Milena Peixoto do ValleMestranda em Endocrinologia GenéticaFaculdade de Medicina da USP

Sistemas de sensores de DNA se baseiam na imobilização da sonda fita simples de DNA (ssDNA) na superfície da nanopartícula, que reconhece a complementariedade da sequência do DNA alvo (tDNA) por hibridização do DNA.

A hibridização pode ser mensurada eletronicamente, opticamente, eletroquimicamente ou usando um dipositivo sensível de massa.

São regiões de sequência de DNA curtas (menos de 800 pares de base) que apresentem variabilidade suficiente para discriminar espécies

Um ensaio de código de barras de DNA utiliza oligonucleotídeos modificados em nanopartículas (AuNPs) para amplificação do sinal e nanopartículas magnéticas (MNPs) para facilitar a separação do complexo de nanopartículas da amostra.

B

Objetivo:Conseguir detectar e identificar a presença do gene do “antígeno

A” (pagA) - Bacillus anthracis e o gene “elemento de inserção” (Iel) de Salmonella enteritidis simultaneamente.

Componentes: O sistema de biosensores é composto por três nanopartículas:

nanopartículas de ouro (AuNPs), nanopartículas magnéticas (MNPs), e nanopartículas rastreadoras (NTs, como PbS, CdS e ZnS).

Sobre a abordagem com ensaios de barcode DNA (bDNA) , esta técnica teria vantagens sobre a detecção óptica , muito usada em ensaios com nanopartículas, que ocupam muito espaço físico.

O requerimento de espaço físico pode ser minimizado utilizando o sistema eletroquiímico para diagnósticos biomédicos proposto, que pode ser integrado a micro sistemas, incluindo o processamento do sinal.

No entanto , sistemas portáteis que poderiam ser utilizados em campo, ainda estão sendo desenvolvidos.

Culturas - Bacillus anthracis e Salmonella enteritidis

Miniprep

PCR pagA(B. anthracis) e Iel (S.enteritidis)

Eletroforese

Purificação

Diluições em H2O

[tDNA] confirmadas por espectrofotômetro

Oligonucleotídeos thiolados foram conjugados às nanopartículas:

Para a detecção do S. enteritidis pelo gene insertion element (Iel)

A primeira sonda de DNA (1pDNA) na AuNPs: 5-AATATGCTGCCTACTGCCCTACGCTT-SH-3’;

A segunda sonda de DNA(2pDNA) nas MNPs: 5-SH-TTTATGTAGTCCTGTATCTTCGCCGT-3’.

Para a detecção do gene pagA do B. anthracis

A primeira sonda de DNA (1pDNA) na AuNPs : 5-SH-GGAAGAGTGAGGGTGGATACAGGCT-3’;

A segunda sonda de DNA(2pDNA) nas MNPs : 5-AGATTTAAATC TGGTAGAAAGGCGG–SH-3

-bDNA nas AuNPs para detectar ambos os genes : 5-NH2-TTATTCGTAGCTAAAA AAAAAA-SH-3’

A dimensão e as propriedades espectroscópicas das AuNPs e dos NTs foram caracterizadas pela TEM (Transmission Electron Microscope).

Às MNPs foram adicionadas as 2pDNA respectivas para cada gene (pagA e Iel).

Às AuNPs, foram adicionados o bDNA juntamente à 1pDNA na proporção 100:1 (complexo estável a TA).

A esse conjugado são adicionado os NTs específicos para cada 1pDNA (pagA e Iel).

A- bio bDNA + NTs + crosslinkers

B- bio bDNA + NTs

C- CdS NTs

Diluições de [tDNA]

Foram adicionadas as MNP-2pDNA

Formação do complexo MNP-2pDNA/tDNA – lavagem

Adicionado o complexo 1pDNA-AuNP-bDNA-NTs

Formado o complexo MNP-2pDNA/tDNA/1pDNA-AuNP-bDNA-NTs

Aplicação do complexo ao campo magnético – 5 lavagens

O sanduíche lavado foi dissolvido em ácido nítrico que libera os íons NTs (Pb2+ ou Cd2+).

Depois é acrecentada uma solução ácida com bismuto que permite a mensuração etroquímica dos NTs .

Square-Wave Anodic Stripping Voltammetry (SWASV)

Razões para o deslocamento do pico:

-DDP Ag/AgCl

-SPCE diferentes

-0,61 -0,87 ?

PbCd

“The possible reason would be that the washing steps were not thorough and the unreacted PbS NTs generated the noise.”

-0,61-0,87

Cd/Salm.

Pb/Antr.

B. anthracis, Pb ( −0.61V) (tDNA-50 ng/mL, 5 ng/mL, 500 pg/mL,e50 pg/mL) são 38uA, 34uA, 29.5uA, and 23uA, respectivamente.

S. enteritidis, Cd(−0.87V) (tDNA-50 ng/mL, 5 ng/mL, 500 pg/mL, and 50 pg/mL) são 42.5uA, 35uA, 32uA, e 27uA, respectivamente

A conjugação dos grupos carbolixílicos nos NTs e a conjugação dos grupos amino nos bio-barcoded AuNPs foi eficiente.

Após mixar as nanopartículas com o tDNA o sanduíche estrutural (MNP-2pDNA/tDNA/1pDNA-AuNP-bDNA-NTs) foi formado.

Os sinais eletroquímicos emitidos pelos NTs liberados aumentam com o aumento da [tDNA].

O biossensor tem boa especificidade e sensibilidade na detecção individual do gene pagA de B. anthracis usando PbS NTs na concentração mínima de 0.2 pg/mL.

O limite da detecção deste sensor multiplex bio-barcoded DNA é 0.5 ng/mL para o gene “insertion element “(Iel) de S. enteritidis utilizando CdS, e 50 pg/mL para ogene “pagA” de B. anthracis utilizando PbS NTs.

O sensor de código de barras baseado nas nanopartículas tem potencial para aplicação da múltipla detecção de agentes de bioterrorismo, co – infeção, e múltiplos contaminantes numa mesma amostra...

FIFIMM