Ana Lívia Rocha Monteiro

MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA

Botucatu-SP

2006

Ana Lívia Rocha Monteiro

MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA

Seminário apresentado à Disciplina de

Seminários I, do Programa de Pós-graduação

em Medicina Veterinária, nível Mestrado, Área

de Reprodução Animal, da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ /

UNESP – Campus de Botucatu

Aluna: Ana Lívia Rocha Monteiro

Orientador: Prof. Ass. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira

Professores Responsáveis: Prof ª Dr ª Maria Denise Lopes

Prof Dr Sony Dimas Bicudo

Botucatu-SP

2006

RESUMO

Há hoje uma preocupação global com a conservação dos animais, por outro

lado se observa um grande número destes em extinção, situação provocada pela

expansão urbana desordenada, degradações ambientais e principalmente o

tráfico de silvestres, no qual atinge principalmente as aves, sendo 82% dos

animais apreendidos no Brasil. Dentro de todo esse contexto vê-se a real

necessidade de programas de conservação desta espécie. A neuroendocrinologia

comportamental é o elo entre a função neuroendócrina e o comportamento em

animais, sendo, portanto uma importante ferramenta no auxílio à conservação,

pois auxilia na avaliação da saúde de uma população ou de um indivíduo. Esses

hormônios podem ser avaliados a partir do plasma sangüíneo (métodos invasivos)

ou a partir de metabólitos nas fezes (métodos não-invasivos), por RIA

(radioimunoensaio), EIA (ensaio imunoensimático) e HPLC (Cromatografia

Líquida de Alta Performance).

PALAVRAS – CHAVE

“Monitoramento não-invasivos, hormônios, reprodução, estresse, bem-estar”

Sumário

1. Introdução 5 2. Revisão de literatura 6 2.1. Animais em extinção 6 2.2. Hormônios do estresse 7 2.2.1. Corticosteróides 8 2.2.2. Prolactina 8 2.3. Hormônios da Reprodução 8 2.3.1. Testosterona 9 2.3.2.Progesterona e Estrógeno 9 2.4. Avaliação dos Hormônios 10 2.4.1. Métodos invasivos 10 2.4.2. Métodos não-invasivos 11 2.4.2.1. Corticosteróides 13 2..4.2.2. Testosterona 13 2.4.2.3. Progesterona e Estradiol 15 2.4.3. Interação entre os Métodos 16 2.4.4.Análise dos Hormônios 16 2.4.4.1.Extração dos Hormônios 16 2.4.4.2. Cromatógrafo Líquido de Alta Performance ( HPLC) 17 2.4.4.3. Radioimunoensaio (RIA) 17 3. Considerações Finais 18 4. Referências Bibliográficas 19

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1. INTRODUÇÃO

Há hoje uma preocupação global com a conservação dos animais, por outro

lado se observa um grande número destes em extinção. Esta crise de extinção é

predominantemente causada por atividades humanas, incluindo habitat,

destruição, introdução de novas espécies e predação direta.

As últimas pesquisas apontam que milhares de espécies animais foram

extintas nos últimos cem anos. Muitas destas espécies jamais serão conhecidas

por gerações futuras. Sabemos que, muitas delas, poderiam revelar ao homem

informações importantes sobre o meio ambiente e até mesmo a cura para

determinados tipos de doenças.

Estratégias para aliviar esta crise devem ser desenvolvidas pelo homem,

como o controle da população humana, preservação do habitat e uma gestão

mais eficiente de populações nativas e exóticas.

Dentro deste contexto percebe-se a real necessidade de programas de

conservação para animais ameaçados de extinção e conseqüentemente para a

sobrevivência das espécies, promovendo a procriação, criando condições para a

sobrevivência de populações de vida livre em suas regiões de origem.

A neuroendocrinologia comportamental é o elo entre a função

neuroendócrina e o comportamento em animais, sendo, portanto uma importante

ferramenta no auxílio à conservação, pois auxilia na avaliação da saúde de uma

população ou de um indivíduo. Esses hormônios podem ser avaliados a partir do

plasma sangüíneo (métodos invasivos) ou a partir de metabólitos nas fezes e na

urina (métodos não-invasivos), por RIA (radioimunoensaio), EIA (ensaio

imunoensimático) e HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance).

Há necessidade de validação destes métodos para cada espécie estudada,

visto que são técnicas espécie-específicas.

A mensuração dos esteróides fecais tem provido gradativamente uma

importante técnica para avaliação da reprodução, do estresse ambiental e

agressão em populações de animais e indivíduos de vida livre e de cativeiro.

Esta revisão objetiva caracterizar técnicas não invasivas para avaliar os

hormônios ligados ao estresse e à reprodução de animais de vida livre e de

cativeiro, pois esta metodologia tem permitido o monitoramento a longo prazo dos

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hormônios avaliados, refletida de maneira mais fisiológica, uma vez que dispensa

os estressantes da colheita de sangue.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Animais em extinção

Os cientistas estimam que hajam em torno de 10 a 15 milhões de espécies

da fauna, flora e microorganismos, desse total 60 mil seriam vertebrados (5 mil

mamíferos e 10 mil aves) e o outro restante seria de insetos e plantas

(http://www.suapesquisa.com/animais/ 18/03/2006).

O relatório do Planeta Vivo 2004 mostra que em 30 anos houve uma redução

de 40% da fauna (http://www.agirazul.com.br/a2/_a2/000001e2.htm/

18/03/2006)Outra importante pesquisa publicada em relatório da União para

Conservação da Natureza (UICN) mostrou que um quarto das espécies

conhecidas pelo homem estão ameaçadas de extinção (http://www.iucn.org/

18/03/2006).

Não se tem certeza do número exato de animais estão extinção em no

mundo, mas os especialistas mencionam que são mais de 17.000 a cada ano,

que são quase dois a cada hora. Se este rítmo continuar é estimado que no início

do século seguinte haverão apenas15 e 25 % de todas as espécies habitantes do

planeta, o que levará a um grande prejuízo futuro.

São diversas as causas que levam a extinção de animais no mundo, dentre

elas, segundo Lopes (2002), a expansão urbana descontrolada, degradações

ambientais e tráfico de animais, tendo o último, papel fundamental neste

processo.

O tráfico traz sérios e substanciais riscos para as espécies comercializadas,

para a saúde e subsistência do homem, ampliando o risco de doenças para

humanos, animais domésticos e silvestres (EUWB, 2005). De acordo com Lopes

(2002), o tráfico de animais silvestres é considerado um dos maiores negócios do

mundo, ocupando o 3º lugar no ranking da ilegalidade.

O Brasil participa com cerca de 5-15% do total mundial (LOPES, 2000 apud

RENCTAS, 2005) e envolve todas as regiões do país (LOPES, 2002). É estimado

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que a cada ano esta atividade movimente entre dois a cinco milhões de aves

vivas, representando 82% do total de animais apreendidos (RENCTAS, 2005).

2.2. Hormônios do estresse

Um adequado balanço entre o processo de catabolismo (mobilização de

energia) induzido pelos hormônios do estresse como a epinefrina, norepinefrina e

cortisol e processos anabólicos (reparação, cicatrização e crescimento)

provocados por esteróides sexuais e hormônios de crescimento são necessários

para a sobrevivência e saúde do animal (LUNDBERG, 2005). Porém com o

aumento da pressão antropogênica e dos distúrbios ambientais, este equilíbrio

pode ser quebrado (ROMERO, 2004), induzindo ao estresse psicológico crônico.

As respostas ao estresse por longo período de tempo afetam negativamente

a sobrevivência, a reprodução e a resistência às doenças, devido à queda da

imunidade de uma grande variedade de aves e mamíferos (HOFER and EAST,

1998 apud DEHNHARD et al., 2003).

A elevação dos níveis de glicocorticóides circulantes resulta em uma

alteração no metabolismo dos carboidratos e uma alteração na via energética em

atividades não essenciais (McKENZIE e DEANE, 2005). Contudo, se o estresse

tornar-se crônico ou freqüente, muitos efeitos deletérios podem ocorrer incluindo

inibição da reprodução e supressão da função imune (SAPOLSKY, 1992 apud

McKENZIE e DEANE, 2005). O cortisol influencia no metabolismo das células, na

distribuição da gordura e no sistema imune, seus níveis são controlados pelo

sistema de feedback no hipotálamo e a formação hipocampal (LUNDBERG,

2005).

Os animais respondem a um estressor com uma série de respostas

endócrinas que aumentam imediatamente a energia disponível em parte por

inibição de processos biológicos que não são requeridos para sobrevivência

imediata (Wingfield, 1994). Uma das respostas primárias ao estresse é um

aumento da atividade do eixo hipotalâmica-pituitária-adrenocortical causando um

aumento da concentração de glicocorticóides na circulação sanguínea. Em pouco

tempo (horas ou dias), os glicocorticóides se elevam redirecionando os recursos

para mobilizar a energia que pode ser usada para resolver a situação de estresse

(Sapolsky, 1992). Caso o estressor não for eliminado e os níveis de

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glicocorticóides continuarem altos por mais que alguns dias, resultaram

conseqüências prejudiciais, incluindo supressão do sistema imune, diminuição de

massa muscular e supressão reprodutiva (Pottinger, 1999).

Lundberg (2005) descreve ainda que algumas implicações na saúde do

animal devido ao elevado nível de cortisol circulante podem promover o acúmulo

de gordura na região abdominal, infarto do miocárdio, problemas

cardiovasculares, diabetes Tipo 2, redução da função do sistema imune, prejuízos

de cognição entre outros.

Portanto, para avaliar a saúde de uma população, estudos sobre

mensuração de resposta ao estresse têm aumentado nas áreas de ecologia,

biologia e medicina da conservação (eg. WASSER et al., 2002).

2.2.1. Corticosteróides

A concentração plasmática de glicocorticosteróides é um indicador de

estresse confiável, acurado e preciso (BEUVING & VONDER, 1986 apud

DEHNHARD et al., 2003), porém em animais silvestres, os níveis plasmáticos de

corticosterona em aves, anfíbios, répteis e muitos roedores e cortisol em peixes e

mamíferos (ROMERO, 2004) elevam-se rapidamente, em aproximadamente 3 a 5

minutos após contenção e manipulação (WINGFIELD & ROMERO, 2001 apud

ROMERO, 2004), além de a avaliação plasmática ser pontual, não representando

os níveis hormonais ao longo do tempo (HARPER & AUSTAD, 2000).

2.2.2. Prolactina:

A prolactina plasmática eleva rapidamente seus níveis durante o estresse em

mamíferos, este aumento é freqüentemente considerado como parte da resposta

clássica ao estresse (De VLAMING, 1979 apud CHASTEL et al., 2005). Porém,

segundo Chastel (2005), em aves, há várias indicações que os níveis de

prolactina plasmática podem decrescer em eventos de estresse.

2.3. Hormônios da Reprodução

Entender os processos básicos de reprodução é crucial para determinar

porque alguns animais se reproduzem e outros não. Diversas espécies de

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felídeos não domésticos se reproduzem fracamente em cativeiro, e há poucas

informações fisiológicas disponíveis para ajudar a identificar as causas desta

reprodução falha em certas espécies, sejam em populações ou indivíduos.

Portanto a meta é desenvolver uma base de dados das inter-relações de

regulação das atividades hormonais. Desse modo, monitorar padrões hormonais,

mas utilizar métodos por coleta de sangue não é prático para estas espécies. Em

substituição, deve-se fazer o uso de técnicas não invasivas para avaliar a função

reprodutiva precisam ser desenvolvidas (Brown et al, 1993).

2.3.1. Testosterona

A testosterona é um hormônio esteróide do testículo, o qual é responsável

pela maturação sexual do macho humano, incluindo o crescimento dos testículos

e do pênis e facilita a espermatogênese (Griffin & Wilson, 1992). Em um grande

número de espécies sinais de agressão são testosterona dependente (Wingfield

et al., 1994).

Morais et al. (1997) em seus estudos com três espécies de pequenos

felídeos, machos, comparou a atividade adrenal com características reprodutivas,

concluiu que apesar do estudo não ter estabelecido especificamente causa-efeito

entre esta relação, houve uma modesta relação entre as altas concentrações de

corticóide fecal e a função espermática prejudicada.

2.3.2. Progesterona e estrógeno

O estabelecimento do comportamento sexual depene da exposição, ou falta

de exposição, do hipotálamo à testosterona durante o início do período neonatal.

Verdadeiramente a testosterona (convertida em estrogênio por aromatização)

promove a masculinização dos centros sexuais no hipotálamo; na ausência da

testosterona o hipotálamo torna-se feminino (CUNNINGHAM, 1999).

Existem vários princípios com relação aos efeitos dos hormônios sobre o

comportamento sexual dos animais domésticos. Primeiramente, a magnitude da

variação na concentração hormonal que afeta o comportamento sexual é

pequena: na gata, por exemplo, um aumento na concentração de 17β-estradiol de

10 a 20 pg/mL de plasma resulta em sinais de proestro. Em segundo lugar, o

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sinergismo entre hormônios costuma ser importante para a receptividade sexual:

por exemplo, na cadela é importante a elevação do estrogênio seguida pela

progesterona. Em terceiro a seqüência de exposição ao hormônio pode ser

importante; por exemplo: na ovelha é requerida a exposição a progesterona antes

da exposição ao estrogênio para que haja manifestação do estro. O estrogênio,

originado no desenvolvimento do folículo antral, é o hormônio necessário à

receptividade sexual em todos os animais domésticos. A progesterona derivada

da granulosa do folículo pré-ovulatório, ou do corpo lúteo também é importante

para o estro em alguns animais (CUNNINGHAM, 1999).

2.4. Avaliação dos hormônios

2.4.1. Métodos invasivos

De acordo com Good (2003), a mensuração de esteróides no plasma reflete

a situação de um indivíduo em um momento pontual, portanto mudanças rápidas

e em curto prazo nas concentrações de glicocorticóides, como aquelas

provocadas por um novo ambiente ou situação, são mais bem determinadas

utilizando amostras de plasma.

Para Brown & Wildt (1997) uma única coleta de sangue pode produzir

valores que representam apenas um único momento, o pico ou o ponto médio de

uma secreção pulsátil.

No passado, glicocorticóides eram tipicamente quantificados do sangue.

Ensaios baseados no sangue (soro ou plasma) mensuram o nível destes

hormônios avaliados em resposta biológica imediata do animal (WINGFIELD et

al., 1994). Portanto o uso de avaliação sangüínea é restrito a algumas espécies,

pois normalmente o animal precisa primeiro ser capturado, conseqüentemente

comprometendo a avaliação do estresse agudo (COOK et al., 2000). Porém estes

estudos não são possíveis em animais selvagens. Em adição, a amostra pontual

provida da mensuração do sangue pode não ser representativa para análises de

níveis hormonais para um longo tempo, devido a padrões de secreção pulsátil dos

glicocorticóides no sangue (HARPER & AUSTAD, 2000).

Estudos com avaliação de hormônios em felídeos selvagens não

progrediram tão rápido quanto os de felídeos domésticos, principalmente por

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causa de tecnologias inadequadas. O primeiro estudo sério para investigar o

sistema endócrino do gato doméstico foi para fundamentar a atividade hormonal

em fêmeas, portanto estas foram mantidas sob condições extremamente

controladas e contidas, um pequeno volume de sangue foi coletado por várias

vezes para estabelecer a dinâmica da gonadotrofina pituitária e a secreção do

esteróide ovariano envolvido na regulação da reprodução. Foram estabelecidos

então valores normais para o gato doméstico, mas por causa da dificuldade de

coleta de sangue para deduzir o dado hormonal e a impossibilidade de

estabelecer padrão semelhante para outras espécies, não há como identificar

estes valores para os felídeos selvagens (BROWN & WILDT, 1997), com este tipo

de abordagem.

Para haver uma coleta sangüínea em animais selvagens é necessário

anestesiá-los e apesar de anestesias ocasionais para este fim não afetar

desfavoravelmente o potencial reprodutivo, a dinâmica da secreção hormonal

(amplitude do pulso e freqüência) pode ser interrompida temporariamente por

drogas anestésicas específicas (JOHNSON & GAY, 1981).

De acordo com Brown & Wildt (1997) o uso de anestesia no intervalo peri-

ovulatório para coleta sangüínea em felídeos selvagens é contra-indicado porque

os dados subseqüentes do hormônio podem está comprometidos.

2.4.2. Métodos não-invasivos

Métodos não invasivos para quantificar o estresse estão sendo

desenvolvidos e aplicados em estudos de vertebrados, o qual oferece diversas

vantagens sobre os métodos invasivos. Os ensaios feitos com metabólitos fecais

de hormônios estão sendo agora utilizados em uma variedade de áreas (ciência

animal, ecologia comportamental, biologia conservacionista, ornitologia e

primatologia) para examinar o estatus reprodutivo e adrenocortical (Dehnhard et

al., 2001).

Estes métodos não invasivos são em particular usados porque amostras

podem ser facilmente obtidas sem incômodo ao animal e sem colocá-lo em perigo

durante a captura (Wasser et al., 2000). Conseqüentemente, amostras podem ser

coletadas em intervalos regulares ao longo do tempo. Por não causar incômodo

ao animal, técnicas não invasivas podem suprir uma avaliação acurada do

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estresse sem a influência do aumento nos glicocorticóides induzidos pela captura.

Portanto os ensaios feitos com metabólitos fecais de glicocorticóides refletem um

nível médio destes hormônios circulantes por um período de tempo, melhor que

uma amostra pontual, e por isso pode prover uma avaliação mais acurada de um

longo tempo de seus níveis (HARPER & AUSTAD, 2000).

Métodos não-invasivos de análise de hormônios ligado ao estresse e a

reprodução, realizada através das fezes, urina e saliva, têm demonstrado uma

importante ferramenta para o monitoramento do bem-estar dos animais

(WASSER et al. 2002; DEHNHARD et al., 2003; LUNDBERG, 2005; McKENZIE e

DEANE, 2005).

Nas fezes há uma grande quantidade de hormônios esteróides como os

andrógenos, estrógenos e progestágenos; glicocorticóides como os

corticosteróides, cortisol e dehidroepiandrosterona e mineralocorticóides. Os

hormônios proteicos, de alto peso molecular, como os luteinizantes e o hormônio

do crescimento são destruídos no intestino e vão para a urina, não podendo ser

avaliados nas fezes. Em adição, hormônios de baixo peso molecular, como os

tireóideos e prostaglandinas, são grupos pouco estudados e apresentam-se nas

fezes (WASSER et al., 2002).

A variação da excreção dos hormônios esteróides pela urina e fezes varia

conforme a espécie e o hormônio a ser avaliado (PALME et al., 1996 apud

WASSER et al., 2002), devendo levar em conta possíveis contaminações ao

avaliar as amostras (WASSER et al., 2002).

Shille et al (1984, 1990) determinou que o estrógeno no gato doméstico foi

excretado nas fezes e não na urina, e em pesquisas subseqüentes afirmou que o

metabólito da progesterona foi quantificado nas fezes em felídeos selvagens.

Brown & Wildt (1997) afirmaram que o monitoramento dos hormônios por

métodos não invasivos proporcionou o entendimento da biologia reprodutiva de

animais e que esta é uma das mais poderosas ferramentas de avaliação em

zoológicos atualmente.

A amostra fecal, ao contrário da amostra sangüínea representa níveis de

metabólitos hormonais de períodos longos, conseqüentemente refletindo o

mínimo de oscilações, a confusão entre a dinâmica secretória normal e uma

resposta fisiológica é improvável. Outra vantagem desta técnica é a de que os

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cientistas não têm um número limitado de amostras, as amostras podem ser

coletadas por diversas vezes e por tempo indeterminado (BROWN & WILDT,

1997).

Khan et al (2002) apud Whitten et al. (1998) afirmou que amostras fecais

são mais fisiológicas, mais estáveis por um tempo maior quando armazenadas

em temperaturas abaixo de zero.

Brown & Wildt (1997) afirmaram que o monitoramento por metabólitos

esteróides nas fezes habilita a avaliação do estado de puberdade, pois o início da

atividade gonadal esteroidogênica é associada com o estabelecimento e

manutenção da gametogênese; determinação da incidência de ovulação

espontânea versus induzida; previsão de parição, identificação de prenhez e

caracterização de período pós-parto; identificação de causas de inatividade

reprodutiva (senescência reprodutiva) ou hiperatividade, incluindo várias

patologias como cistos foliculares e retenção de corpo lúteo; melhora de

tratamentos com gonadotrofina exógena usada na reprodução assistida, por

exemplo, determinando se o tratamento em particular resultou em uma resposta

ovariana normal ou anormal; avaliação do nível do estresse fisiológico como uma

ferramenta para avaliar e melhorando o habitat para aumentar o bem-estar e

também o potencial reprodutivo; e comparações entre espécies para estudo da

conservação e evolução de mecanismos reprodutivos.

2.4.2.1. Corticosteróides:

Dehnhard et al. (2003) revisaram que em patos (Anas platyrhynchos) e

galinhas (Gallus domesticus) os corticosteróides circulantes são metabolizados

pelo fígado apresentando meia-vida de 10 a 15 minutos, sendo excretados pelas

fezes e urina. Porém observaram que em galinhas os níveis de corticosterona

fecal, relacionados ao estresse, são detectados 4 horas após estimulação; os

mesmos autores revisaram que há variações conforme a espécie de ave

estudada.

Hormônios esteróides são excretados via intestinal através da bile, após

clearance do sangue pelo fígado. Mudanças na dieta do animal alteram a

excreção biliar, podendo incorrer em erros na avaliação. Em um estudo com

babuínos, esta alteração fora eliminada através do método de congelamento a

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seco das amostras. (WASSER et al., 1993 apud WASSER et al., 2002). Assim é

interessante um exame separado para cada pool de amostra fecal, de acordo com

a dieta oferecida.

A longevidade dos hormônios excretada pode ser afetada pelo local de

trabalho (temperatura/ umidade), pela forma de armazenagem de curto prazo

(material utilizado durante o transporte da amostra – p.ex. sílica ou etanol) e pela

forma de armazenagem de longo prazo (modo de conservação da amostra até a

sua análise – p.ex. congelamento, secagem ou congelamento a seco). O melhor

método de armazenagem varia conforme a espécie e o hormônio analisado

(WASSER et al., 2002).

2.4.2.3. Testosterona

Brown et al (1996, I) em pesquisas com gatos domésticos determinou o

tempo do curso e a rota primária de excreção da injeção de testosterona C14

marcada em gatos domésticos, validou o radioimunoensaio para quantificar

metabólito fecal do andrógeno e demonstrou a relevância fisiológica do

andrógeno fecal imunoreativo no gato doméstico e em felídeos não domésticos.

Concluiu que os metabólitos da testosterona são excretados quase

exclusivamente nas fezes no gato doméstico macho; que a mensuração dos

metabólitos andrógenos permite ser monitorar a atividade esteroidogênica

testicular no gato doméstico; e que este procedimento também tem um potencial

para ser uma valiosa ferramenta para acessar o status androgênico de espécies

de felídeos ameaçadas de extinção.

Morais et al (1996) utilizando três espécies de felídeos selvagens avaliou

pelo monitoramento não invasivo, analisou metabólitos fecais de esteróides para

gerar uma base de dados reprodutivos destas espécies, foram pesquisados

então: a ciclicidade do estro das fêmeas; a função testicular (esteroidogênica e

espermática) em machos e a influência da estação do ano na atividade

reprodutiva em machos e fêmeas, concluiu que as análises feitas com o

monitoramento não invasivo, por meio dos metabólitos fecais do ovário e do

testículo demonstrou utilidade; em cada espécie houve influência da estação do

ano na atividade reprodutiva, apesar de muitos parâmetros terem efeitos

modestos; estas informações são importantes para definir o processo reprodutivo

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normal, o qual fortemente prova a ajuda valiosa para melhorar as estratégias de

auxílio à conservação de espécies.

2.4.2.2. Progesterona e Estradiol

Diversos estudos foram feitos usando análises de metabólitos fecais de

progesterona e estradiol para examinar a atividade ovariana, estas informações

foram utilizadas para avaliar as possíveis causas de performance reprodutiva

fraca em animais de cativeiro (BROWN et al, 1996, II).

Brown et al (1996, II) em estudos com fêmeas de chitas (Acinonyx jubatus),

esteróides fecais foram utilizados para avaliar eventos reprodutivos nesta espécie,

para confirmar e explicar a aparente falta de ciclicidade ovariana. Em adição, um

novo dado foi produzido na “regularidade” da resposta ovariana ao hormônio

exógeno de indução, e ao protocolo de inseminação artificial em comparação ao

perfil traçado pelo esteróide fecal na prenhez versus não prenhez dos animais

após o acasalamento.

Czekala et al (1994) analisaram metabólitos fecais do estradiol e

progesterona para monitorar a atividade esteroidogênica de felídeos. Para Brown

et al (1996, I) estes dados servem para auxiliar na reprodução assistida, pois com

eles sabe-se o momento correto de fazer uma inseminação artificial, por exemplo,

havendo assim menos chances de falha neste tipo de reprodução.

Brown et al (1993) pesquisando taxas de excreção e o metabolismo da

progesterona no gato doméstico e então desenvolver e validar o

radioimunoensaio para avaliação de progesterona fecal, monitorando assim a

função ovariana no gato doméstico.

2.4.3. Interação entre os métodos:

Nos estudos de Dehnhard et al. (2003) com galinhas, corvo-marinho e

falcão, a dinâmica das concentrações dos metabólitos fecal refletiu o curso da

atividade biológica do hormônio no plasma.O pico do metabólito fecal

acompanhou o do plasma sangüíneo com um atraso de 3,5 + 1,1 h.

2.4.4. Análise dos hormônios:

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É de fundamental importância o anticorpo escolhido para a análise das

amostras, para evitar falsos positivos/negativos. Além da validação dos níveis de

cortisol fecal devido a grande variabilidade de excreção com relação às espécies

(WASSER et al., 2002).

Hormônios adrenais e gonadal nas fezes podem ser avaliados por técnicas

de EIA (Ensaio Imunoenzimático), RIA (Radioimunoensaio), HPLC (Cromatografia

Líquida de Alta Performance) (DEHNHARD et al., 2003).

2.4.4.1. Extração dos hormônios

Segundo Brown e Wildt (1997), o método de extração dos metabólitos

esteróides das fezes conta com a combinação de solventes orgânicos e aquosos.

Amostras são liofilizadas, pulverizadas e 0,1 – 0,2 g do pó é fervido em 5mL

de etanol a 90%:água destilada por 20 minutos. Posteriormente centrifugado em

500 g por 10 minutos, o supernadante é recuperado e o pellet ressuspendido em

5 mL de etanol a 90%, homogeneizado por 1 minuto e recentrifugado. Os

supernadantes do etanol são combinados, secos completamente e então

redissolvido em 1 mL de metanol. Os extratos são homogeneizados (1 minuto),

colocados em um recipiente ultrasônico, limpo por 30 segundos e livres de

partículas aderidas em sua parede, e então homogeneizado brevemente (15

segundos). O extrato depois é diluído (1:20 – 1:80 para o estradiol; 1:800 –

1:80.000 para progesterona) em fosfato (0,01 M PO4, 0,14 M NaCl, 0,5%

albumina sérica bovina (BSA), 0,01% sódio , pH 7,4) antes da análise. Este

método resulta em alta recuperação de esteróides endógenos das amostras nos

estudos rádio marcados, como também esteróides marcados (Wasser et al, 1991,

1993).

2.4.4.2. Cromatógrafo Líquido de Alta Performance (HPLC)

Brown et al. (1996), em seus ensaios com felídeos utilizou HPLC para

determinar o número e a proporção relativa de metabólitos da testosterona nas

fezes de gatos e na sua urina, e foram determinados por estágio reverso HPLC.

Antes da HPLC, amostras são reconstituídas em 0,5 mL, passadas através de

uma coluna matriz C-18 e diluída com 5mL de 80% de metanol para remover os

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contaminantes. O filtrado de extratos fecal e urinário forma evaporados,

reconstituído em 60µL de metanol, e diluído usando um gradiente de 20-30-40-50-

100% metanol: água após 0-10-40-55-120 minutos respectivamente. Uma fração

de mL foi coletada após um período de 120 minutos (1 mL/ minuto taxa de

escoamento). O perfil co-diluição de 3H-testosterona, 3H-androsterona e 3H-

androstenediol também foram determinados. Frações HPLC de diluição foram

levados para secar, reconstituídos em fosfato-protegido salino e metabólito

imunoreativo de testosterona quantificado por RIA.

2.4.4.3. Radioimunoensaio (RIA)

Testosterona imunorreativa em extratos fecais e frações HPLC foram

mensuradas usando anticorpo duplo. 125I- testosterona RIA. O anti-soro foi

seguido à reação cruzada: 100% testosterona, 34% dihidrotestosterona, 3,8% 5β-

androstan-3α, 17β-diol, 3,3% 11-hidroxitestosterona, 2,9% 5α-androstan-3α, 17β-

diol, 2,7% 5α-androstan-3β.17β-diol, 2,1% androsterona, e <1% com drostenediol,

DHEA, 5β-dihidrosterona, aldosterona, cortisol, cortisona, corticosterona,

estradiol, pregnanediol, progesterona e 17α-hidroxiprogesterona. A testosterona

ensaiada foi validada por extratos fecais no gato doméstico por demonstração:

paralelismo entre diluições de extratos e curva padrão; e recuperação significante

de testosterona exógena (2,5-200 ng/mL), adicionada de extratos fecais.

3. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Por causa do potencial efeito deletério do estresse crônico há um grande

interesse entre os diversos campos de estudo em mensurar o estresse animal.

Biólogos conservacionistas estão freqüentemente interessados com o alívio dos

efeitos das condições ambientais e distúrbios induzidos pelo homem na vida

selvagem. Estes estudos auxiliam também na avaliação de manejos

desenvolvidos para animais que vivem em cativeiro.

Após o desenvolvimento de técnicas de avaliações não invasivas é hoje

possível descobrir porque indivíduos ou populações não estão reproduzindo ou

mesmo reproduzindo de forma insatisfatória, podendo facilitar em gestões para a

18

proliferação e em conseqüência conservações de diversas espécies ameaçadas

de extinção, além de evitar que outras espécies tornem-se ameaçadas.

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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