Métodos In Vitro para Avaliação da

Permeabilidade de Fármacos

Sílvia Storpirtis

Professora Associada

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

07.10.2013

Fármaco:

Solubilidade, Permeabilidade e Absorção

Forma Farmacêutica:

Absorção Oral de Fármacos*

intestino

delgado

intestino

grosso

Liberação e

dissolução

do

fármaco

transporte através

de membranas

absorção do fármaco

*Adaptado de Amidon, G. – Dissolution in vitro and ex-vivo: implicatios for BE standards.

Solubilidade

em água

Permeabilidade

intestinal

Como Avaliar os Parâmetros da Absorção?

Como Determinar a Biodisponibilidade?

Como Avaliar a Influência da Formulação

sobre a Biodisponibilidade?

Ensaios In Vivo em Humanos - “Padrão Ouro”

Ética em Pesquisa com Seres Humanos:

Realizar Ensaios In Vivo somente quando

não há um Ensaio In Vitro que possa ser

empregado satisfatoriamente

Alternativa:

Métodos In Vitro

(Correlação com os

Métodos In Vivo)

Como Selecionar um

Método In Vitro?

Mecanismos de

Transporte

Como ocorre a

absorção?

(a) Passivo Transcelular (b) Transportadores de Membrana (Influxo) (c) Passivo Paracelular (d) Transportadores de Efluxo (e) Enzimas Metabolizadoras - Eliminação Pré-sistêmica (BALIMANE et al., 2005, modificado).

influxo

efluxo

Sistema de Classificação Biofarmacêutica

(SCB)

Solubilidade

Classe I:

Solubilidade

Permeabilidade

Classe III:

Solubilidade

Permeabilidade

Classe II:

Solubilidade

Permeabilidade

Classe IV:

Solubilidade

Permeabilidade

Amidon et al., 1995

Modelos para Avaliação da Permeabilidade

Intestinal de Fármacos

Físico-Químicos

In Situ

In Silico

In Vitro

Limitações

Vantagens

Desvantagens

Métodos Físico-Químicos

Consistem em prever a absorção de fármacos a partir de

suas propriedades físico-químicas.

Em geral, a permeabilidade dos fármacos é o principal

fator para determinar sua absorção intestinal por

transporte passivo.

Peso molecular

pKa

Lipofilicidade

Carga / Ionização

Solubilidade

Tamanho ou porção molecular

Métodos In Situ

BONLOKKE, L.; HOVGAARD, L.; KRISTENSEN, H.G.; KNUSTON, L.; LENNERNÄS, H.

Direct estimation of the in vivo dissolution of spironolactone, in two particle size ranges,

using the single-pass difusion technique (Loc-I-Gut®) in humans.

European Journal of Pharmaceutics, v.12, p.239-250, 2.001.

Métodos In Situ

Frog intestinal sac: a new in vitro method for the assessment of intestinal permeability.

Trapani G. et al.

Dipartimento Farmaco-Chimico

Facoltà di Farmacia,

Università degli Studi di Bari, Italy.

J Pharm Sci. 2004 Dec;93(12):2909-19.

The aim of this study was to evaluate a new experimental

protocol utilizing isolated frog intestinal sacs for the assessment

of intestinal drug permeability in humans.

Segments of approximately 5.0 cm in length were used for these

experiments.

Métodos In Silico

Métodos computacionais usados para

prever a permeabilidade da membrana aos

compostos.

Baseiam-se em:

Lipofilicidade do composto

Capacidade de formar ligações de hidrogênio

Tamanho molecular

Área superficial polar

Propriedades quânticas

Métodos In Vitro

Membranas artificiais

PAMPA

Tecido animal

Intestino “invertido”

Segmentos intestinais

Vesículas isoladas de membranas

Cultivos celulares

Caco-2 (adenocarcinoma de cólon humano)

MDCK (células de rim canino)

PAMPA - Parallel Artificial Membrane Permeability Assay

Membrana sintética formada por fosfolipídios depositados em um suporte poroso.

Simula a composição da membrana celular.

Previsão da permeabilidade transcelular passiva.

Técnica rápida e de baixo custo.

Células Caco-2

São células de adenocarcinoma de cólon humano.

Cultivadas em filtros permeáveis e porosos se

diferenciam espontaneamente em enterócitos.

Monocamada celular com microvilosidades, sistemas de

transportes ativos e passivos, sistemas enzimáticos.

Possibilitam a avaliação das diferentes vias de

absorção (paracelular e transcelular).

Limitações ao Emprego de Células Caco-2

• Variação do número de transportadores.

• A baixa permeabilidade de compostos

hidrofílicos com baixo peso molecular.

• A presença de co-solventes (metanol, etanol,

propilenoglicol e polietilenoglicol).

• A aderência física de fármacos de alta

lipossolubilidade aos materiais do suporte de

cultivo celular.

• Tempo de crescimento das células Caco-2.

• Variabilidade entre diferentes laboratórios levam

à necessidade de padronização da técnica.

• Variabilidade dependente das condições de

cultivo.

Cultivo de Células Caco-2 - Laboratório de

Estudos de Permeabilidade de Fármacos

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP

São Paulo, Brasil

Manutenção do cultivo de células

em condições assépticas

Utensílios estéreis, apirogênicos:

Filtros esterilizantes, pipetas ,

garrafas de cultivo (descartáveis)

Manutenção do Banco Celular

Cultivo em garrafas 75cm2

Meio DMEM suplementado com

10% soro fetal bovino + 1% a.a.

não essenciais + 1% glutamina

+ penicilina/estreptomicina

Mantidas em incubadora de CO2

37º C

5% CO2

90% Umidade Relativa

Acompanhamento do Crescimento Celular

Microscópio invertido

Células em

garrafa

de cultivo

Cultivo celular atinge

mais que 90% de

cobertura da área da

garrafa

Necessidade de

repique

( 3 a 4 dias)

Repique

Cultura em garrafa

com, no mínimo, 90%

cobertura da área de

crescimento

Solução de

Tripsina/EDTA

Células em

suspensão

Diluição

1:4

Experimento de Permeabilidade com Células

Caco-2

Placas Transwell® - suporte permeável de policarbonato, polietileno,

polietilenoftalato, policarbonato revestido com colágeno.

Placas com 6, 12, 24 ou 96 poços.

Contagem celular para transferência às

placas Transwell®

Solução de

Tripsina/EDTA

Células em

suspensão

Suspensão celular (10uL) + Triptan Blue

(10uL)

Microscópio biológico

Determinação do número de células viáveis

Suspensão celular

com número de

células viáveis

determinada

Transferência de

volume adequado

de suspensão

celular para poços

da placa

Transferência de Células para Placas

Densidade celular utilizada:

5 x 104 cél/cm2

Placa contendo as células Caco-2

Meio DMEM suplementado com 10%

soro fetal bovino + 1% a.a. não

essenciais + 1% glutamina +

penicilina/estreptomicina

Mantidas em incubadora de CO2

37º C

5% CO2

90% Umidade Relativa

Tempo de cultivo: 21 dias

Incubação do Cultivo em Placas do

Experimento de Permeabilidade

Manutenção do Cultivo nas Placas

Substituição do meio de cultivo a cada 48 horas

Após 21 dias de cultivo, as células estão

diferenciadas para realização do experimento

Avaliação da integridade da membrana por

meio da medida da resistência elétrica

transepitelial (RET)

Diferença do potencial elétrico entre

compartimentos apical e basolateral

Minivoltímetro -

Millicell ERS®

Agitador Orbital Termostatizado

Experimento realizado sob

agitação moderada 25 a 50 rpm a

37ºC

Coleta das amostras em tempos

determinados.

Experimento realizado em meio de

solução balanceada de Hanks.

Os valores do pH do meio variam

entre 5,0 a 7,4 ( faixa fisiológica)

Quantificação das Amostras Provenientes dos

Experimentos de Permeabilidade

HPLC - UV-Vis

HPLC - FL

HPLC - MS/MS

Células Caco-2

Cálculo do Coeficiente de Permeabilidade

aparente

Papp = (V/ A*. Co) (dC/dT)

V = Volume da câmara receptora

A = Área de tecido exposta

Co = Concentração inicial do fármaco na câmara

doadora

dC/dT = É a mudança da concentração do fármaco

na câmara receptora em função do tempo

Valores de Papp - Relação entre a

Permeabilidade e a Fração Absorvida

YEE, S. - In vitro Permeability Across Caco-2 Cells

(Colonic) Can Predict In Vivo (Small Intestinal)

Absorption in Man - Fact or Myth? Pharm. Res., v.

14, p. 763 – 766, 1.997.

Valor da

Permeabilidade

(x 10-6) cm/s

Magnitude da

Permeabilidade

Fração

Absorvida

(%)

< 1 Baixa 0 a 20

1 a 10 Intermediária 20 a 70

> 10 Alta 70 a 100

Empregos Potenciais - Células Caco-2

AVALIAÇÃO DE:

• Permeabilidade e Citotoxidade de fármacos em

desenvolvimento.

• Funções das células epiteliais do intestino.

• Estratégias de formulações (dendrímeros,

nanoencapsulamento).

• Efeito tóxico potencial de determinados

compostos.

• Metabolismo de pré-sistêmico fármacos.

• Possíveis interações entre fármacos no

processo de absorção.

• Bioisenções.

www.fip.org

Monografías – Bioexenciones

Journal of Pharmaceutical Sciences

www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/68503813

Biowaiver Monographs for Immediate Release Solid

Oral Dosage Forms: Levofloxacin

MARCELLE O. KOEPPE, RODRIGO CRISTOFOLETTI, EDUARDO F.

FERNANDES, SILVIA STORPIRTIS, HANS E. JUNGINGER, SABINE

KOPP,4 KAMAL K. MIDHA, VINOD P. SHAH, SALOMON

STAVCHANSKY, JENNIFER B. DRESSMAN, DIRK M. BARENDS

American Pharmacists Association

J Pharm Sci 100:1628–1636, 2011

Keywords: levofloxacin; absorption; Biopharmaceutics

Classification System (BCS); permeability; regulatory science;

solubility

Absorption and BA

The pharmacokinetics of levofloxacin is well described

by a linear two-compartment open model with first-

order elimination.

Plasma concentrations in healthy volunteers reach a mean

peak drug plasma concentration (Cmax ) of approximately

2.8 and 5.2 mg/L within 1–2 h after oral administration of

levofloxacin 250 and 500 mg tablets, respectively.

The BA of oral levofloxacin is very rapid and approaches

100% and is little affected by administration with food.

Permeability

In Caco-2 cells the apical influx clearance value at pH 6

was much greater than the basolateral influx clearance

value, suggesting uptake across the apical membrane

in Caco-2 cells to be mediated by a specific transport

system.

A good correlation was found between the expression

levels of organic anion transporting polypeptide 1A2

(OATP 1A2) and levofloxacin influx clearance in Caco-2

cells.

The in vitro permeability of levofloxacin was evaluated

using a suitable Caco-2 assay according to the criteria

in the Biopharmaceutics Classification System (BCS)

Guidance.

Metoprolol, labetalol, and atenolol served as high

permeability and low permeability reference standards

and an apparent permeability coefficient (Papp ) of levofloxacin of 28.36 1.93 10−6 cm/s was reported.

In the same study, metoprolol, labetalol, and atenolol showed Papp values of 29.88 3.17 10−6

cm/s, 18.05 1.90 10−6 cm/s, and 1.86 0.47 10−6

cm/s, respectively; hence, levofloxacin was classified as

highly permeable.

CONCLUSION

A biowaiver for IR solid oral dosage forms containing

levofloxacin is scientifically justified, provided that

(a) the test product contains only excipients present in IR

levofloxacin drug products approved in ICH or

associated countries in the same dosage form;

(b) both the test and comparator dosage form are very

rapidly dissolving or rapidly dissolving with similarity of

the dissolution profiles demonstrated at pH 1.2, 4.5, and

6.8; and

(c) if the test product contains polysorbates, it

should be both qualitatively and quantitatively identical

to its comparator in terms of polysorbate content.

CORRELAÇÕES IN VITRO - IN VIVO (CIVIV)

MOTZ, S.A. et al - Permeability assessment for solid

oral drug formulations based on Caco-2 monolayer in

combination with a flow through dissolution cell.

Eur. Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,

v. 66, p. 286-295, 2007.

Desenvolvimento de um sistema integrado para avaliar

dissolução e permeabilidade visando à previsão do

desempenho in vivo de formas farmacêuticas.

Comprimidos de Cloridrato de Propanolol:

Liberação Imediata e Modificada (Extended release).

FTPC = Flow through permeation cell

D = Sampling port dissolution

AP = Sampling port apical

BL = Sampling port

basolateral

Dissolution module Permeation module

FTPC

USP

Apparatus

4

D BL

STREAM

SPLITTER

AP

• Observou-se relação linear entre a quantidade

permeada e as três diferentes dosagens de

propranolol avaliadas.

• O efeito da liberação retardada sobre a

permeabilidade foi detectado por meio dos

dados de dissolução e de permeabilidade

obtidos.

• Sistema promissor para avaliar a influência

da forma farmacêutica (formulação e processo)

sobre a permeabilidade.

ESTRATÉGIA DE FORMULAÇÕES

ABERTURA DAS

JUNÇÕES E PASSAGEM

DO FÁRMACO

STORPIRTIS, S.; GONÇALVES, J.E.; CHIANN, C.; GAI, M.N. Biofarmacotécnica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.

STORPIRTIS, S.; GAI, M.N.; CAMPOS, D.R.; GONÇALVES, J.E. Farmacocinética básica e aplicada. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2011. GONÇALVES, J.E.; STORPIRTIS, S. O Sistema de Classificação Biofarmacêutica: Conceitos,

Determinação da Solubilidade e Permeabilidade e Aplicações na Área Farmacêutica – In: VIEIRA e CAMPOS, Manual de

Bioequivalência – Série Pesquisa Clínica – Ed Dendrix, 2011, p. 137- 169.

AMIDON, G.L.; LENNERNAS, H.; SHAH, V.P.; CRISON, J.R. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the

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Seção 1. [A Agência Nacional de Vigilância Sanitária aprova o guia de correlação para estudos in vitro – in vivo (CIVIV)].

2002.

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