Microscopia de contraste diferencial de fase. Contraste: diferença de iluminação entre amostras e...

Microscopia de Microscopia de contraste contraste diferencial de diferencial de fasefase

Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo.

LUZLUZ

absorçãoabsorção

Transmissão = Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão)+ reflexão)

reflexãoreflexão

fluorescênciafluorescência

refraçãorefração

Contraste diferencial de faseContraste diferencial de fase

Conceito Conceito Técnica de contraste em que a luz plana Técnica de contraste em que a luz plana polarizada incidente sobre a amostra passa por polarizada incidente sobre a amostra passa por diferentes caminhos ópticos em pontos diversos diferentes caminhos ópticos em pontos diversos da amostra, causando diferenças de intensidade da amostra, causando diferenças de intensidade de luz que passam por um 2º polarizador.de luz que passam por um 2º polarizador.

Os caminhos ópticos diferentes podem ser Os caminhos ópticos diferentes podem ser causados por diferenças nos índices de refração causados por diferenças nos índices de refração e/ou nas espessuras das estruturas. e/ou nas espessuras das estruturas.

I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).

Contraste = (If - Ia) x 100 If


IndicaçõesIndicações- Amostras vivas ou fixadas não coradas;- Amostras vivas ou fixadas não coradas;- Observação de células (incluindo Observação de células (incluindo organelas) em cultura:organelas) em cultura:- Aplicar coloração óptica;Aplicar coloração óptica;- Melhorar contraste de certas estruturas Melhorar contraste de certas estruturas em amostras coradas;em amostras coradas;- Aplicação da técnica de seccionamento Aplicação da técnica de seccionamento óptico.óptico.


ConfiguraçõesConfigurações1) 1) Tradicional (Normanski, 1952)Tradicional (Normanski, 1952): usa prismas : usa prismas

Wollaston e polarizadores. Também conhecida Wollaston e polarizadores. Também conhecida como conatrste de Normanski.como conatrste de Normanski.

2) 2) Alternativa (Inoué, 1989)Alternativa (Inoué, 1989): usa polarizadores e : usa polarizadores e compensadores de retardo de fase. Também compensadores de retardo de fase. Também conhecida como técnica DIC com compensador conhecida como técnica DIC com compensador de fase. Pode-se usar compensador de de fase. Pode-se usar compensador de Senarmont, compesador de Berek ou filtro Senarmont, compesador de Berek ou filtro com com analisador giratório.analisador giratório.


O que o contraste diferencial faz?O que o contraste diferencial faz?

-- Variações nos caminhos ópticos dos raios Variações nos caminhos ópticos dos raios desviados são ajustadas para dar um contraste com desviados são ajustadas para dar um contraste com impressão de imagem tridimensional;impressão de imagem tridimensional;

- partes da amostra podem ficar mais escuras ou - partes da amostra podem ficar mais escuras ou mais claras que o campo de visão ao redor.mais claras que o campo de visão ao redor.

- não há halos de fase ao redor das - não há halos de fase ao redor das células/estruturas;células/estruturas;

- produz melhor resolução do que o contraste de - produz melhor resolução do que o contraste de fase pela ausência dos anéis de fase nas objetivas e fase pela ausência dos anéis de fase nas objetivas e condensador;condensador;

- há formação de sombras acompanhando um eixo - há formação de sombras acompanhando um eixo no plano da imagem.no plano da imagem.


Configuração tradicionalConfiguração tradicional

Trabalha-se nos planosTrabalha-se nos planosda imagem conoscópicada imagem conoscópica


Analisador

Wollaston

Wollaston

Filtro 1/4

Polarizador

Configuração alternativa (de Configuração alternativa (de Senarmont)Senarmont)

Objetiva

Analisador

Polarizadorgiratório

Filtro ¼ de

Amostra

Fonte de luz

Diafragma docondensador

Compensador de Senarmont:Consiste num filtro ¼ de e um polarizador (pode ser o analisador) giratório.


Analisador

Fenda parainserir filtro Escala vernier

Graduação de 180 ou 360º

Trava

Configurações de compensador de Configurações de compensador de SenarmontSenarmont

(a)

ControleGiratórioremovível

Filtro de ¼ de

Analisador

(b)



1) Faz-se ajuste koehler;1) Faz-se ajuste koehler;

2) coloca-se polarizadores cruzados, com 2) coloca-se polarizadores cruzados, com

o 1º na posição 45º e o 2º a 90º do 1º o 1º na posição 45º e o 2º a 90º do 1º

(campo de visão fica escuro);(campo de visão fica escuro);

3) Insere-se o filtro ¼ de 3) Insere-se o filtro ¼ de na fenda apropriada; na fenda apropriada;



4) Gira-se o analisador até criar um retardo de fase 4) Gira-se o analisador até criar um retardo de fase adequado para se obter o melhor contraste para adequado para se obter o melhor contraste para cada caso. O retardo de fase é dado por: cada caso. O retardo de fase é dado por: **/180 /180 (( é o angulo movido no analisador). é o angulo movido no analisador).



5) Pode-se inserir um filtro vermelho 1 (entre o 5) Pode-se inserir um filtro vermelho 1 (entre o polarizador e a amostra ou entre a objetiva e o polarizador e a amostra ou entre a objetiva e o analisador) para fazer coloração óptica.analisador) para fazer coloração óptica.



É mais prática que a configuração tradicional e está É mais prática que a configuração tradicional e está sendo responsável pela crescente popularidade sendo responsável pela crescente popularidade da técnica de DIC.da técnica de DIC.


Eixos das sombrasEixos das sombras


Dados técnicosDados técnicos1)1) AAcessórios obrigatórios (método cessórios obrigatórios (método

alternativo)alternativo): dois polarizadores : dois polarizadores (sendo um deles giratório) e um filtro (sendo um deles giratório) e um filtro de ¼ de de ¼ de ou filtro ou filtro ou ou compensador de Berek.compensador de Berek.

2) 2) Acessórios extras (método Acessórios extras (método tradicional)tradicional): prismas Wollaston (no : prismas Wollaston (no diafragma do condensador e perto diafragma do condensador e perto do plano retro-focal da objetiva) do plano retro-focal da objetiva) (para a técnica clássica de DIC).(para a técnica clássica de DIC).


Técnicas e contrasteTécnicas e contraste

Amostra Técnica Contraste

Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25%

Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial

de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%



Sem filtro vermelho 1

Com filtro vermelho 1

Técnica de coloração ópticaTécnica de coloração óptica

Secionamento ópticoSecionamento óptico É a técnica de observar planos específicos da É a técnica de observar planos específicos da

amostra separadamente, trabalhando com o amostra separadamente, trabalhando com o ajuste micrométrico em certas técnicas de ajuste micrométrico em certas técnicas de contraste.contraste.


Observação de diversos planos de uma colônia de Volvox (microorganismos aquáticos)

Contraste de fase

DIC

Contraste diferencial de faseContraste diferencial de fase Contraste de fase x DIC: Contraste de fase x DIC: diferençasdiferenças

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