Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular

AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO MIOCÁRDICA, DA ACTIVAÇÃO NEUROHUMORAL E

DA REMODELAGEM NO VENTRÍCULO ESQUERDO DE RATOS COM

HIPERTENSÃO PULMONAR INDUZIDA PELA MONOCROTALINA

Orientador: Professor Doutor Adelino F. Leite-Moreira

André Pedro Leite Martins Lourenço

Porto, 2007

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ÍNDICE

Página

I – Introdução 2

Sobrecarga mecânica e acção neurohumoral na progressão da insuficiência cardíaca 2

Hipertensão pulmonar 4

Sobrecarga selectiva ventricular direita e acção neurohumoral bi-ventricular 4

Disfunção ventricular esquerda em doentes com hipertensão pulmonar 5

Avanços recentes no conhecimento fisiopatológico, abordagem clínica e

terapêutica da hipertensão pulmonar 6

Modelo experimental de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina 9

Função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar 10

Activação neuro-endócrina no miocárdio ventricular esquerdo 11

Estudo da função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar 13

Preparações in vitro de feixes miocárdicos ventriculares esquerdos isolados 13

Avaliação hemodinâmica in vivo dos efeitos da sobrecarga aguda sobre a função diastólica 15

II – Objectivos 19

III – Metodologia 20

Modelo experimental 20

Avaliação hemodinâmica 20

Estudos funcionais em feixes musculares miocárdicos 21

Avaliação histológica 21

Estudos de biologia molecular 21

IV - Activação neuroendócrina local e disfunção ventricular esquerda

sem remodelagem na hipertensão pulmonar (trabalho nº1) 23

V - Mecanismos subcelulares e progressão da disfunção ventricular esquerda

num modelo experimental de hipertensão pulmonar (trabalho nº 2) 32

VI – Conclusões 51

VII – Bibliografia 57

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I - INTRODUÇÃO

Sobrecarga mecânica e acção neurohumoral na progressão da insuficiência cardíaca

Independentemente da etiologia, as alterações da carga ventricular têm sido destacadas entre

os factores clinicamente responsáveis pela progressão da insuficiência cardíaca. O paradigma mais

associado historicamente à fisiopatologia da insuficiência cardíaca assenta no desenvolvimento de

hipertrofia ventricular, redutora da tensão parietal ventricular e da tensão suportada pelos

miocardiócitos, por aumento da espessura da parede ventricular (lei de Laplace), como resposta à

sobrecarga de pressão ventricular (Drazner, 2005). A resposta de hipertrofia miocárdica é um

mecanismo compensatório, a sobrecarga miocitária leva a um crescimento compensatório dos

miócitos, que permite o desenvolvimento de maior força; contudo, este mecanismo acaba por ser

ultrapassado pela persistência da sobrecarga, o crescimento dos miócitos acaba por resultar na

disfunção mecânica e falência do miocárdio (Huang, 2004). Se, inicialmente, a resposta hipertrófica

pode compensar a função cardíaca, a hipertrofia prolongada tem consequências negativas, resultando

em falência miocárdica, o ventrículo entra, então, em falência, sofrendo dilatação e modificação da

forma ventricular, de elipsóide a esférica, dando lugar a um síndroma clínico dominado pelo

congestionamento vascular a jusante (Braunwald, 2001; Hurst, 2004). Embora esta sequência de

eventos nunca tivesse sido inequivocamente comprovada na doença humana (Drazner, 2005), em

modelos experimentais esta progressão está claramente documentada (Hasenfuss, 1998; Hunter,

1999). A maior parte dos casos de insuficiência cardíaca deve-se a uma perda de miocárdio normal,

tipicamente por enfarte, com sobrecarga subsequente do miocárdio viável remanescente (Huang,

2004; Sussman, 2002). Este paradigma mecânico foi, no entanto, posto à prova pela evolução dos

conhecimentos sobre a insuficiência cardíaca e pelas mais recentes inovações terapêuticas. Se é

verdade que a redução da pressão arterial, em doentes hipertensos, previne o desenvolvimento de

hipertrofia e de insuficiência cardíaca, não é menos verdade que a maior parte dos anti-hipertensores

actua por inibição de sistemas neuro-endócrinos, que são intensamente activados na progressão para a

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insuficiência cardíaca. Mediadores autócrinos/parácrinos e neuroendócrinos que estão associados à

progressão da insuficiência cardíaca são produzidos, tanto pelo miocárdio como por outros tecidos, em

resposta a diversos estímulos, como a sobrecarga ou a isquemia (Baker, 1990; Ferrari, 1999; Katz,

2000). Efectivamente, excluíndo algumas abordagens terapêuticas, que são reservadas para os casos

de gravidade mais extrema, como a transplantação (Lim, 2005), a ressincronização cardíaca, com ou

sem cardio-desfibrilador implantado (Feldman, 2005), os dispositivos de suporte ventricular esquerdo

(Pagani, 1999) ou a oxigenação por membrana em circulação extracorporal (Zwischenberger, 1992),

apenas a interferência farmacológica nos sistemas neuro-endócrinos conseguiu alterar o prognóstico

da insuficiência cardíaca (the SOLVD investigators, 1991). Se é verdade que a sobrecarga de pressão

e as alterações hemodinâmicas são encaradas como factores imprescindíveis para a perturbação, não

só da função miocárdica (Katz, 2000; Leite-Moreira, 1999), como também da fisiologia celular e

molecular do cardiomiócito, nomeadamente no que concerne à homeostasia do cálcio e estrutura e

função dos miofilamentos (Dhalla, 1999; Katz, 2000; Sussman, 2002), facto a que não é alheia a

omnipresença da sobrecarga na maioria dos modelos experimentais de insuficiência cardíaca

(Hasenfuss, 1998), são também claras as evidências que demonstram o papel fundamental de neuro-

hormonas e mediadores locais na modulação da função miocárdica e na regulação da expressão génica

e molecular de proteínas envolvidas na fisiologia contráctil subcelular (Flesch, 1997; Rothermund,

2000). Os mediadores neurohumorais modulam as condições de carga do miocárdio, mas também são

precocemente activados na sequência de eventos que acompanha a sobrecarga mecânica e conduz à

resposta hipertrófica (Guerra, 2006; Roncon-Albuquerque, 2006). De facto, entre os vários

mecanismos moleculares subjacentes à hipertrofia miocárdica os neurohumorais têm sido

particularmente estudados e destacados. Os cardiomiócitos, quando sobrecarregados, libertam

angiotensina II que actua como factor de crescimento parácrino (Sadoshima, 1993), o mesmo

acontecendo para a endotelina-1 (Ito, 1993). Vários mediadores autócrinos/parácrinos, como a

angiotensina II, a endotelina-1 e os peptídeos natriuréticos, têm sido implicados na função cardíaca

(Brunner, 2006; Molkentin, 2003; Moravec, 1990), resposta hipertrófica (Baker, 1990) e remodelagem

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miocárdica, desempenhando um importante papel fisiopatológico na insuficiência cardíaca, como

agentes promotores de disfunção, hipertrofia e remodelagem, caso do sistema renina-angiotensina-

aldosterona e da endotelina-1 (Flesch, 1997; Rothermund, 2000), ou como sistemas contra-

reguladores, caso dos peptídeos natriuréticos (Molkentin, 2003). Os papéis desempenhados e a

contribuição relativa da sobrecarga e da activação neuro-humoral para a génese da disfunção

miocárdica e da remodelagem subcelular, subjacentes à progressão da insuficiência cardíaca, não

estão, ainda hoje, bem definidos.

Hipertensão pulmonar

Sobrecarga selectiva ventricular direita e acção neurohumoral bi-ventricular

O maior obstáculo ao esclarecimento dos papéis da sobrecarga e da estimulação neuro-

humoral é colocado pela inexistência de modelos experimentais em que os efeitos de uma e outra

possam ser bem individualizados (Hasenfuss, 1998; Koide, 1999). Recentemente, esta questão tem

sido abordada recorrendo a modelos experimentais de hipertensão pulmonar (Kögler, 2003;

Leineweber, 2002; Schott, 2005; Seyfarth, 2000; Sharma, 2004). Efectivamente, tanto na hipertensão

pulmonar induzida experimentalmente como no contexto clínico de hipertensão pulmonar, ambos os

ventrículos são expostos a activação neuro-humoral, enquanto que apenas o ventrículo direito é sujeito

a sobrecarga biomecânica. A maioria destes estudos de ciência básica tem destacado o papel da

sobrecarga na progressão das alterações funcionais e moleculares que acompanham a evolução da

insuficiência cardíaca, uma vez que é o ventrículo direito que apresenta grande parte das alterações

funcionais e moleculares (Chen, 1998; Kögler, 2003; Leineweber, 2002; Schott, 2005; Sharma, 2004).

No entanto, também já foram descritas alterações miocárdicas intrínsecas no ventrículo esquerdo,

semelhantes às que acompanham a progressão da insuficiência cardíaca, em modelos experimentais de

hipertensão pulmonar, destacando-se a comutação das isoformas das cadeias pesadas de miosina, com

aumento das isoformas β (Ishikawa, 1991), e a alteração da expressão proteica de algumas enzimas do

metabolismo bioenergético (Schott, 2005). Não está descrita a alteração das proteínas reguladoras da

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cinética do cálcio (Kögler, 2003; Sharma, 2004), embora se deva salvaguardar que em modelos

relacionados, de sobrecarga ventricular direita crónica, por constrição da artéria pulmonar tenha sido

observada igualmente alteração destas últimas, concretamente, redução da expressão da SERCA 2a

(ATPase de Ca2+ do retículo sarcoplasmático) e do fosfolambano (LekanneDeprez, 1998).

Disfunção ventricular esquerda em doentes com hipertensão pulmonar

Vários estudos clínicos envolvendo pacientes em estadios avançados de hipertensão pulmonar

reconhecem o desenvolvimento de disfunção ventricular esquerda (Mahmud, 2002; Menzel, 2000;

Schena, 1996; Tutar, 1998). A maior parte das evidências, e opiniões, aponta para a inexistência de

alterações intrínsecas do miocárdio ventricular esquerdo (Dong, 1995; Menzel, 2000; Schena, 1996),

sendo apontados como mecanismos fisiopatológicos a interdependência ventricular, a restricção do

preenchimento ventricular esquerdo (Menzel, 2000) e as alterações geométricas (Dong, 1995; Vonk

Noordegraaf, 1997). O ventrículo esquerdo sofre alterações da sua geometria na dependência da

sobrecarga crónica do ventrículo direito (Tutar, 1998), podendo mesmo ser estabelecida uma

correlação entre o nível de hipertensão pulmonar e a magnitude da disfunção diastólica do ventrículo

esquerdo, avaliada pela razão entre os contributos do preenchimento precoce e da contracção auricular

para o enchimento ventricular, a denominada razão E/A, determinada por ecocardiografia (Moustapha,

2001). Todavia, se a maioria dos trabalhos salienta o papel de factores puramente mecânicos na

fisiopatologia da disfunção ventricular esquerda que acompanha a hipertensão pulmonar grave,

também há várias evidências que sugerem a possibilidade de ocorrência de disfunção contráctil

intrínseca do miocárdio ventricular esquerdo. Vários aspectos da clínica dos doentes com hipertensão

pulmonar não são facilmente explicados se se atender meramente à hipótese mecânica de

interdependência e alterações da geometria e do preenchimento ventricular, sugerindo, por exemplo,

após transplante de pulmão único, em pacientes com hipertensão pulmonar grave e disfunção

ventricular esquerda, a perturbação do relaxamento ventricular esquerdo persiste durante um período

prolongado, após a normalização da geometria e da função ventricular direita (Xie, 1998); de facto,

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nos casos, em que a hipertensão pulmonar é grave e se faz acompanhar de disfunção quer do

ventrículo direito quer do ventrículo esquerdo, é aconselhado o recurso a transplante conjunto de

coração e pulmão, porque a função ventricular esquerda pode não recuperar se apenas for efectuado

transplante pulmonar (Pielsticker, 2001).

Avanços recentes no conhecimento fisiopatológico, abordagem clínica e terapêutica da hipertensão pulmonar

Os últimos anos têm sido particularmente férteis em investigação clínica e básica no campo da

hipertensão pulmonar, o que se traduz por um conjunto recente de revisões publicadas sobre o tema,

facto a que não são alheios, por um lado, o mau prognóstico, a dificuldade no diagnóstico precoce e a

ausência de armas terapêuticas adequadas (Cool, 2005; Newman, 2004; Provencher, 2005; Rubin,

2005; Rubin, 2006; Rubin, 2006b; Zaiman, 2005) e, por outro lado, o reconhecimento crescente da

importância, em termos de prevalência, das formas secundárias de hipertensão pulmonar

(Higenbottam, 2005; Wright, 2005). De forma resumida, a hipertensão pulmonar pode definir-se como

a elevação da pressão média na artéria pulmonar para valores superiores a 25mmHg em repouso e

superiores a 30mmHg durante o exercício, sendo caracterizada por uma elevação progressiva e

sustentada da resistência vascular pulmonar que, em última análise, conduz à falência cardíaca direita.

As causas clínicas são diversificadas, tendo a classificação diagnóstica da hipertensão pulmonar sido

alvo de revisão recente. Segundo a classificação, inicialmente avançada em Evian, em 1998, e mais

tarde modificada em Veneza, em 2003, algumas formas raras, que já receberam a designação de

hipertensão pulmonar primária, passaram a ser classificadas como hipertensão arterial pulmonar. A

hipertensão arterial pulmonar pode ser familiar, idiopática, ou, ainda, secundária a doenças como a

esclerodermia, doenças do conjuntivo, doença hepática (hipertensão portal, com ou sem cirrose),

infecção pelo vírus da imunodeficiência humana ou à ingestão de fármacos anorexiantes, como a

fentermina e a fenfluramina. No entanto, as formas mais comuns de hipertensão pulmonar não são

incorporadas neste grupo, são as formas resultantes de insuficiência ventricular esquerda

(provavelmente a mais frequente), valvulopatias, doença pulmonar crónica, apneia do sono,

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cardiopatias congénitas, tromboembolismo pulmonar crónico e residência em elevadas altitudes

(Higenbottam, 2005; Hoeper, 2006; Roy , 2006; Said, 2006). O reconhecimento de que uma grande

parte dos pacientes com doença pulmonar obstrutiva crónica evolui inexoravelmente, com o avançar

dos anos, para formas de hipertensão pulmonar ligeiras a moderadas, e, num número mais restrito de

casos, graves (Wright, 2005), contribuiu, atendendo à grande prevalência destas formas de doença

pulmonar crónica, para uma maior focalização neste tópico,. Efectivamente, a doença pulmonar

obstrutiva crónica é a quarta causa de morte em adultos, e, pela sua incidência, prevê-se que virá a ser

a terceira em 2020 (Naeije, 2005; Szilasi, 2006).

A hipertensão pulmonar arterial é uma doença com consequências devastadoras que, dada a

inespecificidade dos sintomas de apresentação e a baixa prevalência, é diagnosticada usualmente

quando já está presente um estadio avançado de doença vascular, de reversibilidade limitada, sendo

fatal em cerca de 3 anos, caso não seja instituído qualquer tratamento (Provencher, 2005). Apesar dos

avanços terapêuticos das duas últimas décadas, que acrescentaram às estratégias clássicas de

tratamento de suporte (digitálicos, diuréticos, oxigenioterapia, hipocoagulação e bloqueadores dos

canais de cálcio) a terapia crónica com epoprostenol, endovenoso, a terapia com novas formulações de

prostaciclina, inaladas, endovenosas e orais, e a administração crónica de antagonistas dos receptores

da endotelina, o prognóstico continua a estar bem longe do desejável. As novas terapêuticas são

extremamente dispendiosas e conferem apenas ligeiros benefícios na sobrevida e capacidade funcional

(Newman, 2004), condicionando uma melhoria da condição física dos pacientes e o aumento da

sobrevida para cerca de 50% aos 5 anos (Badesch, 2004; Badesch, 2004b; Sitbon, 2005). Em última

análise, a HTP progride e a única alternativa terapêutica é o transplante pulmonar simples ou o

transplante pulmonar combinado de coração e pulmões (Pielsticker, 2001). Um tal facto deve-se, em

larga escala, ao desconhecimento de grande parte dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes ao

desenvolvimento desta síndrome. É consensual que vários estímulos podem condicionar a

remodelagem dos vasos pulmonares, nomeadamente a hipóxia, toxinas, infecções víricas, o stress

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mecânico e o desequilíbrio na produção de mediadores vasoactivos (Cool, 2005; Said, 2006).

Algumas formas terão por mecanimo patogénico alterações genéticas (Cool, 2005; Geraci, 2001). No

entanto, os mecanismos subcelulares e moleculares envolvidos são, na sua maioria, desconhecidos. Há

várias terapêuticas em investigação, incluíndo, inibidores das fosfodiestérases, estatinas, L-arginina,

anti-agregantes, moduladores da função de canais iónicos, inibidores da serotonina, terapia génica, etc

(Newman, 2004). A terapia de combinação também tem suscitado grandes expectativas, encontrando-

se em avaliação em vários ensaios clínicos (Ghofrani, 2003; Humbert, 2004; Itoh, 2004).

Um resultado claro, que emanou das estratégias terapêuticas combinadas, foi a conclusão de

que os benefícios de fármacos que apenas possuem propriedades vasodilatadoras são limitados, o foco

da terapêutica tem evoluído para o controlo da proliferação vascular da hipertensão arterial pulmonar

(Robbins, 2004). Por outro lado, também é reconhecido que a fisiopatologia da hipertensão pulmonar

se caracteriza pela elevação persistente das resistências vasculares pulmonares, com sobrecarga

progressiva do ventrículo direito, que acaba por conduzir, inevitavelmente, à falência do VD e à morte

(Hoeper, 2006; Newman, 2004; Provencher, 2005), sendo o principal determinante do prognóstico a

integridade da função miocárdica, e não o grau de lesão vascular da circulação pulmonar (Provencher,

2005). Contudo, o estudo da função miocárdica e a caracterização molecular do miocárdio estão

praticamente vedados à investigação clínica. A avaliação hemodinâmica invasiva, o estudo da função

contráctil, características moleculares e actividade endócrina do miocárdio e do leito vascular

pulmonar destes pacientes é impossível em termos técnicos e éticos. A investigação em modelos

experimentais de hipertensão pulmonar assume, então, particular relevância. Grande parte dos avanços

no estudo fisiopatológico e terapêutico da hipertensão pulmonar foi dada inicialmente em modelos

experimentais. Por exemplo, a importância da endotelina-1 na fisiopatologia da hipertensão pulmonar

foi inicialmente reconhecida em modelos experimentais (Miyauchi, 1993), tendo mais tarde sido

comprovada em pacientes, nos quais se verificou uma correlação entre os níveis circulantes desta

hormona e a gravidade clínica da hipertensão pulmonar (Nootens, 1995). De igual modo, a eficácia de

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antagonistas da endotelina-1 na terapêutica da hipertensão pulonar foi, inicialmente, reconhecida em

modelos experimentais (Jasmin, 2001) e, mais tarde, em doentes com hipertensão pulmonar (Rubin,

2002), sendo hoje um pilar da terapêutica crónica de formas mais graves de hipertensão pulmonar. O

Bosentan é uma alternativa, por via oral, aos prostanóides endovenosos, nas formas de hipertensão

pulmonar grave, das classes III e IV, modificadas para a hipertensão pulmonar, da NYHA,

melhorando significativamente quer a capacidade funcional quer um conjunto global de resultados

finais, que inclui a sobrevida, a necessidade de internamento ou de transplante e a necessidade de

iniciar terapêutica endovenosa com prostanóides (Rubin, 2002; Rubin, 2005).

Modelo experimental de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina

Existem diversos modelos experimentais que, apesar de várias limitações, muito têm

contribuído para o esclarecimento da fisiopatologia da hipertensão pulmonar e para os avanços

terapêuticos mais recentes (Robbins, 2004). O modelo de hipertensão pulmonar induzida pela

monocrotalina no rato, é um modelo experimental adequado ao estudo da sobrecarga crónica do

ventrículo direito e insuficiência cardíaca (Brunner, 1999; Werchan, 1989). Este modelo experimental

é o mais divulgado e mais frequentemente empregue no estudo da hipertensão pulmonar. A

monocrotalina é um alcalóide de acção tóxica, isolado a partir da Crotalaria spectabilis, que provoca

uma endarterite obliterativa das arteríolas pulmonares (Kay, 1967). As lesões histológicas provocadas

são semelhantes às lesões típicas da hipertensão pulmonar, resultante de diversas etiologia, sendo a

monocrotalina desprovida de acção tóxica directa no miocárdio (Chen, 1998; Kay, 1967). Embora

nenhum modelo experimental reproduza por completo as alterações histopatológicas da hipertensão

pulmonar humana (Robbins, 2004; Pietra, 1989), este é dos modelos em que a activação neuro-

humoral mais semelhanças apresenta com a insuficiência cardíaca humana (Brunner, 1999;

Leineweber, 2002), sendo de execução simples, não invasivo e de desenvolvimento gradual e

reprodutível. Este modelo experimental tem sido usado na avaliação de novos fármacos, no contexto

da hipertensão pulmonar (Jasmin, 2001), e no estudo da hipertrofia miocárdica (Buermans, 2005),

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mas, recentemente, tem-se destacado a sua importância no estudo comparativo das alterações

funcionais e moleculares entre os dois ventrículos (Kögler, 2003; Leineweber, 2002; Schott, 2006;

Seyfarth, 2000). O ventrículo esquerdo dos animais tratados com monocrotalina encontra-se, à

semelhança do ventrículo direito, sob a influência de um ambiente neuro-humoral semelhante ao da

insuficiência cardíaca, as concentrações plasmáticas de noradrenalina (Leineweber, 2002),

angiotensina II e endotelina-1 (Brunner, 1999; Miyauchi, 1993) aumentam precocemente, mas,

contrariamente ao ventrículo direito, não está sujeito a sobrecarga. Então, o estudo funcional e

molecular do ventrículo esquerdo neste modelo experimental permitirá definir melhor os papéis

precisos da sobrecarga e da mediação humoral, assim como as acções efectivas dos mediadores

humorais in vivo, na ausência de sobrecarga.

Função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar

Nos estudos levados a cabo até ao presente, alguns autores não identificaram perturbação da

função no ventrículo esquerdo (Chen, 1998; Kögler, 2003), enquanto outros relatam perturbação da

contractilidade e do relaxamento (Henriques-Coelho, 2004; Jasmin, 2001). As discrepâncias podem

dever-se, muito simplesmente, a diferenças em determinantes fundamentais da gravidade da

hipertensão pulmonar e do desenvolvimento de insuficiência cardíaca neste modelo experimental,

nomeadamente, as idades e pesos dos animais na altura da injecção da monocrotalina, a via de

administração, a dosagem, e o tempo decorrido entre a administração e o estudo funcional e molecular

(Werchan, 1989). No aspecto funcional, a avaliação hemodinâmica invasiva por cateterização das

câmaras cardíacas revela, em modelos experimentais de hipertensão pulmonar, alterações quer na

função sistólica, quer na função diastólica do ventrículo esquerdo, com particular predomínio das

alterações diastólicas (Gomez, 1993; Gomez, 1994; Henriques-Coelho, 2004; Jasmin, 2001). Nos seus

trabalhos, levados a cabo em modelos experimentais de enfisema, Gomez e cols propuseram a

existência de disfunção intrínseca do miocárdio ventricular esquerdo, com base em índices de função

que são pouco influenciados pelas condições de carga, obtidos pela cateterização das câmaras

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cardíacas, e com base na ausência de alterações significativas do volume da cavidade ventricular

esquerda, avaliado pela implantação de cristais ultrassónicos nos vários diâmetros da cavidade,

avançando como possível hipótese explicativa que o ventrículo direito, sobrecarregado, produzisse

uma substância que actuaria no ventrículo esquerdo induzindo disfunção (Gomez, 1993; Gomez,

1994). Jasmin e cols, por sua vez, verificaram que o tratamento crónico com antagonistas da

endotelina-1 melhorava a sobrevida e o fluxo pulmonar, atenuava a hipertensão pulmonar e melhorava

a função do ventriculo direito, mas, curiosamente, também melhorava os índices hemodinâmicos de

função ventricular esquerda (Jasmin, 2001). Este achado não foi analisado pormenorizadamente pelos

autores, subentendendo-se que a melhoria da função ventricular esquerda se poderia dever à redução

do grau de hipertensão pulmonar e da pressão e hipertrofia do ventrículo direito, e à melhoria do fluxo

pulmonar e, portanto, do preenchimento do ventrículo esquerdo.

Activação neuro-endócrina no miocárdio ventricular esquerdo

Do mesmo modo, não foi discutido ou interpretado o aumento da expressão génica de

endotelina-1 no miocárdio ventricular esquerdo em dois estudos anteriores, levados a cabo no modelo

experimental de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina (Miyauchi, 1993; Park, 2001). O

papel dos sistemas locais, e teciduais, de mediadores endócrinos tem vindo a ser progressivamente

realçado na fisiopatologia da doença cardiovascular, ultrapassando em relevância a acção endócrina,

sistémica (Iwanaga, 1998; Mizuno, 2001; Takemoto, 1997). O reconhecimento da maior importância

dos sistemas locais abre novas perspectivas na interpretação dos resultados experimentais previamente

sumariados. A disfunção ventricular esquerda identificada no estudo hemodinâmico invasivo (Gomez,

1993; Gomez, 1994; Henriques-Coelho, 2004; Jasmin, 2001) em modelos de hipertensão pulmonar, e

a sua reversibilidade após tratamento com antagonistas da endotelina-1 (Jasmin, 2001), podem muito

bem resultar não só da interacção ventricular e da melhoria da hemodinâmica pulmonar com

atenuação do nível de hipertensão pulmonar e da hipertrofia e dilatação do ventrículo direito, mas

também da inibição da endotelina-1 produzida localmente, nos miócitos do ventrículo esquerdo. A

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endotelina-1 produzida no miocárdio tem sido implicada em muitas das alterações que acompanham a

progessão da insuficiência cardíaca (Iwanaga, 1998), perturbando quer a contractilidade quer e o

relaxamento miocárdico, por disfunção da homeostasia do cálcio (Onishi, 1999; Rothermund, 2000) e

por alteração da composição dos miofilamentos, nomeadamente por comutação das isoformas da

cadeia pesada da miosina, favorecendo a forma β (Ichikawa, 1996). Esta forma de miosina é

responsável pela diminuição dos índices de contracção e relaxamento que dependem da velocidade

dos ciclos de pontes cruzadas do miocárdio, porque se associa a ciclos lentos de pontes cruzadas

(Dorn, 1994).

Relativamente à possibilidade de ocorrência de activação neuro-endócrina local ventricular

esquerda em modelos experimentais de hipertensão pulmonar, deve ser notado que os trabalhos em

que esta é descrita pela primeira vez (Miyauchi, 1993; Park, 2001) empregaram métodos de

quantificação de ARNm que não podem ser considerados, presentemente, gold standard e que as

metodologias empregues têm sido alvo de críticas em publicações mais recentes (Ding, 2004; Dvořák,

2003). A reprodutibilidade destes achados experimentais deve ser confirmada com métodos mais

modernos de quantificação de ARNm, como o RT-PCR em tempo real. Igualmente relevantes serão,

por um lado, a confirmação da produção de proteína no ventrículo esquerdo e, por outro lado, o estudo

histológico do ventrículo esquerdo e o estudo das alterações moleculares subcelulares do miocárdio,

particularmente as alterações que mais têm sido associadas à progressão da insuficiência cardíaca e à

activação miocárdica da produção de endotelina-1.

Outra questão pertinente que se levanta é o esclarecimento de posssíveis mecanismos que

podem estar na base desta activação neuroendócrina ventricular esquerda na hipertensão pulmonar. O

miocárdio ventricular esquerdo não está sujeito a sobrecarga, ou a unloading. O unloading, que se

pode definir como redução marcada da pré-carga, com atrofia e alterações moleculares características,

que incluem activação neuro-endócrina local (Lisy, 2000; McGowan, 2003), nunca foi descrito em

modelos de hipertensão pulmonar, ao contrário dos modelos de constricção crónica do tronco

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pulmonar (LekanneDeprez, 1998). Então, outros mecanismos causais, não dependentes da

modificação das condições de carga, devem ser ponderados. A hipoxemia deve seguramente ser

considerada como um possível indutor da expressão génica ventricular esquerda neste modelo de

hipertensão pulmonar (Kakinuma, 2002; Yamashita, 2001). No entanto, a hipóxia que usualmente

acompanha o modelo de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina é ligeira (Meyrick, 1980;

Yuyama, 2004). A hiperactividade do sistema nervoso simpático e a activação neuroendócrina

sistémica, descritas neste modelo (Brunner, 1999; Leineweber, 2002; Miyauchi, 1993), deverão ser

elementos decisivos na indução da actividade neuro-endócrina do ventrículo esquerdo. Quer as

catecolaminas (Kaddoura, 1996; Moser, 2002), quer a angiotensina II (Ito, 1993; Maki, 1998) são

indutores da expressão génica e síntese de endotelina-1. Outra hipótese conceptualmente atraente, que

não deve ser descurada, atendendo à elevada concentração e produção local destes mediadores,

comparativamente com os níveis circulantes (Dell’Italia, 1997), é que, como previamente sugerido

(Gomez, 1993), alguma substância, neste caso um mediador neuro-endócrino, fosse produzida no

ventrículo direito sobrecarregado, ou no pulmão, actuando preferencialmente e em elevada

concentração no ventrículo esquerdo.

Estudo da função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar

Preparações in vitro de feixes miocárdicos ventriculares esquerdos isolados

Apesar de vários resultados experimentais prévios sugerirem a ocorrência de disfunção

intrínseca do ventrículo esquerdo na hipertensão pulmonar, e mesmo que estes tenham sido obtidos

por avaliação hemodinâmica invasiva, recorrendo a índices relativamente independentes da

modulação pelas condições de carga, como a constante de tempo do relaxamento isovolumétrico, τ

(tau) (Ludbrook, 1979; Weiss, 1976), em animais toracotomizados, nos quais é feita a remoção do

pericárdio (Slinker, 1986) o que, em grande parte, excluí factores de confundimento como a

interacção e a interdependência ventriculares, a única metodologia experimental que garante uma

avaliação da função miocárdica intríseca é o estudo da função contráctil de feixes miocárdicos in vitro

14

uma vez que as condições de carga e a frequência cardíaca são controladas, a influência de

mediadores neuro-humorais sistémicos e a modulação pelo sistema nervoso autónomo são anuladas,

tal como o é a interferência de factores mecânicos como os que medeiam a interdependência

ventricular. A avaliação funcional de feixes de miocárdio ventricular esquerdo em modelos

experimentais de hipertensão pulmonar já foi efectuada por alguns autores e não revelou perturbação

da função em estadios de hipertensão pulmonar ligeira (Brown, 1998; Kögler, 2003), não foi, no

entanto, levada a cabo nas fases de doença mais avançada. Um teste frequentemente empregue para

avaliar a reserva contráctil e o estado funcional do miocárdio é a estimulação miocárdica com

frequências crescentes, a designada relação força frequência. O aumento de contractilidade com a

estimulação em frequência crescente, no âmbito das frequências cardíacas fisiológicas, é um

importante mecanismo regulador intrínseco da contractilidade cardíaca, que, quando está presente

garante a existência de uma normal reserva contráctil. Quando, pelo contrário, o miocárdio perde esta

reserva, e a relação força frequência passa a ser negativa, então, este é um claro indicador de

disfuncão miocárdica. A obtenção de relações força frequência é um excelente meio para avaliar a

gravidade da disfunção contráctil e a capacidade de reserva cardíaca (Endoh, 2004). Adicionalmente,

o estudo da função muscular in vitro permite a modulação aguda por fármacos, possibilitando, por

exemplo, o bloqueio da actividade de sistemas neuro-endócrinos locais, como, por exemplo o da

endotelina-1 (Leite-Moreira, 2003; Leite-Moreira, 2004). Contudo, o estudo do miocárdio ventricular

esquerdo do rato em elevadas frequências de estimulação, levanta dificuldades técnicas particulares,

uma vez que, atendendo às necessidades metabólicas elevadas e à necessidade de nutrição por difusão,

a partir de uma solução perfusora, é necessária a constante renovação desta solução e a dissecção de

feixes ultra-finos de miocárdio, com diâmetros de secção transversa inferiores a 300µm. Para

espessuras superiores de miocárdio e e na ausência de renovação constante de solução as zonas mais

profundas, ou centrais, do miocárdio são colocadas sob stress metabólico e entram em disfunção,

particularmente quando sujeitas a elevadas frequências de estimulação ou maiores sobrecargas.

Efectivamente, as relações força frequência do rato foram consideradas negativas durante longos anos,

15

até à demonstração do contrário em condições particularmente rigidas de solução de perfusão,

temperatura e dissecção fina dos feixes musculares; as baixas temperaturas, a ausência de recirculação

da solução perfusora e o estudo de feixes miocárdicos excessivamente espessos foram considerados os

factores de confundimento responsáveis pelos resultados anteriores que apontavam relações força-

frequências negativas no miocárdio do rato (Layland, 1999).

Avaliação hemodinâmica in vivo dos efeitos da sobrecarga aguda sobre a função diastólica

Outro teste de reserva contráctil pode ser levado a cabo, in vivo, no ventrículo esquerdo de

ratos com hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina. A elevação aguda da pós carga em

batimentos únicos é um teste de stress hemodinâmico que permite detectar disfunção diastólica

incipiente, mesmo que esta não seja evidente nos registos hemodinâmicos basais (Gillebert, 1997;

Leite-Moreira, 1999; Leite-Moreira, 2001; Leite-Moreira, 2006), um pouco à semelhança do que

sucede em alguns pacientes que desenvolvem hipertensão arterial durante o exercício (Warner, 1999)

ou nos pacientes idosos com hipertensão, em que a maior rigidez arterial e ventricular esquerda

durante a sístole se correlaciona com insuficiência cardíaca diastólica (Kawaguchi, 2003). Este teste

de sobrecarga hemodinâmica consiste na oclusão abrupta da aorta ascendente, com início na diástole,

para obter níveis de pós-carga variáveis, desde o valor de pressão máxima do batimento basal ao do

batimento isovolumétrico, em um único batimento teste, por forma a excluir variáveis como a

interdependência e interacção ventriculares e a resposta neurohumoral, que se fariam sentir no caso de

se efectuarem oclusões sustentadas. O efeito sobre a velocidade de relaxamento é avaliado através da

modificação da constante de tempo do relaxamento isovolumétrico, τ, e o efeito final na função

diastólica é avaliado pela análise da relação pressão-volume tele-diastólica. A constante de tempo τ,

cuja unidade é o milisegundo, é obtida após conversão matemática do traçado de pressões, registado

durante o relaxamento isovolumétrico, numa equação matemática que traduz a variação da pressão em

função do tempo. Esta equação é, classicamente, uma função exponencial em que τ é uma variável

que pode ser calculada, para cada traçado de queda de pressão, por exemplo, após conversão

16

logarítmica (Weiss, 1976), traduzindo a velocidade da queda de pressões e, portanto, do relaxamento:

a valores elevados de τ corresponde relaxamento mais lento e a valores menores relaxamento mais

rápido. Vários métodos matemáticos alternativos têm sido avançados para reproduzir a queda de

pressões ventricular e calcular τ, destacando-se o modelo logístico (Matsubara, 1995). A definição

hemodinâmica de disfunção diastólica é, classicamente, o desvio positivo da relação pressão-volume

tele-diastólica, que corresponde a pressões mais elevadas para um mesmo volume tele-diastólico e a

uma menor distensibilidade miocárdica (Grossman, 1980; Leite-Moreira, 2006). Durante longos anos

admitiu-se que esta relação só poderia ser modulada cronicamente, por vários factores determinantes

das propriedades passivas do enchimento ventricular (Gilbert & Glantz, 1989; Grossman, 1991) e

nunca pelo comprometimento do relaxamento activo, mas trabalhos mais recentes revelaram que a

elevação aguda da pós-carga pode condicionar quer o prolongamento do relaxamento miocárdico

activo quer a disfunção diastólica (Gillebert, 1997; Leite-Moreira, 1999), independentemente de

variações de pré-carga, mesmo que este efeito seja exacerbado nas pré-cargas mais elevadas (Leite-

Moreira, 2001). Efectivamente, uma sobrecarga de pressão excessiva pode lentificar o relaxamento

activo e prolongar o relaxamento, aumentando a respectiva constante de tempo τ, não permitindo um

relaxamento completo no tempo disponível em diástole, contribuíndo para a elevação da relação

pressão-volume tele-diastólica, ou seja, para a disfunção diastólica. À disfunção diastólica assim

evocada foi atribuída a designação de disfunção diastólica induzida pela pós-carga (Leite-Moreira,

1999; Leite-Moreira, 2001). O efeito da elevação aguda da pós-carga no relaxamento miocárdico e

disfunção diastólica parece ser dependente da espécie animal, sendo mais evidente em coelhos,

oryctolagus cuniculus, do que em rato, Rattus norvegicus (Correia-Pinto, 2003), dependente da

modulação da cinética do cálcio, por exemplo, pela cafeína ou por diferente expressão e actividade de

transportadores envolvidos na homeostasia do cálcio (Correia-Pinto, 2006; Leite-Moreira, 1999b) e do

ventrículo que é sobrecarregado, sendo o ventrículo direito bastante mais sensível à perturbação do

relaxamento induzida pela pós-carga (Correia-Pinto, 2006). Mas mais importante poderá ser a relação

17

com o estado funcional do miocárdio. Em corações saudáveis elevações pequenas a moderadas da

pós-carga aceleram a queda de pressões do relaxamento ventricular e só nas sobrecargas extremas é

que há uma lentificação do relaxamento, esta mudança no resultado dos efeitos da pós-carga ocorre

quando é ultrapassada a reserva contráctil, que neste caso se pode designar por reserva de pós-carga

(Gillebert, 1997), podendo quantificar-se reprodutivelmente o grau de pós-carga em que esta ocorre

recorrendo ao conceito de carga relativa. A carga relativa é o cociente entre a pressão sistólica

máxima desenvolvida num batimento pós-carregado e a pressão sistólica máxima do batimento

isovolumétrico, quando estes são obtidos em condições de pré-carga e contractilidade constantes,

podendo apresentar-se como percentagem. Nos corações com compromisso funcional elevações de

pós-carga menos marcadas, ou seja, cargas relativas inferiores, já desencadeiam uma lentificação do

relaxamento miocárdico e até disfunção diastólica, se a lentificação do relaxamento for de tal forma

pronunciada que não permita um relaxamento completo, no final da diástole, provocando uma

elevação da relação pressão-volume tele-diastólica (Gillebert, 1997; Gillebert, 2000; Leite-Moreira,

1994). As elevações agudas de pós-carga geram batimentos teste em que a contractilidade não se

altera, apesar da elevação da pressão sistólica máxima, e em que, portanto, a função sistólica é

insuficiente apesar da contractilidade ser normal, uma circunstância designada por afterload

mismatch, que pode estar presente no coração insuficiente mesmo em condições basais, com pressões

máximas ventriculares esquerdas relativamente normais para um coração saudável, o coração não

dispõem, então, de reserva contráctil de pós-carga, recorrendo à elevação das pressões tele-diastólicas

e à reserva da pré-carga, para manter uma função sistólica normal (Ross, 1976). A redução da pré- e

pós-carga por clampagem da veia cava inferior reverte a lentificação do relaxamento e a elevação da

relação pressão-volume tele-diastólica em modelos experimentais de insuficiência cardíaca (Ishizaka,

1995) e a redução da pré- e pós-carga melhoram a função diastólica em pacientes com edema agudo

do pulmão no contexto de hipertensão arterial e insuficiência cardíaca diastólica isolada (Gandhi,

2001). A identificação de alterações funcionais semelhantes no ventrículo esquerdo em modelos

experimentais de hipertensão pulmonar permitirá não só consubstanciar a existência de disfunção

18

miocárdica intrínseca, como também identificar novos mecanismos de descompensação na hipetensão

pulmonar. Evidências emanadas quer de modelos experimentais (Kawaguchi, 1992) quer de estudos

clínicos em pacientes com hipertensão pulmonar (Sun, 2001) apontam para uma grande sensibilidade

ao stress hemodinâmico, sendo reconhecida igualmente a má-resposta à agressão anestésico-cirúrgica

(Kerbaul, 2005). De facto, o stress hemodinâmico pelo exercício tem vindo a ser empregue para

facilitar o diagnóstico precoce de doentes com factores de risco para hipertensão pulmonar

(Provencher, 2005).

19

II- OBJECTIVOS

O principal objectivo dos trabalhos levados a cabo é a demonstração inequívoca da ocorrência

de disfunção miocárdica ventricular esquerda intrínseca no modelo experimental de hipertensão

pulmonar induzida pela monocrotalina.

São objectivos adicionais: (i) estabelecer possíveis mecanimos causais prováveis para a

ocorrência de disfunção sem sobrecarga, nomeadamente, o envolvimento de mecanismos

neuroendócrinos locais; (ii) comparar os dois ventrículos relativamente à função, resposta hipertrófica

e remodelagem miocárdica, por forma a melhor definir quais os papéis relativos da sobrecarga e da

actividade neuro-endócrina na progressão da insuficiência cardíaca; (iii) esclarecer possíveis

mecanismos indutores da actividade neuro-endócrina local do miocárdio ventricular esquerdo; (iv)

esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes à disfunção contráctil ventricular esquerda e a

respectiva sequência de activação temporal; e, finalmente, (v) caracterizar in vivo, do ponto de vista

hemodinâmico, a resposta ventricular esquerda a um teste de sobrecarga hemodinâmica por elevação

aguda de pós-carga.

20

III - METODOLOGIA

São tecidas considerações sumárias relativamente à metodologia empregue, sendo os métodos

apresentados com maior detalhe nos trabalhos que incorporam a tese.

Modelo experimental

O modelo experimental empregue é de execução simples, consistindo na administração, por

via subcutânea, em dose única, de 60mg/Kg do alcalóide pirrolizidínico, monocrotalina. Foram

empregues exclusivamente ratos Wistar macho com pesos corporais compreendidos entre 180-200g, e

cerca de 6-7 semanas de idade, estando descrita uma resposta mais ligeira em ratos fêmea (Tofovic,

2005) e respostas variáveis em função da idade (Werchan, 1989). As doses e vias de administração

utilizadas por diferentes grupos de investigadores são algo variáveis, sendo as empregues nos

trabalhos desta tese as mais frequentemente utilizadas. Num subgrupo de animais foi feito tratamento

crónico com o antagonista não-selectivo dos receptores ETA e ETB da endotelina-1, por administração

diária de uma dose de 250mg/Kg através de sonda orogástrica.

Avaliação hemodinâmica

A avaliação hemodinâmica foi levada a cabo em alguns animais, anestesiados com

pentobarbital, administrado por via intraperitoneal, numa dose de 60mg/Kg, ventilados

mecanicamente e sob fluidoterapia com soro fisiológico aquecido, após toracotomia e exérese do

pericárdio. A medição contínua das pressões ventriculares foi efectuada por micromanómetros de alta-

precisão com dimensões de 2F e 3F inseridos nas cavidades ventriculares direita e esquerda,

respectivamente, e os volumes foram registados recorrendo a cristais ultrassónicos implantados nas

paredes septal e lateral do ventrículo esquerdo, sendo a leitura dinâmica das distâncias entre os cristais

efectuada com um sonomicrómetro. Procedeu-se à colheita de registos hemodinâmicos basais e a

registos após oclusões transitórias da aorta ascendente, que elevaram a pós-carga do ventrículo

esquerdo, em ciclos isolados, para valores correspondentes a 60%, 70%, 80% e 90% dos valores de

21

pressão máxima do ciclo isovolumétrico, bem como ao registos de ciclos isovolumétricos, sendo

comparados os valores de τ e da pressão telediastólica entre o ciclo basal e o ciclo pós-carregado para

cada nível de pós-carga.

Estudos funcionais em feixes musculares miocárdicos

Noutro grupo de animais foi feita excisão do coração, sob anestesia, sendo este mantido e

dissecado em finos feixes de miocárdio (<300µm) colhidos do ventrículo esquerdo, sob visualização

microscópica, em solução de Krebs-Ringer modificada, a temperatura constante de 35ºC e pH

constante de 7,4, por intermédio de uma mistura de CO2 a 5% em O2. Os feixes miocárdicos foram

então ligados a transdutores de pressão e estimulados a uma frequência de 0,5 Hz até que a preparação

se tornou estável. Em alguns músculos procedeu-se, então, à estimulação com frequências crescentes

até 5 Hz, enquanto que noutros se administraram antagonistas selectivos dos receptores ETA.

No final das experiências realizadas foram pesados os animais, o coração, o ventrículo direito

e o conjunto constituído pelo septo e pela parede livre do ventrículo direito. Algumas amostras foram

processadas para avaliação histológica, enquanto outras foram conservadas para estudos de biologia

molecular.

Avaliação histológica

A avaliação histológica sumária consistiu na determinação dos diâmetros dos cardiomiócitos

da parede livre do ventrículo direito, do septo e da parede livre do ventrículo esquerdo e na coloração

com tricrómio de Masson para análise semi-quantitativa de fibrose miocárdica.

Estudos de biologia molecular

Os estudos de biologia molecular consistiram na quantificação relativa de ARNm por

transcrição reversa e reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real de genes envolvidos

na síntese de mediadores neuro-endócrinos locais como a endotelina-1, a enzima de conversão da

22

angiotensina, a síntase da aldosterona, o angiotensinogénio e o peptídeo auricular natriurético do tipo

B, e de genes de proteínas reguladoras da cinética do cálcio, como a ATPase de cálcio do retículo

sarcoplasmático e o fosfolambano. A quantificação da expressão génica como método de avaliação da

actividade neuro-endócrina local é um método aceite, em função da grande dependência da produção

dos mediadores e enzimas envolvidos relativamente à transcrição génica (Iwanaga, 1998; Takemoto,

1997; Roncon-Albuquerque, 2006), contudo no caso da endotelina-1 procedeu-se igualmente à

detecção imunohistoquímica em secções de miocardio, como método de confirmação. Já no caso da

expressão dos genes de proteínas reguladoras da cinética do cálcio, as especulações sobre qualquer

repercussão funcional são mais limitadas, uma vez que a sua actividade é substancialmente modulada,

por exemplo, por mecanismos de fosforilação e desfosforilação (Bers, 2006;Mattiazzi, 2005), o que

não invalida que estejam descritas alterações na expressão génica típicas do miocárdio insuficiente

(Bers, 2006; Hasenfuss, 1998; Katz, 2000). Finalmente, procedeu-se à quantificação relativa das

isoformas proteicas das cadeias pesadas de miosina, α e β, por electroforese em gel de poliacrilamida.

23

IV

ACTIVAÇÃO NEUROENDÓCRINA LOCAL E DISFUNÇÃO VENTRICULAR

ESQUERDA SEM REMODELAGEM NA HIPERTENSÃO PULMONAR

24

V

MECANISMOS SUBCELULARES E PROGRESSÃO DA DISFUNÇÃO

VENTRICULAR ESQUERDA NUM MODELO EXPERIMENTAL DE

HIPERTENSÃO PULMONAR

25

Time Course and Mechanisms of Left Ventricular Systolic and Diastolic

Dysfunction in Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension

(Currently under revision – American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology)

Jorge Correia-Pinto; Tiago Henriques-Coelho; Roberto Roncon-Albuquerque, Jr; André P. Lourenço;

Gustavo Melo-Rocha; Thierry C. Gillebert; Adelino F. Leite-Moreira

From the Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto, Portugal

Running title: LV Dysfunction in Pulmonary Hypertension

Current affiliations:

JC-P, GM-R: Health Sciences School, University of Minho, Braga, Portugal; TH-C, RR-A Jr, APL,

AFL-M: Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto, Portugal. TCG:

Department of Cardiology, University of Ghent, Ghent, Belgium.

Correspondence address:

Professor Adelino F. Leite-Moreira

Department of Physiology, Faculty of Medicine

Alameda Professor Hernâni Monteiro

4200-319 Porto, PORTUGAL

Tel: +351 225513644; Fax: +351 225513646

E.mail: amoreira@med.up.pt

26

ABSTRACT

Although pulmonary hypertension (PH) selectively overloads the right ventricle (RV), autocrine/paracrine

activation and intrinsic myocardial dysfunction have been recently described in the left ventricle (LV). In order to

establish the timing of LV dysfunction development in PH and to further clarify the underlying molecular changes,

Wistar rats were studied 4 and 6 weeks after subcutaneous injection of monocrotaline (MCT), 60 mg/Kg (MCT-4,

n=6; MCT-6, n=6), or vehicle (Ctrl-4, n=6; Ctrl-6, n=6). Acute single-beat stepwise increases of systolic pressure

were performed by constricting the ascending aorta from baseline to isovolumetric (LVPiso). This hemodynamic

stress was used to detect early changes in LV performance. Angiotensin-converting enzyme (ACE), Endothelin-1

(ET-1), Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum (SERCA2a), and phospholamban (PLB) mRNA

levels, and myosin heavy chain (MHC) protein isoforms were quantified in LV free wall. MCT treatment increased

RV pressures and RV/LV weight ratio, without changing LV end-diastolic pressures or dimensions. ET-1

overexpression and baseline LV dysfunction were present only in MCT-6 rats: dP/dtmax (Ctrl-4=4953±550;

MCT-4=5263±393; Ctrl-6=5197±567; MCT-6=2205±272 mmHg/s; p<0.001); LVPiso (Ctrl-4=194±7;

MCT-4=208±4; Ctrl-6=202±7; MCT-6=132±7 mmHg; p<0.001); dP/dtmin (Ctrl-4=-3144±259; MCT-4=-

3889±143; Ctrl-6=-2674±271; MCT-6=-1434±140 mmHg; p<0.001); time-constant-τ (Ctrl-4=22±2;

MCT-4=19±2; Ctrl-6=20±2; MCT-6=27±2 ms; p=0.003). Afterload elevations prolonged the time-constant-τ and

upward-shifted the end-diastolic pressure-dimension relation in MCT-4 and even more in MCT-6, but not in Ctrl

rats. MHC-isoform switch and ACE upregulation were present in both MCT groups while SERCA2a and PLB

expression were unaltered. In conclusion, rats with severe longstanding PH develop LV dysfunction associated

with ET-1 overexpression. At an earlier stage, however, LV diastolic dysfunction can be detected in response to a

hemodynamic stress, when only LV molecular changes, such as MHC isoform switch and ACE upregulation, are

present.

KEY WORDS: diastole; overload; heart; pulmonary hypertension; neuroendocrine.

27

INTRODUCTION

Although chronic pulmonary hypertension (PH) selectively overloads the right ventricle (RV), left

ventricular (LV) dysfunction also manifests in the course of primary PH (23), chronic thromboembolism (25) and

cor pulmonale (30). Echocardiography-based studies carried out in PH patients suggested that one of the

mechanisms contributing to LV dysfunction is ventricular interdependence and impaired LV filling (25). Other

studies, however, provide evidences that intrinsic LV myocardial abnormalities also contribute to LV dysfunction

in severe PH (5; 6; 24). In fact, the LV of rats with severe longstanding PH induced by monocrotaline (MCT)

presents local autocrine/paracrine system activation and muscle strips dissected from the LV myocardium show, in

vitro, negative force-frequency relationships (FFR) (24). Intrinsic LV myocardial abnormalities might help to

explain late recovery of LV filling after single-lung transplantation in patients with PH, even if LV geometry and

RV function are immediately restored (36). They might explain as well, why combined heart-lung transplantation is

favored for PH patients when severe impairment of LV function is present, since LV function may not sufficiently

recover after transplantation of the lungs alone (28).

The timing of development and the underlying mechanisms of intrinsic LV myocardial dysfunction were

incompletely investigated so far. In the present study, we analyzed biventricular hemodynamics and LV myocardial

expression of angiotensin converting enzyme (ACE), endothelin-1, sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-

ATPase, and phospholamban, and myosin heavy chain (MHC) protein isoforms, 4 weeks and 6 weeks after MCT

injection in the rat. Hemodynamics were studied at baseline and in response to single-beat afterload elevations,

which allow the detection of diastolic dysfunction that may not be evident during evaluation at rest, but is revealed

during exercise or hemodynamic stress (4; 34; 13; 21).

METHODS

Animal protocol

Animal experiments were performed according to the Portuguese law on animal welfare and conform to

the APS guiding principles in the care and use of animals and the Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals published by the US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revised 1996). Seven-

28

weeks-old male Wistar rats (n=48; CHARLES-RIVER, Barcelona, Spain) were housed in groups of 3 per cage in a

controlled environment under a 12:12h light/dark cycle at a room temperature of 22ºC. Rats randomly received, a

subcutaneous injection of monocrotaline (MCT, 60 mg/Kg; SIGMA CHEMICAL, St. Louis, MO; n=36) or an

equal volume of vehicle (Ctrl, n=12; 1 mL/Kg). Animals had free supply of food and water. Hemodynamic studies

and collection of samples for molecular studies were carried out, for control and MCT-treated rats, at days 22, 24 or

26 (4th week), Ctrl-4 (n=6) and MCT-4 (n=6), respectively, and at days 36, 38 or 40 (6th week) after injection, Ctrl-

6 (n=6) and MCT-6 (n=6), respectively.

Hemodynamic studies

Experimental preparation: Animals were anesthetized with an intraperitoneal injection of 60mg/Kg

pentobarbital sodium and additional boluses of 20 mg/Kg when needed, placed over a heating pad, and

mechanically ventilated (HARVARD RODENT VENTILATOR model 683) through a tracheostomy. The right

jugular vein was cannulated and a pre-warmed 0.9% NaCl solution was administrated to compensate for

perioperative fluid losses. The heart was exposed through a median sternotomy and the pericardium widely

opened. The ascending aorta was dissected and surrounded by a silk thread in order to transiently occlude it

during the experimental protocol. RV pressure was measured with a 2F high-fidelity micromanometer (SPR-

324, MILLAR INSTRUMENTS, Houston, Texas) inserted through the RV free wall into the RV cavity and LV

pressure with a 3F high-fidelity micromanometer (SPR-407, MILLAR INSTRUMENTS, Houston, Texas)

inserted through an apical puncture into the LV cavity. LV septal to free wall diameter was recorded with

ultrasonic crystals using a sonomicrometer amplifier (TRITON TECHNOLOGY, San Diego, CA). One crystal

was placed into the left border of the interventricular septum and the other on the epicardial surface of the LV

free wall, as previously described (1; 2). A limb ECG (II) was recorded throughout. After the instrumentation

period (typically 60 minutes), the animal was allowed to stabilize for 15 minutes before the beginning of the

experimental protocol. Recordings were made with ventilation suspended at end-expiration. Parameters were

converted on line to digital data with a sampling frequency of 1000 Hz.

Data analysis: Peak rates of LV and RV pressure rise (dP/dtmax) and fall (dP/dtmin) were determined.

RV and LV pressures were measured at end-diastole (EDRVP and EDLVP, respectively) and at peak-systole

(RVPmax and LVPmax). Relaxation rate was estimated with the time constant τ, by fitting isovolumetric LV

29

pressure fall to a monoexponential function. From baseline to isovolumetric, multiple graded LV pressure

elevations were randomly performed by abruptly clamping the ascending aortic root starting in the diastole

separating two heartbeats, as previously described (18; 19; 1; 2). Beats preceding aortic obstruction were

designated as baseline heartbeats and those immediately following it as test beats. Along with the baseline

hemodynamics, four afterloaded test-beats with a peak systolic pressure of approximately 60%, 70%, 80%, and

90% of the isovolumetric pressures, and the isovolumetric test-beat were selected for analysis. LV septum to

free wall diameter was measured at end-diastole. Afterload-induced shifts of the end-diastolic pressure-

dimension relation (EDPDR) were assessed by measuring diastolic pressures at matched dimensions, close to

end-diastole, as previously described (18; 19; 1; 2).

At the end of the hemodynamic study animals were euthanized with anesthetic overdose, the position

of crystals and manometers was verified, the RV was carefully dissected from the interventricular septum and

LV free wall, and transmural samples of LV free wall (excluding the septum) were collected for molecular

studies. Two MCT-6 rats died during hemodynamic instrumentation, having been excluded from analysis.

Molecular studies

Relative quantification of mRNA

Two-step Real-time RT-PCR was performed as previously described (24; 9; 8; 29). Briefly, after total

mRNA extraction (no. 74124, QIAGEN), standard curves were obtained using graded dilutions of a rat cardiac

tissue sample. The starting mRNA quantities were correlated (R≥ 0.98) with the respective threshold cycles, for

each gene. Threshold cycles were automatically calculated by software (LightCycler, ROCHE) using the

second derivative maximum method. An equal amount of mRNA from every sample underwent two separate

two-step real time RT-PCR experiments for each gene, using SYBR green as marker (no. 204143, QIAGEN).

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as internal control since its mRNA levels

were similar in the studied groups. Results are normalized for GAPDH and presented in arbitrary units. The

arbitrary unit was set as the mean obtained for the Ctrl-4 group. Specific PCR primer pairs for the studied genes

were: endothelin-1, fw 5’ - CCA TGC AGA AAG GCG TAA AAG - 3’, rev 5’ - CGG GGC TCT GTA GTC

AAT GTG - 3’; angiotensin-converting enzyme, fw 5’ - GCA GGC CAG CAG GGT CCA CTA CAC - 3’, rev

5’ - GAC CTC GCC ATT CCG CTG ATT CT - 3’; sarcoendoplasmic reticulum calcium-ATPase isoform 2a

30

(SERCA2a) fw 5’ - CGA GTT GAA CCT TCC CAC AA - 3’, rev 5’ - GGA GGA GAT GAG GTA GCG GAT

GGA - 3’; phospholamban fw 5’ - GGC ATC ATG GAA AAA GTC CA -3’, rev 5’ - GGT GGA GGG CCA

GGT TGT AA - 3’; and GADPH, fw 5’ - TGG CCT TCC GTG TTC CTA CCC - 3’, rev 5’ - CCG CCT GCT

TCA CCA CCT TCT - 3’.

Relative Quantification of myosin heavy-chain isoforms

Total protein (15 µg) was separated by SDS-PAGE (3.0 % stacking and 5.0 % running polyacrylamide

gels). Electrophoresis was carried out at constant voltage (60 volt) for ~270 min (no. 165-3301, BIO-RAD),

allowing the separation of myosin heavy-chain isoforms α and β isoforms in two distinct bands visible at ~200

KDa. Gels were silver-stained following the manufacturer’s instructions (no. 161-0449, BIO-RAD) and the relative

amount of the myosin heavy-chain isoforms in each sample was quantified by densitometry (Multilmage Light

Cabinet; ALPHA INNOTECH CORPORATION).

Statistical Analysis

Values were expressed as mean±SEM. Differences in baseline hemodynamic parameters, morphology, and

molecular studies were evaluated by two-way ANOVA. Three-way ANOVA was employed to compare data from

graded afterload elevations. Holm-Sidak’s method was used for multiple comparisons when significant differences

were detected. Statistical significance was assumed at a two-tailed value of P<0.05.

RESULTS

All MCT-6 animals presented clinical signs of congestive heart failure such as lethargic behavior, ruffled

fur, cachexia, tachypnea and severe breathing effort, pleural effusion, and ascites. MCT-4 animals behaved

similarly to control animals. Mortality was null in Ctrl-4 and Ctrl-6, 33% in MCT-4 and 70% in MCT-6. No

significant differences were observed between Ctrl-4 and Ctrl-6 for morphometric, hemodynamic and molecular

parameters.

31

Baseline hemodynamics and morphometry

MCT treatment resulted in progressively increasing RV peak-systolic pressures (P<0.001; Figure 1A).

Increased RV pressures were accompanied by selective RV hypertrophy (Table 1), as denoted by the progressive

increase of the RV to LV plus interventricular septum weight ratio (P<0.001; Figure 1B). RV end-diastolic

pressures were significantly increased in MCT-6 (3.9±0.7 vs 1.9±0.5, 0.5±0.3, and 1.1±0.6 mmHg, in MCT-4, Ctrl-

4, and Ctrl-6, respectively; P=0.005). Compared with the other groups, MCT-6 also presented lower body weight

(table 1) and heart rate (200±17 vs 287±7, 265±20, and 270±20 beats/min, in MCT-4, Ctrl-4, and Ctrl-6,

respectively; P=0.025).

Figure 1

Figure 1. Development of pulmonary hypertension and selective RV hypertrophy in response to monocrotaline

(MCT) injection. A: Peak systolic right ventricular pressures (RVPmax). B: Right ventricular (RV) weight/left ventricular

plus interventricular septum (LV+S) weight ratio. RVPmax progressively increased in MCT-4 (*P=0.006 vs Ctrl-4) and

MCT-6 (*P<0.001 vs Ctrl-6; †P=0.016 vs MCT-4); RV weight to LV weight ratio also increased in MCT-4 (*P=0.006 vs

Ctrl-4) and MCT-6 (*P<0.001 vs Ctrl-6; †P<0.001 vs MCT-4); n=6 in each group.

Table 1 – Morphological parameters.

Ctrl-4 MCT-4 Ctrl-6 MCT-6

BW, g 239 ± 25 270 ± 13 258 ± 38 185 ± 14*†

HW/BW, mg/g 3.3 ± 0.1 3.5 ± 0.1 3.1 ± 0.1 4.9 ± 0.2*†

RVW/HW, g/g 0.13 ± 0.01 0.21 ± 0.02* 0.14 ± 0.03 0.25 ± 0.01*†

Data are presented as mean±SE, n=6 in each group. BW, body weight; HW, heart weight; RVW, right

ventricular weight. P<0.05: * vs control at the same week; † vs MCT-4.

Both systolic (Figure 2) and diastolic parameters (Figures 3) were preserved at baseline in the LV of MCT-

4. MCT-6 animals, however, presented low peak LV systolic pressure (P<0.001) and disturbed indexes of both LV

contractility (Figure 2), such as reduced peak isovolumetric pressures (P<0.001) and dP/dtmax (P<0.001), and LV

32

relaxation (Figure 3), such as reduced dP/dtmin (P<0.001) and prolonged time constant τ (P=0.003). Despite these

hemodynamic disturbances neither the EDLVP nor the EDLVD were changed (Figure 3).

Figure 2

Figure 2. Left ventricular (LV) systolic hemodynamic parameters. A: Peak systolic LV pressure (LVPmax). B:

Peak isovolumetric LV pressure (LVPiso). C: Peak rate of LV pressure rise (dP/dtmax). *P<0.001 vs Ctrl-6, †P<0.001 vs

MCT-4, n=6 in each group.

Figure 3

Figure 3. Left ventricular (LV) diastolic hemodynamic parameters. A: End diastolic left ventricular (LV) pressure

(EDLVP). B: End diastolic LV dimensions (EDLVD). C: Peak rate of LV pressure fall (dP/dtmin). D: LV time constant τ.

Significant differences were found for dP/dtmin (*P=0.03 for MCT-4 and <0.001 for MCT-6 vs respective Ctrl group,

†P<0.001 vs MCT-4) and τ (*P=0.003 vs Ctrl-6, †P=0.036 vs MCT-4) whereas no differences were observed for EDLVP

and EDLVD; n=6 in each group.

Response of diastolic function to afterload elevations

Both MCT-4 and MCT-6 revealed an impaired response of diastolic function to afterload elevations

(Figure 4). This figure displays changes in the time constant τ (left panel) and shifts of the EDPDR (right panel)

with increasing afterloads. Effects on τ are expressed by the ratio of test to baseline beats values. Time constant τ

was differently affected by afterload in control and in MCT-treated rats. Control animals responded to afterload

elevations with shortening of τ (acceleration of pressure fall) for almost the entire range of systolic LV pressures,

apart from isovolumetric beats that showed a non-significant change in τ. On the contrary, MCT-treated animals

responded to afterload elevations with a prolongation of τ (slowing of pressure fall). This slowing was observed

33

only with the two highest afterload levels in MCT-4, while in MCT-6 such slowing was more pronounced and

present over the entire range of systolic LV pressures. With regard to the EDPDR, in response to afterload

elevations, it remained unaffected in control animals, but was upward shifted in both MCT-4 and MCT-6 groups.

This upward shift was of similar magnitude in MCT-4 and MCT-6, but occurred at much lower systolic LV

pressures in the later, so that MCT-6 curve in the right panel of Figure 4 is shifted to the left.

Figure 4

Figure 4. Effects of acute left ventricular (LV) afterload elevations on LV diastolic function. A: Fractional changes in

time constant τ (τtest/τbaseline). B: Upward shift in the end-diastolic pressure-dimension relation (EDPDR). Six beats with

progressively higher peak systolic LV pressure (LVPmax) are represented: baseline, test-beats with a peak systolic LV pressure

corresponding to 60%, 70%, 80%, and 90% of the isovolumetric beat, and the isovolumetric test-beat (LVPiso); n=6 in each

group. MCT-treated rats, distinctly from controls (*P<0.001), presented a prolongation of the time constant τ in test beats

compared with baseline beat (†P<0.001), while controls presented an overall acceleration of relaxation and shortening of τ,

with the exception of the isovolumetric test beats. In MCT-6 the changes in τ were more striking and observed for lower

afterload levels than in MCT-4 (‡P=0.007). The upward shift of EDPDR in test-beats compared with baseline beat (†P<0.01)

was more pronounced and observed for lower afterload levels in MCT-treated rats compared with controls (*P=0.008).

LV myofilaments and neuroendocrine and calcium-handling gene expression

The expression of genes involved in autocrine/paracrine systems was upregulated in the LV myocardium

of MCT-treated rats compared with controls (Figure 5). Angiotensin-converting enzyme mRNA levels were

progressively increased in MCT-4 and MCT-6 (P<0.05), whereas endothelin-1 expression was only elevated in

MCT-6 (P<0.05). While the expression of calcium-handling genes such as the Ca2+-ATPase of the

sarcoplasmic/endoplasmic reticulum and phospholamban was unchanged in both MCT-4 and MCT-6 groups

(Figure 6), a significant elevation of myosin heavy-chain β-isoform was observed in the myofilament composition

of both MCT-4 (P=0.003) and MCT-6 (P=0.005) LV myocardium compared with Ctrl-4 and Ctrl-6, respectively

(Figure 7).

Figure 5

34

Figure 5. Left ventricular (LV) mRNA levels

of angiotensin-converting enzyme (ACE; panel A) and

endothelin-1 (ET-1; panel B) in rats with monocrotaline

(MTC)-induced pulmonary hypertension (MCT-4, n=6;

MCT-6, n=6) and controls (Ctrl-4, n=6; Ctrl-6, n=6), 4

and 6 weeks after injection, respectively. Results are

expressed as arbitrary units after normalization for

GAPDH. The arbitrary unit was set as the average value

of the Ctrl-4 group. ACE mRNA levels progressively

increased in MCT-4 (*P=0.002 vs Ctrl-4) and MCT-6

(*P=0.033 vs Ctrl-6, †P=0.032 vs MCT-4), whereas ET-

1 mRNA levels were only increased 6 weeks after MCT

injection (*P=0.033 vs Ctrl-6, †P=0.002 vs MCT-4).

Figure 6

Figure 6. Left ventricular (LV) mRNA levels

of saroendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a;

panel A) and phospholamban (PLB; panel B) in rats with

monocrotaline-induced pulmonary hypertension (MCT)

and controls (Ctrl) 4 and 6 weeks after injection. Results

are expressed as arbitrary units after normalization for

GAPDH. The arbitrary unit was set as the average value

of the Ctrl-4 group. No significant differences were

observed, n=6 in each group.

35

Figure 7

Figure 7. Myosin heavy chain (MHC) isoform switch in monocrotaline-induced pulmonary hypertension, manifested

as a significant increase of the β-MHC isoform that was similar in the MCT-4 and MCT-6 groups. *P<0.01 vs control, at the

same week; n=6 in each group.

DISCUSSION

The present study was undertaken to investigate the onset and progression of LV dysfunction in the course of

PH, as well as, the underlying changes in myofilaments and local neurohumoral activation. A hemodynamic stress test

with single-beat afterload elevations was used to detect early, load dependent, changes in LV diastolic function in

animals with MCT induced PH.

MCT-treated rats progressively developed PH, as evaluated by RVPmax, selective RV myocardial hypertrophy,

and increased EDRVP. As previously reported (24), MCT-6 rats showed clinical signs of congestive heart failure,

disturbed indexes of LV contractility and relaxation, and increased expression of ACE and ET-1 in the LV

myocardium. A more detailed discussion on the possible causes of neuroendocrine activation in the non-overloaded LV

is provided elsewhere (24). MCT-6 animals also presented reductions in body weight and LVPmax, previously

interpreted as consequence of continuous severe sickness (26), as well as, diminished heart rate, suggesting an

attenuation of the sympathetic nervous system response (16; 24). In contrast, MCT-4 rats showed no baseline LV

hemodynamic changes. Nonetheless, single afterloaded test-beats revealed diastolic function impairment in MCT-4.

Systolic performance, as assessed by the contractility indexes LVPiso and dP/dtmax, was unchanged, but diastolic

36

dysfunction was elicited in response to increased afterload (afterload-induced diastolic dysfunction; 18; 19). Diastole

was evaluated with the time constant of isovolumetric relaxation τ and the end-diastolic pressure-volume relation

(EDPVR), the former evaluates relaxation rate while the latter allows a wider scope on diastolic function. The dynamic

process of myocardial relaxation goes on from the ejection phase to the early filling period. The main hemodynamic

manifestation of myocardial relaxation, however, is LV pressure fall and its analysis, through the time constant τ,

allows a description of the course of myocardial relaxation (21). Changes in afterload modify τ and the rate of LV

pressure fall. While in healthy hearts small afterload elevations accelerate LV pressure fall and only marked afterload

increases slow it, in failing hearts even slight increases in afterload may induce slower relaxation. At a similar systolic

LV pressure, in failing hearts the relative load, defined as the ratio of systolic LV pressure to isovolumetric LV

pressure, is higher, the afterload reserve is surpassed and afterload mismatch yields a pronounced slowing of LV

pressure fall, compared with healthy hearts (4; 17).

Diastolic dysfunction is commonly defined, in hemodynamic terms, by an upward displacement of the EDPVR

(21), which reflects a decrease in diastolic distensibility (7). Classically, it was held that only chronic conditions that

altered the compliance and distensibility of the LV could change the filling conditions to the point of modifying the

EDPVR. However, more recent work demonstrated that the EDPVR could be acutely shifted by load (18; 19) and

neurohumoral stimulation (20; 22; 27). Afterload mismatch induces incomplete myocardial relaxation that can be large

enough to increase LV pressure at end-diastole and cause diastolic dysfunction. Compared with control rats, MCT-

treated rats developed prolongation of time constant τ and a larger upward shift of the EDPDR indicating that afterload

mismatch occurred at lower relative loads. Curiously, although MCT-6, unlike MCT-4, presented prolongation of τ at

baseline that was aggravated with every step up in relative load, there were no differences between the two groups

regarding the upward shift of the EDPDR induced by afterload. One possible reason is the difference in heart rates.

Inappropriate increases in heart rate are known to upwardly displace the EDPVR even if relaxation rate is normal (35),

conversely, the reduction in the heart rate of MCT-6 may have partly reverted afterload-dependent diastolic dysfunction

by increasing the time available for relaxation and the extent of relaxation. Animals and patients with PH are known to

respond badly to hemodynamic stress (12; 33). The present results suggest that increased systemic blood pressures may

induce, or contribute to, hemodynamic deterioration in PH by leading to, or worsening of, LV diastolic dysfunction.

One of the most likely subcellular candidates for myocardial dysfunction is the altered myofilament

composition. MCT-treated rats presented myosin heavy-chain isoform switch in the LV myocardium. The slower β-

37

isoform was increased in the LV of both MCT-4 and MCT-6, as previously reported for MCT (10) and hypoxia-

induced PH (32). Changes in the expression of enzymes involved in bioenergetics and cell metabolism such as

pyruvate dehydrogenase kinase-4, acetyl-CoA dehydrogenase and mitochondrial ATP synthase have also been

described in the LV of PH rats (31; 32). Contrastingly, calcium kinetics regulator proteins such as the Ca2+-ATPase of

the sarcoendoplasmic reticulum and phospholamban were consistently reported to be unaltered in the non-overloaded

LV (14; 31; 32). The present study extends the later findings to a stage of severe disease, when LV dysfunction has

already developed, but we must point out that changes in phospholamban phosphorylation have recently been identified

in the LV of mice with hypoxia-induced pulmonary hypertension (15). Regarding local autocrine/paracrine related gene

expression, MCT-4 rats showed increased ACE mRNA levels in the LV myocardium. However, only MCT-6 rats

presented markedly increased expression of ET-1, and ACE was further upregulated compared with MCT-4. The

activation of autocrine/paracrine systems, particularly for ET-1, was concomitant with the development of LV systolic

and diastolic dysfunction in the baseline hemodynamic evaluation. It has been suggested that cardiac ET-1 may play a

critical role in the functional deterioration of LV during the transition to congestive heart failure (11), indeed, chronic

administration of ET-1, for 5 days, to engineered heart tissues, derived from cells of neonatal rat hearts, decreased the

contractile response to calcium and isoprenaline and changed myosin heavy.chain isoform and sarcoendoplasmic

reticulum Ca2+-ATPase expression in a signaling pathway that involved protein kinase-C and the Na+/H+ exchanger

(37). Lower heart rate, LVPmax and LV dysfunction under the stress of anesthesia and surgical manipulation could well

be partly the consequence of refractoriness to adrenergic stimulation mentioned above. Although we also found

modifications in myosin heavy-chain isoform we did not observe changes in sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase

expression, but the experimental settings are not comparable. Further supporting the possibility that endothelin-1 might

have an important role modulating LV function in PH we have previously demonstrated that chronic ET-1 blockade

prevents functional deterioration of the LV myocardium in PH rats, restoring normal contractile response to increasing

frequencies of stimulation (24).

In conclusion, selectively RV overloaded MCT-treated rats develop, on hemodynamic assessment, LV

dysfunction that is accompanied by myosin heavy-chain isoform switch and local LV autocrine/paracrine system

activation. Despite the changes in myocardial molecular phenotype, such as MHC isoform switch and ACE

upregulation, in the LV, four weeks after MCT injection, diastolic dysfunction can only be detected in MCT-4 by

increasing afterload. Two weeks later, however, the LV myocardium of MCT-6 overexpresses ET-1 and presents

38

baseline systolic and diastolic dysfunction. ET-1 may participate in the transition to LV dysfunction and congestive

heart failure in PH. Afterload-dependent diastolic disturbances of the LV may herald, or contribute to, hemodynamic

deterioration in PH.

ACKNOWLEDGEMENTS

Supported by Portuguese grants from FCT (PRAXIS/SAU/11301/98; partially funded by FEDER) and Calouste

Gulbenkian Foundation, through Unidade I&D Cardiovascular (51/94-FCT). There are no conflicts of interest to

disclose.

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43

VI - CONCLUSÕES

Quer a avaliação hemodinâmica invasiva, basal e com elevação de pós-carga, quer a avaliação

in vitro da contractilidade miocárdica ventricular esquerda nos estadios mais avançados de hipertensão

pulmonar, com sinais clínicos de insuficiência cardíaca, denotam disfunção miocárdica intrínseca,

sendo particularmente relevante o achado de relações força–frequência negativas. Estudos anteriores,

levados a cabo neste modelo experimental, em fases mais precoces, com hipertensão pulmonar menos

grave, reveleram relações força-frequência positivas, embora fosse clara uma tendência para

diferenças em relação aos controlos (Kögler, 2003). Embora este modelo seja um modelo

experimental animal, que não tem uma correspondência directa com qualquer patologia humana (Kay,

1967; Pietra, 1989; Robbins, 2004), e, portanto, não se possa fazer uma extrapolação directa dos

resultados para a fisiopatologia da hipertensão pulmonar, estes enquadram-se bem com alguns

achados clínicos dos doentes com HTP grave e disfunção ventricular esquerda, nos quais se opta

frequentemente por transplantação combinada de pulmão e coração, uma vez que a disfunção

ventricular não é, na maior parte dos casos, reversível com o transplante pulmonar isolado

(Pielsticker, 2001). Quando estes pacientes são submetidos a transplante pulmonar de pulmão único,

só um ano após transplantação recuperam o preenchimento VE normal, mesmo que o

restabelecimento da função VD e da geometria do VE ocorra bem mais precocemente (Xie, 1998).

A activação neuro-endócrina miocárdica no modelo experimental de hipertensão pulmonar

induzida pela monocrotalina ocorre não só no ventrículo direito sobrecarregado, mas também no

ventrículo esquerdo. Os trabalhos experimentais desta tese são os primeiros que se centram neste tema

e fazem prova inequívoca desta hipótese. No entanto, a activação ventricular esquerda parece ser

selectiva. Não se verifica para o peptídeo natriurético do tipo B e no caso da enzima de conversão da

angiotensina é mais significativa no ventrículo direito do que no ventrículo esquerdo. A endotelina-1,

contudo, aumenta de forma indiferenciada em ambos os ventrículos, apresentando, até, uma tendência

para uma maior elevação no ventrículo esquerdo, que foi confirmada a nível da proteína, uma vez que

44

a maior marcação imunohistoquímica foi idêntica num e noutro ventrículo. Os factores subjacentes à

activação neuro-endócrina ventricular esquerda não ficam completamente definidos nos trabalhos

experimentais desta tese, embora esta seja a primeira a focar o tema. Não parece ser explicada por

alterações das condições de carga, uma vez que não se registou alteração nas pressões ou volumes

tele-diastólicos do ventrículo esquerdo. Não deve ser interpretada assumindo que o miocárdio

ventricular esquerdo está em continuidade directa com o ventrículo direito, pois houve diferenças

claras no perfil de activação da expressão génica entre os dois ventrículos. A expressão do peptídeo

natriurético do tipo B não foi activada no ventrículo esquerdo, à semelhança do que já havia sido

descrito por outros autores para o peptídeo natriurético do tipo A (Partovian, 1998). Pode também

excluir-se a toxicidade da monocrotalina, uma vez que esta é desprovida de efeitos directos na

estrutura miocárdica (Kay, 1967), e, como as amostras de miocárdio foram colhidas da parede livre, e

não do septo, a sobrecarga do septo pela hipertensão pulmonar também não pode explicar os

resultados. Embora não se possa excluir definitivamente o papel da hipoxemia, o facto de não se terem

encontrado diferenças na expressão génica do factor de transcrição indutível pela hipóxia-1α, factor

que está muito associado aos mecanismos subcelulares da indução da expressão génica da endotelina-

1 pela hipóxia (Kakinuma, 2001), não apoia esta possibilidade. Resta, finalmente, a hipótese, muito

provável, de que sejam mediadores neuro-endócrinos a induzir a activação neuroendócrina ventricular

esquerda. Tanto o sistema nervoso simpático (Kaddoura, 1996; Moser, 2002), como a angiotensina II

(Ito, 1993; Maki, 1998), são indutores da expressão génica da endotelina-1, e os níveis séricos de

ambos os mediadores estão aumentados (Brunner, 1999; Leineweber, 2002). Os trabalhos levados a

cabo permitem, no entanto, especular quanto a possíveis acções parácrinas ou endócrinas específicas.

De facto, demonstrou-se, particularmente, grande activação da produção tecidual local, destes

mediadores, não apenas no ventrículo esquerdo, caso da endotelina-1, mas também no ventrículo

direito, caso da enzima de conversão da angiotensina, sendo segura a maior produção local de

angiotensina II, à semelhança do que acontece no ventrículo esquerdo, quando sobrecarregado

(Schunkert, 1990). É reconhecida a maior importância fisiopatológica e quantitativa do sistema

45

renina-angiotensina local, relativamente ao sistémico (Dell’Italia, 1997; Kyriakidis, 1998; Takemoto,

1997), e também o seu papel como indutor da expressão da endotelina-1 (Clavell, 1996; Fujisaki,

1995; Ito, 1993). Atendendo à proximidade dos ventrículos e à comunicação através da circulação

pulmonar, não seria surpreendente que a maior produção ventricular direita de factores parácrinos e

endócrinos como a angiotensina II fosse responsável pela indução da expressão génica ventricular

esquerda, particularmente no caso da endotelina-1. De facto, apesar destas não constituírem

argumento de causalidade, pudemos estabelecer correlações fortes entre a expressão de ARNm da

enzima de conversão da angiotensina ventricular direita com a de endotelina-1 ventricular esquerda,

ao passo que a correlação entre a expressão de endotelina-1 no ventrículo direito e a de enzima

conversora da angiotensina no ventrículo esquerdo não foi significativa (dados não publicados). Estes

resultados apoiam a hipótese previamente avançada de que uma substância produzida no ventrículo

direito sobrecarregado pudesse actuar no ventrículo esquerdo induzindo alterações funcionais

(Gomez, 1993; Gomez, 1994).

Apesar da activação neuro-endócrina de sistemas classicamente associados a hipertrofia e

fibrose miocárdica, sem activação concomitante de um importante sistema contra-regulador, como o

dos peptídeos natriuréticos, foi no ventrículo direito que se identificou hipertrofia cardiomiocitária e

fibrose, e não no ventrículo esquerdo, o que reforça quer a concepção que os peptídeos natriuréticos

desempenham um papel modesto, como contrareguladores, sendo os seus efeitos largamente

ultrapassados pela acção dos sistemas promotores de hipertrofia e fibrose miocárdica, na progressão

da resposta hipertrófica e remodelagem miocárdica (Molkentin, 2003), quer o papel essencial da

sobrecarga nestas alterações (Koide, 1999). Contudo, deve ser realçado que a activação neuro-

endócrina se faz sentir tardiamente, enquanto que a sobrecarga ventricular direita está presente

praticamente desde o início do modelo experimental, o que obviamente deve ser tido em conta na

interpretação dos resultados.

46

O tratamento crónico, dos animais com hipertensão pulmonar, com um antagonista não-

selectivo da endotelina-1 não só atenuou a hipertrofia ventricular direita, indicando um efeito benéfico

na hipertensão pulmonar, por provável acção na vasculatura pulmonar, já descrito (Hill, 1997), como

também restaurou a positividade das relações força frequência, que apresentaram valores similares aos

dos controlos, sustentando a hipótese de que parte das acções benéficas dos antagonistas da

endotelina-1 se devam a efeitos miocárdicos. Outras evidências experimentais recolhidas apoiam esta

hipótese: a activação e hiperprodução local da endotelina-1, com alteração do efeito contráctil no

bloqueio agudo dos receptores ETA in vitro em feixes musculares ventriculares esquerdos sugere não

só hiperactividade deste sistema no miocárdio ventricular esquerdo, como também uma perturbação

da resposta funcional usual, à semelhança do que acontece na hiperactividade do sistema nervoso

simpático (Leineweber, 2002; Seyfarth, 2000). Apesar das reservas quanto à extrapolação para a

fisiopatologia da doença humana, deve referir-se que estes resultados também se enquadram bem com

aspectos clínicos de descrição recente. Num relato do caso clínico de um paciente com hipertensão

pulmonar, e disfunção ventricular esquerda severa concomitante, o transplante pulmonar isolado foi

bem tolerado, com recuperação completa da função cardíaca, após um período de terapia, durante

alguns meses, com Bosentan. Os autores atribuíram este resultado essencialmente à redução da

interacção ventricular, tendo, contudo, especulado sobre possíveis acções miocárdicas directas do

Bosentan (Brauchlin, 2005). As acções miocárdicas directas do Bosentan poderão explicar em parte o

grande sucesso na terapêutica da hipertensão pulmonar, comparativamente com outros fármacos que

têm vindo a ser testados, particularmente na recuperação da capacidade funcional e de exercício

(Rubin, 2005). Os resultados podem assumir igualmente relevância fisiopatológica e clínica se se

admitir que a função ventricular esquerda poderá ser um alvo terapêutico na hipertensão pulmonar,

um estudo mais recente, que segue esta linha de pensamento, identificou melhoria da sobrevida, no

mesmo modelo experimental, após terapêutica crónica com Valsartan (antagonista AT1 selectivo),

tendo correlacionado esta melhoria com alterações no ventrículo esquerdo, e não no ventrículo direito

(Usui, 2006).

47

Os mecanismos moleculares subcelulares que explicam a disfunção intrínseca do ventrículo

esquerdo não ficam completamente esclarecidos neste trabalho. Quanto à comutação das isoformas

das cadeias pesadas de miosina, com maior predomínio das formas β, apesar da demonstração prévia

de alterações semelhantes em ambos os ventrículos neste modelo experimental (Ishikawa, 1991), estes

resultados foram postos em causa num trabalho recente, que empregou metodologia experimental

mais moderna (Kögler, 2003). Contudo, este trabalho foi levado a cabo em animais com formas

menos graves de doença. Recorrendo à mesma metodologia experimental, de electroforese em gel de

poliacrilamida, identificamos comutação das isoformas das cadeias pesadas de miosina também no

ventrículo esquerdo. Estas alterações moleculares têm sido associadas à acção da endotelina-1 e, de

facto, os antagonistas da endotelina-1 inibem esta comutação no ventrículo direito no mesmo modelo

experimental (Ichikawa, 1996). Deve salientar-se, no entanto, que apesar de a comutação para as

isoformas β ser responsável pela diminuição dos índices de contracção e relaxamento que dependem

da velocidade dos ciclos de pontes cruzadas do miocárdio, estas alterações são muito mais relevantes

no miocárdio do rato do que no miocárdio humano (Dorn, 1994). Quanto à expressão de proteínas

reguladoras da cinética do cálcio, não foram identificadas alterações, ao contrário do que ocorre no

ventrículo direito (Kögler, 2003). Estes resultados não são concordantes com a acção neuro-endócrina

crónica, com as acções da endotelina-1 ou com o que é usual encontrar-se no miocárdio disfuncional,

contudo, eles devem ser interpretados considerando que a activação neuro-endócrina só é marcada nas

fases mais avançadas da doença e que, portanto, podem existir alterações funcionais nestas proteínas

sem que tenha havido tempo para a modulação da expressão génica. Efectivamente, no modelo de

hipertensão pulmonar induzida pela hipóxia foi recentemente descrita, no ventrículo esquerdo, a

alteração do estado de fosforilação do fosfolambano (Larsen, 2006).

A identificação, por um lado, de disfunção diastólica ventricular esquerda induzida pela pós-

carga em estadios menos graves de hipertensão pulmonar, em que esta não era evidente para a função

basal, e, por outro, de exacerbação da disfunção diastólica nos estadios mais avançados, em que já é

48

notória a disfunção basal tem, para além de relevância experimental, particular relevância clínica. No

primeiro caso, porque aponta, tal como as relações força-frequência negativas, levadas a cabo in vitro,

para disfunção miocárdica intrínseca, com a vantagem de ser um teste levado a cabo in vivo,

confirmando a capacidade deste teste hemodinâmico de sobrecarga para distinguir entre miocárdio

com reserva contráctil, e normal função, e miocárdio disfuncional. No segundo caso, porque poderá

constituir um alerta clínico a todos os que tratam doentes com hipertensão pulmonar, em consulta, em

cuidados intensivos ou no bloco operatório (Kerbaul, 2004; Sun, 2001;). A hipertensão sistémica

poderá ser mais um factor de descompensação ou agravamento clínico a evitar, mesmo que a causa de

hipertensão pulmonar não seja a falência ventricular esquerda ou a valvulopatia mitral.

49

VII - BIBLIOGRAFIA

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