CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando

http://www.cbi.cnpia.embrapa.br Paula Kuser Falcão

CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS

Determinação da Estrutura

tri-dimensional de Proteínas

utilizando

difração de Raios-X


O processo completoconsiste em produzir cristais de proteínas (>0.1 mm na sua menor dimensão), nos quais as moléculas estejam razoavelmente bem ordenadas para que o feixe de raios-X incidente sobre esse cristal seja difratado gerando um padrão de reflexões que, através da análise dos dados cristalográficos, produzam um mapa tri-dimensional de densidade eletrônica da molécula. Um modelo da proteína com sequência conhecida deve então ser modelado neste mapa.

CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS


POR QUE RAIOS-X ?

Adaptado de http://www.ipac.caltech.edu/Outreach/Multiwave/

O uso de radiação eletromagnética para visualizar objetos requer que a radiação tenha um comprimento de onda comparável às menores características que desejamos resolver. Os raios-X tem um comprimento de onda de 1.54Å. Este valor é próximo à distância entre átomos de carbono numa ligação peptídica, sendo então ideal para estudar estruturas de proteínas.


Incidir Raios-X sobre uma única molécula resultaria num sinal extremamente fraco que nunca poderia ser detectado acima do nível de barulho, gerado pelo espalhamento da água e do ar. Um cristal arranja um número grande de moléculas na mesma orientação, então as ondas espalhadas podem ser adicionadas em fase aumentando o sinal a um nível que possa ser medido. O cristal atua como um

amplificador.

POR QUE CRISTAIS?


• Uma gota é formada misturando-se volumes iguais de solução de proteína e de uma solução precipitante.

gota contendo proteína e precipitante

• Inicialmente a concentração de precipitante na gota é metade da sua concentração no poço.

• Um volume bem maior de precipitante é colocado em um reservatório abaixo da gota.

Método de difusão de vapor com a gota sentada


GP120 - uma glicoproteína do

envelope exterior do vírus HIVtipo 1 Universidade de

Columbia

Proteína que liga quitina

Tjaard Pijning RU Groninger

Lisozima Eddie Snell NASA

Dihidrolipoamida desidrogenase Tassie & Roeber NASA

Biliverdina-IX redustase

complexada com NADP

Rosa Perez-Luque IBMB-CSIC Barcelona

Exemplos de cristais de proteínas já estudados

TIMAparícioLNLS


Raios-X e Cristais de Proteínas

O Experimento :

Uma vez obtido, o cristal da proteína é irradiado com Raios-X

Placa de Imagem

Espelhos para focalizar o feixe de raios-x

Os raios-X são difratados pelo cristal


Padrão de Difração de Raios-

X

A organização dos pontos no padrão está relacionada com a distribuição de moléculas no cristal;

Diferenças de intensidade relacionam-se com a distribuição dos átomos na molécula.

O espalhamento do feixe de raios-X pelo cristal produz o padrão de difração;


Mapa de densidade eletrônica

O resultado do experimento não é a figura dos átomos , mas um mapa de distribuição dos elétrons

na molécula, isto é, um mapa de densidade eletrônica. No entanto, uma vez que os elétrons são

mais localizados ao redor do núcleo, o mapa de densidade eletrônica nos dá uma boa idéia da

molécula.


Resolução

Todos os modelos tem uma incerteza na posição dos átomos. Valores numéricos pequenos para resolução significam uma pequena incerteza, então resolução alta; valores altos significam uma grande incerteza, então resolução baixa.

A resolução é medida em Ångstroms (Å).

Está diretamente relacionada com a distância mínima a que dois objetos podem estar e ainda serem vistos como dois objetos.

7.0 Å é uma resolução baixa para proteína

3.0 Å é uma resolução média

1.6 Å é alta resolução

Quebra na densidade eletrônica

Posição do CO não está bem definida


Mapa de densidadeeletrônica

Átomos são inseridos na densidade

para construir o modelo daproteína

Ajustando o modelo na densidade eletrônica


Construção do modelo da proteína

Uma vez obtido o mapa de densidade eletrônica, é necessário colocar a sequência de aminoácidos da proteína dentro da densidade para construir o modelo:


Uma vez obtida a estrutura tri-dimensional da proteína podemos utilizá-la para: entender seu funcionamento...

Análise do modelo para estudo da função da proteína


… visualizar partes específicas de uma proteína como sítios de ligação de pequenas moléculas, para entender como a ligação acontece...


… verificar as distâncias interatômicas...


… fazer comparações entre estruturas de proteínas, ...


Azul: cargas positivas

… visualizar a distribuição de cargas na superfície da proteína, etc.

Vermelho: cargas negativas


A informação estrutural é essencial para entender como as moléculas biológicas funcionam e fornece conhecimento para a obtenção de novos medicamentos para cura de doenças como AIDS, Câncer, anemia, diabetes, etc.

HIV protease ligado a um inibidor

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