levam a um aumento na produção de GA1 (KUMAR& LONSANE, 1989).

Em FES a medida de pH é complexa. Desta forma, existem poucos registros na

literatura descrevendo os valores utilizados para a produção de GA3. GELMI et al.(2000),

utilizando suporte inerte de amberlite, estabeleceram para o sistema estudado um pH inicial

16

de 4,5 e TOMASINI et al. (1997) numa fermentação em farelo de mandioca utilizaram um pH

de 6,0. Estudos feitos para a produção de GA3 em substrato misto casca de café – bagaço de

mandioca foram testado pH inicial entre 4,0 e 5,7. Os melhores resultados foram obtidos com

valores entre 5,0 e 5,4.

1.8.4 Temperatura

O efeito da temperatura sobre a produção de GA3 usando G. fujikuroi ou F.

moniliforme é dependente da cepa empregada (BRÜCKNER & BLECHSCHMIDT, 1991).

Mas, segundo JEFFERYS (1970), ao revisar diversos trabalhos, pode-se considerar que a

temperatura ótima para reprodução das cepas está entre 31 e 32 oC, enquanto que para a

produção de GA3 utiliza-se uma temperatura máxima de 29 ºC.

1.8.5 Aeração

É bem reconhecido que um contínuo suprimento de oxigênio é requerido para

produção de GA3, uma vez que sua biossíntese progride através de compostos de crescentes

níveis de oxidação. Uma vez que a taxa de consumo de oxigênio para a produção de micélio

na fase logarítmica deve permanecer constante, a demanda por oxigênio aumenta

aproximadamente de forma exponencial (TUDZYNSKI, 1999). JEFFERYS (1970) sugere

que a aeração deva ser a mais vigorosa possível, existindo notícias de rotações entre 150 e

1400 rpm, em fermentação submersa. Em FES, BANDELIER et al. (1997) utilizaram uma

vazão de ar de 0,9 l.(h.kg MS)-1 em reator batelada-alimentada, TOMASINI et al. (1997) de

0,42 l.(h.kg MS)-1 e GELMI, et al. (2000) 0,46 l.(h.kg MS)-1 em reator de colunas.

1.9 ANÁLISE DE GIBERELINAS

Os métodos analíticos utilizados para identificação e quantificação de giberelinas são

de dois tipos: bioensaios e métodos físico-químicos.

Os bioensaios tiveram uma grande importância na identificação das giberelinas,

existindo um total de 33 sistemas teste incluindo diferentes partes, órgãos ou funções de

plantas. Este tipo de teste, apesar de bem reprodutível é demorado, difícil e incômodo, se

comparado ao físico-químico, tornando-os impróprios para a indústria (KUMAR &

LONSANE, 1989).

Para identificação e quantificação de giberelinas pode-se utilizar uma variedade de

métodos, cujas vantagens e desvantagens são descritas a seguir:

a) Método espectrofotométrico:

17

Baseado na conversão do ácido giberélico em ácido giberelênico pela ação de ácidos

fortes e medida sua absorbância a 254 nm. O gráfico de calibração entre 1 e 4 mg GA3.l-1 é

reprodutível e linear (HOLBROOK et al., 1961). É um método rápido e específico para o

ácido giberélico, e é rotineiramente utilizado para a análise de caldos fermentados pela

técnica de FSm. (KUMAR & LONSANE, 1989).

b) Análise fluorométrica:

Utilizada para identificar os ácidos giberélico e giberelênico nos meios fermentativos.

Baseia-se na fluorescência destes compostos pela ação de ácido sulfúrico 85%. Porém não há

separação entre os dois compostos (KAVANAGH & KUZEL, 1958). Uma vez que e a ação

biológica do ácido giberelênico é muito baixa se comparada à do GA3 este método conduz a

resultados falsos (KUMAR & LONSANE, 1989).

c) Análise espectrofluorodensitométrica:

Envolve a separação do GA3 por cromatografia de camada delgada utilizando sistema

de solventes constituído de clorofórmio: acetato de etila : ácido acético glacial na razão 5:4:1,

aquecimento da placa em forno a 100 ºC por 30 minutos e análise da fluorescência produzida

em espectrofluorodensitômetro a 254 nm sob luz ultravioleta, e compará-la a curva de

calibração previamente obtida nas mesmas condições (KUMAR & LONSANE, 1986).

d) Cromatografia de camada delgada:

É um método simples e eficiente de identificação de giberelinas, existindo diversos

trabalhos relatando os valores de Rf para diferentes sistemas. Normalmente utiliza-se como

fase móvel uma mistura de acetato de etila, ácido acético e clorofórmio e como revelador

ácido sulfúrico concentrado. Sua maior desvantagem é ser qualitativo, não podendo ser

utilizado se for necessária uma quantificação acurada do metabólito (RUSSELL, 1976).

e) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE):

Promove separação de diferentes tipos de giberelinas com boa resolução, incluindo

isômeros como GA1 e GA3 ou GA4 e GA7., além de uma quantificação precisa. Dois tipos de

colunas podem ser usados: µBondapak C18 e Radial-Pak-A. A fase móvel consiste de

metanol-água destilada acidificada com ácido fosfórico em pH 3, com detecção a 203 ou 206

nm (BARENDSE & VAN DE WERKEN, 1997; CASTILLO & MARTINEZ, 1997).

2. FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO

O termo fermentação no estado sólido (FES), tradução do inglês "solid state

fermentation", é objeto de numerosas definições. RAIMBAULT & ALAZARD (1980),

18

MAHEVA (1984) e LONSANE et al. (1985), descrevem como a fermentação na qual o

crescimento do microrganismo em substratos sólidos ocorre na ausência de líquido na forma

livre. A água livre indispensável ao crescimento dos microrganismos é adsorvida num suporte

sólido ou complexada no interior de uma matriz sólida. A fermentação no estado sólido é

considerada mais natural que outros tipos de fermentações, como, por exemplo, a fermentação

submersa (FSm), porque seus processos assemelham-se às condições sob as quais a maioria

dos microrganismos cresce na natureza (HESSELTINE, 1987).

Os materiais sólidos utilizados na FES, devem possuir partículas de porosidade e

tamanho adequado com grande área superficial por unidade de volume (entre 103 e 106 m2.l-1),

para facilitar a acessibilidade e a penetração do organismo no substrato, proporcionando um

crescimento microbial na interface sólido/gás e levando a altas taxas de processos

bioquímicos. Além disso, a matriz sólida não deve ser contaminada por inibidores da

atividade microbiana e deve conter ou ser capaz de absorver as fontes nutricionais dos

microrganismos como carboidratos (celulose, amido, açúcares), nitrogênio (amônia, uréia,

peptídeos) e sais minerais (PANDEY, 1991; RAIMBAULT, 1997).

2.1 APLICAÇÕES ATUAIS E FUTURAS

A utilização da FES não é recente. Numerosas fermentações alimentares e agrícolas

baseadas neste princípio têm sido praticadas há séculos em todo mundo. Essa fermentação é

muito desenvolvida nos países orientais, particularmente Japão, China e Coréia (PANDEY,

1992; PANDEY et al., 2001). No quadro 4 são mostrados setores econômicos da

agroindústria, agricultura e fermentação industrial que utilizam a FES em seus processos. A

maior parte destes são comercializados em países africanos, latino americanos e do sudeste

asiático.

A possibilidade de desenvolvimento de novos processos de FES é ampla e se baseia

fundamentalmente nas vantagens comparativas que esta modalidade de fermentação apresenta

sobre a fermentação líquida, assim como na obtenção de uma eficiente exploração comercial

dos processos tradicionais ou de interesse econômico. Segundo SOCCOL (1995), (2001) e

SOCCOL & VANDENBERGHE (2002), os novos campos de aplicação da FES de acordo

com suas potencialidades poderiam resumir-se em:

a) a utilização de FES para a produção de metabólitos fúngicos que habitualmente

são produzidos por meio líquido;

19

b) a possibilidade de obtenção de metabólitos que dependem da diferenciação celular

do micélio a qual normalmente está suprimida ou restrita na fermentação em meio

líquido;

c) a transferência das aplicações sócio-econômicas da FES aos países

industrializados, permitindo a colaboração e intercâmbio entre regiões pobres e

desenvolvidas;

d) aplicação dos processos tradicionais no enriquecimento protéico de alimentos,

especialmente produtos agroindustriais com alto teor de amido ou celulose;

e) produção de metano através da digestão anaeróbia de dejetos humanos, animais ou

resíduos sólidos em geral;

f) biodegradação de compostos orgânicos tóxicos do solo como pesticidas e

herbicidas por meio de microrganismos que requeiram grandes quantidades de

inóculo;

g) aproveitamento de diferentes resíduos agrícolas e agroindustriais para obtenção de

produtos de alto valor comercial como hormônios vegetais, bioinseticidas,

pigmentos naturais e ácidos orgânicos.

QUADRO 4 - APLICAÇÕES DE FES EM DIFERENTES SETORES ECONÔMICOSSETOR APLICAÇÃO EXEMPLOS

Fermentações de alimentos Koji, Tempeh, Ragi, Attieke, queijos fermentadosProdução de cogumelos Agaricus, Pleuretus, Shiitake

Bioconversão de resíduos Compostagem, detoxificação, ensilagem

IndústriaAgro-alimentar

Aditivos alimentares Aromas, gorduras essenciais, ácidos orgânicosBiocontrole, bioinseticidas Beauveria, Metarrhizium, Trichoderma

Crescimento de plantas Giberelinas, Rhizobium, Trichoderma

Agricultura

Micorrização, Inóculo de plantasEnzimas Amilases, celulases, proteases, pectinases,

xilanasesAntibióticos Penicilina, probióticosÁcidos orgânicos Ácidos cítrico, fumárico, gálico, lácticoEtanol Schwanniomyces sp.

Fermentaçãoindustrial

Metabólitos fúngicos Hormônios, alcalóidesFONTE: RAIMBAULT,1997

2.2 MICRORGANISMOS E SUBSTRATOS

Bactérias, fungos e leveduras podem crescer em substratos sólidos e são aplicados em

processos de FES. Os fungos filamentosos são os utilizados na maioria dos casos, devido às

suas propriedades fisiológicas, enzimológicas e bioquímicas (SOCCOL, 1994).

20

O modo de crescimento dos fungos, sua boa tolerância a baixas aw e altas pressões

osmóticas os fazem eficientes e competitivos com a microflora natural para bioconversão de

substratos sólidos. O crescimento por hifas dá aos fungos uma maior vantagem sobre os

microrganismos unicelulares na colonização do substrato sólido e utilização dos nutrientes

disponíveis, dando ao fungo filamentoso, o poder de penetrar no substrato sólido. A ligação

da parede celular aos filamentos e o micélio proporcionam uma estrutura firme e sólida. As

enzimas hidrolíticas são excretadas nas hifas sem grande diluição como ocorre na FSm, o que

faz com que sua ação seja muito mais eficiente, permitindo a penetração no substrato e

aumentando a acessibilidade de todos os nutrientes disponíveis nas partículas.

(RAIMBAULT,1997)

Tanto substâncias sintéticas como naturais podem ser utilizadas nos processos de FES.

Na natureza a maioria dos materiais orgânicos disponíveis é de estrutura polimérica, tais

como polissacarídeos, proteínas e ligninas, conferindo determinadas propriedades de sólido

ao substrato. Em geral, todos podem ser utilizados pelos microrganismos como fonte de

nutrientes, bem como serem utilizados como suporte inerte no qual carbono e fontes de

energia (açúcares, lipídios, ácidos orgânicos) são adsorvidos. (HESSELTINE, 1972).

No Laboratório de Processos Biotecnológicos da UFPR diversos resíduos

agroindustriais, celulósicos ou amiláceos têm sido utilizados para a produção de biomassa ou

metabólitos em FES. Alguns exemplos são mostrados no quadro 5, a seguir:

QUADRO 5 - DIFERENTES RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS UTILIZADOS EM FESSUBSTRATO PRODUTOS AUTOR

Bagaço de cana Fungo entomopatogênico DALLA SANTA, 2000Bagaço de maçã Aromas naturais BRAMORSKI, 1997Batata refugo Fungo entomopatogênico AYALA, 1996Farelo de palma Aromas naturais MEDEIROS, 1998Farelo de soja Enzimas GERMANO, 2000Farelos de milho e trigo Cogumelos BEUX, 1995Palha de arroz Cogumelos TONIAL. 1997Resíduos da extração do suco de maçã Farinha com alto teor protéico STURZA, 1995

Na maioria dos casos estes resíduos utilizados como substrato são formados por

estruturas complexas que geralmente são pouco acessíveis ao ataque microbiano. Assim, a

preparação e o pré-tratamento representam etapas necessárias para converter um resíduo em

forma passível de uso, incluindo redução de tamanho por moagem e/ou seleção; hidrólise

físico-química ou enzimática das grandes cadeias de açúcares para torná-los acessíveis aos

microrganismos; suplementação com nutrientes (fósforo, nitrogênio, sais) e adequação do pH

21

e umidade pela solução mineral; cozimento ou tratamento a vapor para pré-degradação da

estrutura macromolecular e eliminação de contaminantes ou inibidores de crescimento e

metabolismo do microrganismo.

Na escolha do pré-tratamento o problema mais significativo é a grande

heterogeneidade do substrato quanto a não uniformidade da estrutura e variabilidade entre

bateladas, tornando difícil considerar-se apenas uma categoria de processo hidrolítico e

levando a dificuldades de modelagem. (DOELLE, 1985; PANDEY, 1992; RAIMBAULT,

1997)

2.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DA FES

Fatores ambientais como temperatura, pH, atividade de água, níveis de oxigênio e

concentrações de nutrientes e produtos afetam significativamente o crescimento microbiano e

formação de produtos (PANDEY, 1992).

Em culturas submersas o controle ambiental é relativamente simples pela

homogeneidade da suspensão microbiana de células, da solução nutritiva e dos produtos na

fase líquida. O baixo conteúdo de umidade na FES proporciona um menor volume de reator

por massa de substrato que em FSm, e, também, simplifica a recuperação do produto. Grandes

problemas, entretanto, são encontrados à respeito de mistura, troca de calor, transferência de

oxigênio, controle de umidade e localização dos gradientes de pH e níveis de nutrientes e

produtos, como conseqüência da heterogeneidade do meio. Assim, os microrganismos

selecionados para FES devem ser mais tolerantes às variadas condições de cultivo

(RAIMBAULT, 1997).

2.4 ESTIMATIVA DA BIOMASSA

A biomassa é um parâmetro fundamental para a caracterização do crescimento

microbiano. A determinação direta de biomassa em FES é muito difícil devido aos problemas

de separação entre a biomassa microbiana e o substrato. Isso é especialmente válido para

processos envolvendo fungos, pois suas hifas penetram mo suporte fornecendo forte ligação

do micélio com o mesmo. Existem duas categorias de medidas da biomassa em FES:

estimativa direta ou indireta (quantificação de componentes da biomassa e medida

metabólica). A seguir serão explicados os fundamentos de ambos os métodos (RAIMBAULT,

1997).

22

2.4.1 Estimativa direta

A recuperação completa da biomassa fúngica é possível apenas sob certas

circunstâncias artificiais em culturas em filtros de membranas, uma vez que a membrana

previne a penetração das hifas no substrato. O micélio completo pode ser recuperado

simplesmente soltando-o da membrana, e pesando-o diretamente ou depois de secagem. Este

método, porém, não pode ser utilizado na maioria dos processos de FES, sendo usado apenas

como calibração de outros processos indiretos de estimativa da biomassa.

Observações por microscópico eletrônico também podem representar um bom modo

de apreciar o crescimento do fungo em FES. De qualquer forma a medida direta exata da

biomassa em FES é uma questão muito complicada, sendo que outras aproximações são

preferidas por pesquisadores. Para tanto, pode-se considerar a equação estequiométrica global

do crescimento microbiano:

C + N + P + H2O + O2 Biomassa + CO2 + Metabólitos + Calor

Uma vez determinada a estequiometria da equação acima, pode-se, a partir da variação

de um componente, determinar a evolução dos outros (RAIMBAULT, 1997).

2.4.2 Componentes da biomassa

A biomassa também pode ser estimada pela medida de componentes específicos que

tenham composição constante e estável. Os principais componentes utilizados para tal prática

são: proteína; ácidos nucléicos; glucosamina; ergosterol e medidas físicas (diferença de

condutividade elétrica entre a biomassa e o substrato).

2.4.3 Medida metabólica da biomassa

a) Produção de enzimas extracelulares ou de metabólitos primários:

Outra atividade metabólica que pode ser associada ao crescimento é a produção de

enzimas extracelulares. Por outro lado, pode-se associar uma freqüentemente boa correlação

entre crescimento micelial e produção de ácidos orgânicos, que pode ser medida pela variação

de pH ou pela posterior análise dos extratos pela CLAE (RAIMBAULT, 1997; PANDEY, et

al., 2001).

b) Metabolismo de respiração

O consumo de O2 e CO2 é o resultado da respiração, o processo metabólico pelo qual

os microrganismos aeróbios retiram a maior parte de sua energia de crescimento. Essas

23

atividades metabólicas são, portanto, associadas ao crescimento e podem ser utilizadas para a

biossíntese de biomassa. À medida que os compostos de carbono são metabolizados, eles são

convertidos em biomassa e dióxido de carbono. A produção de CO2 causa a diminuição do

peso do substrato fermentado ao longo do crescimento, e a quantidade de perda de peso pode

ser correlacionada com o crescimento que ocorreu. A estimativa do crescimento baseada na

produção de CO2 ou consumo de O2 assume que o metabolismo destes dois componentes é

completamente associado ao crescimento, o que significa que a quantidade de biomassa

produzida por unidade de gás metabolizado é constante. Isso, no entanto, não é

completamente correto uma vez que existem modificações em diferentes etapas do

crescimento, como germinação, crescimento vegetativo, metabolismo secundário, esporulação

e degeneração do micélio (RAIMBAULT, 1997).

A medida do metabolismo dos gases é mais eficiente se for considerado um modelo de

correlação. A aplicação destes modelos envolvendo predição do crescimento a partir de

determinações das taxas de O2 e CO2 requer o uso de técnicas numéricas para resolver

equações diferenciais. Dessa forma, o uso de computador e software adequado, é essencial.

Se há disponibilidade de equipamento de monitoramento e computacional estes modelos de

correlação são uma ferramenta poderosa de estimativa de biomassa uma vez que medidas

contínuas on-line podem ser feitas. Outra vantagem do monitoramento de concentrações de

gás efluente com analisadores paramagnéticos e infravermelhos, inclui a habilidade de

monitorar o quociente respiratório para assegurar uma ótima oxidação do substrato, a

habilidade de incorporar controle de retroalimentação automatizada sobre a taxa de aeração e

a natureza não destrutiva do procedimento de medida (RAIMBAULT, 1997).

2.5 FES EM COLUNAS AERADAS

RAIMBAULT & ALAZARD (1980), desenvolveram um sistema fermentativo para

estudo da FES, que facilita o desenvolvimento seletivo e homogêneo do micélio e possibilita

o estudo da fisiologia e crescimento do fungo nas condições determinadas. O equipamento

desenvolvido constitui-se de colunas de vidro empacotadas com o substrato em condições

adequadas de pH e umidade e previamente inoculado com solução de esporos. As colunas

empacotadas são encaixadas em um borbulhador com água, e o sistema é mantido em banho

de água com temperatura regulada. Alguns autores têm utilizado colunas aeradas na produção

de ácido giberélico por FES, como mostrado no quadro 6.

24

QUADRO 6 - PRODUÇÃO DE ÁCIDO GIBERÉLICO EM COLUNAS AERADASSUBSTRATO PRODUÇÃO1 – TEMPO2 AERAÇÃO3 AUTOR

Amberlite com solução nutriente 730 – 142 0,46 GELMI et al., 2000Casca de café / bagaço de mandioca 744 – 144 0,18/0,72 4 MACHADO et al., 2001

Farinha de mandioca 250 – 36 0,42 TOMASINI et al., 19971 mg GA3.(kg suporte)-1

2 h3 ml ar.(h.kg suporte)-1

4 0-72 h/72 h-144h

2.6 FES EM BIORREATORES EM ESCALA PILOTO

Num processo fermentativo o biorreator provê o meio ambiente para o crescimento e

atividade dos microrganismos que produzem as reações biológicas. Durante o período da

fermentação, ele deve ser capaz de impedir a saída do meio/biomassa interno assim como

prevenir a entrada de substâncias estranhas no meio de reação. Um fermentador ideal deve

possuir algumas características, tais como ser feito de material não tóxico, com resistência à

pressão. Não deve ser afetado por corrosão química e deve possuir um sistema de

aeração/agitação, com amostragem, pontos de carga e descarga. Um sistema de resfriamento

pode ser necessário para o controle da energia de metabolismo. Finalmente, o biorreator deve

ser capaz de operar sob condições assépticas (PANDEY, 1991).

2.7 CÁLCULOS CINÉTICOS

A importância dos estudos cinéticos está no fato que estes permitem determinar

parâmetros importantes como: velocidade específica de crescimento, rendimento do processo,

produtividade e calor gerado no sistema, critérios de controle do processo, estratégia de

produção de um metabólito específico, critérios de escalonamento. Modelos capazes de

predizer o crescimento da biomassa e a produção de metabólito são necessários para a

otimização de operações de FES em biorreatores. No caso específico da produção de

metabólito secundário, também devem ser descritas as mudanças na biomassa ativa e

limitação de substrato (PANDEY et al. 2001; GELMI et al. 2000).

Sem dúvidas, a análise cinética é o procedimento que descreverá o desenvolvimento

do processo. Por outro lado, tal análise também simplificará significativamente a mudança de

escala e otimização de operação de um biorreator. Mesmo com as dificuldades encontradas

em FES, esta análise não pode ser substituída apenas pelo bom senso, subjetivismo ou

mesmo, pela descrição inicial e final do processo (PANDEY et al., 2001, MITCHELL, et al.

2000). Entretanto, existe uma grande deficiência de trabalhos que estudem a cinética da

produção de metabólitos por fermentação no estado sólido.

25

Um estudo cinético é determinado pela variação de uma ou mais variáveis durante o

período de fermentação. Deste ponto de vista, qualquer variável disponível (medida) pode ser

escolhida para determinar características cinéticas. A variável selecionada será relacionada a

outros fatores no processo. A identificação destes fatores dependentes ou independentes

permitirá o estabelecimento de modelos apropriados que descrevam o processo ou parte dele,

a postulação de estudos para a otimização do processo e a determinação de critérios de

controle.

As variáveis utilizadas normalmente nos cálculos cinéticos são: concentração de

biomassa (síntese) no sistema, concentração de substrato, concentração de um produto

(metabólito), vazão do O2 consumido ou do CO2 produzido, calor envolvido na reação. A

seguir será feita uma explanação sobre as principais variáveis correlacionadas nos estudos

cinéticos de um processo fermentativo

A síntese da biomassa é, em geral, a primeira variável considerada para a

representação cinética de um processo. Considerando-se a variação da biomassa durante o

tempo de processamento, pode-se estabelecer que ela é dependente de diversos fatores:

,...),,( TSXFdt

dX= (1)

Onde:

X: concentração de biomassa (gbiomassa.l-1 ou gbiomassa.kg-1);

t: tempo (h);

S: substrato ((g MS).l-1 ou (g MS).kg-1);

T: temperatura (ºC)

O primeiro termo na equação (1) é a velocidade ou termo cinético. Ele representa a

variação de concentração de biomassa em relação ao tempo. A partir da representação gráfica

desta equação podem-se determinar parâmetros como a concentração máxima de células

obtida na fermentação, tempo de crescimento de biomassa no reator, substrato consumido no

processo e relação biomassa/substrato obtida no processo.

MONOD (1942) foi um dos primeiros cientistas a descrever matematicamente um

processo fermentativo. Ele propôs um modelo que correlaciona a síntese da biomassa com o

substrato consumido. Este modelo é:

SK

S

S += maxµµ (2)

26

Onde:

µ : taxa de crescimento específico (h-1);

µmax : taxa de crescimento específico máximo (h-1);

S : concentração de substrato (g.l-1);

Ks : constante de afinidade biomassa/substrato.

No modelo proposto por Monod (eq. 2), o tempo não está explícito, mas é incluído no

termo chamado taxa de crescimento específico, que é independente do processo e definido

por:

dt

dX

X

1=µ (3)

Onde:

X : concentração da biomassa em um determinado tempo (g.l-1).

A taxa de crescimento específico definida pela expressão (3) permitiu a representação

do padrão cinético de crescimento microbiano por diferentes fases, conhecidas como: fase de

crescimento: fase Lag (µ ≈ 0); fase de crescimento acelerado (µ > 0); fase de crescimento

exponencial (µ = µmax) fase de crescimento desacelerado (µmax >µ >0), fase de crescimento

estacionário (µ = 0) e fase de taxa negativa de crescimento (µ < 0).

A fase de crescimento logarítmico ou exponencial é a mais importante de uma

fermentação. É caracterizada pela taxa de crescimento constante e máxima. Aplicando-se a

função (3) para essa fase, e estabelecendo-se que na fase exponencial µ = k, onde k é uma

constante, tem-se que:

∫∫ =tX

Xdt

X

dX

00

µ (4)

Integrando-se a equação (4):

tX

Xµ=

0

ln (5)

Onde:

X : concentração da biomassa no tempo t (g.l-1).

X0: biomassa inicial de concentração no t = 0 (g.l-1);

µ : taxa de crescimento específico na fase exponencial (h-1);

t: tempo correspondente à concentração da biomassa X (h)

A partir da equação (5) pode-se obter o tempo de duplicação (td). Este parâmetro,

chamado de tempo de duplicação da biomassa, caracteriza o tempo de fermentação necessário

27

para a concentração de biomassa dobrar. Então, para seu cálculo, considera-se na equação (5),

que: x = 2X0 e t0 = 0. Assim:

max

2ln

µ=dt (6)

Outro parâmetro importante que pode ser obtido em função de µ., é a produtividade da

biomassa (P), dada em gbiomassa.h-1, e definida por:

xP µ= (7)

O último parâmetro diretamente relacionado com µ, é o rendimento biomassa /

substrato consumido (YX/S):

t

S

SXSS

XXY

−−

=0

0/ (8)

Onde:

YX/S : rendimento biomassa/substrato consumido (adimensional);

S0: concentração inicial do substrato (g.l-1);

S : concentração final do substrato (g.l-1);

X0: concentração inicial de biomassa (g.l-1);

X : concentração inicial de biomassa (g.l-1).

Uma vez que o rendimento biomassa/substrato é adimensional, costuma-se representá-

lo em percentagem.

2.8 CÁLCULOS RESPIROMÉTRICOS

Os cálculos cinéticos de fermentação não levam em conta o tipo de processo

considerado. Entretanto, tendo como principal parâmetro cinético o crescimento do

microrganismo ao longo do tempo, torna-se um problema fazer estas medidas quando se trata

de FES. A impossibilidade de separar-se a biomassa do substrato e a heterogeneidade do

substrato em processos de FES são as principais dificuldades encontradas quando se pretende

fazer estudos cinéticos deste tipo de processo. Esses fatos impedem a aquisição de amostras

significativas e os problemas são particularmente agudos no caso do crescimento de fungos e

produção micelial (PANDEY et al. 2001; GELMI et al. 2000).

No ítem 2.3 deste trabalho, são mostrados alguns métodos utilizados para a

determinação da biomassa em FES. Destes, a medida metabólica da biomassa (2.3.3),

especialmente do metabolismo de respiração (2.3.3.2), é a medida mais confiável e eficiente,

uma vez que é não destrutiva, pode ser realizada on-line, obtendo-se respostas rápidas e

28

confiáveis. De fato, este método pode ser considerado uma medida direta da cinética do

processo. A seguir, serão demonstradas as principais equações envolvidas na respirometria de

um processo fermentativo, segundo Pandey et al., 2001.

Assumindo que no fermentador entra ar puro, pode-se considerar que a sua

composição em porcentagem volumétrica é de 21 e 79% respectivamente para O2 e N2. As

vazões volumétricas de O2 e N2 são dados pelas expressões:

eeO FV

=100

212

(9)

eeN FV

=100

792

(10)

Onde:

VO2e : vazão volumétrica de oxigênio na entrada do fermentador (l.h-1);

VN2e : vazão volumétrica de nitrogênio na entrada do fermentador (l.h-1);

Fe : vazão de ar na entrada do fermentador (l.h-1).

O cálculo das vazões volumétricas de saída dos gases do fermentador é baseado na

composição centesimal em O2 e CO2 que os mesmos apresentam. Considerando que na

corrente de saída só estão presentes O2, CO2 e N2:

SsOF

sOV

=

100

% 22

(11)

SsCO FsCO

V

=

100

% 22

(12)

SsN FsCOsO

V

−−

=100

%%100 222

(13)

Onde:

VO2s : vazão volumétrica de oxigênio na saída do fermentador (l.h-1);

VCO2s: vazão volumétrica de gás carbônico na saída do fermentador (l.h-1);

VN2s: vazão volumétrica de nitrogênio na saída do fermentador (l.h-1);

Fs : vazão de ar na saída do fermentador (l.h-1).

Fazendo o balanço de massa para o O2 e relacionando-o com as equações 9 e 11 tem-

se a expressão da vazão volumétrica de oxigênio consumido na reação

SecO FsO

FV

−

=

100

%

100

21 22

(14)

29

A relação entre o Fe e Fs pode ser obtida a partir do fato que o N2 do ar não é

consumido no processo e portanto:

sVNeVN 22 = (15)

E relacionando-se as equações (2), (5) e (7) tem-se a seguinte expressão:

−−

=79

%%100 22 sCOsOFF Se (16)

O cálculo dos valores das vazões volumétricas de consumo de O2 e da produção do

CO2 no processo fermentativo, poderá ser realizado em moles.h-1 ou g.h-1. Levando-se em

conta que nas condições de fermentação pode-se considerar que os gases seguem a lei dos

gases ideais e que nas CNTP (273 K e 1 atm) 1 mol de qualquer gás ocupa um volume de 22,4

L, podem-se fazer as correções pertinentes às condições de fermentação.

Para se corrigir a vazão em relação à CNTP (Fcorr) e possibilitar o cálculo das

velocidades de consumo O2 e produção de CO2 nas condições do experimento, considera-se

que a pressão é a mesma (1 atm) e se faz a correção para T:

=

273

TFFcorr (17)

Chegando-se a:

( ) corrcO FCOO

OV

−−

−=22

2

%%100

%79,021,0

2 (18)

( ) corrsCO FCOO

COV

−−

=22

2

%%100

%79,02

(19)

Valores em l.h-1. Para determinar a vazão molar e mássica:

• CO2s (mol.h-1) = VCO2s/0,082T

• O2s (mol.h-1) = VO2s/0,082T

• CO2s (g.h-1) = 32 VO2s /0,082T

• O2s (g.h-1) = 44 VCO2s /0,082T

O tipo de cinética que o sistema estudado apresenta em função do crescimento

microbiano pode ser indicado pelo quociente respirométrico dado por:

consumido

produzido

rO

COQ

2

2= (20)

Onde: Qr = quociente respirométrico (adimensional)

30

A seguir serão feitas algumas considerações a respeito da classificação proposta

relacionada ao Qr:

a) Crescimento associado:

É o padrão cinético observado quando produtos são formados ao mesmo tempo em

que a biomassa. Um exemplo deste tipo de fermentação é aquela onde se deseja obter

biomassa microbiana ou qualquer constituinte celular. Neste caso, o quociente respirométrico

mantém-se praticamente constante em todo o processo.

b) Crescimento parcialmente associado:

Neste sistema fermentativo se começa a produzir um metabólito extracelular em

algum momento depois que se iniciou a síntese de biomassa (normalmente em algum

momento da fase exponencial). Quando ocorre este tipo de processo é lógico assumir que

existe, a partir da síntese de um novo produto, um novo rendimento enquanto há consumo de

oxigênio e um Qr diferente, devido à energia necessária para a síntese do metabólito. Isto

implica:

- que é necessário estimar-se o rendimento baseado no oxigênio consumido e o

coeficiente de manutenção para as novas condições, ou seja, que os mesmo

variaram e não podem ser assumidos como iguais ao período anterior.

- O valor do coeficiente de respiração deve ser menor que o inicial (1, para o caso de

açúcares simples), pois existe um consumo de O2 não associado à síntese de

biomassa e portanto, se diminui a produção de CO2

c) Crescimento não associado:

Este padrão cinético corresponde a um processo onde se deseja produzir um

metabólito, o qual começa a ser produzido após a síntese de maior parte da biomassa, ou seja,

no final da fase exponencial. Neste caso, o Qr também será diferente de 1 e deve ser estimado

segundo condições específicas.

Baseando-se no exposto anteriormente, quando se trata de FES, pode-se considerar o

seguinte, a respeito do padrão respirométrico do processo:

a) Se o quociente respirométrico é aproximadamente igual a 1, pode-se considerar

que, em todo o período, o rendimento biomassa:consumo de oxigênio (Yx/o) e o

coeficiente de manutenção (m) são constantes.

b) Se existe uma tendência para Qr < 1, é válido assumir a possibilidade da produção

de um ou mais metabólitos não constitutivos que até o momento não haviam sido

31

produzidos. A partir deste ponto, é indispensável calcular-se novos valores para

Yx/o e m.

c) Quando Qr > 1, deve-se considerar que a maior produção de CO2 relacionada ao

consumo de O2, corresponde a um mau funcionamento da aeração, existindo zonas

anaeróbicas no sistema.

Deve-se lembrar que todas estas considerações são baseadas no consumo de açúcares

simples. Quando se trabalha com outra fonte de substrato a rota metabólica particular do

mesmo deve ser levada em conta, de modo a se determinar valores adequados para Qr.

3. SUBSTRATOS

3.1 CAFÉ

O cafeeiro pertence ao grupo das plantas Fanerógamas, classe Angiosperma, subclasse

Dicotiledônea, ordem Rubiales, Família das Rubiáceas, gênero Coffea. É uma planta de porte

arbustivo, caule lenhoso, lignificado, reto e quase cilíndrico. Pode chegar naturalmente de 10

a 12 metros, mas na sua cultura é mantido a 2 ou 3 metros para facilitar a colheita dos frutos.

Suas folhas são opostas, inteiras, tendo coloração verde mais escura e brilhante na parte

superior do limbo, e mais clara e opaca, com nervuras salientes, na parte inferior. Nos ramos

laterais e nas axilas das folhas, são formadas as gemas florais, que dão origem à floração e

frutificação. As flores são normalmente brancas, podendo ser amareladas e rosa claro,

apresentando 5 pétalas em Coffea arábica. (MATIELLO, 1991; COMITÉ FRANÇAIS DU

CAFÉ, 1997).

O fruto do café é uma drupa elipsoidal com três eixos: um longitudinal mais comprido

e dois transversais de diferente dimensão, devido à posição das duas sementes plano convexas

que contém. É constituído pelo pericarpo, onde podem se distinguir três camadas de tecidos:

as duas mas externas (epicarpo e mesocarpo), que em conjunto se designam comumente por

“polpa”, constituem uma zona suculenta e facilmente desintegrável do fruto; a mais interna,

chamada “pergaminho” é uma camada dura de fibras amareladas que envolve cada uma das

sementes (figura 4). No cafeeiro arábica, polpa e pergaminho separam-se facilmente, no

robusta, aderem mais. (MATIELLO, 1991; CARDOSO, 1994).

32

FIGURA 4 - CORTE LONGITUDINAL DE UMA CEREJA DE CAFÉ (C. ARABICA).

Partes representadas – 1. epicárpio (pele); 2. disco; 3. mesocarpio (polpa);4. endocárpio (pergaminho); 5. espermoderma (película prateada); 6. embrião.

FONTE: BRESSANI, 1978

3.1.1 Panorama da produção

Os maiores produtores mundiais do café são Brasil, Colômbia, México e Guatemala,

onde se destaca o plantio do café arábica, e Indonésia, Vietnã, Costa do Marfim, Índia,

Uganda e Etiópia, onde predomina o plantio do café robusta (figura 5). No final da década de

70 a área cultivada com café no mundo era de 10 milhões de hectares, evoluindo para 13,5

milhões de hectares no final da década de 80, quando começou a cair. Hoje situa-se em torno

de 11,5 milhões de hectares (SEAB, 1999; IAPAR, 2002).

FIGURA 5 - MAIORES PRODUTORES MUNDIAIS DE CAFÉ, SAFRA DE 2001/02(Valores dados em milhões de sacas de 60 kg)

SAFRAS 2001/02

3,77

3,83

4,65

11,00

12,25

33,70

24,313,303,25

5,98

4,70

Uganda

Costa do Marfim

Etiópia

Guatemala

Índia

México

Indonésia

Colômbia

Vietnam

Brasil

Outros

FONTE: ABECAFÉ, 2002

O Brasil é o maior produtor de café do mundo, e as exportações brasileiras têm

aumentado ano a ano, chegando a 18,8 milhões de sacas de 60 kg, em 2000. O Paraná é o 4 º

produtor nacional de café, sendo que a estimativa do valor bruto da produção desse produto

na agropecuária paranaense em 1999 é de R$310,00 milhões (SEAB, 1999; ABECAFÉ,

33

2002). O café é responsável por significativa geração de divisas para o país, da ordem de 2,5

bilhões de dólares por ano. Ele tem, ainda, efeito multiplicador na forma de taxas e impostos

arrecadados pelos governos dos Estados e dos municípios e resulta em renda e empregos para

os setores de comércio e indústria (MATIELLO, 1991).

3.1.2 Processamento do café

Do ponto de vista econômico, o café tem sido por muitos anos um dos cultivos mais

rentáveis tanto na América Latina como em outras regiões do mundo. Apesar de a

produtividade ter aumentado, o método utilizado para processar o fruto de café não tem

sofrido grandes modificações com o passar dos anos (ELÍAS, 1978).

O café é plantado a partir de mudas produzidas em viveiros. As mudas são o resultado

de uma cuidadosa seleção das melhores sementes, que podem gerar árvores sadias e

resistentes. O plantio é feito em espaços projetados para permitir um bom crescimento e o

trabalho de manutenção das árvores, do solo e da colheita. As áreas destinadas à lavoura são

sempre as mais nobres e valorizadas de cada região. O café é uma das culturas que mais

emprega mão de obra e exige cuidados durante todo o ano (ABIC, 2002).

A colheita no Brasil vai de junho a outubro, incluídas as fases de colheita dos frutos

das árvores, transporte, secagem e limpeza nos terreiros e mais o benefício (remoção da polpa

e pergaminho) e a preparação por tipos. No Brasil, a maior parte dos produtores fazem a

colheita retirando todos os frutos dos ramos ao mesmo tempo (conhecido como derriça). Nos

países produtores da América Latina e Central (Colômbia, Costa Rica, Jamaica,...) a colheita é

feita fruto à fruto, escolhendo somente os que estiverem totalmente maduros (colheita

manual). O trabalho no Brasil é muito mais mecanizado que em outros países, embora a

colheita manual traga um certo valor agregado maior entre os grandes compradores (ABIC,

2002).

Existem duas tecnologias de preparação dos grãos do café: vias úmida e seca. Na

figura 6, a seguir, é apresentado um esquema que mostra as principais etapas de ambos os

processamentos, com os subprodutos gerados. No Brasil, o processo de seleção e descasque

do café é feito principalmente por via seca. Este proporciona a migração dos açúcares da

polpa para o grão, resultando numa bebida mais encorpada e menos ácida. A colheita feita por

derriça, causa um aspecto visual não uniforme (ABIC, 2002).

34

FIGURA 6 - ESQUEMA DAS PRINCIPAIS ETAPAS DOS PROCESSOS DE BENEFICIAMENTODO CAFÉ E SUBPRODUTOS GERADOS

O café colhido é lavado, resultando em duas frações: o café chamado “bóia” e o café

“miúdo”. As duas frações são, então, secas separadamente. Então o café vai uma etapa de

beneficiamento, na qual os grãos são separados de impurezas através de peneiras vibratórias.

O café limpo sofre então o descasque, em descascadores de percussão ou fricção. Nestas

máquinas o café “coco” é impulsionado violentamente pela rotação de um cilindro horizontal

contra lâminas de aço. Dessa forma, os tecidos secos do epicarpo mesocarpo e endocarpo que

o envolviam são quebrados e, em conseqüência, separam-se das sementes. A separação das

cascas é feita por ventilação que as lança para fora em montes ou depósitos próprios fora do

armazém. Esta casca constitui o principal resíduo da industrialização do café, representando

cerca de 50% em massa, do mesmo. O café descascado é selecionado, embalado e enviado

para a indústria de torrefação e de fabricação de café solúvel (MATIELLO, 1991;

CARDOSO, 1994, MASSON, et al., 1984 a; 1984 b).

3.1.3 Casca de café

Como mostrado no item anterior, tem-se a casca de café como principal subproduto no

processo por via seca, representando cerca de 50% em massa do mesmo, chegando à uma

35

produção anual superior de um milhão de toneladas no Brasil. Esse resíduo praticamente não

é aproveitado, sendo deixado em pilhas perto das fazendas e causando um grande problema

ambiental.

Apesar de seu potencial poluente e de sua riqueza nutricional (composição próxima à

do grão), existem poucos trabalhos na sua caracterização e possível utilização como matéria

prima para a indústria. A maioria dos trabalhos existentes foram feitos por pesquisadores de

países da América Latina como México, Cuba, Guatemala e tratam do aproveitamento da

polpa, uma vez que este é o principal resíduo gerado no processamento por via úmida, feito

por esses países. A casca do café é formada pela polpa (epicárpio + mesocárpio) e o

pergaminho (endocárpio), a primeira representando cerca de 75%. Dessa forma, a composição

química e as possíveis utilizações são semelhantes (tabela 1).

TABELA 1 - COMPOSIÇÃO QUÍMICA MÉDIA DE PARTES DO CAFÉ (EM BASE SECA).COMPONENTE GRÃO CASCA POLPA

Proteína bruta (%) 9,5 – 15,9 9,2 - 11,3 8,4 - 12,8Matéria graxa (%) 5,0 – 13,0 1,7 - 2,0 2,2 - 2,9Celulose + Hemicelulose (%) 10,0 – 20,0 13,3 - 27,6 20Cinzas (%) 2,5 – 4,5 3,3 – 6,8 5,0 - 9,4Açucares redutores (%) 12,4 9,6 - 12,4Taninos (%) 2 4,5 1,8 – 8,56Cafeína (%) 1,8 – 2,6 0,9 0,7 - 1,3

FONTES: TANGO, 1971 - grão e casca; PEÑALOZA et al., 1985, ELÍAS, 1978 - polpa.

3.1.3.1 Potenciais utilizações

Tradicionalmente a casca e polpa de café só encontram uso em poucas aplicações,

como fertilizantes, composto e ração de animais de granja. Essas aplicações utilizam apenas

uma fração dos resíduos disponíveis (PANDEY et al., 2001)

Tem-se estudado a possibilidade de sua utilização para alimentação de gado, devido à

sua composição química. A maior dificuldade é a presença de compostos antifisiológicos

como cafeína e taninos que podem causar transtornos estomacais nos animais. Portanto, uma

ensilagem torna-se necessária para eliminação destes compostos Dessa forma, trabalhos vem

sendo feitos no sentido de detoxificar a casca (ou a polpa) do café através de processos de

fermentação no estado sólido, utilizando-se microrganismos que metabolizem os compostos

tóxicos, utilizando-os em seu crescimento. Os principais microrganismos estudados são dos

gêneros Aspergillus, Penicillium e Rhizopus, chegando-se à reduções em 100, 98 e 87% de

cafeína, respectivamente (BRAND, 1999; BRAND et al., 2000, 2001, 2002).

Outra possibilidade é servir-se da casca de café como meio de cultivo para

microrganismos, produzindo biomassa ou metabólitos secundários, uma vez que sua

36

composição química é rica e equilibrada, inclusive quanto à existência de micronutrientes

fundamentais para o crescimento de microrganismos (tabela 2).

Estudos feitos no Laboratório de Processo Biotecnológicos da UFPR indicam a

possibilidade de produção de cogumelos, aromas, enzimas e gomas (SOARES, 1998; LEIFA,

1999; WOICIECHOWSKI, 2001; MACHADO, 2000; SOCCOL, 2002). Deve-se levar em

conta, porém, que também neste caso, a presença de compostos como cafeína e fenólicos

pode influenciar no metabolismo do microrganismo (tabela 3).

TABELA 2 - COMPOSIÇÃO MINERAL DA POLPA DE CAFÉELEMENTO CONTEÚDO

Potássio (mg %) 1765Cálcio (mg%) 554Fósforo (mg %) 116Sódio (mg %) 100Ferro (mg %) 15Boro (ppm) 26Manganês (ppm) 6,25Cobre (ppm) 5Zinco (ppm) 4Magnésio (ppm) Traços

FONTE: ELÍAS, 1978.

TABELA 3 - COMPOSTOS ANTIFISIOLÓGICOS DA POLPA DE CAFÉCOMPOSTO CONTEÚDO

Cafeína 1,3Tanino (ácido tânico) 1,8 – 8,56Ácido clorogênico 2,6Ácido caféico total 1,6

FONTE: ELÍAS, 1978

4. MANDIOCA

A mandioca é uma planta pertencente à família das euforbiáceas. O gênero “Manihot”

apresenta várias espécies que são cultivadas no Brasil e, dependendo do teor de ácido

cianídrico em suas raízes, ela pode ser chamada brava ou mansa. Sua cultura adapta-se às

condições ecológicas mais variadas, podendo ser cultivada em áreas de altas precipitações

pluviais, superiores a 2000 mm/ano, clima equatorial como em áreas de clima semi-árido,

com precipitações inferiores a 1000 mm/ano. O Brasil é considerado o maior centro de

difusão da sua cultura, seguido da América Central (CARIOCA e ARORA, 1984, BEZERRA,

2000).

É uma planta arbustiva lenhosa perene, de 1,3-5 m de altura, semeada através de

estacas retiradas das ramas, as quais demonstram uma forte dominância apical, que leva ao

desenvolvimento de raízes laterais armazenadoras de grande quantidade de amido (figura 7).

37

Cada planta pode produzir de 5 a 10 tubérculos, e cada tubérculo chega a atingir de 20-80 cm

de comprimento e 5-10 cm de diâmetro. O peso seco dos tubérculos varia de algumas

centenas de gramas a 5 quilogramas. A tabela 4 abaixo mostra a composição média dos

tubérculos (BEZERRA, 2000; PANDEY et al., 2001; PANDEY et al., 2000).

FIGURA 7 - PLANTA DE MANDIOCA

A mandioca apresenta elevada eficiência na conversão de energia solar em carboidrato

sendo capaz de fornecer produtos de alto valor energético. O amido armazenado nas raízes

tuberosas da planta é de largo emprego na alimentação humana e animal e na indústria.

(CARIOCA e ARORA, 1984). Além da destacada importância na alimentação humana e

animal, as raízes de mandioca são também utilizadas como matéria-prima em inúmeros

produtos industriais.

TABELA 4 - COMPOSIÇÃO MÉDIA DE RAÍZES DE MANDIOCA (em base de 100 g)COMPONENTE BASE ÚMIDA

Calorias (kcal) 135Umidade (%) 65,5Proteínas (g) 1,00Lipídios (g) 0,2Amido (g) 32,4Fibras (g) 1,1Cinzas (g) 0,9Cálcio (mg) 26Fósforo (mg) 32Ferro (mg) 0,9Sódio (mg) 2Potássio (mg) 394Vitamina B2 (mg) 0,04Vitamina C (mg) 34Niacina (mg) 0,6Cianida (%) ---

38

4.1.1 Panorama da produção

Originária da América do Sul, a mandioca constitui um dos principais alimentos

energéticos para cerca de 500 milhões de pessoas, sobretudo nos países em desenvolvimento,

onde é cultivada em pequenas áreas com baixo nível tecnológico.

Mais de 80 países produzem mandioca, sendo que o Brasil participa com mais de 15%

da produção mundial (figura 8). De fácil adaptação, a mandioca é cultivada em todos os

estados brasileiros, situando-se entre os nove primeiros produtos agrícolas do País, em termos

de área cultivada, e o sexto em valor de produção (EMBRAPA, 2002).

FIGURA 8 - PRINCIPAIS PAÍSES PRODUTORES DE MANDIOCA (safra de 1998)

(FONTE: FAO, 2002)

O Paraná é o segundo produtor nacional de mandioca, destacando-se pela

produtividade ao redor de 21 toneladas/ha, gerando cerca de 3,4 milhões de toneladas de

raízes de mandioca anualmente, que corresponde a mais de 15% da produção nacional. Cerca

de 70% das raízes são destinadas para a indústria. Em todo estado, estão envolvidos com a

produção da mandioca mais de 30 mil produtores que plantam tanto para o mercado quanto

em regime de subsistência, para a sua própria alimentação e a de seus animais (TECPAR,

2002).

4.1.2 Processamento da mandioca

Grande parte das raízes de mandioca é utilizada para a produção de fécula de

mandioca, amidos modificados e maltodextrina. A seguir (figura 9), descreve-se o fluxograma

de uma indústria de processamento de raízes de mandioca e resíduos gerados.

Principais produtores (1998)

6,00

7,18

7,85

15,42

20,93

33,06

38,97

16,50

16,51

5,653,65

China

Moçambique

India

Tanzânia

Gana

Indonésia

Congo

Tailândia

Brasil

Nigéria

Outros

39

FIGURA 9 - FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO DE RAÍZES DE MANDIOCA

4.1.3 Bagaço de mandioca

O bagaço de mandioca contém por volta de 40-70% de amido com uma granulometria

de 1 a 200 µm. A sua composição físico-química bastante variável é mostrada na tabela 5.

TABELA 5 - COMPOSIÇÃO FISICO-QUÍMICA DO BAGAÇO DE MANDIOCACOMPOSIÇÃO

(g/100g MS)SOCCOL

1994CEREDA

1994KOLICHESKI

1995STERTZ

1997VANDENBERGHE

2000Umidade 5,02 9,52 8,96 10,70 9,51Proteína 1,57 0,32 1,61 1,60 0,24Lipídios 1,06 0,83 0,93 0,53 0,53Fibras 50,55 14,88 13,95 22,20 22,20Cinzas 1,10 0,66 1,44 1,50 0,65Carboidratos 40,50 63,85 48,60 63,40 67,54

40

4.1.3.1 Utilizações potenciais

O bagaço de mandioca não contém ácido cianídrico, apesar disso seu baixo teor

protéico o torna inadequado para utilização em ração animal. Por outro lado, devido à sua

baixa concentração de cinzas e alto conteúdo de carboidratos este resíduo torna-se um

material interessante como substrato para processos biotecnológicos, especialmente com

microrganismos que possuam a capacidade de converter amido em açúcares fermentescíveis.

Abaixo, no quadro 7, são mostrados os principais microrganismos utilizados em fermentação

de bagaço de mandioca, o sistema fermentativo utilizado e o produto obtido:

QUADRO 7 - PROCESSOS FERMENTATIVOS UTILIZANDO BAGAÇO DE MANDIOCAMICRORGANISMO PROCESSO PRODUTO AUTORA. niger LPB 21 FES Ácido cítrico KOLICHESKI et al., 1995A. niger NRRL 2001 FES Ácido cítrico VANDENBERGHE et al., 1999A. niger CFTRI 30 FES Ácido cítrico SHANKARANAD & LONSANE, 1994Candida lipolitica FSM Ácido cítrico VANDENBERGHE et al, 1998C. fimbriata FES Aromas CHRISTEN et al. 1997C. fimbriata FES Aromas BRAMORSKI et al., 1998AK. marxianus FES Aromas MEDEIROS, 1998L. edodes FES Cogumelo BEUX et al., 1995P. sajor-caju FES Cogumelo BARBOSA et al., 1995Rhizopus sp FSM Acido fumárico CARTA et al., 1999R. oryzae FES Aromas BRAMORSKI et al., 1998B

41

MMAATTEERRIIAALL EE MMÉÉTTOODDOOSS

A parte experimental do presente trabalho foi toda desenvolvida no Laboratório de

Processos Biotecnológicos da UFPR, exceto pelos ensaios biológicos que foram feitos na

Embrapa Hortaliças em Brasília.

5. MICRORGANISMO E SUBSTRATOS

5.1 MICRORGANISMO

A cepa de Gibberella fujikuroi LPB-06, é pertencente à micoteca do LPB e foi isolada

de uma planta infectada. O fungo é repicado em tubos inclinados contendo ágar dextrose-

batata (BDA), incubado a 32 ºC, por um período de 8 dias e conservado à 4 ºC durante o

período máximo de 90 dias. O procedimento para preparo da solução-semente utilizada como

inóculo na FES é mostrado na figura 10, a seguir (BANDELIER, et al., 1996, MACHADO,

2000).

FIGURA 10 - ESQUEMA DA PRODUÇÃO DE INÓCULO PARA FERMENTAÇÃO

42

5.2 SUBSTRATOS

A casca de café utilizada foi cedida pelo Instituto Tecnológico do Paraná (TECPAR),

chegou ao LPB em sacas de 10 kg. O bagaço de mandioca foi proveniente da indústria Lorenz

(Quatro Pontes, PR). No laboratório ambos os substratos foram triturados em moinho de disco

(ALPHA) e selecionados em peneiras, sendo utilizadas, nesta tese, as partículas entre 0,8 e

2,0 mm.

O meio sólido consiste em casca de café pré-tratada (CC) com solução alcalina KOH

0,25% em autoclave a 100 ºC por 45 minutos e bagaço de mandioca (BM) na razão 7:3. O

pré-tratamento da casca de café é necessário para a remoção de componentes como ácidos

caféico, clorogênico e tânico presentes neste resíduo e que são inibidores da biossíntese de

GA3. A adição de BM ao meio de cultivo é feita para um deslocamento da razão C:N natural

da casca de café, conforme mostrado no item 1.8.1.

O pH (entre 5,0 e 5,4) e a umidade foram ajustados pela adição de solução salina

constituída por 30 mg de FeSO4 e 10 mg de (NH4)2SO4 /100 ml H2O Este meio foi então

esterilizado em autoclave a 121 oC por 20 minutos. O pré-tratamento, a razão CC:BM, o pH

e a solução salina utilizados foram otimizados em trabalhos anteriores (MACHADO, 2000;

SOCCOL, 2001).

6. ANÁLISES DO FERMENTADO

As análises físico-químicas efetuadas no material fermentado foram: umidade,

nitrogênio real, açúcares solúveis totais, não redutores e redutores, pH, atividade de água,

perda de peso do substrato e produção de ácido giberélico, segundo as metodologias descritas

a seguir:

a) Umidade: método termogravimétrico: 100 –105 ºC (IAL, 1985);

b) Atividade de água (aw): medidor de aw marca Aqualab, modelo CX-02;

c) pH: uso de potenciômetro (LABSTORE, PL-800) em uma suspensão obtida após

homogeneização por agitação de 5g de amostra diluída em 50 mL de água destilada.

d) Perda de peso do substrato: diferença de peso percentual entre as colunas

empacotadas antes e após a fermentação

e) Proteína real: precipitação da proteína real pelo método de Stutzer (VERVACK,

1973) e posterior quantificação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl (IAL,1985);

f) Açucares solúveis totais, redutores e não redutores: método espectrofotométrico de

Somogyi-Nelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945);

43

g) Biomassa: calculada como o dobro do ganho de proteína real, assumindo-se que

50% da biomassa é proteína. Fez-se um ajuste considerando-se que o nitrogênio

consumido é proporcional à perda de peso do substrato (ABDULLAH, TAGERDY

& MURPHY, 1985).

h) Ácido Giberélico: extração do metabólito com tampão fosfato pH 7,4 e

quantificação por método espectrofotométrico a 254 nm (HOLBROOK et al., 1961),

de acordo com a figura 11, a seguir.

FIGURA 11 - EXTRAÇÃO E ANÁLISE DO ÁCIDO GIBERÉLICO

7. PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA

A primeira etapa deste trabalho constituiu-se no estudo da produção de ácido

giberélico em colunas de aeração forçada. Inicialmente fez-se uma otimização das condições

de fermentação, partindo-se dos parâmetros determinados em frascos erlenmeyer

(MACHADO, 2000). Em seguida, foram feitos cálculos cinéticos do crescimento microbiano

e produção de GA3. Finalmente, fez-se a análise respirométrica da fermentação em colunas e

correlação entre a produção de gases e a biomassa.

44

7.1 SISTEMA DE FERMENTAÇÃO

Os incubadores são constituídos por colunas de vidro de 3,5 a 4,0 centímetros de

diâmetro por 20 a 25 centímetros de altura e com volume aproximado de 250 cm3. Cada

incubador está ligado a uma válvula que permite ajustar o fluxo de ar ao valor desejado,

controlado através de um rotâmetro (OMEL) na saída de ar da coluna.

As colunas são conectadas a erlenmeyers (250 ml) contendo água destilada para

umedecer o fluxo de ar por borbulhamento, antes de sua passagem pelo incubador. O controle

de temperatura da água contida na cuba é obtido através de um termostato. A água contida na

cuba é agitada, lentamente com ar, para homogeneização da temperatura (figura 12).

FIGURA 12 - ESQUEMA DO SISTEMA DE FERMENTAÇÃO EM COLUNAS DE AERAÇÃOFORÇADA COM RESPIROMETRIA UTILIZADO NESTE TRABALHO

ONDE: 1. injeção de ar com pressão regulada; 2. banho de água com temperatura controlada;3. fermentadores em coluna; 4. tubos com sílica-gel; 5. amostrador de gás;

6. injetor de gás; 7. cromatógrafo gasoso; 8. computadorFONTE: SAUCEDO-CASTAÑEDA et al. (1994)

Em todas as fermentações para este sistema, inoculou-se 15% v/m de solução-semente

ao meio sólido úmido com pH ajustado entre 5,0 e 5,4. Esse material foi então empacotado

nas colunas de aeração forçada. A fermentação deu-se em banho de água para as colunas

aeradas a 29 ºC, por 7 dias.

7.2 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA

Inicialmente foi feito um estudo de mudança de sistema fermentativo, utilizando-se

um biorreator do tipo colunas de aeração forçada, partindo-se das condições otimizadas para

os frascos erlenmeyer (MACHADO, 2000).

45

Para o melhor ajuste das variáveis foram necessários três experimentos, todos

completos 3(2-0), com duas repetições do ponto central, resultando em 11 colunas (ensaios).

Após sete dias de fermentação as colunas foram retiradas e analisadas quanto ao seu conteúdo

de GA3.

No planejamento e verificação dos resultados utilizou-se o programa Statística da

Statsoft. Além da produção de ácido giberélico, determinou-se após sete dias de fermentação a

perda de peso do substrato, umidade, atividade de água e pH finais do mesmo.

7.2.1 Primeira otimização em colunas aeradas

Para fermentação em frascos erlenmeyer, com o mesmo substrato utilizado neste

trabalho, a umidade ótima para produção de GA3 é de 77% (MACHADO, 2000, SOCCOL,

MACHADO & OLIVEIRA, 2001). Uma vez que em colunas é feita aeração com ar saturado,

considerou-se que provavelmente níveis menores de umidade seriam adequados. Portanto, na

primeira otimização foram testados valores entre 63 e 68%.

Para determinarem-se os níveis de aeração a serem estudados inicialmente na

produção de GA3 em colunas partiu-se dos valores usados por outros autores – 0,46 l ar.(h.g

MS)-1 (GELMI et al., 2000) e 0,42 l ar.(h.g MS)-1 (TOMASINI et al., 1997).

TABELA 6 - CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO – PRIMEIRA OTIMIZAÇÃONÍVEL AERAÇÃO

(l.h-1.g-1)UMIDADE

(%)- 1 0,24 630 0,48 65

+ 1 0,72 68

7.2.2 Segunda otimização em colunas aeradas

A partir dos resultados obtidos na primeira otimização, decidiu-se manter os níveis de

aeração do teste anterior, aumentando-se a umidade inicial do meio de cultivo (Tabela 7).

TABELA 7 - CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO – SEGUNDA OTIMIZAÇÃONÍVEL AERAÇÃO

(l.h-1.g-1)UMIDADE

(%)- 1 0,24 680 0,48 73

+ 1 0,72 78

7.2.3 Terceira otimização em colunas aeradas

Na terceira otimização aumentou-se ainda mais a umidade inicial do meio de cultivo.

Como a importância de grande quantidade de oxigênio para a produção de GA3 é bem

conhecida (item 1.8.5), considerou-se que um fluxo muito alto no início da fermentação

46

provavelmente prejudicaria o crescimento do fungo. Dessa forma, neste experimento, a

aeração foi mantida em 0,18 l ar.(h.g MS)-1 pelas primeiras 72 horas de fermentação, em

todos os níveis, e após este período foi aumentada, como mostrado na tabela 8.

TABELA 8 - CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO – TERCEIRA OTIMIZAÇÃONÍVEL AERAÇÃO

(l.h-1.g-1)UMIDADE

(%)- 1 0,18 – 0,24 780 0,18 – 0,72 80

+ 1 0,18 – 1,20 82


Retiraram-se duas colunas a cada 24 horas, a partir do 1º dia. Em cada uma delas

foram analisados, além da produção de GA3, o pH, a atividade de água e umidade final do

meio, perda de peso, nitrogênio real, açúcares não redutores e redutores, segundo as

metodologias descritas no capítulo 6 deste trabalho.

As condições de fermentação foram: umidade inicial do meio de cultivo – 77%;

aeração nas primeiras 72 h – 0,24 l ar.(h.g MS)-1, e após esse período – 0,72 l ar.(h.g MS)-1.

Os parâmetros cinéticos foram calculados de acordo com o explanado no capítulo 2.7

deste trabalho, utilizando-se as equações a seguir.

a) Taxa de crescimento específico (µ):

∫∫ = 2

1

2

1

t

t

X

Xdt

X

dX µ (21)

Ao longo da fermentação a taxa de crescimento específico não é constante. Porém,

tomando-se pequenos intervalos de tempo, fez-se uma aproximação considerando-se que o µ

nestes intervalos (a cada 24 horas) é constante. Assim, tem-se a cada ∆t:

12

12 lnln

tt

XX

−−

=µ (22)

onde: X = concentração da biomassa (g.(kg MS)-1);

t = tempo (h);

µ = taxa de crescimento específico (h-1).

A taxa de crescimento específico máximo (µmax) é calculada pela mesma equação (22),

sendo considerado o intervalo de tempo onde há crescimento exponencial. A taxa de

crescimento específico global ( µ ) foi calculada como a média das taxas de crescimento

específico diárias.

47

b) Consumo horário de substrato (rS)

O rs é dado pela seguinte equação:

dt

dSrS −= (23)

Integrando-se a equação e utilizando-se o mesmo raciocínio feito para a taxa de

crescimento específico, tem-se o rS a cada 24 horas de fermentação, de acordo com a equação

24 a seguir:

12

21

tt

SSrS −

−= (24)

onde: S = concentração do substrato (g.(kg MS)-1);

t = tempo (h);

rS = consumo horário de substrato (g.(kg MS.h)-1).

O consumo horário máximo de substrato (rSmax) é calculado pela mesma equação (24),

no período linear de maior consumo de substrato. O consumo horário global de substrato Sr é

dado pela média dos valores de rS diários.

c) Produção horária de GA3 (rP)

É calculado de forma similar ao rS, fazendo-se as mesmas considerações para a

produção horária máxima (rPmax) e global ( Pr ) de GA3 (equação 25).

12

12

tt

PPrP −

−= (25)

onde: P = concentração de GA3 (g.(kg MS)-1);

t = tempo (h);

rP = produção horária de GA3 (g.(kg MS.h)-1).

7.4 RESPIROMETRIA

Na mesma fermentação onde foi feita a cinética do crescimento microbiano e

produção de metabólito também se fez a análise da respiração dos microrganismos

(respirometria). Para tanto, foram acopladas quatro colunas de fermentação ao cromatógrafo

gasoso, que injetava automaticamente a cada 15 minutos uma amostra da corrente gasosa de

saída das mesmas. Os resultados obtidos foram considerados como uma quadruplicata e fez-se

a média dos mesmos para análise dos dados.

48

O sistema de análise de dados é constituído de um cromatógrafo gasoso equipado de

detector de condutividade térmica ligado a um computador. O programa de integração dos

cromatogramas CHROMA da sociedade BIOSYSTEMES realiza o cálculo das

concentrações. O programa possibilita também controlar as saídas externas através de

programação em BASIC para gerenciar as amostragens. Este dispositivo permite acompanhar

de forma contínua a evolução dos gases ao longo da fermentação para várias colunas

simultaneamente.

7.5 CORRELAÇÃO ENTRE A BIOMASSA E O CO2 PRODUZIDO

Para a determinação de uma correlação entre a biomassa e o CO2, inicialmente

determinou-se o CO2 acumulado produzido, definido como a integral da produção de CO2

com o tempo, ou seja:

∫=t prod

acumdt

dCOCO

0

22 (26)

Para a determinação de valores de biomassa em todos os tempos onde havia tomada de

amostra para CO2, escolheu-se um modelo matemático logístico, de perfil sigmoidal, que

segundo GELMI et al. (2000) ajusta-se bem à FES de G. fujikuroi para a produção de GA3:

cteb

a

atX

−−+=

)1(1)( (27)


t = tempo (h);

Então, a cada tempo onde havia tomada de amostra para CO2, determinou-se, pela

equação 27, valores teóricos de biomassa. A partir destes dados fez-se um gráfico CO2

acumulado X biomassa, determinando-se finalmente a curva logarítmica que correlacionava

estes dois dados (28)

zCOyLnXacum

+= )( 2 (28)

onde: X = concentração da biomassa (g.(kg MS)-1) em um determinado tempo

CO2acum = CO2 acumulado (mg.(kg MS)-1) em um determinado tempo

8. PRODUÇÃO DE GA3 EM REATOR ESCALA PILOTO

Foram estudadas diferentes condições de produção de ácido giberélico por FES em

reator escala piloto. Para tanto, a cada 24 h de fermentação foi feita uma medida de

49

temperatura no substrato fermentado e então, retirada uma amostra de cerca de 50 g. Nesta

amostra além da concentração de GA3 eram analisados o pH, a atividade de água, umidade

final do meio e nitrogênio real, segundo as metodologias descritas no capítulo 6 deste

trabalho e feita a análise respirométrica.

8.1 SISTEMA DE FERMENTAÇÃO

O reator trabalha em batelada ou batelada-alimentada com capacidade para 10 kg de

substrato úmido. Consiste de um cilindro horizontal, com dimensões internas de 30 cm de

diâmetro e 35 cm de comprimento construído em aço inox 360 (figura 13).

O sistema de aeração envolve um duplo casco onde dentro existe um tubo perfurado

por onde passa ar. Dessa forma, tem-se um “colchão de ar” envolvendo todo o substrato,

minimizando, assim os problemas de caminho preferencial do ar ao longo da fermentação. A

alimentação de ar é feita na parte inferior e a saída na parte superior favorece a circulação de

ar por todo o leito. O ar é introduzido via um compressor pequeno e borbulhado em água

aquecida ou a temperatura ambiente. (figura 14).

FIGURA 13 - FOTOGRAFIA DO BIORREATOR EM ESCALA PILOTOUTILIZADO NOS EXPERIMENTOS

A agitação foi feita periodicamente através de pás paralelas ao casco, numa velocidade

muito baixa (5 rpm). Dessa forma, a agitação é por tombamento do material e não por

cisalhamento do mesmo.

Em todas as fermentações as condições foram: umidade inicial do meio – 77%; pH

inicial entre 5,0 e 5,4, temperatura desejada 29 ºC, inóculo de 15% massa:volume de solução-

semente ao meio sólido, tempo de fermentação de 6 dias.

50

FIGURA 14 - DESENHO ESQUEMÁTICO DO FUNCIONAMENTODO BIORREATOR COM RESPIROMETRIA

8.2 CONDIÇÕES ESTUDADAS

Diferentes condições de fermentação foram estudadas no biorreator: condições

semelhantes as das colunas de aeração forçada, uma fermentação tipo batelada-alimentada

com parâmetros de fermentação semelhantes a anterior e fermentação com baixa aeração

durante todo o processo.

8.2.1 Fermentação em batelada com condições semelhantes à coluna aerada

Neste primeiro experimento com o reator procurou-se reproduzir as condições da

cinética em colunas. A aeração foi de 0,12 l ar.(h.g MS)-1nas primeiras 72 h e após esse

período de 0,48 l ar.(h.g MS)-1. Não foi possível fazer-se uma aeração igual a realizada em

colunas porque com um peso muito maior de material (2000 g) houve dificuldade no ajuste da

vazão de ar.

8.2.2 Fermentação em batelada-alimentada

O sistema consiste em inicialmente colocar-se todo o inóculo com uma quantidade

controlada de substrato que é alimentado ao longo do tempo. Assim, no caso estudado

inoculou-se 500 g de substrato, com todo o inóculo (15% de 2000 g), e uma aeração de 0,12 l

ar.(h.g MS)-1. Então, após 24 h alimentou-se o reator com mais 500 g de substrato, e ajustou-

se a aeração, de modo a mantê-la constante em 0,12 l ar.(h.g MS)-1. Repetiu-se o

procedimento com 48 e 72 h de fermentação, chegando-se a uma massa total de 2000 g de

substrato. Com 96 h de fermentação a aeração foi aumentada para 0,3 l ar.(h.g MS)-1 e

mantida até 144 h.

8.2.3 Fermentação em batelada com aeração baixa

Aqui se testou um sistema com aeração muito baixa (0,06 l ar.(h.g MS)-1) por todo o

período de fermentação, simulando as condições de frasco erlenmeyer.

51


Foram feitos os cálculos cinéticos para os parâmetros relativos à produção de

biomassa e produto para os três sistemas de fermentação estudados, utilizando-se as mesmas

equações descritas no capítulo 7.3 deste trabalho.

8.4 RESPIROMETRIA

As análises respirométricas feitas em reator escala piloto foram realizadas da mesma

forma que em colunas de aeração forçada, exceto pela não existência de repetição de cada

ponto estudado. Foram usadas duas colunas, com corridas de 30 minutos. Em uma delas

passava o ar de saída do reator e em outra, ar ambiente (sem CO2). Assim, os pontos para

análise foram coletados de hora em hora.

8.5 CORRELAÇÃO ENTRE A BIOMASSA E O CO2 PRODUZIDO

Na fermentação em reator batelada com condições semelhantes à coluna, determinou-

se a correlação entre a produção de biomassa e CO2 ao longo da fermentação de maneira

similar à descrita no capítulo 7.5 deste trabalho.

Para os outros dois sistemas (batelada-alimentada e batelada com aeração baixa),

utilizou-se a equação de correlação obtida no sistema com condições semelhantes à coluna

para determinar-se a biomassa estimada, e os parâmetros cinéticos foram determinados a

partir destes valores.

9. BIOENSAIOS COM O METABÓLITO PRODUZIDO

Foram feitos bioensaios com o GA3 produzido por fermentação. Nesses ensaios

utilizou-se o extrato da fermentação em biorreator com condições semelhantes à coluna (que

obteve os melhores resultados). Este extrato foi mantido a 4 ºC por 60 dias, mantendo sua

concentração por este período.

9.1 INIBIÇÃO DO GA3 ENDÓGENO

Foram plantadas em solo comercial sementes de tomate em três caixas-teste com 128

células. Após 14 dias de emergência aplicou-se Pachlobutrazol 100 CEMR, numa diluição de

0,2% em água. Este produto, fabricado por Jianhu Pesticide Factory (China), é um regulador

de crescimento vegetativo por inibição da síntese de giberelinas na planta. Após três semanas

desta aplicação quando já havia um desenvolvimento das plantas foram retiradas ao acaso 15

52

mudas de cada caixa para controle da homogeneidade entre amostras e nas plantas

remanescentes foi feito o bioensaio com GA3 (figura 15).

FIGURA 15 - CAIXAS TESTE COM AS MUDAS DE TOMATEIRO

Onde: A = testemunha, B = GA3 testado, C = GA3 comercial

9.2 BIOENSAIO

Cada uma das caixas foi considerada um tratamento. No primeiro, a testemunha, fez-se

aspersão de água. No outro grupo foi feita aspersão de 200 mg GA3.(l H2O)-1, usando-se ácido

giberélico P.A., da marca Sigma Aldrich com 95% de pureza. No terceiro tratamento,

aplicou-se o extrato bruto em tampão fosfato pH 7,4 da fermentação. Diluiu-se o mesmo de

modo que a concentração de GA3 fosse a mesma que no tratamento com o produto comercial.

Após 4 e 8 dias da aplicação foram retiradas ao acaso 15 mudas de cada tratamento.

Estas foram lavadas e em seguida feitas medidas de comprimento da planta, peso da raiz, peso

da parte aérea das amostras. Foram reunidas as amostras de raiz e parte aérea de cada

tratamento, os grupos foram pesados e secos em estufa com circulação de ar por 48 h a 55ºC

para o cálculo do peso seco da raiz e parte aérea de cada tratamento.

53

RREESSUULLTTAADDOOSS EE DDIISSCCUUSSSSÃÃOO

10. PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA

As otimizações para a fermentação em colunas de aeração forçada foram feitas a partir

das condições otimizadas para produção de GA3 por FES, utilizando como substrato casca de

café e bagaço de mandioca em frascos erlenmeyer (MACHADO, 2000). Em seguida, , foram

feitos cálculos cinéticos e respirométricos nas melhores condições determinadas, para

verificação dos resultados obtidos na otimização e um estudo mais aprofundado da influência

da aeração no sistema.

10.1 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO

Segundo HAALAND (1989), a maior parte dos processos biotecnológicos não possui

modelos teóricos que possam ser usados para explicar todo o desenvolvimento do processo.

Conseqüentemente, uma pesquisa bem sucedida nesta área é caracterizada pela resolução do

problema empiricamente. Porém, existem, em geral, limitação de recursos e tempo, tornando

a produtividade do processo de importância crítica. Desta forma, o planejamento e a resolução

dos problemas utilizando ferramentas estatísticas dá melhor possibilidade de maximizar a

eficiência e produtividade de problemas empíricos.

Um experimento deve passar pelas seguintes etapas: “screening”, otimização e

verificação de dados. Experimentos de “screening” são aqueles em que são incluídas diversas

variáveis e por incluírem diversos fatores, não possuem muita informação por fator. Seu

objetivo é a redução do problema, ou seja, descobrir quais as variáveis realmente importantes

e qual a direção a tomar nos próximos experimentos. A proposta da otimização é a construção

de um modelo matemático que possa predizer o comportamento do processo investigado,

encontrando a região de reposta ótima. Para tanto, requer muita informação para cada fator,

necessitando assim, que se inclua somente os fatores com influência significativa em relação

aos outros. E finalmente a verificação é feita para comprovar-se o modelo determinado e

explicar o processo nas condições do experimento (HAALAND, 1989; BARROS-NETO,

SCARMINIO & BRUNS, 1996).

Como discutido no item 7.2 deste trabalho, foram apenas otimizadas aeração e

umidade. O primeiro fator por não ocorrer no sistema de frascos erlenmeyer, e o segundo por

ser a aeração das colunas feita com ar saturado, modificando o equilíbrio água-matriz sólida

54

do substrato. Portanto, como já se partiu de condições otimizadas, foi possível excluir a

primeira etapa do experimento, o “screening”.

Para a segunda etapa, foram necessárias três otimizações. A primeira e a segunda

utilizaram os mesmos níveis de aeração, uma vez que pela resposta obtida nas otimizações

pareceu não haver uma influência significativa da mesma. De fato, esperava-se que houvesse

um incremento expressivo na produção de GA3 com a inclusão da aeração no sistema, uma

vez que as etapas de biossíntese do mesmo são oxidações consecutivas. Porém, inicialmente

isso não foi observado. Na terceira otimização fez-se uma aeração de gradiente, baixa no

princípio, e a partir de 72 h aumentada em diferentes níveis.

10.1.1 Primeira otimização em colunas aeradas

Neste experimento, a maior produção obtida foi de 268 mg GA3.(kg MS)-1, com uma

umidade de 0,68 e aeração de 0,24 l ar.(h.g MS)-1. A produção foi baixa em relação ao melhor

valor obtido com frascos erlenmeyer (492,5 mg GA3.(kg MS)-1) com umidade de 78%. Mas

aqui foi demonstrada uma grande influência da umidade. Se comparado com a concentração

obtida com frascos erlenmeyer – 168,5 mg GA3.(kg MS)-1 para umidade de 65%, tem-se um

acréscimo de 60% na produtividade pela aeração (MACHADO, 2000).

No Diagrama de Pareto, é colocada, graficamente, a magnitude dos efeitos (mostrados

do maior para o menor) dos dados na variável resposta. Dessa forma, são demonstradas quais

as variáveis realmente importantes e qual a direção tomar nas próximas otimizações a serem

feitas (HAALAND, 1989; BARROS-NETO, SCARMINIO & BRUNS, 1996). Observando-se

o Diagrama de Pareto (figura 16), percebe-se que a única variável com influência significativa

dentro dos níveis estudados foi a umidade, sendo esta relação diretamente proporcional.

Uma vez que se estudou apenas duas variáveis, foi possível fazer um experimento

completo em três níveis, 3 (2-0), com duas repetições do ponto central, resultando em 11

amostras. Num experimento completo desse tipo, todas as interações possíveis entre os

fatores podem ser estimadas, inclusive quadráticas. Porém como mostrado no Diagrama de

Pareto, nesse caso não houve interações significativas entre as variáveis. Mesmo assim, na

superfície de contorno, no modelo matemático estimado e na ANOVA mostrados considerou-

se a interação linear entre as variáveis, uma vez que este foi o segundo fator mais influente no

experimento.

55

FIGURA 16 - DIAGRAMA DE PARETO, PRIMEIRA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

Nos experimentos de otimização utiliza-se a superfície de resposta como ferramenta

de avaliação do modelo obtido. Esta pode ser mostrada num gráfico tridimensional, onde a

altura corresponde à variável resposta, ou em curvas de nível (contorno de resposta), como

feito na figura 17, onde diferentes cores representam diferentes valores da variável resposta.

FIGURA 17 - CONTORNO DE RESPOSTA, PRIMEIRA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

Modelo matemático: z = -31072,52 + 90899,86*x - 65893,94*x^2 + 2021,12*y - 25,59*y^2 - 3078,51 *x*y

Onde: x = umidade;y = aeração (l ar.(h.g MS)-1);z = mgGA3.(kg MS)-1

A metodologia de superfície de resposta é constituída de duas etapas distintas: a

modelagem e o deslocamento. Estas etapas são repetidas tantas vezes quantas forem

necessárias (HAALAND, 1989; BARROS-NETO, SCARMINIO & BRUNS, 1996). Assim,

Primeira otimização em colunas aeradas

Variável resposta: mgGA 3 .kgsubstrato-1

onde: L = interação linear; Q = interação quadrática

Efeito estimado (valor absoluto)

,0746061

-,519584

,8223833

1,491009

-1,50763

2,185949

-2,81334

5,843132

p=,05

Aeração(Q)

1Lpor2Q

1Qpor2Q

1Qpor2L

(2)Aeração(L)

Umidade(Q)

1Lpor2L

(1)Umidade(L)

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

56

chega-se ao ponto ótimo quando a resposta desejada (superior ou inferior, conforme o caso)

aparecer inteiro no centro da superfície, sugerindo que o aumento ou diminuição de qualquer

fator irá afetar negativamente a variável resposta. Como observado na figura 17, neste

experimento ainda não se conseguiu que o ponto ótimo (neste caso o nível mais alto –

vermelho escuro) ficasse limitado na superfície. Assim, faz-se necessária uma nova

otimização.

Uma maneira de se avaliar o modelo obtido é considerar a análise de variância –

ANOVA (tabela 9). O procedimento usual de avaliação do desempenho de um modelo

começa pela análise dos desvios das observações em relação à média global. Esta análise é

representada pelo coeficiente de determinação (R2). O valor R2 pode ser interpretado como a

proporção da variância em y que pode ser atribuída à variância em x, que varia entre 0 e 1. O

melhor valor para R2 é 1, e ele só ocorrerá se não houver resíduo algum, e portanto, toda a

variação em torno da média for explicada pela regressão (BARROS NETO, SCARMINIO &

BRUNS, 1996).

Outros termos estatísticos utilizados na ANOVA são a razões F (F-value) e p (p-

value). A primeira mede quão grande é o coeficiente em relação ao erro padrão. Assim, uma

maior razão F em módulo relaciona-se a um fator mais significativo na variável resposta. A

razão p é a probabilidade que um determinado fator tem de aumentar sua razão F, ou seja, de

ter maior influência na variável resposta. Dessa forma, valores menores da razão p

relacionam-se com grandes razões F, pois isso implica que a razão F é muito maior que o erro

padrão (HAALAND, 1989).

TABELA 9 - ANOVA DA PRIMEIRA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

FATOR SOMA DOSQUADRADOS

GRAUS DELIBERDADE

MÉDIASQUADRADAS

RAZÃO F RAZÃO p

(1) Umidade (L) 20926,14 1 20926,14 34,14 0,0281Umidade (Q) 3894,15 1 3894,15 6,35 0,128(2) Aeração (L) 1419,08 1 1419,08 2,315 0,267Aeração (Q) 88,04 1 88,04 0,14 0,7411L por 2L 5531,66 1 5531,66 9,02 0,0952

R2 = 0,902Onde: F = razão entre a variabilidade das amostras e a variabilidade dentro da amostra;

P = nível de significância no intervalo de probabilidade escolhido (5%);R2 = coeficiente de determinação para o ajuste do modelo à superfície de resposta

Como já havia sido observado no diagrama de Pareto, o fator com maior influência é

a umidade linear, seguida pela interação entre as variáveis lineares e a umidade quadrática.

57

Segundo HAALAND (1989) para um modelo ser adequado, o R2 deve ser no mínimo 0,75.

Valores acima de 0,90, como o obtido nesta otimização, são considerados muito bons.

10.1.2 Segunda otimização em colunas aeradas

A partir dos resultados obtidos na primeira otimização, neste segundo experimento

foram aumentados os níveis de umidade. Por outro lado, mantiveram-se os mesmos níveis

para aeração, uma vez que esta teve uma influência positiva em relação ao sistema sem

aeração (frascos erlenmeyer), porém dentro dos níveis estudados na primeira otimização, não

teve influência significativa.

O melhor resultado obtido foi de 373 mg GA3.(kg MS)-1 com uma umidade de 0,78 e

aeração de 0,72 l ar.(h.g MS)-1. Comparando-se com o sistema em frascos erlenmeyer com a

mesma umidade, a concentração obtida foi de 492,5 mg GA3.(kg MS)-1 (MACHADO, 2000),

um valor 32 % maior. Isto nos faria acreditar na influência negativa da aeração, contrariando

o que ocorre em fermentação submersa, e a teoria, uma vez que a biossíntese do metabólito

progride através de compostos de crescentes níveis de oxidação. De fato, segundo

TUDZINSKI (1999) uma vez que a taxa de consumo de oxigênio para a produção de micélio

na fase logarítmica deve permanecer constante, a demanda por oxigênio aumenta

aproximadamente de forma exponencial.

Observando-se o Diagrama de Pareto (figura 18), percebe-se que não há influência

significativa das interações entre as variáveis. Assim, o gráfico de contorno de resposta, a

ANOVA (tabela 10) e o modelo matemático estimado foram feitos sem considerar estes

fatores.

FIGURA 18 - DIAGRAMA DE PARETO, SEGUNDA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

6HJXQGD�RWLPL]DomR�HP�FROXQDV�DHUDGDV9DULiYHO�UHVSRVWD��PJ*$��NJVXEVWUDWR��

RQGH��/� �LQWHUDomR�OLQHDU��4� �LQWHUDomR�TXDGUiWLFD

(IHLWR�HVWLPDGR��YDORU�DEVROXWR�

,8731006

-1,15377

1,185441

-1,49496

1,889122

3,245807

-4,11933

11,96322

p=,05

1Qpor2Q

1Qpor2L

1Lpor2Q

Umidade(Q)

Aeração(Q)

1Lpor2L

(2)Aeração(L)

(1)Umidade(L)

-2 0 2 4 6 8 10 12 14

58

Com os resultados, confirma-se uma influência diretamente proporcional da umidade,

sugerindo-se a necessidade de um aumento ainda maior para esta variável. Foi obtida uma

regressão satisfatória no modelo matemático do Contorno de Resposta (figura 19), porém

ainda há a necessidade de mais uma otimização, uma vez que o nível superior não está

centralizado no gráfico.

FIGURA 19 - CONTORNO DE RESPOSTA, SEGUNDA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

Modelo matemático: z = 1949,78 - 6199,05*x + 5331,47*x^2 + 83,82*y - 97,68*y^2

Onde: x = umidade;y = aeração (l ar.(h.g MS)-1);z = mgGA3.(kg MS)-1

TABELA 10 - ANOVA DA SEGUNDA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

FATOR SOMA DOSQUADRADOS

GRAUS DELIBERDADE

MÉDIASQUADRADAS

RAZÃO F RAZÃO p

(1)Umidade (L) 37678,62 1 37678,62 53,55 0,000332Umidade (Q) 450,06 1 450,06 0,639 0,454(2)Aeração (L) 4467,37 1 4467,37 6,35 0,0453Aeração (Q) 1283,22 1 1283,22 1,82 0,225

R2 = 0,912Onde: F = razão entre a variabilidade das amostras e a variabilidade dentro da amostra;

P = nível de significância no intervalo de probabilidade escolhido (5%);R2 = coeficiente de determinação para o ajuste do modelo à superfície de resposta

10.1.3 Terceira otimização em colunas aeradas

Com os resultados obtidos na otimização anterior, e comparando-se com a produção

em frascos erlenmeyer, houve uma indicação da influência negativa da aeração. Porém uma

vez que a necessidade de aeração para a produção de GA3 é um fato bem conhecido e sendo

este metabólito secundário, considerou-se que talvez uma agitação vigorosa no início da

fermentação estivesse impedindo o crescimento dos microrganismos e que esta apenas seria

59

indispensável após algum tempo de fermentação, no momento da síntese do metabólito.

Assim, nesta otimização, nas primeiras 72 h, todas as amostras tiveram uma aeração baixa, de

0,18 l ar.(h.g MS)-1 e após este período variou-se em diferentes níveis.

Com este recurso, obteve-se uma produção de GA3 maior, chegando a 625 mg

GA3.(kg MS)-1 com uma umidade de 0,78 e aeração de 0,72 l ar.(h.g MS)-1, ou seja, 27%

maior que na fermentação sem aeração em frascos erlenmeyer e 68% maior que na

fermentação em colunas com aeração constante de 0,72 l ar.(h.g MS)-1.

No Diagrama de Pareto (figura 20) com todas as correlações possíveis entre as

variáveis, percebe-se que não há variável significativa no experimento. Dessa forma, o

contorno de resposta, a ANOVA e o modelo matemático para a otimização foram feitos sem

considerar tais correlações. Observando-se a ANOVA (tabela 11) sem considerar interações

entre as variáveis, observa-se valores p menores que 0,05 para a umidade linear e a aeração

quadrática. Esta disparidade entre os resultados do Diagrama de Pareto e da ANOVA é devida

à análise diferente entre eles – considerando-se, ou não, as interações entre as variáveis.

FIGURA 20 - DIAGRAMA DE PARETO, TERCEIRA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

No contorno de resposta (figura 21) tem-se a área ótima de aeração limitada entre 0,4 e

0,7 l ar.(h.g MS)-1. Apesar do nível mais alto da variável resposta não estar fechado quanto ao

eixo x (umidade) pode-se considerar que a otimização quanto a esta variável também está

finalizada, uma vez que níveis menores já foram testados nos experimentos anteriores e não

foram obtidos melhores resultados.

7HUFHLUD�RWLPL]DomR�HP�FROXQDV�DHUDGDV9DULiYHO�UHVSRVWD��PJ�*$��NJ�VXEVWUDWR��

RQGH��/� �LQWHUDomR�OLQHDU�H�4� �LQWHUDomR�TXDGUiWLFD

(IHLWR�HVWLPDGR��YDORU�DEVROXWR�

- ,270524

-,689201

-,718094

-,74795

,8863632

1,768161

2,163604

-3,78272

p=,05

1Qpor2L

1Lpor2Q

1Lpor2L

1Qpor2Q

Umidade(Q)

(2)Aeração(L)

Aeração(Q)

(1)Umidade(L)

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

60

FIGURA 21 - CONTORNO DE RESPOSTA, TERCEIRA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0)

Modelo matemático: z = - 48347,62 + 127105,88*x - 83031,91*x^2 + 707,11*y - 413,34*y^2

Onde: x = umidade;y = aeração l ar.(h.g MS)-1

z = mgGA3.(kg MS)-1

TABELA 11 - ANOVA DA TERCEIRA OTIMIZAÇÃO EM COLUNAS, 3(2-0) FATOR SOMA DOS

QUADRADOSGRAUS DE

LIBERDADEMÉDIAS

QUADRADASRAZÃO F RAZÃO p

(1) Umidade (L) 79216,66 1 79216,66 23,69 0,00280Umidade (Q) 2794,49 1 2794,49 0,835 0,396(2) Aeração (L) 17308,21 1 17308,21 5,18 0,0632Aeração (Q) 22976,35 1 22976,35 6,87 0,0395

R2 =0,865

Onde: F = razão entre a variabilidade das amostras e a variabilidade dentro da amostra;P = nível de significância no intervalo de probabilidade escolhido (5%);R2 = fator de correlação para o ajuste do modelo à superfície de resposta

10.2 CINÉTICA DA PRODUÇÃO DE GA3 EM COLUNAS DE AERAÇÃO FORÇADA

A cinética da produção de GA3 por FES em colunas de aeração forçada foi feita para

um conhecimento mais aprofundado de como ocorre a biossíntese do mesmo e como

parâmetro de mudança de escala para a próxima etapa do trabalho. Uma vez que foram

utilizadas as melhores condições determinadas no experimento anterior, este estudo também

serviu como a etapa de verificação do estudo feito em colunas de aeração forçada, onde o

modelo determinado foi comprovado.

Neste experimento, além das variáveis necessárias para os cálculos cinéticos

(biomassa, substrato e produto), foram analisadas a umidade, atividade de água, pH e perda de

peso do substrato durante a fermentação.

61

Houve certa variação da atividade de água e da umidade ao longo da fermentação,

ambos os parâmetros com tendência a aumento. Este comportamento é esperado uma vez que

a aeração é feita com ar saturado, ou seja, existe uma transferência de massa significativa no

sistema. Essa hipótese é confirmada pelo comportamento do sistema em frascos erlenmeyer

(MACHADO, 2000), onde sem aeração a umidade diminuiu gradativamente.

Houve uma pequena variação do pH durante a fermentação, oscilando entre 5,2 e 5,5

nos primeiros 5 dias de fermentação, e aumentando mais no sexto e sétimo dias. A variação

dos primeiros dias não é significativa, se for levada em conta a dificuldade existente em se

medir o pH na fermentação no estado sólido, principalmente no que concerne à retirada de

amostra. Talvez devido a esta dificuldade, o único registro da evolução do pH na produção de

ácido giberélico por FES foi feito por TOMASINI, et al., utilizando como substrato farelo de

mandioca, e tendo como pH inicial 6,0. Os autores demonstraram que o pH baixou para 5,3 já

nas primeiras 10 horas de fermentação, mantendo-se praticamente constante até o final da

coleta de amostras, 40 horas depois.

A perda de peso do substrato é um importante parâmetro a ser medido, uma vez que

ele pode ser considerado como uma medida indireta do crescimento do microrganismo, pois

sua variação está relacionada ao consumo de nutrientes pela biomassa. A perda de peso

chegou a 9% no sétimo dia de fermentação e seguiu o modelo de Monod para crescimento

microbiano: uma fase lag de 0-48 horas, fase logarítmica de 48-120 horas e estabilização de

96-144 horas.

TABELA 12 - PARÂMETROS CINÉTICOS NA FES PARA PRODUÇÃO DE GA3

Tempo(h)

Xg.(kg MS)-1

Sg.(kg MS)-1

Pg.(kg MS)-1

µµ(h-1)

rs

g.(kg MS.h)-1rp

g.(kg MS.h)-1

0 1,122 76,665 0,000 - - -24 1,677 64,226 0,153 0,0167 0,518 0,00648 5,872 38,742 0,206 0,0522 1,062 0,00272 10,791 37,504 0,315 0,0254 0,052 0,00596 15,764 36,886 0,417 0,0158 0,026 0,004120 19,276 36,443 0,711 0,0084 0,018 0,012144 21,743 35,519 0,925 0,0050 0,039 0,009168 24,185 28,664 0,740 0,0044 0,286 -0,008

Onde: MS – matéria seca (substrato fermentado seco);X – biomassa;S – substrato (açúcares não redutores);P – produto (ácido giberélico);µ - taxa diária de crescimento específico;rS – consumo horário de substrato;rP – produção horária de GA3

62

Na tabela 12 acima, são apresentados os dados utilizados nos cálculos dos parâmetros

cinéticos da fermentação. A produção máxima de GA3 se deu após 144 horas de fermentação.

Desta forma, o tempo máximo de fermentação usado nos cálculos foi 144 horas.

10.2.1 Fases da evolução da biomassa

As fases de evolução da biomassa podem ser observadas na figura 22. A fermentação

claramente segue o modelo de Monod, possuindo uma fase Lag (de 0 a 24 horas), onde o

crescimento específico é praticamente nulo, e representa a fase em que a biomassa começa a

se multiplicar; fase Logarítmica ou exponencial (entre 24 e 48 horas); crescimento

desacelerado após 72 horas. Não se determinou uma fase estacionária nem de decaimento, que

provavelmente ocorreriam após o sétimo dia.

FIGURA 22 - FASES DA EVOLUÇÃO DA BIOMASSA

A taxa de crescimento específico (µ) foi determinada de acordo com o modelo de

Monod. O µ máximo foi entre 24 e 48 horas.

µmax = 0,0522 h-1 ou 1,25 dia-1 (entre 24 e 48 horas)

µ = 0,0183 h-1 ou 0,44 dia-1 (entre 0 e 168 h)

O valor de duplicação da biomassa (tD) é o tempo necessário para que a biomassa

dobre de peso. É calculada de acordo com a equação a seguir:

max

)2ln(

µ=Dt (29)

O tempo de duplicação da biomassa, na fase logarítmica do processo estudado foi

aproximadamente de 13 h e 15 minutos.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 24 48 72 96 120 144 168

tempo (h)

ln X

(g

/kg

MS

)

63

10.2.2 Consumo de substrato

O meio de cultivo utilizado é complexo, contendo diferentes fontes de carbono. Para

se determinar o substrato principal, observou-se o comportamento dos açúcares redutores e

não redutores ao longo da fermentação – figura 23, e a partir daí entendeu-se que o substrato

principal foram os açúcares não redutores (especialmente o amido proveniente do bagaço de

mandioca). Assim, na coluna “S” da tabela 12, contém as concentrações desse componente

analisadas ao longo da fermentação.

FIGURA 23 - EVOLUÇÃO DOS CARBOIDRATOS AO LONGO DA FERMENTAÇÃO

Observando-se a tabela 12 (e a figura 23) tem-se que o intervalo de consumo máximo

do substrato é entre 24 e 48 horas, no mesmo momento da maior produção de biomassa.

rSmax = 1,062 g.(kg MS.h)-1 (entre 24 e 48 h);

Sr = 0,286 g.(kg MS.h)-1

Outro parâmetro importante diretamente relacionado com a taxa de crescimento

específico é do rendimento biomassa:substrato, definido como a quantidade de substrato

utilizada para produzir a biomassa.

S

XY

S

X ∆∆

−= (30)

Ou seja, 50,1% do amido presente no meio de cultivo foi convertido em biomassa.

Esta conversão pode parecer baixa, mas deve-se lembrar que o amido não foi a única fonte de

carbono presente. Se for considerada a conversão dos açúcares solúveis totais, esta chega a

75%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 24 48 72 96 120 144 168

tempo (h)

Co

ncen

tração

(g

/kg

MS

)

redutores totais não redutores

64

10.2.3 Produção de ácido giberélico

O produto principal da fermentação estudada é o GA3. Após 6 dias de fermentação

chegou-se a uma produção de 0,925 g GA3.(kg MS)-1. Observando-se a tabela 12 e a figura

24, percebe-se que a faixa de maior produtividade do metabólito é entre 96 e 120 horas de

fermentação, logo após a fase de crescimento logarítmico. Esse comportamento é

característico da cinética de metabólitos secundários como o ácido giberélico.

O decaimento da concentração de GA3 no substrato, após algum tempo de fermentação

foi observado por outros autores que trabalham com produção de GA3 por FES. TOMASI et

al. (1997), utilizando farelo de mandioca, obtiveram sua concentração máxima com 35 horas

de fermentação, a partir do qual houve um decréscimo de quase 11 mg GA3.(kg MS.h)-1.

BANDELIER et al. (1997), trabalhando com farelo de trigo em reator asséptico escala piloto

atingiram sua produção máxima no décimo dia de fermentação, a partir do qual houve um

decaimento de cerca de 18 mg GA3 (kg MS.h)-1. Na FES em frascos erlenmeyer utilizando

como substrato casca de café e bagaço de mandioca (MACHADO, 2000), também observou-

se este fenômeno. Tal decaimento se dá, provavelmente, pela decomposição do GA3 no

sistema produtivo, uma vez que o ácido giberélico é extremamente instável em soluções

aquosas (PERREZ, et al., 1996; GELMI, et al., 2002).

FIGURA 24 - PRODUÇÃO DE ÁCIDO GIBERÉLICO

Os parâmetros cinéticos calculados de acordo com as equações desenvolvidas no

capítulo 6.5 deste trabalho foram a taxa de produção de GA3 máxima e média (rPmax, Pr ).

rPmax = 0,012 g.(kg MS.h)-1 entre 96 e 120 horas

Pr = 0,0063 g.(kg MS.h)-1 entre 0 e 144 horas

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 24 48 72 96 120 144 168

tempo (h)

GA

3 (

g/k

g M

S)

65

Outro parâmetro que pode ser utilizado para determinação da eficiência da

fermentação estudada é a conversão da biomassa em produto (YP/X), definida pela quantidade

de produto formado por unidade de biomassa (equação 31):

X

PY

X

P ∆∆

= (31)

Por este critério, produziu-se, entre 0 e 144 horas 44,8 mg de GA3 .(g biomassa.)-1.

Existe uma certa dificuldade de comparação da produtividade com outros autores, uma

vez são utilizados substratos, cepas e reatores diferentes. Porém, parâmetros como o

crescimento específico máximo (µmax) e a conversão biomassa:produto são facilmente

calculados e podem ser fatores de confronto eficientes entre diferentes cepas e sistemas

fermentativos.

Em colunas de aeração forçada, GELMI et al. chegaram a 0,760 g GA3.(kg MS)-1 em

um suporte inerte de vermiculite, com solução nutriente após 5 dias de fermentação da cepa

G. fujikuroi ATCC 12616. O crescimento específico máximo (µmax) da cepa foi de 0,046 h-1

entre 0 e 48 horas. A conversão biomassa:produto (YP/X) foi de 65 mg de GA3 .(g biomassa)-1,

valor 40% maior que o obtido neste trabalho. Isso confirma a informação dada pelos autores

que a cepa utilizada é hiperprodutora de GA3. Por outro lado, percebe-se baixa eficiência do

sistema fermentativo utilizado, uma vez que houve pouca produção de biomassa, e por

conseguinte, de produto. TOMASINI et al. (1997) obtiveram 0,24 g GA3.(kg MS)-1 após 3

dias de fermentação utilizando farinha de mandioca como substrato e a cepa G fujikuroi

NRRL 2278. O µmax obtido foi de 0,033 h-1 entre 0 e 48 horas, com uma conversão

biomassa/produto de 50 mg GA3 .(g biomassa)-1, revelando uma cepa com produtividade

semelhante à LPB-06, porém um sistema de produção menos eficiente que o estudado neste

trabalho.

10.3 RESPIROMETRIA

Os cálculos respirométricos foram feitos de acordo com o discutido na revisão de

literatura (cap.2.7). Assim, foram calculados g CO2 produzido.(h.g MS)-1 e g O2 consumido.

h-1. (g MS)-1, a cada ponto analisado (de hora em hora).

66

10.3.1 Modelagem matemática da produção de biomassa

Como descrito no item 7.5 deste trabalho, utilizou-se, para a regressão dos dados

experimentais de biomassa, uma equação sigmoidal (27) proposta por GELMI, et al. (2000),

e que, segundo estes autores, ajusta-se bem à FES de G. fujikuroi para a produção de GA3.

cteb

a

atX

−−+=

)1(1)( (27)


t = tempo (h);

a, b e c = constantes de correlação entre biomassa e tempo

De fato, observando-se a equação sigmoidal colocada acima (27) percebe-se que esta

semelhante àquela obtida pela integração do modelo logístico empírico de crescimento

microbiano (equação 34). O modelo logístico (equação 33) descreve o crescimento micelial

nas fases logarítmica e estacionária em FES para diferentes concentrações de substrato

(EBUNE, AL-ASHEH & DUVNJAK, 1995; MITCHELL, et al., 1999).

Confrontando-se as duas equações, tem-se que as constantes a, b e c, do modelo

proposto por GELMI, et al. (2000), são equivalentes, respectivamente, a Xm, X0 e µmax, no

modelo usado por EBUNE, AL-ASHEH & DUVNJAK, (1995).

−=

mX

XX

dt

dX1µ (32)

t

m

me

XX µβ −+

=1

Æ 10

−=X

Xmβ (33)

onde: X = concentração da biomassa (g.(kg MS)-1) em um tempo t (h);

t = tempo (h);

µmax = taxa de crescimento específico máximo (h-1);

Xmax = concentração máxima de biomassa (g.(kg MS)-1);

X0 = concentração inicial de biomassa (g.(kg MS)-1)

Dessa forma, a qualidade do modelo matemático proposto pode ser avaliada, além do

coeficiente de determinação (R2), pelos valores de Xmax, X0 e µmax obtidos.

Feita a regressão dos dados de biomassa experimental da fermentação em colunas de

aeração forçada (tabela 12, no item 10.2), utilizando-se o programa Statistica da StatSoft,

obteve-se as seguintes constantes (R2 = 0,996):

a = Xmax = 24, 38

67

b = X0 = 1,171

c = µmax = 0,037

Comparando-se com os valores experimentais (Xmax = 24, 18 g.(kg MS)-1, X0 = 1,122

g.(kg MS)-1 e µmax = 0,0522 h-1) com as constantes da regressão acima, percebe-se uma

adequação satisfatória do modelo.

10.3.2 Correlação entre biomassa e produção de CO2

Nos processos fermentativos, parte do substrato ou da energia que se obtém a partir da

biodegradação (processos de oxidação-redução) de um determinado substrato é empregada

nos processos endógenos. Nestes, uma parcela é empregada na reprodução da biomassa, e

outra, empregada na síntese dos metabólitos não constitutivos das células. Levando-se em

conta que nos processos de fermentação aeróbia o O2 é consumido durante o processo, deve-

se considerar o balanço do oxigênio sob o enfoque do desenvolvimento de tais processos

endógenos.

Em geral, nos processos de FES pode-se determinar a quantidade de biomassa em um

momento da fermentação, partir do padrão de consumo de oxigênio, desde que a fração do O2

empregada na síntese de metabólitos não constitutivos da biomassa seja desprezível ou

conhecida.

A síntese de GA3 possui várias etapas oxidativas. Além disso, neste trabalho foi

utilizado um substrato composto, constituído de resíduos agro-industriais, com diferentes

fontes de carbono. Desta forma, a modelagem matemática do mesmo, relacionando-se o

consumo de O2 com a produção de biomassa, é de grande complexidade. Pelo mesmo motivo,

o uso do quociente respirométrico (QR) como um parâmetro de verificação da etapa do

processo também é pouco indicado.

Por outro lado, uma vez que o gás carbônico é apenas produzido pela respiração

microbiana, o parâmetro que pareceu ser mais facilmente relacionado à produção de biomassa

neste caso foi o CO2 acumulado produzido, calculado pela equação (26), de acordo com o

descrito no item 7.5deste trabalho:

∫=t

acum dttCOCO0 22 )( (26)

onde: CO2acum = quantidade de CO2 produzida até um instante t (gCO2.(g MS)-1);

CO2= vazão mássica de CO2, em um instante t (gCO2.(g MS.h)-1)

68

Assim, neste trabalho, em todos os sistemas estudados, o CO2acum foi o principal

parâmetro analisado. Com a metodologia mostrada no item 7.5, determinou-se, então, uma

correlação entre o CO2 acumulado e a biomassa.

824,23)ln(9872,3 2 += acumCOX

(R2 = 0,879)

onde: X = quantidade de biomassa produzida até um instante t (g.(kg MS)-1);CO2acum = quantidade de CO2 produzida até um instante t (g.(g MS)-1)

O procedimento acima descrito pode ser considerado efetivo, uma vez que a regressão

da reta formada pelo gráfico X estimada vs. X experimental obteve um R2 alto, como

demonstrado na figura 25, a seguir. Dessa forma, confirmou-se a possibilidade da utilização

do CO2acum durante a fermentação como uma medida indireta da biomassa, na produção de

GA3 por FES.

FIGURA 25 - BIOMASSA ESTIMADA A PARTIR DO CO2 ACUMULADO E EXPERIMENTAL

10.3.3 Cálculos cinéticos com a biomassa estimada

Os cálculos cinéticos da fermentação em colunas de aeração forçada foram refeitos

com os valores da biomassa estimada a partir do CO2acum, a partir dos valores da tabela 13 a

seguir.

Uma vez que os únicos parâmetros diferentes são os relativos à biomassa, foram feitos

apenas aqueles cálculos cinéticos que consideram a biomassa, ou seja: µmax e µ .

As fases de evolução da biomassa estimada, confrontadas com os valores

experimentais, podem ser observadas na figura 26. A taxa de crescimento específico (µ) foi

R2 = 0,9654

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

X experimental

X e

sti

mad

a

69

determinada de acordo com o modelo de Monod. O µmax também entre 24 e 48 horas, e ficou

4 % menor. Já a taxa de crescimento média calculada entre 0 e 144 h de fermentação foi 10%

maior que a obtida com os valores experimentais. Porém esta diferença se dá, quando o µ

experimental é calculado entre 0 e 168 horas. Se o intervalo utilizado for o mesmo que o

utilizado para a biomassa estimada, tem-se um µ igual.

µmax = 0,0520 h-1 ou 1,25 dia-1 (entre 24 e 48 horas)

µ = 0,0206 h-1 ou 0,49 dia-1 (entre 0 e 144 h)


Tempo(h)

Xg.(kg MS)-1

Sg.(kg MS)-1

Pg.(kg MS)-1

µµ(h-1)

rs

g.(kg MS.h)-1rp

g.(kg MS.h)-1

0 1,122 76,665 0,000 --- - -24 1,690 64,226 0,153 0,017 0,518 0,00648 5,590 38,742 0,206 0,050 1,062 0,00272 10,791 37,504 0,315 0,027 0,052 0,00596 15,764 36,886 0,417 0,016 0,026 0,004

120 19,276 36,443 0,711 0,008 0,018 0,012144 21,743 35,519 0,925 0,005 0,039 0,009

Onde: MS – matéria seca (substrato fermentado seco);X – biomassa;S – substrato (açúcares não redutores);P – produto (ácido giberélico);µ - taxa diária de crescimento específico;rS – consumo horário de substrato;rP – produção horária de GA3

FIGURA 26 - FASES DE EVOLUÇÃO DA BIOMASSA

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

ln X

experimental estimada

70

11. PRODUÇÃO DE GA3 EM REATOR AERADO ESCALA PILOTO

A partir das condições otimizadas em coluna de aeração forçada, e utilizando-se os

dados da respirometria obtidos naquelas condições, foram testadas diferentes técnicas e

condições de fermentação. Inicialmente fez-se uma fermentação com condições semelhantes

às em coluna, depois foi feita uma fermentação batelada-alimentada nas mesmas condições e

finalmente uma fermentação com aeração baixa e constante.

Nas três fermentações analisou-se além da produção de GA3 a produção de gases,

consumo de substrato, variação de pH, umidade e atividade de água. Com esses dados foram

feitos os cálculos cinéticos para cada uma delas comparando-as entre si, com a fermentação

em colunas e em frascos erlenmeyer.

11.1 PRODUÇÃO EM CONDIÇÕES SEMELHANTES ÀS COLUNAS AERADAS

Fez-se uma fermentação utilizando-se 2000 g de substrato seco, com umidade de 77%,

pH inicial de 5,2 e vazão de ar inicial de 0,12 l ar.(h.g MS)-1 e após 72 h de fermentação passou a

0,48 l ar.(h.g MS)-1. Este sistema foi o que teve melhores resultados. Em 5 dias de fermentação

chegou-se a uma produção de 1,19 g GA3.(kg MS)-1, uma produção 28% maior que a obtida

em colunas.

O pH variou pouco oscilando entre 5,0 e 5,3 por toda a fermentação. A atividade de

água e umidade também não variaram muito ficando entre 0,981-0,992 e 0,75-0,78,

respectivamente.

A temperatura é um parâmetro importante na FES em reatores maiores, uma vez que a

dissipação do calor metabólico produzido só pode ser feita através da aeração. Nesta

fermentação, uma vez que a aeração é relativamente alta e a havia controle de temperatura na

água do borbulhador, a temperatura alterou-se pouco, variando entre 28,5 e 30ºC.

11.1.1 Cinética da produção de GA3

Na tabela 14 a seguir, são apresentados os dados utilizados nos cálculos dos

parâmetros cinéticos da fermentação. A produção máxima de GA3 se deu após 120 horas de

fermentação. Os cálculos foram feitos pelas equações demonstradas no item 7.3 deste

trabalho.

Os parâmetros relacionados à biomassa (µmax e µ ) foram determinados com a X

experimental e estimada a partir dos valores de CO2acum.

71


Tempo(h)

X experimentalg.(kg MS)-1

X estimadag.(kg MS)-1

Pg.(kg MS)-1

µµ experimental(h-1)

µµ estimada(h-1)

rp

g.(kg MS.h)-1

0 1,098 1,098 0,000 --- --- ---24 1,285 1,309 0,000 0,007 0,007 0,000048 7,631 8,858 0,182 0,074 0,080 0,007672 14,959 12,514 0,500 0,028 0,014 0,013296 18,743 16,402 0,915 0,009 0,011 0,0173

120 19,324 18,097 1,193 0,001 0,004 0,0116144 19,402 19,220 1,071 0,000 0,003 -0,0051

Onde: MS – matéria seca (substrato fermentado seco);X – biomassa;S – substrato (açúcares não redutores);P – produto (ácido giberélico);µ - taxa diária de crescimento específico;rP – produção horária de GA3

11.1.1.1 Produção de biomassa

Na figura 27 observa-se que a fermentação seguiu o modelo de Monod de crescimento

microbiano. A fase de adaptação durou cerca de 20 horas, e o crescimento exponencial se deu

entre 24 e 48 horas para a biomassa experimental e estimada, como na fermentação em

colunas. Após este período houver uma diminuição na produção de biomassa, com uma fase

estacionária de crescimento a partir de 120 horas.



Monod. Constatou-se uma diferença de 7% entre os valores do µmax estimado e experimental.

Já para o µ os valores obtidos foram iguais.

µmax experimental = 0,0742 h-1 ou 1,78 dia-1 (entre 24 e 48 horas)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

ln X

experimental estimada

72

µmax estimado = 0,0799 h-1 ou 1,92 dia-1 (entre 24 e 48 horas)

µ experimental = µ estimado = 0,0199 h-1 ou 0,48 dia-1 (entre 0 e 144 horas)

11.1.1.2 Produção de ácido giberélico

Como pode ser observado na figura 28, a seguir, a produção máxima de GA3 foi entre

72 e 96 horas, havendo uma diminuição da concentração do metabólito nos sistema após 120

h de fermentação. Dessa forma, alcançou-se, em reator escala piloto, uma produção maior e

mais rápida que em colunas.


Além da taxa de produção de GA3 máxima e média (rPmax, Pr ), foi calculada a

conversão da biomassa em produto (YP/X) para a biomassa experimental e estimada.

rPmax = 0,0173 g.(kg MS.h)-1 entre 72 e 96 horas

Pr = 0,0099 g.(kg MS.h)-1 entre 0 e 120 horas

X

PY

X

P ∆∆

= (31)

YP/X experimental = 65,45 mg de GA3 .(g biomassa.)-1

YP/X estimada = 70,18 mg de GA3 .(g biomassa.)-1

11.1.2 Correlação entre biomassa e produção de CO2

O perfil de produção de CO2 e consumo de O2 foram semelhantes ao sistema em

colunas. Aqui também houve uma fase lag de cerca de 20 h. Por outro lado, os valores

absolutos de produção acumulada de CO2 foram bem menores. Este comportamento justifica-

se pela diferença da estrutura de enchimento dos dois sistemas: o substrato enche

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

P (

g/k

g M

S)

73

completamente as colunas de aeração forçada. Já no reator escala piloto, apenas um terço de

seu volume é ocupado pelo substrato, havendo uma diluição do ar de saída analisado no

cromatógrafo gasoso. Dessa forma, foi necessário que os cálculos de correlação entre o CO2

acumulado e a biomassa produzida fossem refeitos.

Os cálculos para a correlação entre a biomassa experimental e o CO2 acumulado foram

feitos de maneira semelhante aos das colunas de aeração forçada (itens 10.3.2 e 10.3.3), e os

resultados obtidos serão mostrados em seguida.

11.1.2.1 Modelagem matemática da produção de biomassa

A partir do ajuste dos dados obtidos pela análise de biomassa (tabela 14) à equação

sigmoidal (equação 27 – item 7.5), utilizando-se o programa Statistica da StatSoft, obteve-se

as seguintes constantes (R2 = 0,996):

a = Xmax = 19,31

b = X0 = 0,93

c = µmax = 0,0686

Comparando-se com os valores experimentais (Xmax = 19,402 g.(kg MS)-1, X0 = 1,098

g.(kg MS)-1 e µmax = 0,0742 h-1) com as constantes da regressão acima, percebe-se uma

adequação satisfatória do modelo.

11.1.2.2 Correlação entre biomassa e produção de CO2

Assim como em colunas de aeração forçada, foi possível determinar-se uma correlação

logarítmica entre o CO2 acumulado e a biomassa, como mostrado na equação a seguir:

365,25)ln(584,3 2 += acumCOX

(R2 = 0,916)

onde: X = quantidade de biomassa produzida até um instante t (g.(kg MS)-1);CO2acum = quantidade de CO2 produzida até um instante t (g.(g MS)-1)

O procedimento acima descrito pode ser considerado efetivo, uma vez que a regressão

da reta formada pelo gráfico X estimada vs. X experimental obteve um R2 alto, como

demonstrado na figura 29, a seguir. Dessa forma, confirmou-se a possibilidade da utilização

do CO2acum durante a fermentação como uma medida indireta da biomassa, na produção de

GA3 por FES, também em reator escala piloto

74

FIGURA 29 - BIOMASSA ESTIMADA A PARTIR DO CO2 ACUMULADO E EXPERIMENTAL

11.2 PRODUÇÃO EM BATELADA-ALIMENTADA (FED-BATCH)

Nesta fermentação foi feita uma alimentação parcelada em 4 alíquotas de 500 g de

substrato. Toda a biomassa foi alimentada no primeiro dia e a aeração manteve-se constante

em 0,1 l ar.(h.g MS)-1 pelas primeiras 72 h passando a 0,48 l ar.(h.g MS)-1 após este período.

Além da análise respirométrica foram feitas a análise da produção de GA3, temperatura do

substrato, pH, umidade e aw a cada 24 h.

Este tipo de alimentação é muito usado em fermentação submersa para uma

maximização da produção de biomassa e metabólitos associados ao crescimento. Em FES é

pouco estudado pela dificuldade operacional. A maioria dos reatores utilizados é em batelada

em não permitem uma alimentação parcial. Por outro lado, como o substrato é sólido a

homogeneização entre substrato presente no reator e o alimentado torna-se um fator crucial

importância.

Como já esperado, este sistema teve uma alta produção de biomassa. Por outro lado a

produção de GA3 foi bem menor que na fermentação em batelada e em colunas aeradas. A

concentração máxima obtida foi de 0,615 g GA3.(kg MS)-1. Isto é explicado pelo fato do

produto ser um metabólito secundário. Ou seja, ele é principalmente produzido quando há a

exaustão do nitrogênio no substrato. Este tipo de fermentação deve ser adequado para

produção de biomassa e metabólitos primários – associados ao crescimento.

O controle de temperatura neste sistema foi um pouco mais complexo pela variação

diária na quantidade de substrato e por perecer ter havido uma atividade metabólica mais

intensa – com uma tendência maior para um aumento da temperatura que no sistema batelada.

De qualquer forma, a oscilação não foi tão grande, mantendo-se entre 29 e 31 ºC.

R2 = 0,9935

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

ln X experimental

ln X

esti

mad

a

75

Houve uma tendência de aumento do pH ao longo da fermentação, chegando a 5,6 já

nas primeiras 24 horas de fermentação e com 144 h indo a 5,9. A umidade, como nos outros

casos, também teve uma tendência a aumento, mas não passou de 78%. A atividade de água

oscilou pouco, ficando entre 0,988 e 0,990 em todo o período.

11.2.1 Cálculos respirométricos e cinéticos

Uma vez que houve uma ótima correlação entre a biomassa experimental e a biomassa

estimada em colunas de aeração forçada e no reator escala piloto, nesta fermentação não foi

feita a análise da biomassa tendo os cálculos cinéticos sido feitos baseados na biomassa

estimada pelas equações determinadas nos itens 11.1.2.1 e 11.2.2.2 deste trabalho. Assim, na

tabela 15, a seguir, e nos cálculos cinéticos, são apenas usados valores relativos à biomassa

estimada.


Tempo(h)


Pg.(kg MS)-1

µµ estimada(h-1)

rp

g.(kg MS.h)-1

0 1,750 0,000 --- ---24 6,717 0,000 0,056 0,000048 12,461 0,042 0,026 0,001872 14,709 0,171 0,007 0,005396 16,560 0,307 0,005 0,0057

120 18,102 0,461 0,004 0,0064144 18,868 0,615 0,002 0,0064



Observando-se a figura 30 a seguir, e a tabela 15 tem-se que a taxa de crescimento

específico máximo (µmax) deu-se entre 6 e 18 horas. A fase de adaptação foi reduzida

sensivelmente em comparação ao outros sistemas, diminuindo de 20 para 7 horas. Por outro

lado, a estabilização do crescimento microbiano também foi mais rápida, após 48 de

fermentação.


Monod. Calculou-se também o tempo de duplicação da biomassa (tD):

max

)2ln(

µ=Dt (29)

76

µmax estimado = 0,159 h-1 ou 3,82dia-1 (entre 6 e 18 horas)

µ estimado = 0,0165 h-1 ou 0,40 dia-1 (entre 0 e 144 horas)

tD = 4 horas e 20 minutos


O valor de µmax foi muito maior que para colunas e reator em batelada. Já a taxa de

crescimento específico global foi um pouco menor que a obtida nas outras fermentações, uma

vez que a estabilização do crescimento se deu também mais rapidamente.

Também para fermentação submersa o que ocorre neste tipo de fermentação é uma

produção muito rápida e intensa de biomassa nos primeiros instantes de fermentação, quando

há uma grande quantidade de inóculo em relação ao substrato existente. Depois há uma

estabilização do sistema, após terminar a alimentação de substrato. Se o objetivo dessa

fermentação fosse a produção de biomassa ou metabólito associado ao crescimento, quatro

dias seria o tempo ideal de fermentação. Esse recurso, em escala industrial seria muito útil,

minimizando em 50 % o tempo de fermentação em batelada, diminuindo sensivelmente os

custos de produção.


Também houve uma mudança de comportamento na produção de GA3 do sistema

batelada-alimentada em relação ao batelada. Como pode ser observado na figura 31, não

houve muita diferença na taxa de produção de GA3 tendo esta aumentado um pouco entre 96 e

144 h. De qualquer forma, a produção menor que em reator batelada e mesmo que em colunas

de aeração forçada. Isto provavelmente é devido à contínua alimentação de substrato até 72

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

ln X

esti

mad

o

77

horas de fermentação, uma vez que o GA3 é produzido em maior quantidade no momento de

diminuição da fonte de nitrogênio.

Provavelmente, com um tempo maior de fermentação houvesse um aumento da

produção do metabólito, como o observado por BANDELIER, RENAUD & DURAND

(1997). Estes autores obtiveram uma produção de aproximadamente 3 g GA3 . (kg MS)-1, em

um sistema batelada alimentado, após 10 dias de cultivo. Esta produção alta deu-se a partir de

144 h de fermentação


Os parâmetros cinéticos calculados de acordo com as equações desenvolvidas no

capítulo 6.5 deste trabalho foram a taxa de produção de GA3 máxima e média (rPmax, Pr ),

além da conversão da biomassa em produto (YP/X):

rPmax estimada = 0,064 g.(kg MS.h)-1 entre 96 e 144 horas

Pr estimada = 0,0043 g.(kg MS.h)-1 entre 0 e 144 horas

YP/X estimada = 35,93 mg de GA3 .(g biomassa.)-1

11.3 FERMENTAÇÃO COM AERAÇÃO BAIXA

Esta fermentação foi feita em batelada (uma única alimentação) com aeração baixa

(0,06 l ar.(h.g MS)-1), numa aproximação à fermentação em frascos erlenmeyer. Com 120 h

foi preciso um aumento da aeração para 0,12 l ar.(h.g MS)-1, pela necessidade de dissipar-se o

calor de reação produzido no leito que chegou a 40 ºC. Pelo efeito do aquecimento do leito,

houve uma diminuição da umidade do mesmo, chegando a 73,9% após 120 h de fermentação

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

P (

g/k

g M

S)

78

e tendendo a aumentar um pouco nas últimas 24 h de fermentação (74,1%). Também a

atividade de água diminuiu, partindo de 0,988 e chegando a 0,968. O pH evoluiu de maneira

similar aos outros sistemas, com uma tendência de aumento chegando a 5,8 no final da

fermentação.

O calor excessivo prejudicou o crescimento microbiano e conseqüentemente a

produção de metabólito, que além disso foi degradado pela temperatura. Após 96 h de

fermentação chegou-se a uma produção de 0,323 g GA3.(kg MS)-1 que decaiu após este

período.

11.3.1 Cálculos respirométricos e cinético

Como para a fermentação em batelada-alimentada, na fermentação com aeração baixa

não foram feitas análises experimentais para a biomassa, sendo esta estimada pelo CO2

acumulado segundo as equações desenvolvidas nos itens 11.1.2.1 e 11.2.2. Assim, na tabela

16, a seguir, e nos cálculos cinéticos, são apenas usados valores relativos à biomassa

estimada.


Tempo(h)


Pg.(kg MS)-1

µµ estimada(h-1)

rp

g.(kg MS.h)-1

0 1,010 0,000 --- ---24 2,382 0,040 0,036 0,001748 9,519 0,095 0,058 0,002372 12,419 0,162 0,011 0,002896 14,433 0,323 0,006 0,0067

120 15,249 0,283 0,002 -0,0017144 16,128 0,206 0,002 -0,0032



A biomassa começou a ser produzida após 19 horas de fermentação, um tempo

aproximado ao obtido com fermentação em batelada e em colunas (figura 32) . Porém a fase

de crescimento exponencial foi bem mais curta, entre 18 e 30 horas, já praticamente não

havendo crescimento após 72 horas de fermentação. Dessa forma, a taxa de crescimento

máximo específico foi muito alta, próxima à obtida no sistema em batelada. Por outro lado, a

79

taxa de crescimento específico global foi baixa, provavelmente pelo o crescimento ter sido

prejudicado com o aquecimento do meio de cultivo pela energia não dissipada.


µmax estimado = 0,142 h-1 ou 3,4 dia-1 (entre 18 e 30 horas)

µ estimado = 0,0192 h-1 ou 0,46 dia-1 (entre 0 e 144 horas)

tD = 4 horas e 55 minutos


O produto foi metabolizado principalmente entre 72 e 96 h, havendo um grande

decaimento do mesmo após este período (figura 33). A baixa produção está relacionada com a

menor aeração utilizada, e o decaimento da concentração do produto no meio já a partir do

quarto dia de fermentação pode ser atribuído ao aumento de temperatura do substrato,

degradando o produto.


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 24 48 72 96 120 144

Tempo (h)

P (

g/k

gsu

bst)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

ln X

esti

mad

a

80

Os parâmetros cinéticos relativos à produção de GA3 (rPmax, Pr , YP/X), foram

calculados de acordo com as equações desenvolvidas no capítulo 6.5 deste trabalho:

rPmax estimada = 0,067 g.(kg MS.h)-1 entre 72 e 96

Pr estimada = 0,0034 g.(kg MS.h)-1 entre 0 e 96 horas

YP/X estimada = 24 mg de GA3 .(g biomassa.)-1 entre 0 e 96 horas

12. COMPARAÇÃO ENTRE OS SISTEMAS ESTUDADOS

Com os resultados demonstrados nos itens 10.2, 10.3, 11.1, 11.2 e 11.3 deste trabalho,

é possível se fazer diferentes considerações a respeito dos diversos sistemas fermentativos

estudados.

12.1 CO2 ACUMULADO

Como provado neste trabalho, o CO2 acumulado produzido é um bom parâmetro de

medida do crescimento microbiano. Assim, aqui será feito um estudo comparativo deste

parâmetro nas quatro situações estudadas.

Na figura 34 é mostrada a produção de CO2 em colunas de aeração forçada e no reator

escala piloto nas condições semelhantes à coluna. Foram feitos diferentes escalas de

concentração do gás para facilitar a comparação entre os perfis da produção de CO2.

Observando-se a figura 34, percebe-se que os perfis são praticamente iguais. Pode-se, desta

forma, concluir que a mudança de escala em 100 vezes não alterou o crescimento do

microrganismo.

FIGURA 34 - CO2 ACUMULADO EM COLUNAS E REATOR

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

g C

O2 /g

MS

(co

lun

as)

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

g C

O2 /g

MS

(re

ato

r)

colunas reator condições colunas

81

Por outro lado, comparando-se os diferentes sistemas de alimentação e aeração no

reator, foram observadas diferenças significativas entre os mesmos (figura 35). Como já

discutido anteriormente, observa-se que o reator com baixa aeração teve uma produção muito

baixa de CO2 em relação aos outros sistemas. Também fica claro, na figura, que o sistema em

batelada-alimentada teve uma produção de gás muito mais rápida que os outros dois sistemas.

FIGURA 35 - CO2 ACUMULADO EM REATOR NOS DIFERENTES SISTEMAS ESTUDADOS

12.2 BIOMASSA ESTIMADA

Também a biomassa é um parâmetro interessante de comparação entre os sistemas.

Observando-se a figura 36 consegue-se determinar claramente as diferenças entre os sistemas.

Após 144 horas de fermentação chegou-se a uma produção semelhante de biomassa em todos

os sistemas, exceto pelo reator com baixa aeração. Este produziu uma quantidade bem menor

de biomassa, provavelmente devido a problemas de dificuldade na dissipação do calor

produzido ao longo da fermentação.

Apesar desta produção final semelhante, os perfis são bem diferentes. O reator em

batelada-alimentada teve uma fase de adaptação muito baixa (cerca de 6 horas) se comparada

com os outros sistemas (entre 18 e 20 horas). A fase logarítmica de crescimento também foi

diferente nos sistemas, sendo muito curta (12 horas) para o reator em batelada-alimentada e

baixa aeração e um pouco maior (24 horas) para as colunas e o reator em condições

semelhantes às colunas.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

g C

O2/g

MS

reator condições colunas

reator batelada-alimentada

reator baixa aeração

82

FIGURA 36 - BIOMASSA ESTIMADA NOS DIFERENTES SISTEMAS ESTUDADOS

12.3 PRODUÇÃO DE GA3

O último parâmetro a ser comparado é a produção do metabólito de interesse.

Novamente, foram detectadas diferenças significativas entre os sistemas (figura 37). A

conversão maior se deu no reator com as condições semelhantes à coluna, chegando a 1,2 g

GA3. (kg MS)-1. Porém após 5 dias de fermentação houve um decaimento da concentração de

GA3 no sistema fermentativo.

FIGURA 37 - PRODUÇÃO DE GA3 NOS DIFERENTES SISTEMAS ESTUDADOS

Em colunas este decaimento foi detectado após 144 horas de fermentação. No reator

com baixa aeração a produção foi baixa, e já com 96 horas de fermentação houve decréscimo

na concentração de GA3.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

mg

X/g

MS

colunas

reator condições colunas

reator batelada-alimentada

reator baixa aeração

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 24 48 72 96 120 144

tempo (h)

g G

A3/k

g M

S

colunasreator condições colunasreator batelada-alimentadareator baixa aeração

83

No sistema em batelada-alimentada a produção do metabólito foi praticamente

constante a partir de 48 horas de fermentação. Uma vez que formou-se grande quantidade de

biomassa neste sistema, talvez houvesse um incremento na produção do produto após 144

horas, como ocorreu com BANDELIER, RENAUD & DURAND (1997) em um reator escala

piloto com sistema de alimentação semelhante e farelo de trigo como substrato.

13. ENSAIOS BIOLÓGICOS COM O EXTRATO

Foram feitos ensaios biológicos comparando-se o uso do extrato do fermentado em

tampão fosfato com a mesma concentração de GA3 comercial em mudas de tomateiro tratadas

com Pachlobutrazol MR, um inibidor de giberelinas endógenas da plantas. Após o teste as

amostras foram analisadas quanto ao seu comprimento total, peso úmido e seco da parte aérea

e raiz.

Conforme mostrado nas figuras 38 e 39 houve uma diferença significativa entre o

comprimento das raízes tratadas com GA3 e a testemunha, tanto para o ácido giberélico

comercial como para o produzido por FES, nos dois tempos. O desvio padrão do

comprimento entre as testemunhas foi de 6 e 9% da média para o 4º e 8º dia respectivamente.

Para as amostras tratadas com GA3 comercial foi menor, de 6 e 7%, respectivamente e para o

GA3 produzido por FES foi maior de 11% nos dois tempos. Este desvio padrão pode ser

divido ao extrato não ser purificado, aumentando a heterogeneidade do sistema. De qualquer

forma não chega a ser um impedimento ao seu uso, uma vez que a eficiência, em média, foi

equivalente (e até um pouco maior) que o metabólito padrão com 95% de pureza.

FIGURA 38 - RESULTADO APÓS 4 DIAS DA APLICAÇÃO DE GA3

84

FIGURA 39 - MÉDIAS DE COMPRIMENTO DAS MUDAS DE TOMATEIRO

Quanto ao peso seco da raiz e parte aérea das mudas, como demonstrado na tabela 17

e figura 40 a seguir, não houve diferença significativa entre os tratamentos (inclusive a

testemunha). De fato a raiz mostrou um peso maior para a testemunha nos dois tempos. Este

resultado é esperado uma vez que o ácido giberélico tem efeito no crescimento apical da

planta e não no acúmulo ganho de peso da mesma. Inclusive, produtos inibidores da síntese de

giberelinas como o PachlobutrazolMR são utilizados justamente para que a muda ganhe mais

peso facilitando assim seu transplante e adaptação ao campo.

TABELA 17 - RESULTADOS DE PESO SECO DAS MUDAS DE TOMATEIRODIA TESTEMUNHA COMERCIAL FERMENTADO DESVIO PADRÃO

RAIZ AÉREA RAIZ AÉREA RAIZ AÉREA RAIZ AÉREA

4 1,381 3,536 1,343 3,738 1,307 3,660 0,037 0,1028 1,592 4,312 1,527 4,630 1,435 4,202 0,079 0,222

FIGURA 40 - PESO SECO DA RAIZ E PARTE AÉREA DOS TRATAMENTOS

17,0517,45

19,38

22,01

20,24

22,65

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

4 8tempo (dias)

co

mp

rim

en

to t

ota

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T ES T E MUNHA COMER CIAL F ER ME NT ADO

0

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peso

seco

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T E S T E M . R A Í Z C O M . R A Í Z F E R M . R A Í Z

T E S T E M . A É R E A C O M . A É R E A F E R M . A É R E A

85

Apesar de preliminares os bioensaios possibilitaram verificar a eficiência do

metabólito produzido, e comprovar que não há necessidade de purificação do mesmo,

diminuindo consideravelmente os custos de produção.

Cabe estudar o tempo de prateleira desse produto, uma vez que a meia vida do mesmo

em soluções aquosas (em tampão fosfato), concentração 10 mg.l-1 a 30 ºC e pH 7,0 é de

aproximadamente 57,8 horas (GELMI et al., 1996) . A temperaturas baixas a conservação é

melhor. Durante o tempo dos ensaios biológicos – 40 dias, conservado em 5 ºC não houve

degradação do GA3 presente no extrato tampão fosfato pH 7,0.

Em geral o GA3 é vendido na forma de um pó branco, com concentrações variadas do

metabólito ativo. Os dois produtos comerciais mais utilizados são o ProGibbMR fabricado

pela Abbott, vendido em concentrações entre 2 e 20% e o GibGroMR fabricado pela Agtrol em

concentrações de 5, 10 e 20%. A Agtrol também vende o produto na forma líquida (GibGro 4

LSMR), diluído em álcool isopropílico numa concentração de 4%. Nas instruções desse

produto a recomendação é de armazenamento entre 0 e 37 ºC. Uma vez que o GA3 é muito

solúvel em solventes orgânicos, seria interessante fazer a extração do fermentado com um

álcool para vendê-lo desta forma. Provavelmente a meia vida do mesmo seria maior.

É interessante ressaltar que apesar de ser vendido em diferentes concentrações e

formas, o preço do GA3 para aplicação na agricultura não varia muito, estando sempre em

torno de US$ 2,00 a grama.

Outra forma de comercialização a ser estudada seria como um bioproduto rico em GA3

a ser aplicado no solo. Dessa maneira haveria uma diminuição ainda maior nos custos de

produção. Os dois parâmetros a serem estudados seriam a forma de secagem do substrato

fermentado (temperaturas baixas, pois o GA3 é termolábil) e a eficiência desse material

misturado ao solo.

86

CCOONNCCLLUUSSÃÃOO

Neste trabalho foram estudadas as condições da produção de ácido giberélico em

diferentes sistemas fermentativos, utilizando-se o fungo Gibberella fujikuroi, num processo

de fermentação no estado sólido da mistura casca de café – bagaço de mandioca e teste da

eficiência biológica do metabólito obtido.

Com relação às otimizações feitas para determinação das condições adequadas para

produção de GA3 em colunas de aeração forçada, houve uma influência significativa da

umidade, com os melhores resultados obtidos entre 76 e 78%. Uma aeração alta (maior que

0,18 l ar.(h.g MS)-1) nos primeiros dias de fermentação exerce um efeito negativo no

crescimento do microrganismo, porém após 72 horas de fermentação faz-se necessária uma

aeração maior – entre 0,5 e 1, l ar.(h.g MS)-1.

O melhor resultado alcançado foi de 0,925 g GA3.(kg MS)-1, após 144 h de

fermentação nas seguintes condições: umidade e pH iniciais do meio de cultivo 77% e 5,2,

respectivamente, aeração nas primeiras 72 h – 0,24 l ar.(h.g MS)-11, e após esse período – 0,72

l ar.(h.g MS)-1e temperatura do banho, 29 ºC.

Foram feitos cálculos cinéticos e respirométricos para o sistema. Foi possível

determinar uma correlação logarítmica entre o CO2 produzido acumulado e a biomassa

produzida. Os parâmetros cinéticos da biomassa estimada e experimental foram próximos,

havendo uma diferença máxima de 10% entre eles. A taxa de crescimento específico máximo

(µmax ) foi observada entre 24 e 48 horas de fermentação sendo cerca de 1,2 dia-1.

A maior produção obtida em reator escala piloto foi de 1,19 g GA3.(kg MS)-1 após 120

h de fermentação, uma produção 28% maior que a obtida em colunas com 144 h. Condições:

umidade e pH iniciais do meio de cultivo 77% e 5,1, respectivamente, temperatura entre 28,5

e 30 ºC e aeração de 0,12 l ar.(h.g MS)-1nas primeiras 72 h, e após esse período, de 0,48 l

ar.(h.g MS)-1.

Foram feitos cálculos cinéticos e respirométricos e correlacionada a biomassa

experimental com o CO2 produzido acumulado. Também se obteve uma correlação

logarítmica e a diferença entre os parâmetros da biomassa experimental e estimada calculados

foram menores que 8%. O µmax foi observado entre 24 e 72 horas como para as colunas

chegando a 1,78 dia-1.

87

Na fermentação em reator escala piloto, em batelada-alimentada, a produção de

metabólito foi de 0,615 g X.(kg MS)-1 após 144 horas. Os cálculos cinéticos foram feitos com

a biomassa estimada a partir do CO2 acumulado. Houve uma redução sensível da fase de

adaptação, que foi de apenas 7 horas. O µmax observado foi maior que para as colunas e para o

reator em batelada, chegando a 3,8 dia-1. Este sistema de alimentação seria muito interessante

se o objetivo fosse a produção de biomassa ou metabólito associado ao crescimento, uma vez

que a produção de biomassa é muito rápida.

A fermentação com aeração baixa e constante no reator escala piloto foi inadequada

para a produção do metabólito, pelo alto calor produzido, que impediu o crescimento

adequado do microrganismo e degradou o ácido giberélico após 96 horas de fermentação,

quando havia atingido uma concentração de 0,323 g GA3.kg substrato-1.

Como para a fermentação em batelada-alimentada, os cálculos cinéticos do teste com

baixa aeração foram feitos com a biomassa estimada a partir do CO2 acumulado produzido. A

biomassa começou a ser produzida após 19 horas, entrando imediatamente em crescimento

exponencial até 48 horas. A taxa de crescimento máximo foi de 3,4 dia-1, confirmando a

hipótese formulada na otimização em colunas aeradas, de que uma aeração alta prejudicaria o

desenvolvimento da biomassa.

O extrato tampão-fosfato pH 7,4 do fermentado, com uma concentração de 200 ppm,

aplicado em mudas de tomateiro teve um efeito ainda maior que da solução 200 ppm de GA3

comercial, com um aumento em relação à testemunha (sem aplicação de GA3) de 18 e 30% no

comprimento da planta após 4 e 8 dias da aplicação. Não houve diferença significativa no

peso da raiz ou parte aérea entre os tratamentos.

Com os bioensaios comprovou-se a eficiência do metabólito produzido mesmo em

solução tampão bruta. Com condições bem estabelecidas, é possível produzir-se GA3 por FES

em resíduos agroindustriais com uma alta produtividade e baixo custo.

88

SSUUGGEESSTTÕÕEESS DDEE TTRRAABBAALLHHOOSS FFUUTTUURROOSS

A partir dos resultados obtidos surgiram diversas perspectivas para novos trabalhos a

serem desenvolvidos na produção de GA3 por FES, relacionados, principalmente, com a

extração, purificação e alternativas de uso do material produzido, algumas destas, enumeradas

a seguir:

• Bioensaios mais aprofundados com o extrato tampão fosfato;

• Verificação criteriosa do tempo de prateleira e meios de conservação do extrato

tampão fosfato;

• Otimização da extração do metabólito produzido, considerando-se, especialmente,

extração com álcoois, como isopropanol;

- aplicação de bioensaios com o extrato alcoólico testado;

- verificação do tempo de prateleira e meios de conservação do mesmo

• Teste da secagem do material fermentado

- aplicação de bioensaios com o produto sólido seco rico em GA3 misturado ao solo;

- verificação do tempo de prateleira do produto sólido seco

• Fazer um estudo econômico comparativo dos custos de produção e uso do novo

produto nas suas diferentes formas estudadas (extrato aquoso tampão fosfato, extrato

alcoólico, sólido seco);

• Testar o sistema de produção do GA3 por FES no reator escala piloto batelada-

alimentada, por mais tempo (dez a quinze dias de fermentação), adicionando,

inicialmente, apenas a casca de café, e depois, a cada 24 horas, apenas a fonte de

carbono (bagaço de mandioca);

• Otimizar a produção do metabólito em uma escala ainda maior – reator de 10 a 25 kg

de substrato seco.

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Maria Machado

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