UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINRIAPROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA PSDOUTORADO EM HIGIENE VETERINRIA E PROCESSAMENTO TECNOLGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

MTODOS MOLECULARES PARA ANLISE DE PROTENASDANUZA PINHEIRO BASTOS GARCIA DE MATTOS JORGE LUIZ FORTUNADisciplina: BIOLOGIA MOLECULAR Prof. Dr. Elmiro Rosendo do Nascimento

NITERI-RJ 2010

INTRODUO PROTENA Composto orgnico de alto peso molecular Formado pelo encadeamento de aminocidos Representa cerca de 50-80% do peso seco da clula Sendo o mais abundante de matria viva

INTRODUO MAPEAMENTO GENTICO GENOMA conjunto de todos os GENES Sequenciamento do Cdigo Gentico

GENMICA FUNCIONAL Nova rea nas Cincias Biolgicas Determina funo para os diversos genes sequenciados No seria necessrio estudar nveis de protenas Determinava apenas os nveis de RNA-mGENE DNA RNARNA-m RNARNA-r + RNA-t RNAPROTENA

INTRODUO GENMICA FUNCIONAL Comparando abundncia de RNA-m e PTN Concluso anlise das PTN mais apropriada para entender funo dos GENES, pois analisa o produto final do GENOMA TRANSCRIPTOMA PROTEOMA conjunto de todos os RNA-m conjunto de todas as PTN

METABOLOMA conjunto de todos os metablitos que so produzidos e/ou modificados por um organismo

INTRODUOA PROTEMICA, portanto, parece ser a ferramenta mais apropriada para se entender o funcionamento dos GENES, pois analisa o produto final do GENOMA, isto , as PROTENAS e, consequentemente, os seus METABLITOS. O estudo PROTEMICO exige a separao (isolamento) das PROTENAS atravs de tcnicas com alta resoluo, como as da BIOLOGIA MOLECULAR.

ANLISE DE PROTENAS PRINCIPAIS TCNICAS Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Eletroforese Bidimensional Radioautografia (Autorradiografia) Western Blotting Cromatografia Fracionamento Celular Espectrometria de Massa

ANLISE DE PROTENAS ELETROFORESE Separa misturas de PTN livres em soluo aquosa colocadas em gel submetido a uma diferena de potencial eltrico Migrao ocorre do plo negativo para o plo positivo PTN so separadas ao migrarem a uma velocidade que depende: Carga eltrica Tamanho Forma Massa

PTN maiores migram mais lentamente do que as menores

ANLISE DE PROTENAS ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Empregada para anlises proteicas a partir da dissoluo das PTN em soluo de SDS SDS Dodecil Sulfato de Sdio (Sodium Dodecyl Sulfate) (CH2)11OSO3Na Utiliza gel de Poliacrilamida: Ligaes altamente cruzadas Matriz inerte Ocorre migrao das PTN

ANLISE DE PROTENAS ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) PTN so colocadas em uma soluo de SDS SDS: Detergente forte Extensa cauda apolar e cabea polar (Sulfato) Carregado negativamente

Poro apolar interage com regies hidrofbicas das PTN poro polar fica exposta MICELA Excesso de molculas negativas de SDS PTN tornam-se negativas

ANLISE DE PROTENAS ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) SDS provoca desdobramento das PTN em cadeias polipeptdicas estendidas Dissociao das PTN Adio de -Mercaptoetanol: Agente redutor Quebra ligaes dissulfeto (S-S) Separa PTN OLIGOMTRICAS

ANLISE DE PROTENAS ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) PTN do mesmo tamanho tendem a migrar com velocidades similares Formao de uma srie de diferentes bandas de PTN nica banda pode corresponder a vrias PTN Visualizadas utilizando marcadores: Azul de Cromassie Prata Ouro

Tcnica mais importante de anlise de PTN, podendo ser utilizada para separar todos os tipos de PTN

ANLISE DE PROTENAS ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL DE POLIACRILAMIDA (2D-PAGE) Bandas (ou picos) de PTN muito prximos sobreposio resolvem apenas um nmero pequeno de PTN ( ptn Dilise para retirar sais da soluo de ptn

CROMATOGRAFIACromatografia de filtrao em gel Discrimina melhor com base no tamanho Coluna (fase estacionria) constituda de gros porosos de polmero insolvel altamente hidratado (ex. dextran, agarose ou poliacrilamida) Molculas maiores fluem mais rapidamente (volume menor acessvel a elas) = ordem inversa eletroforese Pode-se separar quantidades maiores

CROMATOGRAFIA Cromatografia de filtrao em gel

CROMATOGRAFIACromatografia de afinidade

FRACIONAMENTO CELULAR

FRACIONAMENTO CELULAR Ruptura da membrana plasmtica Pistilo; Ultra-som;...

Homogeneizado em soluo de sacarose Separao por centrifugao fracionada ou diferencial (diferenas no coeficiente de sedimentao) Sucessivas e com velocidades crescentes

FRACIONAMENTO CELULAR

FRACIONAMENTO CELULAR

CLIVAGEM SELETIVA Clivagem de protenas em fragmentos menores (Fingerprinting) Enzimas proteolticas e reagentes qumicos clivagem entre resduos especficos de aminocidos Tripsina: extremidade carboxila dos resduos de lisina ou arginina Brometo de cianognio: prximo aos resduos de metionina

ESPECTROMETRIA DE MASSA Tcnica analtica que permite: Medir massa molecular de compostos Identificar compostos desconhecidos Quantificar compostos Revelar a estrutura de molculas Determinar modificaes ps traducionais em protenas (fosforilao, glicosilao e pontes de sulfeto)

ESPECTROMETRIA DE MASSAExemplo de aplicaes Detectar e identificar substncias proibidas em atletas; Monitorar pacientes durante uma cirurgia; Determinar a composio de espcies encontradas no espao; Localizar depsitos de petrleo; Monitorar processos de fermentao; Deteco de dioxinas em peixes; Determinar danos em genes; Estabelecer composio elementar de material semi condutor

ESPECTROMETRIA DE MASSA Uma pequena quantidade de amostra vaporizada e injetada no espectrmetro de massa; A amostra ento ionizada; Os ons formados podem ser positivos ou negativos; Fragmentos neutros no so detectados; Os ons so ento separados de acordo com sua razo m/z; onde m = massa; z = carga Os ons so ento detectados

ESPECTROMETRIA DE MASSA

ESPECTROMETRIA DE MASSA Cromatografia Lquida LC/MS - termicamente instveis, compostos de alto PM LC/MS adequado para protenas e peptdeos Sondas de insero direta Amostras colocadas em uma sonda e inseridas Amostras podem misturadas a uma matriz Cromatografia Gasosa Amostras precisam ser volteis

ESPECTROMETRIA DE MASSA MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desroption Ionization-Time-Of-Flight Spectometry) Amostra misturada a matriz que absorva UV Matriz absorve energia do laser causando sua volatilizao junto com a volatilizao da amostra As molculas da matriz ionizada transferem prtons para a amostra

ESPECTROMETRIA DE MASSA

ESPECTROMETRIA DE MASSA

Enquanto isso...

danuzamattos@vm.uff.br prof.magoo@uol.com.br