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Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO Disciplina de Microbiologia – Turma de Nutrição

MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM

Introdução: Os métodos de coloração são muito importantes em bacteriologia, pois facilitam a visualização das bactérias ao microscópio de luz. Alguns métodos são denominados de diferenciais, isto é permitem a classificação das bactérias em “grupos”. Entre estes métodos destacam-se o Método de Coloração de Gram (que classifica a maioria das bactérias em Gram positivas e Gram negativas) e o Método de Ziehl-Neelsen (que cora em particular as micobactérias). O objetivo desta aula é executar o Método de Coloração de Gram. Este diferencia as bactérias em relação a sua capacidade de resistir a remoção do complexo corante iodopararrosanilina (reação do corante cristal violeta e com o iodo do mordente lugol) por uma solução de descorante orgânico (solução de álcool etílico, solução de acetona, ...). As bactérias que retêm o complexo corante (reação positiva) se apresentam coradas em roxo são chamadas de “Gram positivas”. As que não conseguem reter o complexo corante (reação negativa) se apresentam coradas em rosa são chamadas de “Gram negativas”. Observação: Os esporos bacterianos não se coram no Método de Gram. Procedimento: 1- Preparo de Esfregaço Bacteriano: 1.1- A Partir de Colônias Bacterianas:

⇒ colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina; ⇒ tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo e homogeneizar o material da alça na

gota de salina colocada da lâmina; ⇒ distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue

e homogêneo (ESFREGAÇO); ⇒ deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente; ⇒ fixar o esfregaço à lâmina passando esta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem;

1.2- A Partir de Culturas em Meio Líquido: ⇒ colocar uma “alçada” da cultura na lâmina; ⇒ distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue

e homogêneo; ⇒ deixar o ESFREGAÇO secar a temperatura ambiente; ⇒ fixar o esfregaço à lâmina passando esta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem;

2- Coloração do Esfregaço Bacteriano pelo Método de Gram :

⇒ cobrir o esfregaço com a Solução de Cristal Violeta por 1 minuto ; ⇒ desprezar o corante e lavar a lâmina com água corrente (não deixar que o jato de água incida

diretamente sobre o esfregaço); ⇒ cobrir o esfregaço com o Solução de Lugol (iodo + iodeto de potássio) por 1 minuto ; ⇒ desprezar o mordente e lavar a lâmina com água corrente; ⇒ cobrir o esfregaço com o Solução Descorante por alguns segundos e desprezar; ⇒ lavar a lâmina com água corrente*; ⇒ cobrir o esfregaço com a Solução de Contra-Corante (safranina ou fucsina de Ziehl-Neelsen

diluída 1/10) por 30 segundos ; ⇒ desprezar o contra-corante e lavar a lâmina com água corrente*; ⇒ secar a lâmina e observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão;