UNIVERSIDADE DE SO PAULOFaculdade de Zootecnia e Engenharia de AlimentosDepartamento de Cincias Bsicas

BIOQUMICA FUNDAMENTALPROF. DR. MARCELO DE CERQUEIRA CESARENGENHARIA DE ALIMENTOS XIV - DIURNO

MTODO DE LOWRY: DETERMINAO DE PROTENA EM AMOSTRA DE LEITE

CAROLINE OLIVEIRA AGOSTINI 9006913

Pirassununga 2015

SUMRIO

RESUMO31.INTRODUO42.OBJETIVO73.MTODO84.RESULTADOS E DISCUSSO105.CONCLUSO136.BIBLIOGRAFIA14

RESUMO

Devido a diversidade de funes realizadas pelas protenas torna-se interessante utilizar mtodos para quantifica-las, o mtodo de Lowry vantajoso, pois apresenta uma alta sensibilidade. No experimento, foram feitas amostras padro, para posterior clculo de uma curva padro, e amostras de leite integral e desnatado diludos na proporo de 1:200. A partir da curva padro foi ajustada uma reta onde y representa as absorbncias obtidas por um espectrofotmetro e x a concentrao de protenas em mg/mL. Pela equao da reta ajustada foi possvel calcular as concentraes das amostras de leite depois de medir suas absorbncias e substitu-las na equao calculada. Foi feita uma mdia das concentraes e concluiu-se que a mdia do leite desnatado foi superior a mdia do leite integral, porm a diferena foi mnima, sendo justificada por erros experimentais que esto envolvidos em qualquer experimento e confirmando a informao dos rtulos de leite integral e desnatado que dizem que as concentraes de protenas so iguais.Palavras chave: protenas, mtodo de Lowry, leite, reativo de Folin, absorbncia, espectrofotmetro

1. INTRODUOProtenas so as macromolculas biolgicas mais abundantes que ocorrem em todas as clulas e em todas as partes das clulas (LEHNINGER, 2006). Sua unidade estrutural bsica so os aminocidos, que existem em grandes quantidades, porm apenas 22 so considerados proteinognicos, ou seja, podem ser encontrados como constituintes de protenas (MORAES et al., 2013). Com exceo da glicina, todas as molculas de aminocidos so assimtricas, o carbono central ligado a um grupo amina (-NH2), a um grupo cido carboxlico (-COOH), a um hidrognio e a uma cadeia lateral variada. Sendo assim, as protenas possuem uma grande variedade estrutural devido ao grande nmero de possibilidades de sequncias de aminocidos. Para formar protenas necessrio que se formem ligaes peptdicas (Figura 1) entre os aminocidos, essas ligaes ocorrem quando o grupamento amina de um aminocido se liga ao grupamento cido carboxlico de outro aminocido (MORAES et al., 2013).

Figura 1 Ligao peptdicaFonte: http://www.simbiotica.org/composicaoquimicacelula.htm

Em virtude da alta variabilidade estrutural das protenas elas possuem diversas funes como, por exemplo, fornecer proteo e resistncia a estruturas biolgicas, catalisar reaes (enzimas), transportar molculas e regular a atividade celular. Por esse motivo torna-se interessante estudar metodologias para determinao de protenas em vrias reas como tecnologia e cincias de alimentos, laboratrios de anlises clnicas, nutrio animal, nutrio humana, entre outros.Na literatura esto descritos vrios mtodos de determinao de protenas baseados em espectrofotometria, nefelometria e medies HPLC (SANTOS, 2012). Os mtodos vias espectrofotometria mais utilizados so: mtodo de Biureto, mtodo de Bradford, mtodo de Smith ou BCA, mtodo de absoro ultravioleta e mtodo de Lowry, esse ser utilizado no experimento desse relatrio. importante acrescentar que no existe um mtodo universal, a escolha deste vai depender do tipo de anlise e da substncia a ser analisada.O mtodo de Lowry para determinao de protenas consiste, basicamente, em duas reaes, a primeira delas a de reduo do on cobre, em condies alcalinas, formando um complexo com as ligaes peptdicas, o on de cobre monovalente conjuntamente s cadeias laterais de alguns aminocidos da protena (tirosina, triptofano, cistena, asparagina e histidina) levam reduo dos componentes cidos presentes no reagente de Folin amplificando a colorao primeiramente obtida (MORAES et al. , 2013), sendo assim, as amostras com tons de azul mais fortes devem conter maior concentrao de protenas.As principais vantagens do mtodo de Lowry so: a sua alta sensibilidade, melhor exatido e menor consumo de amostra e, por isto, tem sido utilizado para a determinao da concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: lquor, plasma sanguneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas, leite humano e produtos alimentcios (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998).

A concentrao de protena, nesse mtodo, calculada a partir da leitura da absorbncia ou quantidade de luz absorvida, que medida por um espectrofotmetro. Este constitudo por uma fonte de luz, um colimador, um prisma, uma fenda seletora, um compartimento de amostras, uma clula foteltrica e um amplificador (Figura 2). A luz fornecida fracionada pelo prisma em luzes monocromticas, o comprimento de onda dirigido at a amostra onde parte da luz absorvida e outra parte transmitida, a reduo de intensidade luminosa medida pela clula foteltrica, o sinal eltrico amplificado e visualizado no galvanmetro em nmeros, lido como uma absorbncia e proporcional concentrao da substncia existente no compartimento.

Figura 2 Componentes de um espectrofotmetro: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma, (d) fenda seletora, (e) compartimento de amostras, (f) clula foteltrica e (g) amplificador.Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/componentes.html

Sendo assim, neste relatrio o mtodo de Lowry ser utilizado para quantificar as protenas do leite desnatado e integral, que, no rtulo, so iguais.

2. OBJETIVOEsse relatrio tem por objetivo determinar a quantidade de protena do leite pelo mtodo de Lowry.

3. MTODOPrimeiramente foram identificados 2 micro tubos com leite integral e leite desnatado. As amostras de leite foram diludas com gua destilada na proporo 1:20 em outros dois micro tubos identificados como leite integral diludo e leite desnatado diludo. Sendo assim, os micro tubos diludos continham 50L de leite integral ou desnatado e 950L de gua destilada. Aps a diluio os micro tubos foram homogeneizados.Cinco tubos de ensaio foram enumerados de 1 a 5, em outro tubo escreveu-se BRANCO, em outros 3 tubos escreveu-se LID (Leite Integral Diludo) e em outros 3 LDD (Leite Desnatado Diludo).Foi ento colocada nos tubos BRANCO e os enumerados de 1 a 5 uma soluo padro de albumina e gua destilada nas medidas indicadas na tabela 1 para a curva padro e depois fez-se a leitura de absorbncia dos tubos.

Tabela 1 Quantidade de soluo padro de albumina e gua destilada nos respectivos tubosTubosSoluo Padro de Albumina (0,4mg/mL)gua Destilada

BRANCO-500L

1100L400L

2200L300L

3300L200L

4400L100L

5500L-

Nos tubos das triplicatas de Leite Integral Diludo e Leite Desnatado Diludo foram colocadas as amostras inicialmente diludas e gua destilada, as quantidades esto na tabela abaixo:

Tabela 2 Quantidade das amostras diludas e de gua destilada nos respectivos tubosTubosLeite Integral Diludo 20xgua Destilada

Triplicata50L450L

TubosLeite Desnatado Diludo 20xgua Destilada

Triplicata50L450L

Em seguida, foi colocado 5mL de mistura reativa em todos os tubos, agitou-se todos eles no agitador para tubos e incubou-se por 10 minutos a temperatura ambiente. Aps os 10 minutos, adicionou-se 500L do reativo de Folin e cobriu-se com papel parafilme todos os tubos para que fosse levado ao agitador novamente. Os tubos foram incubados a temperatura ambiente por mais 30 minutos. Fez-se ento a leitura das absorbncias de cada tubo em espectrofotmetro a 660nm, sendo que o tubo BRANCO foi utilizado como padro.

4. RESULTADOS E DISCUSSOAo fazer a leitura dos tubos de 1 a 5 (Figura 3) e do tubo BRANCO foram obtidas as seguintes absorbncias:Tabela 3 Absorbncias dos tubos 1 a 5 e BRANCOTubosLeitura

BRANCO0

10,234

20,121

30,239

40,280

50,316

Figura 3 Tubos 1 a 5 da direita para esquerda aps adio do reativo Folin

Era esperado que fosse obtida uma absorbncia crescente ao longo dos tubos, porm, por algum erro de pipetagem, o tubo 2 apresentou uma absorbncia menor do que a esperada. Com esses valores montou-se uma curva padro e ajustou-se uma reta como pode ser visto na Figura 4.

Figura 4 Curva padro das amostras padres e reta ajustada com equao y=0,6557x + 0,0672

A partir da equao da reta ajustada foi possvel calcular a concentrao de protena nas amostras de leite integral (Tabela 4) e desnatado (Tabela 5) a partir da leitura dos tubos (Figura 5) LID e LDD em triplicata pelo espectrofotmetro.

Figura 5 Tubos LID e LDD aps adio do reativo de FolinTabela 4 Concentrao de protenas no leite integralTubos - LIDLeituraConcentrao de protena (mg/mL)Mdia

10,13921,900226,6789 mg/mL

20,16830,7458

30,15727,3906

Tabela 5 Concentrao de protenas no leite desnatadoTubos LDDLeituraConcentrao de protena (mg/mL)Mdia

10,18937,151127,7972 mg/mL

20,15526,7805

30,13119,4601

5. CONCLUSOAps realizar o experimento concluiu-se que feitas as mdias pode-se notar que a concentrao de protenas no leite desnatado foi maior que no leite integral. E importante ressaltar que, por ter mais gordura que o leite desnatado, o leite integral pode sofrer alteraes nas medidas de absorbncia, pois a gordura um fator interferente na espectrofotometria. Apesar de as mdias diferirem, a diferena pouca e justificada por erros inatos ao experimento, podendo concluir que no existe diferena significativa entre as concentraes de protenas do leite desnatado e integral, como est nos rtulos.

6. BIBLIOGRAFIA

Lehninger, D., & Cox, M. (2006). Princpios de Bioqumica (4 ed.). So Paulo: Sarvier.Moraes, C. d., Junior, F. O., Masson, G., Rebello, K. M., Santos, L. d., Bastos, N. F., & Faria, R. C.-R. (2013). Srie em biologia celular e molecular - Mtodos experimentais no estudo de protenas (1 ed.). Rio de Janeiro.Santos, F. R. (2012). MTODO DE LOWRY: VALIDAO E ESTIMATIVA DO CLCULO DA INCERTEZA. Araraquara.Zaia, D. A., Zaia, C. T., & Lichtig, J. (1998). DETERMINAO DE PROTENAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MTODOS EXISTENTES. Qumica Nova, 787-793.

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