MILENE TAVARES BATISTA Uma nova estratégia vacinal para o ...
-
Upload
truongngoc -
Category
Documents
-
view
225 -
download
6
Transcript of MILENE TAVARES BATISTA Uma nova estratégia vacinal para o ...
-
MILENE TAVARES BATISTA
Uma nova estratgia vacinal para o controle da crie baseada em
linhagens recombinantes de Bacillus subtilis
So Paulo 2012
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Microbiologia do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para obteno do Ttulo de Doutor em Cincias
-
MILENE TAVARES BATISTA
Uma nova estratgia vacinal para o controle da crie baseada em
linhagens recombinantes de Bacillus subtilis
rea de Concentrao: Microbiologia
Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cssia Caf Ferreira Co-orientador: Prof. Dr. Lus Carlos de Souza Ferreira Verso original
So Paulo 2012
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Microbiologia do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para obteno do Ttulo de Doutor em Cincias
-
Aos meus pais,
Ana e Adilao
Aos meus irmos,
Michael e Marcel
Ao meu marido e eterno amor,
Leandro
Muito obrigada pelo amor, dedicao, apoio e
compreenso ao longo destes anos.
-
Agradeo Deus e Nossa Senhora por me permitir concluir mais uma etapa
da minha vida.
Aos meus pais, Ana e Adilao, que so a razo da minha vida. Obrigada por me
darem uma famlia linda, por me ensinarem os valores da vida e por sempre estarem
ao meu lado. Me, obrigada por ser meu exemplo de grandiosidade de corao, por
sua alegria, companheirismo, f e amor incondicional. Pai, obrigada por ser meu
exemplo de homem, de trabalhador, pai, por me ensinar o que boa msica, e por
cuidar de mim como sua princesinha.
Aos meus irmos, Michael e Marcel, por serem meus eternos comparsas, por
me apoiarem sempre, me ajudarem quando ningum mais podia.
Ao meu namorido, Leandro, por ser to doce, amvel, companheiro, por me
entender e apoiar, por me ajudar a dar risada quando o que eu mais queria era
chorar. E por ser meu eterno namorado, marido, amigo e amor.
Aos meus avs pelo amor, carinho e cuidado.
minha tia Edna por ser minha segunda me, cuidar de mim e me amar acima
de tudo. E a minha priminha-irm, Jssica, pelas suas eternas estripulias e alegria.
As minhas cunhadas, Vanessa e Vanessa, que so parte da famlia e trazem
ainda mais amor e unio a nossa casa.
Profa. Rita, minha orientadora, por ser minha eterna mestra e amiga, por me
dar a oportunidade de conhecer a cincia, por me apoiar sempre, me ensinar e guiar
pelo caminho profissional e pessoal (muitas vezes!). Obrigada pelo seu carinho e
alegria!
Ao Prof. Lus, meu co-orientador, por ser um exemplo de dedicao,
pesquisador e pessoa, pelos ensinamentos e pacincia no trabalho, por seus bate-
papos alegres e incentivadores.
Ao Prof. Wolfgang pelo seu carinho e cuidado em um tempo de incertezas.
Profa Jeannine, um exemplo de pessoa e profissional, por me receber com
carinho e ateno, pela oportunidade de crescer profissional e pessoalmente, por sua
amizade.
sbib-marciaTexto digitado
sbib-marciaTexto digitadoAGRADECIMENTOS
sbib-marciaTexto digitado
sbib-marciaTexto digitado
-
amiga e mestra Elisa, por ser um exemplo de fora e amizade. Por me ajudar
nos primeiros passos na cincia e ser meu ombro amigo, pelos incontveis almoos e
sorvetes, pela pacincia em ouvir minhas preocupaes e pelas risadas.
Aos amigos Luana, Bruno (Tintim) e Sabrina, pelo companheirismo dentro e
fora do laboratrio, pela descontrao e suporte.
Ao amigo de outrora que me iniciou no laboratrio, muito obrigada!
Aos amigos Bacileiros, Wilson, Rafael, Renata e Juliano (ex-bacileiro) pelo
trabalho em equipe, pela amizade. um prazer trabalhar com pessoas como vocs.
Renata pela sua ajuda profissional e pessoal, pelo carinho, por ter sempre
aquele toque amigo, por ser minha comparsa de viagens nacionais e internacionais.
amiga e companheira de noitadas no laboratrio Camila Santos pela sua
incansvel energia, sua inteligncia nica, por sua maravilhosa fora e amizade ao
longo destes anos. Obrigada por construir comigo uma amizade linda e sincera.
Ao grupo do VTNC (Renata, Rafael e Cariri) que permitiram que eu me
mantivesse s em momentos turbulentos, pelas risadas e amizade.
Aos companheiros de laboratrio (Carol IC, Ewerton, Mnica, Nana, Sara,
Dbora, Priscila, Raza, Rubens, Jaime, Marcinha, Mariana IC, Juliana, Deni, Luana
(e Manuzinha), Mari, Cariri e Bruna). Vocs esto no meu corao, obrigada pela
amizade e coleguismo, colaboraes e por momentos de alegria e baboseira.
Ao Eduardo, Loren e Lilian pela inestimvel ajuda em tudo.
Ao Eduardo por seu profissionalismo, competncia, amizade e por me aguentar
pedindo coisas a toda hora.
Aos estagirios (Paschoal, Joelma, Bruno Tintim, Marianna, Mariela, Marilys e
Gabriela) que me ensinaram muitas lies profissionais e de vida, pela ajuda e
companheirismo.
Maria Elizabete Almeida-Sbrogio (Bete) pelos ensinamentos, carinho e
mimos ao longo destes anos.
Aos funcionrios do Departamento de Microbiologia pelo suporte em todos os
momentos.
Aos funcionrios e amigos do biotrio da Parasitologia (Sandra, Juliane e Dani)
pela competncia, ajuda, ensinamentos e risadas.
-
As agncias de fomento FAPESP, CNPq e CAPES pelo suporte financeiro,
sem o qual seria impossvel realizar este trabalho.
A todos aqueles que no consegui agradecer, minha eterna gratido.
-
Talvez no tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito.
No sou o que deveria ser, mas Graas a Deus, no sou o que era antes.
Marthin Luther King
-
RESUMO
TAVARES, M. B. Uma nova estratgia vacinal para o controle da crie baseada em linhagens recombinantes de Bacillus subtilis. 2012. 200 f. Tese (Doutorado em Microbiologia) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.
O Streptococcus mutans (S. mutans) o agente etiolgico da crie dental humana, uma doena com ampla distribuio mundial. A adeso superfcie dental depende da interao entre a protena de superfcie P1 e a aglutinina salivar (SAG) adsorvida ao dente. A regio N-terminal da P1 um alvo vacinal importante que est diretamente associada s funes de adeso e agregao. Este trabalho teve o objetivo de avaliar estratgias vacinais contra o S. mutans baseadas na protena P1 usando linhagens recombinantes de B. subtilis. O B. subtilis uma bactria gram positiva, formadora de esporos, no patognica, empregada como sistema de expresso de protenas heterlogas e como veculo vacinal administrado por vias de mucosas. Empregamos, inicialmente, o B. subtilis para expressar e purificar a protena P139-512 derivada da protena P1 de S. mutans UA159. O antgeno P139-512 apresentou eptopos lineares e conformacionais semelhantes aos presentes na protena P1 nativa. O stio de ligao SAG est preservado nessa protena assim como suas propriedades imunognicas. A coadministrao parenteral do antgeno com adjuvantes vacinais promoveu resposta sistmica especfica com anticorpos eficazes no bloqueio da adeso de S. mutans. Por fim, usamos esporos de B. subtilis como veculo de entrega de mucosa para o antgeno alvo de S. mutans. Esporos de B. subtilis foram modificados para expressar na superfcie adesinas bacterianas (SlpA, InvA ou Inv600) com capacidade de ligao ao epitlio intestinal e, quando no estgio de clula vegetativa, expressar intracelularmente o antgeno P139-512. A imunizao oral com os esporos adesivos induziu altas concentraes de anticorpos sistmicos e de mucosa. A imunizao nasal ou sublingual com os esporos recombinantes induziu nveis de anticorpos sistmicos maiores do que aqueles obtidos aps a imunizao oral. Alm disso, esses anticorpos foram mais eficientes em bloquear a adeso de S. mutans SAG imobilizada, sem interferir com a agregao. Em concluso, os resultados obtidos abrem perspectivas interessantes para o desenvolvimento de vacinas anti-crie baseadas em linhagens de B. subtilis.
Palavras-chave: Bacillus subtilis. Streptococcus mutans. Vacina. Crie dental. Protenas heterlogas. Veculo vacinal. Esporos.
-
ABSTRACT
TAVARES, M. B. A new vaccine approach for the control of tooth decay based on recombinant Bacillus subtilis strains. 2012. 200 p. Ph. D. thesis (Microbiology) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012. S. mutans is the major etiologic agent of human dental caries, a disease with worldwide distribution. The adhesion to the tooth surface is dependent on the interaction of the P1 surface protein and salivary agglutinin (SAG) adsorbed to the tooth. The N-terminal region of P1 is an important vaccine target that is directly associated with adhesion and aggregation functions. This study aimed to evaluate vaccination strategies against S. mutans based on the P1 protein using recombinant B. subtilis strains. B. subtilis is a gram positive, spore-forming, non-pathogenic bacterium used as expression system for heterologous proteins and as a vaccine vehicle administered by mucosal routes. Inicially, we employed a recombinant B. subtilis strain to express and purify the P139-512 protein derived from the S. mutans UA159 P1 protein. The P139-512 antigen showed important conformational and linear epitopes similar to those present in the native P1 protein. The SAG-binding site is preserved in P139-512 as well as immunological properties. The parenteral co-administration of antigen with vaccine adjuvants stimulated systemic antibodies effective in blocking adhesion of S. mutans to SAG. Lastly, we used B. subtilis spores as a mucosal delivery vehicle for antigen targeting. B. subtilis endospores were modified to display bacterial adhesins (SlpA, InvA or Inv600), capable to bind to the intestinal epithelium, on the spore surface and to express intracellularly the P139-512 antigen during the vegetative cell stage. Oral immunization with adhesives spores induced high systemic and mucosal specific antibodies levels. The nasal or sublingual immunization with B. subtilis recombinant spores induced higher amounts of systemic antibodies than the oral immunization. Furthermore, the specific antibodies were highly effective in blocking the adherence of S. mutans to immobilized SAG, without interfering with aggregation. In conclusion, the results open interesting perspectives for the development of anti-caries vaccines based on B. subtilis strains.
Keywords: Bacillus subtilis. Streptococcus mutans. Vaccine. Dental caries. Heterologous proteins. Vaccine vehicle. Spores.
-
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1- Representao esquemtica da protena P1 de S. mutans. ........................... 26
Figura 2- Construo do vetor de expresso e purificao da protena P139-512 em B.
subtilis (pLDV701). ......................................................................................................... 71
Figura 3- Deteco e purificao da protena P139-512 produzida em linhagem
recombinante de B. subtilis. ........................................................................................... 72
Figura 4- Representao esquemtica das protenas recombinantes derivadas da
protena P1 de S. mutans e distribuio dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 na
estrutura conformacional da protena. ............................................................................ 74
Figura 5- Avaliao da reatividade dos mAbs anti-P1 com a protena nativa expressa no
S. mutans NG8 e com os fragmentos de protena derivados da protena P1. ............... 75
Figura 6- Caracterizao dos eptopos da protena recombinante P139-512 usando
anticorpos monoclonais anti-P1. .................................................................................... 76
Figura 7- Interao da protena P139-512 recombinante com a SAG usando BIAcore
(surface plasmon resonance). ........................................................................................ 78
Figura 8- Especificidade antignica dos anticorpos produzidos em camundongos
imunizados com a protena P139-512. ............................................................................... 81
Figura 9- Reatividade dos soros gerados em camundongos com a protena P139-512
purificada em linhagem recombinante de B. subtilis LDV701. ....................................... 83
Figura 10- Determinao da funcionalidade in vitro dos anticorpos gerados em
camundongos com as protenas P139-512 ou P139-512d. ................................................... 86
Figura 11- Avaliao da resposta imunolgica sistmica em camundongos imunizados
pela via subcutnea com a protena P139-512 associada aos diferentes adjuvantes. ...... 89
-
Figura 12- Determinao da avidez dos anticorpos em relao ao antgeno vacinal P139-
512. .................................................................................................................................. 91
Figura 13- Reatividade dos soros com a protena P1 nativa de S. mutans NG8 e os
fragmentos truncados da P1. ......................................................................................... 93
Figura 14- Deposio do complemento na superfcie de S. mutans na presena de
anticorpos anti-P139-512. .................................................................................................. 95
Figura 15- Funcionalidade dos soros gerados aps imunizao da protena P139-512 co-
administrada com diferentes adjuvantes. ....................................................................... 97
Figura 16- Representao esquemtica do direcionamento dos esporos de B. subtilis
para clulas imunes de mucosa no GALT (gastrointestinal-associated lymphoid tissue) e
consequncia para a resposta imunolgica ao antgeno alvo. ..................................... 107
-
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Linhagens empregadas e construdas neste trabalho. ................................. 42
Quadro 2 - Vetores empregados e construdos neste trabalho. ..................................... 43
Quadro 3 - Iniciadores desenhados para a amplificao dos genes de interesse.......... 47
Quadro 4- Reatividade dos anticorpos policlonais com as protenas recombinantes P1,
P1 39-512 ou P1 39-512d. ..................................................................................................... 82
-
SUMRIO
1 INTRODUO ............................................................................................................ 21
1.1 A crie dental humana ........................................................................................... 21
1.2 Streptococcus mutans ........................................................................................... 22
1.3 A famlia do Antgeno I/II e a Protena P1 de S. mutans ...................................... 23
1.4 Regio A ou Regio de ligao saliva ............................................................... 27
1.5 Estratgias vacinais contra a crie dental ........................................................... 28
1.6 Bacillus subtilis e o desenvolvimento de vacinas .............................................. 32
1.7 Vacinas de mucosa baseadas em B. subtilis ....................................................... 37
2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 39
2.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 39
2.2 Objetivos especficos............................................................................................. 39
3 MATERIAIS E MTODOS .......................................................................................... 40
3.1 Linhagens e vetores bacterianos, condies de cultivo .................................... 40
3.2 Competncia e transformao em E. coli ............................................................ 40
3.3 Competncia e transformao em B. subtilis ...................................................... 41
3.4 Lise de clulas vegetativas de B. subtilis ............................................................ 44
3.5 Extrao de protenas totais de S. mutans .......................................................... 44
3.6 Induo e purificao da protena CG14 a partir de E. coli ................................ 44
3.7 Produo de anticorpos anti-P1 de S. mutans .................................................... 44
3.8 Construo do vetor de clonagem pGP1N ........................................................... 45
3.8.1 Isolamento de DNA genmico de S. mutans .................................................... 45
3.8.2 Amplificao do gene spaP1N por reao em cadeia da polimerase (PCR) e
clonagem no vetor pGEM-T-easy ................................................................................ 45
3.9 Construo do vetor de expresso pLDV701 ...................................................... 48
-
3.10 Expresso da protena recombinante P139-512 em linhagem de B. subtilis
LDV701 .......................................................................................................................... 48
3.11 Fracionamento da amostra induzida de LDV701 ............................................... 49
3.12 Purificao da protena recombinante P139-512 a partir de linhagem
recombinante de B. subtilis ......................................................................................... 50
3.13 SDS-PAGE e Western blot da protena P139-512 .................................................. 50
3.14 Expresso e purificao dos fragmentos da protena P1 ................................. 50
3.15 Preparao dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 ................................ 50
3.16 Reatividade dos anticorpos monoclonais anti-P1 com a protena P139-512 por
meio de Western blot ................................................................................................... 51
3.17 Determinao da reatividade dos mAbs anti-P1 com os fragmentos da
protena P1 e a protena P139-512 por meio de ELISA ................................................. 51
3.18 Preparo da aglutinina salivar (SAG) ................................................................... 52
3.19 Ensaio de ligao da P139-512 SAG imobilizada em microchip via sistema
BIAcore.......................................................................................................................... 52
3.20 Regime vacinal e processamento das amostras ............................................... 53
3.21 Produo de anticorpos contra toda bactria S. mutans ................................. 53
3.22 Adsoro dos anticorpos IgG anti-P1 com as protenas P139-512 e P139-512d ... 54
3.23 ELISA para deteco de anticorpos especficos contra as protenas P1,
P139-512 e P139-512d ......................................................................................................... 54
3.24 Imunofluorescncia do S. mutans ...................................................................... 55
3.25 Ensaio de inibio da agregao do S. mutans mediada por saliva livre por
meio de anticorpos anti-P139-512 .................................................................................. 55
3.26 Bloqueio da adeso de S. mutans SAG imobilizada por anticorpos
anti-P139-512 em placa de microtitulao ..................................................................... 56
3.27 Imunogenicidade da protena P139-512 em associao com diferentes
adjuvantes - Protocolo vacinal .................................................................................... 57
-
3.28 Coleta de amostras .............................................................................................. 57
3.29 ELISA para deteco de anticorpos especficos contra a protena P139-512 .... 58
3.30 ELISA de avidez .................................................................................................... 58
3.31 Reatividade dos soros policlonais anti-P139-512 com os fragmentos da
protena P1 por meio de ELISA ................................................................................... 59
3.32 Inibio da adeso de S. mutans ao SAG imobilizado por anticorpos anti-
P139-512 especficos utilizando o sistema de BIAcore ................................................ 59
3.33 Inibio da agregao de S. mutans ao SAG livre por meio de
espectrofotometria ....................................................................................................... 60
3.34 Ensaio de deposio da protena C3 do complemento .................................... 60
3.35 Construo das linhagens de B. subtilis capazes de expressar adesinas
bacterianas na superfcie dos esporos ...................................................................... 61
3.36 Construo do vetor vacinal pLDV702 de B. subtilis ........................................ 62
3.37 Preparo dos esporos de B. subtilis .................................................................... 63
3.38 Extrao e deteco das protenas recombinantes da capa dos esporos ...... 63
3.39 Deteco e quantificao da expresso in vitro da P139-512 nas linhagens
vacinais de B. subtilis .................................................................................................. 64
3.40 Imunofluorescncia dos esporos ....................................................................... 64
3.41 Adeso dos esporos recombinantes de B. subtilis a clulas Caco-2 in vitro . 65
3.42 Disseminao dos esporos no intestino de camundongos ............................. 66
3.43 Adeso dos esporos de B. subtilis s placas de Peyer de camundongos ..... 66
3.44 Regime vacinal com esporos recombinantes de B. subtilis e processamento
das amostras ................................................................................................................ 67
3.45 Deteco das respostas antgeno-especficas de anticorpos sricos e de
mucosa .......................................................................................................................... 67
3.46 Inibio da agregao de S. mutans mediada pela SAG livre em placas de
microtitulao ............................................................................................................... 68
-
3.47 Inibio da adeso de S. mutans mediada pelo SAG ligado em placa de
microtitulao ............................................................................................................... 68
3.48 Anlises estatsticas ............................................................................................ 69
4 RESULTADOS ............................................................................................................ 70
4.1 Captulo I. Produo e caracterizao funcional e imunolgica da protena
P139-512 produzida a partir de uma linhagem recombinante de B. subtilis ............... 70
4.1.1 Construo da linhagem recombinante de B. subtilis LDV701, expresso e
purificao da protena recombinante P139-512 ........................................................... 70
4.1.2 Reatividade dos monoclonais (mAbs) anti-P1 com as protenas P1, P139-512 e
os domnios funcionais da P1 ..................................................................................... 73
4.1.3 Ligao da protena recombinante P139-512 produzida em B. subtilis LDV701
SAG ............................................................................................................................... 77
4.1.4 Avaliao das propriedades imunognicas e antignicas da P139-512 expressa
em B. subtilis usando soros policlonais .................................................................... 79
4.1.5 Inibio do processo de agregao e adeso dependente de saliva com
anticorpos anti-P139-512 e anti-P139-512d ....................................................................... 84
4.2 Captulo II. Caracterizao imunolgica de formulaes vacinais usando a
protena P139-512 co-administrada com diferentes adjuvantes .................................. 87
4.2.1 Avaliao da imunogenicidade da protena recombinante P139-512 produzida
em B. subtilis administrada com diferentes adjuvantes ........................................... 87
4.2.2 Caracterizao dos soros gerados com a protena P139-512 associada a
adjuvantes quanto a sua avidez pelo antgeno ......................................................... 90
4.2.3 Avaliao da antigenicidade dos fragmentos de P1 usando os soros gerados
com a protena P1 39-512 associada aos adjuvantes ................................................... 92
4.2.4 Ativao da via clssica do complemento pelos soros policlonais gerados
com a protena P139-512 associada aos diferentes adjuvantes .................................. 94
4.2.5 Funcionalidade in vitro dos soros gerados com a protena P139-512 associada
a adjuvantes em bloquear a adeso do S. mutans NG8 SAG ................................ 96
-
4.2.6 Inibio da agregao de S. mutans NG8 in vitro usando os soros
policlonais gerados com os diferentes adjuvantes .................................................. 96
4.2.7 Discusso do Captulo I e II ................................................................................ 98
4.3 Captulo III. Desenvolvimento e caracterizao dos esporos adesivos de B.
subtilis como veculo vacinal de entrega de mucosa ............................................. 104
5 DISCUSSO FINAL ................................................................................................. 147
6 CONCLUSO E PERSPECTIVAS ........................................................................... 151
REFERNCIAS ............................................................................................................ 152
APNDICE A - Induction of neutralizing antibodies in mice immunized with an
amino-terminal polypeptide of Streptococcus mutans P1 protein produced by a
recombinant Bacillus subtilis strain ......................................................................... 173
APNDICE B - Avaliao da influncia das condies de cultivo e mtodo de
purificao na recuperao de esporos de B. subtilis com alto grau de pureza e
rendimento .................................................................................................................. 180
APNDICE C - Smula curricular .............................................................................. 196
-
21
1 INTRODUO
1.1 A crie dental humana
A sade bucal um componente substancial da sade do ser humano.
Entretanto, nos dias atuais diversas doenas orais crnicas, como a crie dental,
esto disseminadas em pases industrializados e em desenvolvimento. A Organizao
Mundial da Sade (OMS) qualifica a crie dental como um dos maiores problemas de
sade pblica, devido alta prevalncia no mundo. Atualmente, a doena acomete
cerca de 90% das crianas em idade escolar e cerca de 100% da populao mundial
adulta (LEHNER, 1992; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2012).
A crie dental uma doena transmissvel, crnica, no letal, caracterizada
pela desmineralizao do esmalte dental em consequncia da produo de cidos por
bactrias fermentadoras presentes no biofilme dental (COTE et al., 2004;
HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998; SMITH, 2012; TAKAHASHI;
NYVAD, 2011; TAUBMAN; NASH, 2006). A doena crie apresenta etiologia
multifatorial com envolvimento da dieta e susceptibilidade do hospedeiro, microbiota e
o tempo (FEJERSKOV, 2004; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009).
Mais de 700 espcies bacterianas esto presentes no biofilme dental e dentre
estas duas espcies pertencentes ao gnero Streptococcus tem sido relacionadas
como agentes etiolgicos primrios da crie dental de superfcie lisa, o S. mutans e o
S. sobrinus, sendo o primeiro mais frequentemente isolado da cavidade oral de
humanos e responsvel por mais de 90% das leses cariosas (DEWHIRST et al.,
2010; HAMADA; SLADE, 1980; LOESCHE, 1986). Alm disso, essa bactria tem sido
associada a doenas infecciosas no orais como a endocardite bacteriana (AJDIC et
al., 2002; HAMADA; SLADE, 1980; LOESCHE, 1986).
Medidas como a administrao tpica e sistmica de flor tiveram forte impacto
sobre a incidncia de crie na populao mundial, contudo a eficcia desses mtodos
no foi suficiente para erradicar a doena (HAJISHENGALLIS; MICHALEK 1999;
KOGA et al., 2002; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009). Desta forma, o
-
22
desenvolvimento de medidas efetivas de sade pblica que controlem o patgeno
mostra-se interessante pelo potencial impacto sobre a sade bucal e geral do
individuo.
1.2 Streptococcus mutans
O S. mutans um coco, firmicute, imvel, catalase negativo, facultativo, capaz
de fermentar diversos acares provenientes da dieta do hospedeiro produzindo
cidos que reduzem o pH da placa dental e promovem a desmineralizao do esmalte
(HAMADA; SLADE, 1980; TAUBMAN; NASH, 2006 ). A infeco por S. mutans pode
ocorrer em dois momentos ao longo da vida do indivduo saudvel, na erupo dos
dentes decduos e na troca para os dentes permanentes, estes perodos so
denominados de janelas de infectividade (CAUFIELD; CUTTER; DASANAYAKE,
1993; SMITH, 2002).
A capacidade de aderir superfcie dental, a habilidade de metabolizar
carboidratos e produzir cidos (acidogenicidade), e a capacidade de suportar
ambientes cidos (aciduricidade) so os principais fatores de virulncias do S. mutans
relacionados com a doena crie (HAMADA; KOGA; OOSHIMA, 1984; MICHALEK et
al., 1981). A adeso fundamental para a patognese da crie dental, pois na
ausncia desta no haver formao do biofilme e desenvolvimento da doena. A
aderncia do S. mutans superfcie dental envolve dois estgios, o primeiro deles,
denominado sacarose-independente e o segundo, sacarose-dependente (HAMADA;
SLADE, 1980; STAAT; LANGLEY; DOYLE, 1980; TAUBMAN; NASH, 2006).
O primeiro estgio de adeso do S. mutans ao dente reversvel e
caracterizado pela interao entre uma protena de superfcie da bactria, o antgeno
I/II ou P1, expresso por todas as linhagens cariognicas de S. mutans e glicoprotenas
presente na pelcula adquirida adsorvida ao dente (BOWEN et al., 1991; CROWLEY
et al., 1999; SMITH, 2002; STAAT; LANGLEY; DOYLE, 1980). O segundo estgio de
adeso irreversvel e associado produo de polissacardeos extracelulares
insolveis (glucanos) e posterior interao desses com as protenas ligadoras de
glucanos (Gbp) e glicosiltransferases (GtfB) presentes na superfcie bacteriana. Este
-
23
estgio permite o acmulo do S. mutans e o desenvolvimento do biofilme na
superfcie dental (BOWEN; KOO, 2011; HAMADA; KOGA, 1984; SHIROZA et al.,
2003).
O S. mutans apresenta diferentes antgenos em sua superfcie incluindo
polissacardeos antignicos, as Gtfs, Gbp, antgeno D, antgeno III, antgeno A,
antgeno C e antgeno B (P1). Entretanto, at momento apenas a protena P1 e a
GbpB tem mostrado potencial como alvos vacinais com resultados favorveis para o
controle da doena (BRADY et al., 2010; KOGA et al., 1995; KURAMITSU, 1993)
1.3 A famlia do Antgeno I/II e a Protena P1 de S. mutans
Na cavidade oral a interao inicial entre bactria e hospedeiro dependente
da associao entre adesinas de superfcie bacteriana e receptores presentes na
pelcula adquirida adsorvida sobre o dente (HAMADA; SLADE, 1980).
Nos estreptococos orais do grupo Viridans, as protenas da famlia I/II
participam na aderncia, colonizao e desenvolvimento da comunidade microbiana.
As protenas da famlia I/II so adesinas ancoradas parede celular bacteriana com
estrutura e antigenicidade relacionadas e apresentam entre 1310 e 1653 resduos de
aminocidos (BRADY et al., 2010). Essas protenas possuem propriedades
multifuncionais como ligao a matriz extracelular, a receptores do hospedeiro, co-
agregao com outras bactrias, interao com glicoprotenas salivares e ativao de
clulas monocticas (JENKINSON; DEMUTH, 1997; JENKINSON; LAMONT, 1997;
MADDOCKS et al., 2011). As protenas da famlia I/II tm sido extensivamente
caracterizadas em numerosas linhagens de S. mutans e S. gordonii e apresentam
uma organizao estrutural global altamente conservada com identidade entre 65 a
70% (DEMUTH et al., 1988, 1990; JENKINSON et al., 1993; KELLY et al., 1990; LEE;
PROGULSKE-FOX; BLEIWEIS, 1988; OGIER et al., 1990; OKAHASHI et al., 1989;
TOKUDA et al., 1991). A importncia dessa famlia de protenas pode ser
demonstrada pela presena de ortlogos em virtualmente todos os estreptococos
orais e a identificao destas tambm em S. pyogenes e S. agalactiae (MA et al.,
1991; ZHANG et al., 2006).
-
24
A protena P1 de S. mutans, tambm referida como Antgeno I/II, Antgeno B
ou PAc, o maior antgeno de superfcie deste microrganismo e pertence a grande
famlia I/II (JENKINSON; LAMONT, 1997; RUSSELL; LEHNER, 1978; KOGA et al.,
1995). A protena P1 em S. mutans est envolvida no complexo processo multifatorial
de aderncia as glicoprotenas salivares adsorvidas ao esmalte dentrio (BOWEN et
al., 1991). Na linhagem UA159 de S. mutans do sorotipo c, a protena P1 com peso
molecular aproximado de 171 kDa codificada pelo gene spaP com 4689 pb (AJDIC
et al., 2002).
A sequncia primria da P1 de S. mutans apresenta seis regies distintas: um
peptdeo sinal predito composto pelos resduos de aminocido 1 at 38, adjacente a
este est a poro N-terminal altamente carregada composta principalmente por uma
regio rica em alanina (regio A, resduos de aminocidos 186-464). A regio C-
terminal inclui um segmento rico em prolina (regio P, resduos de aminocidos 840-
963) que confere uma alta hidrofobicidade a protena, um domnio transmembrnico e
o motivo LPXTG que permite a ancoragem proteica na parede celular bacteriana. Na
regio central, entre as regies A e P, localiza-se um segmento denominado de
varivel (regio V) onde reside a maior variabilidade de sequncia da protena P1
entre as cepas de S. mutans (BRADY et al., 1991, 1998; FISCHETTI; PANCHOLI;
SCHNEEWIND, 1990; KELLY et al., 1989, 1995; MURAKAMI et al., 1997; THON-
THAT; MARRAFFINI; SCHNEEWIND, 2004) (figura 1A).
Anterior cristalografia da protena P1 de S. mutans um conjunto de 11
anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 de S. mutans foram usados como ferramentas
para caracterizar os domnios funcionais da P1 assim como a antigenicidade desta ou
de fragmentos truncados derivados da P1, permitindo a elucidao de algumas das
propriedades mais importantes deste antgeno (BRADY et al., 1991, 1992; CROWLEY
et al., 1993). Em 2002, Troffer-Charlier obtiveram a cristalografia da regio V da
protena P1, permitindo a primeira observao sobre a estrutura 3D desta protena de
S. mutans. Em 2010 e 2011, o restante da estrutura cristalogrfica da protena P1 de
S. mutans foi resolvida e mostrou ser singular. A protena P1 de S. mutans apresenta
uma estrutura fibrilar alongada de aproximadamente 50 nm, onde a regio A forma
-
25
uma -hlice que entrelaa intimamente a regio P em hlice, enquanto a regio V se
dobra formando uma estrutura globular (LARSON et al., 2010, 2011) (figura 1B).
A deleo da protena P1 em linhagens de S. mutans resulta em reduo
drstica da adeso superfcie dental na presena de saliva e de sua hidrofobicidade,
indicando o papel desta protena na colonizao da cavidade oral pelo patgeno
(BRADY et al., 1992; KOGA et al., 1990; LEE et al., 1989). A protena P1 de S.
mutans interage especificamente com o receptor de varredura da imunidade inata, a
glicoprotena 340 (gp340), presente na aglutinina salivar (SAG) (LEITO et al., 2008).
O SAG uma protena oligomrica complexa de massa molecular aproximada de 400
kDa composta pela gp340, imunoglobulina A secretada e uma protena de 80 kDa
(OHO et al., 1998; PRAKOBPHOL et al., 2000). A protena P1 pode interagir com
duas formas da gp340, livre ou ligada superfcie dental, e isso determinar o destino
da bactria na cavidade oral. Quando livre na saliva, a glicoprotena interage com a
protena P1 de superfcie do S. mutans resultando em agregao e provavelmente
eliminao da cavidade oral por meio da deglutio. Esse processo importante na
proteo inata contra a crie dental e tem sido considerado um mecanismo no imune
de eliminao do patgeno. Quando imobilizada, a glicoprotena servir como um
receptor para aderncia do S. mutans ao dente com consequente estabelecimento do
biofilme dental (LOIMARANTA et al., 2005; STENUDD et al., 2001). Entretanto,
apesar de ambos os processos envolverem os mesmos constituintes (protena P1 e
gp340) dados sugerem que esses processos devem envolver domnios distintos das
protenas (BRADY et al., 1992).
Evidncias prvias de que vrios fragmentos derivados da protena P1 eram
capazes de interagir com a gp340 indicavam que essa protena poderia apresentar
mltiplos stios de ligao gp340 adsorvida (BRADY et al., 1992; KELLY et al., 1995;
NAKAI et al., 1993). De fato, a protena P1 de S. mutans apresenta pelo menos dois
stios de ligao SAG, um stio est localizado na regio C-terminal, mais
precisamente entre a regio C1 e C2, e outro stio est localizado dentro do fragmento
A3VP1, que corresponde a ltima regio de repetio A, toda a regio V e a primeira
regio de repetio P. Adicionalmente, foi demonstrado que esses fragmentos no
-
26
competem entre si pelo SAG indicando stios distintos de ligao (LARSON et al.,
2011) (figura 1B).
Figura 1- Representao esquemtica da protena P1 de S. mutans.
(A) Representao da sequncia primria da P1 com seus domnios relevantes. (B) Modelo da estrutura terciria da protena P1 e os stios de ligao aglutinina salivar humana (SAG). PS, peptdeo sinal. Fonte: Modificado de Larson et al. (2010, 2011).
-
27
1.4 Regio A ou Regio de ligao saliva
Na poro amino-terminal da protena P1 do S. mutans est localizada uma
regio rica no aminocido alanina, composta por trs repeties de alanina completas
e uma incompleta formando uma estrutura em -hlice denominada de regio A
(KELLY et al., 1989; LARSON et al., 2010). Por avidez aos componentes salivares, a
regio A tem sido referida como regio de ligao saliva ou SBR (Saliva-Binding
Region) (CROWLEY et al., 1993; HAJISHENGALLIS; KOGA; RUSSELL, 1994;
HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998; NAKAI et al., 1993).
A regio SBR codifica para uma protena de peso molecular aproximado de 42
kDa, a qual permite a interao de S. mutans com componentes salivares,
particularmente a protena gp340, demonstrando sua importncia para aderncia
inicial do patgeno saliva adsorvida ao dente e subsequente desenvolvimento da
crie (CROWLEY et al., 1993; HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998;
KOGA; RUSSELL, 1994; MOISSET et al., 1994; PRAKOBPHOL et al., 2000). Esse
segmento da P1 inibe competitivamente tanto aderncia do S. mutans ao SAG
imobilizado quanto agregao na presena de SAG livre (CROWLEY et al. 1993).
Alm disso, a SBR tem papel fundamental na estrutura tridimensional, na expresso,
estabilidade e na antigenicidade da protena P1 de S. mutans (SEIFERT; BLEIWEIS;
BRADY, 2004).
Ademais, essa regio antignica e abrange tanto eptopos para clulas B
como para T, e anticorpos direcionados para a SBR de S. mutans tem reatividade
cruzada com a protena P1 (Pag) de S. sobrinus (KELLY et al., 1995; LEHNER et al.,
1990; SENPUKU et al., 1996; TAKAHASHI et al., 1991). As sequncias
TELARVQKANADAKAAY (repetida trs vezes, com vrios aminocidos conservados)
e TYEAALKQYEADL (repetida quatro vezes, com vrios aminocidos conservados)
localizadas dentro da regio A foram descritas como potenciais stios de adeso aos
componentes salivares (adesitopos) (BRADY et al., 1992; KELLY et al., 1995;
MOISSET et al., 1994; NAKAI et al., 1993; OKAHASHI et al., 1993; SENPUKU et al.,
1995).
-
28
Anticorpos sricos e da saliva de indivduos naturalmente infectados pelo S.
mutans, porm sem relatos de crie, so capazes de reconhecer fortemente vinte
sete decapeptdeos derivados da regio A da protena P1, indicando o papel protetor
de anticorpos direcionados contra essa regio (MATSUSHITA et al.,1994). Ainda,
estratgias vacinais empregando peptdeos derivados desse segmento da P1 so
capazes de bloquear a agregao e a adeso de S. mutans e reduzir o
desenvolvimento de crie dental em animais (HUANG; HAJISHENGALLIS;
MICHALEK, 2001; MICHALEK; KATZ; CHILDERS, 2001; MUNRO et al., 1993;
TAKAHASHI et al., 1991; TSUHA et al., 2004). Demonstrando que, entre os domnios
funcionais da protena P1, essa regio o maior alvo vacinal para o controle da crie
dental humana.
1.5 Estratgias vacinais contra a crie dental
O conceito de vacinao contra a crie dental foi estabelecido pouco depois da
determinao do papel do S. mutans no desenvolvimento da doena (LEHNER;
CHALLACOMBE; CALDWELL, 1980; LOESCHE, 1986; TAUBMAN; NASH, 2006). As
primeiras estratgias de controle da crie empregaram a imunizao do S. mutans
completo pela via subcutnea e demonstraram resultados encorajadores com reduo
significativa da colonizao oral pelo S. mutans. Entretanto, a observao que esse
tipo de imunizao poderia gerar anticorpos com reatividade cruzada com fibras
cardacas humanas e de coelho, reduziu gradativamente o interesse por essa
abordagem. Consequentemente houve um crescente em estratgias de subunidade
com protenas e peptdeos derivados dos antgenos de superfcie de S. mutans,
principalmente contra a P1 (BOWEN, 1969; KOGA et al., 2002; LEHNER, 1992;
LEHNER; CHALLACOMBE; CALDWELL, 1980; RUSSELL, 1987; WU; RUSSELL,
1990).
Anticorpos contra a protena P1 bloqueiam a adeso rompendo com a
colonizao da cavidade oral pelo S. mutans (MA et al., 1998; MA; LEHNER, 1990).
De fato, a protena P1 tem mostrado ser um alvo promissor na imunidade protetora
natural em humanos e tem sido estudada como um candidato em estudos de
-
29
imunizao ativa de primatas no-humanos e murinos (LEHNER et al., 1981;
MICHALEK; KATZ; CHILDERS, 2001; SHIVAKUMAR; VIDYA; CHANDU, 2009;
SMITH; MATTOS-GRANER, 2008). Dados atuais tem demonstrado que alm da
protena P1 inteira, fragmentos derivados dela so ponteciais alvos em vacinas
acelulares para o controle da crie (BRADY et al., 2010; SHIVAKUMAR; VIDYA;
CHANDU, 2009).
A SBR apresenta um enorme potencial protetor em estratgias contra a crie
dental visto que tanto anticorpos monoclonais como policlonais contra a regio so
fortes inibidores do primeiro estgio de adeso do S. mutans a superfcie dental
(BRADY et al., 1992; HAJISHENGALLIS et al., 1995; HUANG; HAJISHENGALLIS;
MICHALEK, 2001; LEHNER et al., 1981; SCULLY; LEHNER, 1979). A administrao
parenteral da protena SBR capaz de induzir altos ttulos de IgG e inibir a
colonizao da cavidade oral de camundongos pelo S. mutans (TAKAHASHI et al.,
1991; YU et al., 1997). Quando administrada por via de mucosas, como a via oral ou
nasal, a SBR induz respostas sistmicas e de mucosa potentes em modelos murinos
desde que esteja fusionada a um adjuvante como a CT, LT-I, LT-II ou seus variantes
(HAJISHENGALLIS et al., 1995, 1996, 2001). Contudo, em alguns casos uma dose
reforo foi importante para induo de uma resposta imunolgica pronunciada
(RUSSELL; WU, 1991).
As estratgias usando a regio SBR da protena P1 como alvo vacinal foram
principalmente baseadas na protena recombinante expressa em E. coli, normalmente
fusionada protenas de altos pesos moleculares como transportadora, ou mesmo
secretada no periplasma bacteriano, a fim de reduzir a degradao proteoltica ou
melhorar o processo de purificao e a imunogenicidade do antgeno (CROWLEY et
al., 1993; HAJISHENGALLIS et al., 1995; MATSUMOTO-NAKANO et al., 2008;
MUNRO et al., 1993; OKAHASHI et al. 1993; TOIDA et al., 1997). Baixo custo e alto
rendimento so as duas maiores razes para a grande disseminao do uso de cepas
de E. coli para a expresso de protenas heterlogas. Contudo, muitos problemas
esto associados expresso de protenas recombinantes em E. coli, como baixo
rendimento, gerao de protenas insolveis, contaminao por endotoxinas e a perda
-
30
de importantes determinantes imunolgicos nativos (HARWOOD, 1992; SCHUMANN,
2007).
Tanto a resposta humoral sistmica, com o extravasamento de IgG pelo fludo
crevicular, como a resposta de mucosa, na forma de IgA salivar, contra a protena P1
de S. mutans tm sido associadas proteo contra a crie dental (BRADY, 2005;
BRADY et al., 2010; MICHALEK; KATZ; CHILDERS, 2001; TENOVUO; LEHTONEN;
AALTONEN, 1990). Contudo, estratgias que promovam a induo de IgA secretor
especfico mostram-se mais promissoras visto que essa imunoglobulina encontra-se
em maior concentrao na saliva e na cavidade oral (LEHNER, 1992; MARCOTTE;
LAVOIE, 1998).
O uso de protenas solveis ou peptdeos, principalmente pela via parental, no
so mtodos eficientes para induzir IgA nas mucosas ou altos ttulos de IgG. Para
isso, novas vias de imunizao enteral como oral, nasal, tonsilar, nas glndulas
salivares e outras foram exploradas, assim como a associao com potentes
adjuvantes de mucosa, como a flagelina e as toxinas termo-lbeis (KOGA, 2002;
SHIVAKUMAR;VIDYA; CHANDU, 2009).
A flagelina um agonista do Toll-like 5 (TLR5) que um receptor de padres
moleculares associados ao patgeno (HAYASHI et al., 2001). Apresenta um potente
efeito adjuvante capaz de ativar tanto a resposta humoral quanto sistmica aps
administrao enteral ou parenteral (BRAGA et al., 2009, 2010; HONKO et al., 2006;
SHI et al., 2012). Shi et al. (2012) demonstraram que a presena da protena FliC de
Salmonella, como adjuvante, em uma vacina de DNA codificando a poro N-terminal
da protena P1 administrada por via nasal aumentou respostas imunolgicas
sistmicas e de mucosa. Como resultado foi observado uma reduo da colonizao
pelo S. mutans e dos ndices de crie em ratos, sugerindo o potencial desta protena
como adjuvante para formulaes vacinais contra a crie dental.
A toxina termolbil de E. coli ETEC (LT) um dos mais efetivos adjuvantes de
mucosa conhecidos, contudo a toxicidade inerente da LT tem impedido seu uso em
humanos. Diferentes metodologias j foram descritas para subverter este problema,
como o uso de protenas mutantes detoxificadas at o uso das subunidades no
txicas desta protena (FREYTAG; CLEMENTS, 2005; HOLMGREN et al., 2005).
-
31
Abordagens vacinais empregando a SBR como antgeno alvo associado a diferentes
variantes de LT como adjuvante de mucosa foram capazes de induzir tanto respostas
sistmicas quanto de mucosa e, em alguns casos, respostas persistentes (CONNELL,
2007; HAJISHENGALLIS et al., 2005; MARTIN et al., 2000; ZHAO; ZHAO; RUSSELL,
2011).
Uma alternativa eficaz para o controle de doenas infecciosas o uso de
vetores bacterianos vivos de entrega. Esse tipo de abordagem apresenta diversas
vantagens como o baixo custo, no ser invasivo, de fcil aplicao e potencial de uso
em regies geogrficas afastadas (BOLTON et al., 2012; MESTECKY, 1987; RYAN;
DALY; MILLS, 2001). Os vetores vivos bacterianos so baseados em patgenos
atenuados, tais como Salmonella e Listeria (DARJI et al., 2000; LOEFFLER et al.,
2006). As poucas estratgias vacinas anti-crie usando veculos vacinais vivos
carregando antgenos derivados da protena P1 foram desenvolvidos com linhagens
de S. enterica Typhimurium (HAJISHENGALLIS; MICHALEK, 1999;
HAJISHENGALLIS; MICHALEK; RUSSELL, 1996; HUANG; HAJISHENGALLIS;
MICHALEK, 2001; SALAM et al., 2006). Linhagens recombinantes de S. enterica
foram construdas para expressar in vivo a SBR ou a SBR fusionada CTB. A
administrao nasal e oral de ambas as linhagens foram capazes de induzir IgA
especfico na saliva e IgG no soro dos animais imunizados, entretanto para aumentar
os nveis de anticorpos foi necessrio uma dose reforo ou a co-administrao de um
adjuvante (CT). Apesar dos resultados promissores, o potencial risco de reverso
para o fentipo virulento deste tipo de abordagem tem reduzido o interesse por seu
uso no desenvolvimento de formulaes de vacina, em especial para seres humanos
(DARJI et al., 2000; LOEFFLER et al., 2006).
At o momento poucos ensaios clnicos em pequena escala em humanos
foram realizados para testar a eficcia de formulaes vacinais anti-crie. Muitos
dados conflitantes principalmente correlacionando negativamente a presena de IgA
na saliva e a prevalncia de crie dental, assim como a observao de que muitas
dessas estratgias induzem respostas imunolgicas inadequadas em humanos,
inviabilizaram a continuao dos ensaios e a disponibilizao de um produto no
mercado (RUSSELL et al., 2004; SHIVAKUMAR; VIDYA; CHANDU, 2009).
-
32
Atualmente, est disponvel no mercado internacional um produto para imunizao
passiva baseada em um anticorpo monoclonal produzido em plantas transgnicas do
Tabaco denominada de CaroRx (Planet Biotechnology, Hyaward, California, USA)
que est em fase de aprovao pelo FDA (Food Drug Administration) nos EUA e j
est licenciado na Europa. No entanto, a efetividade do tratamento dependente de
inmeras aplicaes profissionais do produto e o efeito apresenta um tempo limitado,
cerca de um ano (MA et al., 1990, 1994; MA; LEHNER, 1990; MA; SMITH; LEHNER,
1987). Desta forma, o desenvolvimento de estratgias de imunizao ativa que
permitam o controle efetivo da crie dental em humanos se faz necessria.
1.6 Bacillus subtilis e o desenvolvimento de vacinas
O B. subtilis uma bacilo gram positivo, ubiquitrio, produtor de endosporos,
que tem sido explorado como sistema alternativo para expresso de protenas
heterlogas com aplicaes biotecnolgicas e mais recentemente como veculo
vacinal vivo tanto na forma de esporos como na forma de clulas vegetativas
(HARWOOD, 1992; FERREIRA; FERREIRA; SCHUMANN, 2005; PACCEZ et al.,
2006, 2007; PAULITZ; BELANGER, 2001). Alm disso, os esporos de B. subtilis tm
sido usados como probiticos para uso em humanos e animais (DARIENZO et al.,
2006; FOLIGNE et al., 2012; GUO et al. 2006; GREEN et al., 1999;
PERMPOONPATTANA et al., 2012; SHIVARAMAIAH et al., 2011).
O enorme potencial aplicado do B. subtilis devido a muitas caractersticas
peculiares, como: i) a formao de esporos, a forma de vida mais resiliente do
planeta, que facilita sua estocagem e transporte; ii) ausncia de membrana externa e,
portanto, de contaminao com lipopolissacardeos (LPS); iii) um grande
conhecimento de sua gentica e fisiologia, comparvel ao conhecimento de E. coli,
sendo considerado o modelo de estudo gram positivo; iv) diferentes sistemas de
expresso e purificao disponveis, v) sua segurana para uso em humanos, com o
status GRAS (Generally regard as safe) conferido pelo FDA americano (MEIMA; VAN
DIJL; BRON, 2004; WESTERS; WESTERS; QUAX, 2004).
-
33
Como sistema de expresso e purificao de protenas heterlogas, o B.
subtilis uma alternativa em potencial aos modelos procariotos convencionais
baseados em E. coli, isto porque capaz de produzir molculas com atividade
biolgica preservada e em grandes quantidades, sem a contaminao por
endotoxinas (FERREIRA; FERREIRA; SCHUMANN, 2005; HARWOOD, 1992;
MEIMA; PAULITZ; BELANGER, 2001; VAN DIJL; BRON, 2004; WESTERS;
WESTERS; QUAX, 2004). Inmeros vetores de expresso em B. subtilis esto
disponveis, estes empregam os mais diferentes promotores e direcionamento das
protenas heterlogas para compartimentos diferentes, intracelular ou extracelular
(KAKESHITA et al., 2011; NGUYEN et al., 2005, 2006; NGUYEN; SCHUMANN,
2006;PACCEZ et al., 2007; PHAN; TROESCHEL et al., 2012; YANO et al., 2011).
Ao longo das ltimas dcadas a enorme capacidade de expresso e
purificao de protenas recombinantes usando linhagens de B. subtilis tem sido bem
explorada. Excelentes resultados foram observados principalmente quando protenas
de bactrias gram positivas foram expressas, como o caso da estreptoquinase de S.
equisimis que apresentou uma grande estabilidade quando expressa em B. subtilis
(HARWOOD, 1992; SCHUMANN, 2007; TERPE, 2006; WONG; YE; NATHOO, 1994).
Excelentes resultados tambm foram observados com protenas de interesse mdico,
como a interleucina humana 3 que foi purificada com sucesso a partir de B. subtilis e
com um timo rendimento, por volta de 100 mg/L, e o hormnio de crescimento
humano, por volta de 70 mg/L (OZDAMAR et al., 2009; WESTERS et al., 2005).
Alm da expresso de protenas de interesse mdico os sistemas de
expresso de B. subtilis foram utilizados para a produo de antgenos vacinais.
Dentre os antgenos vacinais produzidos em B. subtilis destaca-se o antgeno PA de
B. anthracis, a subunidade S4 de Bordetella pertussis, a protena P1 de Neisseria
meningitidis, as protenas Omp2 e Hsp60 de Chlamydia pneumoniae, a protena
HpaG de Xanthomonas oryzae, e mais recentemente a protena L1 do capsdeo do
vrus do papiloma humano. Essas protenas recombinantes foram produzidas em
grandes quantidades, com estabilidade e promoveram a ativao de potentes
respostas imunolgicas humorais e celulares (AIRAKSINEN et al., 2003; BAEK et al.,
-
34
2012; HIMANEN et al., 1990; IDNPN-HEIKKIL et al., 1996; IVINS; WELKOS,
1986; IVINS et al., 1990; LIN et al., 2001; MUTTILAINEN et al., 1995).
Como veculo vacinal, o B. subtilis uma alternativa segura, barata, no
invasiva (sem uso de agulha) e com aplicao sobre doenas infecciosas,
especialmente as causadas por patgenos que colonizam ou invadem o epitlio da
mucosa. O uso do B. subtilis como veculo vacinal de mucosa relativamente recente
e pode ser divido em duas abordagens de sucesso: i) expresso do antgeno na
superfcie dos esporos fusionado as protenas de capa ou ii) dentro da clula
vegetativa (ISTICATO et al., 2001; PACCEZ et al., 2006, 2007).
Na primeira abordagem, a protena heterloga expressa no esporo em fuso
com uma protena exposta em sua superfcie, como a CotB, CotC ou CotG,
frequentemente denominada de estratgia OUT (fora) (DUC et al., 2003; ISTICATO et
al., 2001; LEE et al., 2010a, b; MAURIELLO et al., 2004; NING et al., 2011;
PERMPOONPATTANA et al., 2011; POTOT et al., 2010). At o momento, foi
fusionada a capa dos esporos apenas antgenos com interesse vacinal, para os quais
eram esperadas respostas imunolgicas protetoras. Essa estratgia permite uma
melhor apresentao do antgeno carreado nos stios aferentes do tecido linfide
associado mucosa (MALT), induzindo respostas imunes adaptativas, tais como
respostas de anticorpos especficos de mucosa (IgA) e sistmicos (IgG) (CERAGIOLI
et al., 2009; HOANG et al., 2008).
Na segunda abordagem utilizada com sucesso, a lgica distinta e emprega
plasmdeos, no qual o gene recombinante expresso sob o controle de promotores
ativos apenas na fase de clula vegetativa, imediatamente aps a germinao dos
esporos, denominada de estratgia IN (dentro) (PACCEZ et al., 2006, 2007). Esta
abordagem de entrega de antgeno baseia-se no fato de que os esporos de B. subtilis
germinam durante o trnsito atravs do trato gastrointestinal e depois da captura
pelas clulas apresentadoras de antgeno (DUC et al., 2004; DUC; HOANG;
CUTTING, 2003; HOA et al., 2001). Tais esporos recombinantes demonstraram
induzir anticorpos especficos na mucosa (IgA fecal) e no soro (IgG) aps
administrao pelas vias de mucosa (nasal ou oral) (FERREIRA; FERREIRA;
SCHUMANN, 2005; LUIZ et al., 2008; PACCEZ et al., 2006, 2007 ).
-
35
Infelizmente, estratgias empregando os esporos ou clulas vegetativas de B.
subtilis como carreadores vacinais demonstraram uma baixa imunogenicidade aos
antgenos carregados (FERREIRA; FERREIRA; SCHUMANN, 2005). De fato, trs
fatores podem contribuir para a reduo da imunogenicidade do B. subtilis,
especialmente aps a entrega por via oral. O primeiro fator pode ser atribudo
entrega de uma pequena quantidade de antgeno vacinal ao sistema imunolgico e
consequente falha na ativao deste. Um segundo fator, a exposio natural e
frequente aos esporos presentes nos alimentos ingeridos e gua podendo levar a
tolerncia imunolgica e, em consequncia o desenvolvimento de mecanismos
imunossupressores que reduzem ou bloqueiam a induo de respostas imunolgicas
mais fortes s protenas de esporos e aos antgenos associados (CERAGIOLI et al.,
2009; DUC et al., 2004). Por fim, outro fator que certamente afeta a imunogenicidade
de esporos de B. subtilis, e nunca antes avaliado, o rpido trnsito atravs do trato
gastrointestinal aps administrao oral. Apesar da evidncia de que os esporos de B.
subtilis germinam durante o trnsito atravs do intestino de mamferos, B. subtilis
administrados oralmente, sejam na forma clulas vegetativas ou de esporos, so
totalmente eliminados do intestino dos camundongos em menos de 72 horas, o que
reduz a possibilidade de interao produtiva com o tecido linfide associado ao trato
gastrointestinal (GALT) e com as clulas M presentes nas placas de Peyer (DUC;
HOANG; CUTTING, 2003; DUC et al., 2004). Desta forma, abordagens que permitam
o aumento do contato e o direcionamento dos esporos para o GALT podem resultar
em potencializao da resposta imunolgica contra o antgeno de interesse.
A expresso de protenas heterlogas na superfcie dos microrganismos
uma estratgia com aplicaes em vrias reas do conhecimento como:
microbiologia, biotecnologia e vacinologia. Os veculos vivos de entrega apresentam
vantagens para a induo de respostas de anticorpos antgeno-especfica quando
expressam protenas heterlogas em sua superfcie, principalmente no caso de
bactrias no patognicas, como o caso do B. subtilis (KLEMM; SCHEMBRI, 2000;
SAMUELSON et al., 2002). Bactrias comensais no invasivas, em geral so
ineficientes em gerar fortes respostas de anticorpos, contudo tem sido demonstrado
que esses veculos vacinais podem ser melhorados pela co-expresso de adesinas
-
36
que iro auxiliar no direcionamento para o epitlio da mucosa (CANO et al., 1999;
LILJEQVIST et al., 1999).
Adesinas presentes na superfcie das bactrias permitem um ntimo contato
com as clulas eucariticas e so importantes na colonizao do hospedeiro por
microrganismos (NAVARRE; SCHNEEWIND, 1999). A especificidade da adesina
bacteriana por um determinado receptor permitir um direcionamento deste para
stios especficos, refletindo em tropismo por um tecido (KLEMM; SCHEMBRI, 2000).
A protena SlpA de Lactobacillus brevis ATCC8287, assim como a invasina
(InvA) de Yersinia pseudotuberculosis, so protenas de superfcie com papel de
adesina que permite a colonizao de superfcies do hospedeiro (CLARK; HIRST;
HYNONE et al., 2004; JEPSON, 1998). A SlpA de L. brevis o constituinte da
camada S deste microrganismo, e uma protena altamente bsica com massa
molecular variando entre 38 55 kDa capaz de interagir com as protenas da matriz
extracelular como fibronectina, laminina e colgeno (VIDGRN et al., 1992; YASUI;
YOD; KAMIYA, 1995).
A protena invasina de Y. pseudotuberculosis permite a adeso e a
subsequente internalizao da bactria por meio da ligao ao receptor 1- integrina
localizado na superfcie das clulas M das placas de Peyer (CLARK; HIRST;
JEPSON, 1998; LePORE, 2008). A interao da invasina com o receptor 1-
integrina induz uma reorganizao do citoesqueleto da clula que forma pseudpodes
que englobam e internalizam a bactria (YOUNG; FALKOW; SCHOOLNIK, 1992). A
poro C-terminal desta protena, mais precisamente os ltimos 197 resduos de
aminocidos, so suficientes para a ligao da bactria as clulas epiteliais, mas no
para sua internalizao (LEONG; FOURNIER; ISBERG, 1990).
A baixa imunogenicidade do antgeno carregado aps o uso de bactrias
lcticas como veculos vacinais vivos, incapazes de colonizar o trato gastrointestinal
de mamferos, induziu pesquisadores a empregar uma estratgia inovadora. Nessa
abordagem a bactria foi geneticamente modificada para expressar adesinas
bacterianas com capacidade de reconhecer receptores de clulas do hospedeiro,
permitindo o direcionamento e aumentando o contato com clulas intestinais.
Linhagens de Lactococcus lactis recombinantes expressando a protena A de ligao
-
37
a fibronectina de Staphylococcus aureus ou a internalina A de Listeria monocytogenes
mostraram uma capacidade aumentada para se ligar e invadir clulas de mamferos e
foram mais eficientes como veculo de entrega para vacinas de DNA (GUIMARES et
al., 2005, 2006; INNOCENTIN et al., 2009). Adicionalmente, a expresso da poro
N-terminal da SlpA de L. brevis em L. lactis permitiu que esta bactria, antes no
adesiva, aderisse a fibronectina e as clulas intestinais humanas in vitro (AVLL-
JSKELINEN; LINDHOLM; PALVA, 2003).
Uma estratgia similar foi empregada com sucesso usando uma E. coli no
patognica expressando a invasina de Y. pseudotuberculosis. A linhagem
recombinante de E. coli foi capaz de invadir clulas de mamferos e entregar
plasmdeos e protenas produzindo efeitos teraputicos em tumores (CRITCHLEY et
al., 2004; CRITCHLEY-THORNER; STAGG; VASSAUX, 2006; GRILLOT-COURVALIN
et al., 1998). Apesar do potencial deste tipo de abordagem, ela nunca foi aplicada a
outras bactrias gram positivas no invasivas, tais como o B. subtilis.
1.7 Vacinas de mucosa baseadas em B. subtilis
A via de imunizao tem efeito significativo sobre a natureza da resposta
imunolgica. Nas ltimas dcadas tem havido um crescente interesse em vacinas de
administrao mucosa, visto que estas so alternativas seguras, no precisam de
agulhas o que resulta em maior aceitabilidade pela populao e no necessitam de
profissionais treinados para aplicao. Alm disso, vacinas de mucosa so capazes
de estimular tanto respostas imunolgicas de mucosa (IgA) como sistmicas (IgG),
sendo efetivas contra um grande nmero de patgenos (BELYAKOV; AHLERS,
2009; NEUTRA; KOZLOWSKI, 2006). Entretanto, h a necessidade do uso de
veculos vacinais com estabilidade trmica e resistncia aos estresses induzidos
quando da passagem pelas vias de mucosa, esse o caso dos esporos de B. subtilis.
Dentre as vias de mucosa utilizadas com o B. subtilis como veculo vacinal,
podemos destacar as vias oral, nasal e, mais recentemente, a sublingual (AMUGUNI;
TZIPORI, 2012; LUIZ et al., 2008; PACCEZ et al., 2007). As primeiras estratgias
usando B. subtilis como veculo vacinal foram baseadas na administrao oral das
-
38
linhagens vacinais contra uma variedade de patgenos humanos e de animais.
Contudo, apesar dos resultados iniciais promissores desta via de administrao, o
pouco conhecimento do processamento do antgeno, a necessidade de usar uma
grande quantidade de antgeno e altos nmeros de doses, associados a muitos
insucessos induziram a busca de outras vias de administrao (CUTTING et al., 2009;
FU et al., 2008; HU et al., 2011; LUIZ et al., 2008; NING et al., 2011; PACCEZ et al.,
2007; PERMPOONPATTANA et al., 2011).
A via nasal tem demonstrado potencial aplicao visto que capaz de induzir
respostas sistmicas e de mucosa superiores a administrao oral, com nmero de
doses menores e concentrao menor do antgeno. Abordagens vacinais baseadas
em B. subtilis, principalmente aquelas empregando esporos recombinantes
expressando o antgeno na superfcie, usando essa via produziram resultados
similares e, em muitos casos, superiores aos obtidos com a imunizao oral, com
produo de altos ttulos de IgA nas mucosas e de IgG srico, permitindo a reduo
da quantidade de esporos usados e melhora do protocolo vacinal (DUC et al., 2007;
LEE et al., 2010; LEE et al., 2010b). Contudo, a segurana desta via tem sido
criticada desde que alguns estudos demonstraram que antgenos inalados ou
adjuvantes co-administrados podem percorrer um caminho retrgrado pelo bulbo
olfativo e causar efeitos colaterais (ARMSTRONG et al., 2005).
Mais recentemente grupos tem explorado a via sublingual como alternativa a
via oral e, possivelmente, para via nasal. Na via sublingual os antgenos no sofrem
com a degradao por enzimas, alm disso, o antgeno rapidamente absorvido. De
fato, trabalhos usando esporos de B. subtilis tem demonstrado a capacidade desta via
de induzir anticorpos sistmicos e de mucosa protetores contra a toxina tetnica em
camundongos e leites (AMUGUNI et al., 2011, 2012). Contudo, estudos mais
aprofundados so necessrios para caracterizar melhor a captura, processamento e
gerao de respostas contra os antgenos carreados pelo B. subtilis usando essa via
de administrao.
-
39
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este projeto teve como objetivo desenvolver e caracterizar diferentes
estratgias vacinais contra a crie dental humana causada pelo S. mutans usando
linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis. As linhagens de B. subtilis foram
modificadas para expressar como antgeno vacinal um fragmento (P139-512) da
protena P1, a maior protena de superfcie de S. mutans, claramente envolvida na
adeso do patgeno a superfcie dental.
2.2 Objetivos especficos
O trabalho de tese envolveu trs objetivos especficos, cada um deles
representando uma etapa das pesquisas realizadas. (i) Caracterizao das
propriedades antignicas e imunognicas de um novo fragmento derivado da protena
P1 de S. mutans, a protena P139-512, expresso em linhagem recombinante de B.
subtilis; (ii) Uso da protena P139-512 como alvo em vacinas de subunidade em
associao com diferentes adjuvantes; (iii) Construo e caracterizao de um novo
sistema de entrega baseado em esporos de B. subtilis com capacidade interagir com
clulas intestinais e avaliao do potencial vacinal contra o S. mutans.
-
40
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Linhagens e vetores bacterianos, condies de cultivo
As linhagens e os vetores bacterianos utilizados nesta tese esto descritos nas
Quadros 1 e 2. As condies de cultivo foram especficas para cada linhagem, sendo
que as cepas de S. mutans foram cultivadas em meio THY ou BHY a 37 C com 5%
de CO2. A linhagem de S. mutans PC3370 foi cultivada em meio contendo tetraciclina
(15 g/ml) e a linhagem PC3370C em meio com tetraciclina (15 g/ml) e canamicina
(500 g/ml). As linhagens de B. subtilis e de E. coli foram mantidas em meio Luria
Bertani (LB) com antibiticos especficos a 37 C em aerobiose.
3.2 Competncia e transformao em E. coli
A competncia qumica e transformao trmica de E. coli foi realizada de
acordo com protocolos descritos por Sambrook et al. (2001). Para o preparado de
competncia uma unidade formadora de colnia (ufc) de E. coli DH5, previamente
isolada em meio LB contendo MgCl2 (25 mM), foi inoculada em 5 ml de LB e incubada
a 37 oC, 200 rpm por 16 horas. Depois, 500 l da cultura foi inoculada em 50 ml de LB
e incubada a 37 oC at atingir a D.O600nm de 0.5 0.6. Em seguida, a cultura foi
mantida em gelo por 15 minutos e depois centrifugada (5.000 rpm, 10 minutos, 4oC).
As clulas foram ressuspendidas em 16 ml de RF1 (100 mM RbCl, 50 mM
MnCl2.4H2O, 30 mM KOAc, 10 mM CaCl2.2H2O, 15% (peso/vol), pH ajustado para 5.8
usando 0.2 M de cido actico) e mantidas em gelo por 60 minutos, em seguida foram
centrifugadas (5.000 rpm, 10 minutos, 4 oC). Logo aps, a amostra foi ressuspendida
em 4 ml de RF2 (10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2.2H2O, 15% (peso/vol), pH
ajustado para 6.8 usando 1 M de NaOH) e mantida em gelo por 15 minutos. Amostras
de 200 l foram imediatamente congeladas usando nitrognio lquido e depois
estocadas a 80 oC.
-
41
Para a transformao foi usada uma amostra de clulas quimiocompetentes
(200 l) para cada vetor a ser transformado. As clulas foram incubadas em gelo por
10 minutos e a mistura de ligao foi adicionada. O conjunto foi incubado em gelo por
35 minutos e colocado em banho-maria a 42 C por 2 minutos. Imediatamente, a
mistura foi incubada em gelo por 10 minutos e foi adicionado 800 l de SOC (2%
triptona (peso/vol), 0.5% extrato de levedura (peso/vol), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10
mM MgCl2, 20 mM glicose), para cada tubo de transformao. Novamente, a amostra
foi incubada por 90 minutos a 37 C com agitao leve (100 rpm). A suspenso foi
semeada em placas de LB contendo os antibiticos de escolha e mantida a 37 C por
uma noite, para obteno das colnias transformantes.
3.3 Competncia e transformao em B. subtilis
As linhagens de B. subtilis preparadas para transformao seguiu protocolo
descrito por Anagnostopoulos e Spizizen (1961). O B. subtilis torna-se competente
aps cultivo em meio HS (20% de glicose, 0.1% de L-triptofano, 10% de extrato de
levedura, 2% de casaminocidos, 8% de arginina e 0.4% de histidina) at o incio da
fase estacionria (D.O600nm igual ou superior 3). Nessa D.O foi adicionado 1 ml de
glicerol 80% para cada 10 ml de cultura competente e esta foi separada em amostras
(1 ml) armazenadas a 80 C at sua utilizao.
Para a transformao de B. subtilis uma amostra de clula competente foi
inoculada em 10 ml de meio LS (S-Base Mg2+ 1X; 20% glicose; 0.1% L-triptofano; 2%
casaminocidos; 2% extrato de levedura; 500 mM MgCl2). A cultura foi incubada por 2
horas a 30 C, sob agitao constante, aps este perodo foi adicionado 100 l de
EGTA (etilenoglicol tetractico). Novamente, a cultura foi incubada a 30 C por 5
minutos, uma amostra de 1 ml foi retirada e o vetor de interesse foi adicionado.
Seguiu-se nova incubao a 37 C por 2 horas. Ao final, a cultura foi centrifugada, o
precipitado ressuspendido em 200 l de meio LS, semeado em placas LB contendo o
antibitico de escolha e incubado por uma noite 37 C.
-
42
Quadro 1 - Linhagens empregadas e construdas neste trabalho.
Linhagens Caractersticas Referncia
S. mutans
UA159 Linhagem selvagem do sorotipo c; genoma sequenciado AJDIC et al.(2002)
NG8 Linhagem selvagem do sorotipo c, ErmS, Spec
S, Kan
S LI et al.(2001)
PC3370 S. mutans NG8 spaP::tetR
CROWLEY et al. (1999)
PC3370C PC3370 contendo o vetor pMAD (P1 completa); Tet
R;
KanR
BRADY et al. (1998)
E. coli
DH5 F
-80dlacZM15 (lacZYA-argF)U169 deoR, recA1
endA1 hsdR17(rk- mk
+ phoA supE44
- thi-1 gyrA96 relA1
Invitrogen
CG14 M15(pREP4) albergando o vetor pCG14 BRADY et al. (1998)
B. subtilis
1012 leuA8 metB5 trpC2 hsrdRM1amyE::neo. WEHRL; NIEDERWEIS; SCHUMANN, (2000)
DV701 1012 transformada com o vetor pLDV701 (P139512 sobre o controle do promotor Pgrac).
Este trabalho
LDV700 1012 transformado com pHCMC03. Este trabalho
LDV702 1012 transformada com vetor pLDV702. Este trabalho
BsSlpA 1012 expressando o gene slpA de L. brevis (thrC::slpA-
SpecR)
Este trabalho
LDV703 BsSlpA transformada com o vetor pLDV702. Este trabalho
BsInvA 1012 expressando a protena InvA (invA) de Y. pseudotuberculosis (thrC::invA-Spec
R).
Este trabalho
LDV704 BsInvA transformado com pLDV702. Este trabalho
BsInv600 1012 expressando a regio ligadora da protena InvA (inv600) de Y. pseudotuberculosis (thrC::inv600-Spec
R).
Este trabalho
LDV705 BsInv600 transformado com pLDV702. Este trabalho
-
43
Quadro 2 - Vetores empregados e construdos neste trabalho.
Plasmidios Caractersticas Referncia
pGEM-T-Easy
Ampr; operon lac;T- end
Promega
pCG14 Derivado do pQE-30 clonado com o gene spaP que codifica
para os aminocidos 39 a 1561 da protena P1 BRADY et al. (1992)
pGP1N
pGEM-T- Easy clonado com a sequncia que codifica para a regio N-terminal da protena P1 de S. mutans UA159 (P139-512)
Este trabalho
pDG1731 Vetor para integrao ectpica no gene thrC; AmpR, Spec
R
GUEROUT-FLEURY; FRANDSEN; STRAGIER, (1996)
pDGcotB pDG1731 contendo o fragmento que codifica para a regio N-terminal do gene cotB e seu promotor proveniente da linhagem 1012 de B. subtilis
Este trabalho
pSlpA pDGcotB clonado com o gene slpA de L. brevis Este trabalho
pInvA pDGcotB clonado com o gene invA de Y. pseudotuberculosis
Este trabalho
pInv600 pDGcotB clonado com a regio ligadora do gene invA Este trabalho
pHT08 AmpR; Cm
R; Promotor induzvel por IPTG (Pgrac); His-tag NGUYEN; PHAN;
SCHUMANN, (2007)
pLDV701 Vetor pHT08 clonado com o gene spaP1N (codifica para a
protena P139-512) Este trabalho
pHCMC03 PgsiB (Promotor induzvel por estresse), ApR; Cm
R PHAN; NGUYEN;
SCHUMANN (2006)
pLDV702 Vetor pHCMC03 clonado com o gene spaP1N (codifica
para a protena P139-512) Este trabalho
-
44
3.4 Lise de clulas vegetativas de B. subtilis
Amostras de clulas de B. subtilis foram vigorosamente ressuspendidos em
tampo lise (30% sacarose, 50 mM Tris-HCl 7.2, 800 g/ml de lisozima) e incubadas
a 37 C por 15 minutos. Foi adicionado 10 l de SDS (dodecil sulfato de sdio)
seguido por homogeneizao vigorosa. As amostras lisadas foram armazenadas a
80 C at o momento do uso.
3.5 Extrao de protenas totais de S. mutans
Culturas de S. mutans crescidas por 16 horas em meio BHY ou THY foram
centrifugadas (7.000 rpm, 5 minutos). As clulas foram lavadas duas vezes
vigorosamente com gua destilada estril. Em seguida, o material foi ressuspendido
em 1/3 do volume inicial em gua destilada e submetido a trs ciclos trmicos (30
minutos -80 C, seguido por 30 minutos 37 C). A mistura foi homogeneizada
vigorosamente com 800 g/ml de lisozima e incubado por 1 hora a 37 C. Por fim, foi
adicionado 1/10 volume de SDS a 10% e a mistura foi ressuspendida vigorosamente.
As amostras lisadas foram armazenadas a 80 C at o momento do uso.
3.6 Induo e purificao da protena CG14 a partir de E. coli
A induo e purificao da protena P1 completa (CG14) de S. mutans NG8 em
sistema pQE-30 de E. coli seguiu protocolo descrito por Brady et al., 1998.
3.7 Produo de anticorpos anti-P1 de S. mutans
A protena purificada P1 (CG14) foi inoculada por via subcutnea em
camundongos Balb/c. O protocolo de imunizao foi o de cinco doses com intervalo
de 15 dias e a coleta de soro foi feita 15 dias aps a ltima dose. Foi administrado por
-
45
dose 10 g de protena/animal. A primeira dose foi administrada com adjuvante
completo de Freund e as demais com adjuvante incompleto de Freund. As amostras
de soro foram preparadas para uso e estocadas a 20 C at uso.
3.8 Construo do vetor de clonagem pGP1N
3.8.1 Isolamento de DNA genmico de S. mutans
Uma amostra de S.mutans UA159 crescido (2 ml) por uma noite a 37 C foi
centrifugada (7.000 rpm, 5 minutos). Ao precipitado foi adicionado 400 l de tampo
de lise (50 mM EDTA, 0.5% -mercaptaetanol, 3% SDS, 50 mM Tris HCl pH 7.2). O
precipitado foi ressuspendido vigorosamente e depois incubado por uma hora a 65 oC
com agitao a cada 15 minutos. Aps a incubao, as amostras lisadas foram
tratadas com igual volume de fenol:clorofrmio (1:1) e submetidas centrifugao. A
fase aquosa (superior) foi retirada e transferida para outro tubo, ao qual foi adicionado
igual volume de clorofrmio:alcol isoamlico (24:1). Novamente a amostra foi
centrifugada e a fase superior removida e transferida para outro tubo. Em seguida, foi
adicionado 200 l de isopropanol absoluto e 40 l de acetato de sdio 3 M (NAOAc),
as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi
lavado com 500 l de etanol 70% e centrifugado (5 minutos, 10.000 rpm), o
sobrenadante foi descartado e o precipitado seco foi ressuspendido em 30 l de gua
milliQ estril contendo 50 g/ml de RNAse. As amostras foram analisadas em gel de
agarose 0,8% e estocadas a -20 C.
3.8.2 Amplificao do gene spaP1N por reao em cadeia da polimerase (PCR) e
clonagem no vetor pGEM-T-easy
A regio do gene spaP que codifica para sua poro N-terminal sem o peptdeo
sinal e uma pequena poro da regio V da protena P1, foi denominada nesta tese
de spaP1N e foi amplificada usando iniciadores especficos desenhados (Quadro 3).
Para as reaes de amplificao foram empregadas 100 ng de DNA genmico da
-
46
linhagem UA159 de S. mutans, 1.5 pmoles de cada iniciador, 1.6 mM de dNTP, 4 mM
de MgCl2, 1X tampo da enzima e 1 unidade de Taq DNA polimerase Platinum
(Promega, Madison, Wisconsin, USA) para um volume final de 50 l. O ciclo de PCR
empregado foi: 2 minutos a 92 oC, 2 minutos a 94 oC, 3 minutos a 56 oC, 2 minutos
72 oC, repetio por 29 vezes, 20 minutos a 72o C. O produto gerado foi analisado
com eletroforese em gel de agarose 0,8%.
O produto de PCR originado foi purificado usando o kit GFX (Amersham,
USA) segundo mtodo descrito pelo fabricante e posteriormente, submetido a reao
de adio de cauda poli-A. Para a reao foram empregados 100 ng de fragmento de
PCR purificado, 0.5 mM de dATP, tampo enzimtico 1X e 1 unidade de enzima CIAP
(calf intestinal alkaline phosphatase, Fermentas, Pittsburgh, Pensilvnia, USA) para
um volume final de 50 l. A reao foi incubada por 15 minutos a 37 oC, seguida por
inativao a 70 oC por 5 minutos. Novamente, os produtos foram purificados com kit
GFX.
O fragmento preparado foi utilizado para a clonagem no vetor pGEM-T-Easy
(Promega), sendo utilizado 150 ng de inserto, 50 ng de vetor, 1 unidade de T4 DNA
ligase, 1X tampo enzimtico, 1X polietilenoglicol (PEG 4000) e H2O milli-Q q.s.p 10
l. A reao foi incubada por 1 hora a 22o C e depois por uma noite a 4o C. A mistura
de ligao foi transformada em linhagem quimiocompetente de E. coli K12 por mtodo
de choque trmico (SAMBROOK et al., 2001). As colnias de E. coli resistentes
ampicilina e deficientes na converso do X-gal (colnias brancas) foram submetidas
ao isolamento do DNA plasmidial e clivagem com enzimas de restrio para
confirmao da clonagem dos fragmentos amplificados (SAMBROOK et al., 2001). O
vetor originado foi denominado de pGP1N (Quadro 2) e foi confirmado por
sequenciamento.
-
47
Quadro 3 - Iniciadores desenhados para a amplificao dos genes de interesse.
GENE NOME STIO DE
RESTRIO1
SEQUNCIA
spaP1N
FWspaP BamHI aaaggatccatggatgaaacgaccactac
RVsbr AatII cgcgacgtcatttggctcaagatcatagac
cotB
CotB5 BamHI ggccatggatccacggattaggccgtttgtcc
CotB3 HindIII ggccataagcttggatgattgatcatctgaagatt
slpA
SlpAFw HindIII caacgactgctaagcttatgaagtcatacgct
SlpARv EcoRI ggccatgaattccgttatcgttggtggc
invA
InvAFw HindIII atatccctaaagcttgtacctacgctgaccggt
InvA3 EcoRI ggccatgaattctattgacagcgcacagagcg
Inv600 InvA5 HindIII ggccataagcttcttttccagccaatcagtga
1 Sequncia de restrio sublinhada
-
48
3.9 Construo do vetor de expresso pLDV701
A subclonagem do gene spaP1N no vetor de expresso pHT08 de B. subtilis
envolveu a obteno do fragmento por meio de dupla digesto com as enzimas
BamHI e AatII a partir do vetor pGP1N, assim como digesto do vetor pHT08 com as
mesmas enzimas. Para tal reao foram empregados 200 ng de vetor, 1X tampo
enzimtico, 1 unidade de BamHI, 1 unidade de AatII e H2O q.s.p 50 l, a digesto foi
mantida por 2 horas a 37o C. Aps este perodo, as amostras foram submetidas a
eletroforese em gel de agarose 0,8% e a banda correspondente ao fragmento de
interesse, aproximadamente 1.4 kb, foi excisada, e purificado com kit GFX segundo
instrues do fabricante. O produto purificado e quantificado foi ligado empregando a
reao de ligao: 150 ng de inserto, 50 ng de vetor, 1 unidade de T4 DNA ligase, 1X
tampo enzimtico, 1X PEG 4000 e H2O milli-Q q.s.p 10 l. A reao foi incubada por
1 hora a 22 C e depois por uma noite a 4 C. A mistura de ligao foi transformada
em linhagem competente de E. coli K12 DH5. As colnias que cresceram em meio
seletivo foram isoladas e submetidas a extrao de DNA plasmidial, seguida de
anlise de restrio com as correspondentes enzimas e visualizao em gel de
agarose. O vetor construdo foi denominado de pLDV701 (Quadro 2).
3.10 Expresso da protena recombinante P139-512 em linhagem de B. subtilis
LDV701
O vetor pLDV701 construdo e o vetor pHT08 (controle) foram introduzidos por
transformao natural em clulas competentes da linhagem 1012 de B. subtilis,
originando as linhagens LDV701 e LDV700, respectivamente (Quadro 1). Um clone
recombinante transformado com o vetor pLDV701 e outro com pLDV700 foram
selecionados e submetidos a induo da expresso proteica. As linhagens de B.
subtilis LDV701 e LDV700 (controle) foram crescidas em meio LB, com 30 g/ml de
cloranfenicol a 37 oC sob agitao constante (200 rpm) por 16 horas. Aps esse
perodo, 1 ml do pr-inculo foi diludo em 50 ml de meio LB com cloranfenicol (20
g/ml) e incubado a 37 oC sob agitao at atingir a D.O600nm de 0,6-0,8. Nesta D.O
-
49
foi retirado 1 ml da cultura, centrifugado (5 minutos, 7.000 rpm). O precipitado,
denominado de T0 (tempo 0), foi congelado a 20 oC. A induo da expresso da
protena P139-512 foi realizada com a adio de IPTG (Isopropil -D-tiogalacyosdeo)
na concentrao final de 1 mM ao restante da amostra. Aps a adio do agente
indutor a linhagem foi cultivada a 37 oC sob agitao por mais 4 horas. Ao final a
amostra induzida foi centrifugada (7.000 rpm, 10 minutos), e o precipitado (T4) foi
congelado a -20 oC. As amostras correspondentes ao T0 e T4 de B. subtilis foram
lisadas conforme protocolo de lise proteica e preparados com tampo de amostra de
SDS-PAGE. As suspenses foram aquecidas a 100 oC por 10 minutos e depois
analisadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (SAMBROOK et al., 2001).
3.11 Fracionamento da amostra induzida de LDV701
Inicialmente, os precipitados induzidos de B. subtilis LDV701 e LDV700 foram
submetidos a ressuspenso vigorosa com 1/10 do volume de tampo F (0.1 M Tris
HCl pH 7.0, 0.5 M NaCl) e lisozima (800 g/ml), seguido por uma incubao em gelo
por 30 minutos. Posteriormente,foi adicionado 0.01% SDS e 0.01 mM PMSF
(fenilmetanosulfonilfluorido), e as suspenses foram sonicadas por 2.5 minutos, com
pulso ativo de 30 segundos e pausa de 1 minuto, com amplitude minma de 40% por 3
vezes. Aps o fracionamento, as amostras foram centrifugadas (1 hora, 13.000 rpm,
4 C), o precipitado foi separado do sobrenadante e estes foram denominados de
extrato insolvel (I) e solvel (S), respectivamente. Amostras dos extratos solveis e
insolveis foram preparadas com tampo de amostra, fervidas por 5 minutos, e
analisadas em gel desnaturante de poliacrilamida. A concentrao de protenas foi
determinada usando kit de quantificao proteica BCA (Pierce, Rockford, Ilinois,
USA), com soro albumina bovina como padro.
-
50
3.12 Purificao da protena recombinante P139-512 a partir de linhagem
recombinante de B. subtilis
O extrato solvel da linhagem LDV701 foi aplicado no aparelho FPLC (fast
performance liquid chromatograph) AKTA usando colunas niqueladas segundo
instrues do fabricante (Amersham Bioscience). As amostras foram eludas com
tampo B (0.1 M Tris HCl, 0.5M NaCl, pH 7.5) com concetraes crescentes de
imidazol (0.05 M at 1 M) e as eluies foram verificadas em gel de policrilamida.
3.13 SDS-PAGE e Western blot da protena P139-512
A eletroforese em gel desnaturante de policarilamida (SDS-PAGE) foi feita
segundo protocolo descrito por Laemmli (1970), e usando o aparelho Mini Protean II
vertical electrophoresis unit (Miniprotean, BioRad). Para os ensaios com a protena
P1 completa foram usados gis de poliacrilamida com concentrao de 7.5%, para os
demais ensaios foram empregados gis de 12.5%. Os Western blots foram realizados
usando incubao das membranas de nitrocelulose com anticorpo anti-P1 especfico
(1:3,000) ou anti-P139-512 (1:2,000). As bandas reativas foram detectadas com kit de
quimio luminescncia (Super Signal, Pierce), como descrito pelo fabricante.
3.14 Expresso e purificao dos fragmentos da protena P1
Os fragmentos da P1 (CK2, LT1, MA41, NR5) foram produzidos e purificados
seguindo os protocolos descritos por McArthur et al. (2007); Rhodin et al. (2004);
Robinette et al. (2009, 2011).
3.15 Preparao dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1
Os mAbs anti-P1 (mAb 3-8D, 1-6F, 4-9D e 4-10A) foram obtidos de hibridomas
previamente estabelecidos no laboratrio da Dra L. Jeannine Brady (AYAKAWA et al.,
-
51
1987). Todos os mAbs empregados neste trabalho foram purificados seguindo o
protocolo descrito por Robinette et al. (2009).
3.16 Reatividade dos anticorpos monoclonais anti-P1 com a protena P139-512 por
meio de Western blot
A protena P139-512 recombinante purificada de B. subtilis foi submetida