Minha defesa de dissertação 2004
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DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM
MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS
ADRIANA ELIAS PIRES
Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso
Campo Grande - MS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA - MESTRADO
INTRODUÇÃO
MEDICAMENTO FITOTERÁPICO
Medicamento farmacêutico obtido por processos tecnologicamente adequados, empregando-se
exclusivamente matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de
diagnóstico73.
“Fitoterápicos não têm efeitos colaterais...”
“Pode ser usado pelo tempo que você quiser...”
“Se não fizer bem, mal não há de fazer...”
Grande parte das espécies vegetais utilizadas não tem ação farmacológica comprovada, estudo químico realizado, nem estudos toxicológicos.
Fraudes e problemas na qualidade dos fitoterápicos.
MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS - Brasil
INTRODUÇÃO
Resolução da ANVISA – RDC nº17 de 24 de janeiro de 2000.
Consultas públicas - nº 94 de 6 de novembro de 2003.
Alternativa menos agressiva ao organismo;
Rigor da legislação e da vigilância sanitária;
Exigência de qualidade:
autenticidade;
da presença do teor correto de princípios ativos;
de boas condições de conservação; e outros.
PAÍSES COM TRADIÇÃO NO USO DE FITOTERÁPICOSComo Alemanha, França e Bélgica
INTRODUÇÃO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS
Desenvolvimento de metodologias:
Seleciona-se a substância de interesse na matriz;
Otimiza-se um método de extração;
Procede-se a determinação. Processo de Validação:
Garante confiabilidade às medidas obtidas;
Normas nacionais e internacionais:
INTRODUÇÃO
► ANVISA → Agência Nacional de Vigilância Sanitária
► FDA → US Food and Drug Administration
► USP → United States Pharmacopeia
► ICH → International Conference of Harmonization
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
Especificidade
Limite de Quantificação
Limite de Detecção
Linearidade e Faixa de aplicação
Sensibilidade
Exatidão
Precisão
Estabilidade
Robustez
Diferenciar compostos na presença de outros.
Menor quantidade determinada com precisão/ exatidão.Menor quantidade detectada.
Produzir resultados lineares numa
dada faixa de variação.
Distinguir quantidades próximas.
Concordância entre os valores encontrados e o verdadeiro.
Inalteração dos resultados apesar de pequenas modificações do
método.
Constância do analito nas amostras.
Proximidade entre os resultados.
INTRODUÇÃO
FURANOCUMARINAS
Classe das cumarinas
Fotoreatividade (luz UV entre 200 e 300 nm)
Furanocumarinas ativadas
DNA, RNA, proteínas e
lipídios
Morte ou replicação da célula, síntese, mutação ou reparo do DNA
INTRODUÇÃO
Uso desde 2000 a.C. em doenças de pele como:
vitiligo micosePsoríase
FURANOCUMARINAS OU PSORALENOS
Famílias Apiaceae, Rutaceae e Moraceae.
INTRODUÇÃO
*5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona
*
• Efeitos colaterais: eritema, formação de bolhas, náuseas, prurido, dor de cabeça e depressão, genotoxicidade (alteram o conteúdo informacional dos genes).
• Uso continuado é questionado:
Efeito carcinogênico, envelhecimento precoce, tendência ao aparecimento de cataratas.
TERAPIA PUVA (PSORALENOS + UV A)
INTRODUÇÃO
TRATAMENTO DE DOENÇAS DE PELE
OBJETIVOS PRINCIPAIS
Desenvolver metodologias de extração de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos escolhidos no comércio.
Validar as metodologias desenvolvidas através de parâmetros de validação da ICH.
MEDICAMENTOS ANALISADOS → total= 10
7 Medicamentos contendo espécies do gênero Dorstenia:
• Indicados para tratamento de distúrbios menstruais e sintomas da menopausa.
• Não tinham informação sobre presença de furanocumarinas.
3 Medicamentos indicados para vitiligo:
• 2 eram identificados apenas como “produto natural”
• 1 informava sobre presença de furanocumarinas na seiva de Brosimum gaudichaudii.
Aquisição em farmácias de manipulação, drogarias e ervanários.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Gênero Dorstenia
Dorstenia brasiliensis
•Habilidade em sintetizar furanocumarinas;
•Antiofídico, anti-reumático, infecções e doenças de pele;
•Carapiá ou figueirilha;
•Cardenolídeos, triterpenos, ácidos graxos, esteróides e vários flavonóides.
Brosimum gaudichaudii
•Utilizada no tratamento de doenças de pele;
•Mamica-de-cadela;
•Nativa do cerrado brasileiro, ampla distribuição por todo o Brasil;
•Cumarinas, chalcona, esteróides e triterpeno.
Espécie Brosimum gaudichaudii
Soluções orais
A Tinturas de Dorstenia multiformis, Davilla rugosa e Plumeria lancifolia
3 lotes São Paulo, Brasília, Goiânia e Rio de Janeiro
B Tinturas de Dorstenia multiformis e Plumeria lancifolia
2 lotes São Paulo, Goiânia, Rio de Janeiro e Brasília
C Tinturas de Dorstenia multiformis, Cereus jamacaru, Plumeria lancifolia e Erythrina mulungu
3 lotes Campo Grande
D Tintura de Dorstenia multiformis 1 lote Campo Grande
Cápsulas E Extratos secos de Dorstenia multiformis e Plumeria lancifolia
3 lotes Campo Grande
F Extratos secos de Dorstenia multiformis, Plumeria lancifolia, Cereus jamacaru e Erythrina mulungu
3 lotes Campo Grande
G Pó de Dorstenia brasiliensis 3 lotes Rio de Janeiro
Comprimidos
H Produto natural 3 lotes Campo Grande
I Produto natural 3 lotes Coxim
J Seiva de Brosimum gaudichaudii e vitaminas
2 lotes Campo Grande
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
SOLUÇÕES ORAIS – A, B, C e D
Análises preliminares em CCD → presença de furanocumarinas
Análise direta:
Solução oral A
Solução oral A
Psoraleno
sustâncias mais polares
Bergapteno
• Excluísse da solução de análise a maior parte das substâncias mais polares;
• Abrangente;
• Não oneroso;
• Solução de análise capaz de ser analisada em CLAE e CG.
Adquiridas de junho de 2002 à novembro de 2003.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO
Soluções Orais A, B, C e D
Extração líquido - líquido
• Solvente extrator – diclorometano, éter etílico, clorofórmio
• Tempo em ultra-som – 10, 20, 30, 40, 50 min
• Tempo em centrifugação – 5, 10, 15 min Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3).
Necessidade de reextração da fase inferior.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
MÉTODO OTIMIZADO
Solução Oral
(5 mL) 7 mL de clorofórmio
10 min em ultra-som
10 min em centrifugação
1ª Fração superior
1ª Fração inferior
5 mL de clorofórmio
10 min em ultra-som
10 min em centrifugação
2ª Fração superior
2ª Fração inferior
Solução de análise 1
(MeOH)
Solução de análise 2
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Modelo: Shimadzu LC-6AD
Detector: UV-Vis de comprimento de onda fixo (Shimadzu)
Coluna: fase reversa octadecyl Shim-pack (25cm x 4,6mm x 5µm)
e pré-coluna (2,5cm x 4,6 mm) de mesma fase
CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICASEluente: água – acetonitrila
Proporção 45: 55 (v/v)
Fluxo: 1mL/min
Comprimento de onda: 223 nm
Injeção: 10 µL
EQUIPAMENTO
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
C adic (µg ml-
1)
Psoraleno (%) (média ± DP)
Bergapteno (%) (média ± DP)
A B C A B C4 95,99 ±
1,1797,28 ±
0,9196,13 ±
1,1698,76 ±
0,7498,34 ±
1,1796,43 ±
1,11
40 92,35 ± 0,35
96,55 ± 1,14
97,19 ± 0,99
99,89 ± 0,87
99,97 ± 0,89
97,29 ± 0,67
100 93,76 ± 0,81
99,05 ± 0,74
98,98 ± 1,01
94,43 ± 0,53
98,43 ± 0,79
98,11 ± 1,03
200 96,83 ± 0,97
95,95 ± 0,87
98,37 ± 0,78
98,26 ± 0,93
96,86 ± 1,05
97,81 ± 1,15
Recuperação do método para soluções orais A, B e C (n=5 para cada amostra).
RECUPERAÇÃO
C adic, concentração adicionada.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
SOLUÇÃO ORAL A
Amostra inteira
Solução de análise 1
Solução de análise 2
1 – Psoraleno
2 - Bergapteno
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
SOLUÇÃO ORAL B
Amostra inteira
Solução de análise 1
Solução de análise 2
1 – Psoraleno
2 - Bergapteno
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
SOLUÇÃO ORAL C
Amostra inteira
Solução de análise 1
Solução de análise 2
1 – Psoraleno
2 - Bergapteno
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Metodologia de extração dos medicamentos E, G, H e I já havia sido
determinada em nosso laboratório → metanol-clorofórmio 7:3, tempo em
ultra-som 15 min e tempo em centrifugação de 10 min.
MEDICAMENTOS EM CÁPSULAS E COMPRIMIDOS
Estudar a aplicabilidade do método a:
Medicamento em cápsula F: maior complexibilidade de composição: (mistura de extratos secos de 5 plantas).
Medicamento J: adição de substâncias ativas isoladas (não-fitoterápico): seiva concentrada de uma planta medicinal + vitaminas.
Foram mantidos os mesmos tempo de ultra-som e centrifugação. Vários solventes e misturas de solventes testados.
Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3).
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
MÉTODO OTIMIZADO – F, E, G, H e I
Medicamento
(100 mg) 10 mL de metanol-clorofórmio
7:3
15 min em ultra-som
10 min em centrifugação
1º Resíduo
1º Extrato
10 mL de metanol-clorofórmio 7:3
15 min em ultra-som
10 min em centrifugação
2º Resíduo 2º Extrato
Solução de
análise(MeOH)
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Recuperação do método para E, F, G, H e I (n=5 para cada amostra).
RECUPERAÇÃO → Eficiência da extração
PSORALENO (%) (MÉDIA ± DP)
C adic (µg mL-
1)E F G H I
1 97,33 ± 1,36 97,99 ± 0,94
97,34 ± 0,99
97,45 ± 1,16
97,89 ± 0,87
20 98,79 ± 0,85 99,14 ± 1,37
98,98 ± 0,96
98,96 ± 0,78
99,44 ± 1,11
40 99,03 ± 0,97 99,05 ± 0,77
99,47 ± 1,27
99,29 ± 0,91
99,27 ± 0,80
BERGAPTENO (%) (MÉDIA ± DP)
C adic (µg mL-
1)E F G H I
1 98,13 ± 0,81 98,87 ± 1,12
98,01 ± 1,19
97,89 ± 1,10
98,67 ± 0,83
20 99,43 ± 0,71 99,46 ± 0,91
99,26 ± 0,73
99,02 ± 0,86
99,29 ± 1,11
40 99,01 ± 0,67 99,39 ± 0,80
98,11 ± 1,03
99,44 ± 0,93
99,33 ± 0,76
DT (%) (MÉDIA ± DP)
C adic (µg mL-
1)E F G H I
1 97,45 ± 1,28 97,88 ± 0,99
97,67 ± 0,87
97,74 ± 1,25
98,68 ± 1,03
20 98,99 ± 0,73 99,35 ± 1,27
99,01 ± 1,13
98,76 ± 0,89
99,50 ± 1,19
40 99,14 ± 1,02 99,13 ± 0,97
98,00 ± 1,22
99,36 ± 1,27
99,55 ± 0,82
C adic, concentração adicionada.
O medicamento em comprimidos J não se enquadrou no método.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
sustâncias mais polares
MEDICAMENTO J – não se enquadrou no método.
Psoraleno Bergapteno
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
MEDICAMENTO F
Psoraleno
Bergapteno
DT
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
E G
H I
MEDICAMENTOS E, G, H e I
• Utilizando-se as mesmas condições para CLAE descrita em soluções orais.
1 – Psoraleno
2 - Bergapteno
3 - DT
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS
Estudo interequipamento
• Confirmar valores encontrados → não havia parâmetros de referência de quantidade;
• Precisão interequipamento;
• Possibilidade da utilização de CLAE e CG nos métodos.
CG-DIC → para método de soluções orais A, B e C.
Modelo: Varian
Coluna: LM-5 (15m x 0,2mm x 0,2 µm)
Detector: DIC, temperatura 280º C
Injetor: 280ºC
Split: 1:20
Gás de arraste: Hidrogênio com fluxo de 0,8 mL/min
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS
CG-EM → para método dos medicamentos E, F, G, H e I
Modelo: Shimadzu 17
Coluna: LM-A (15m x 0,2mm x 0,2 µm)
Injetor Split/Splitless: razão de Split 1:20
Temperatura da interface: 280ºC
Detector seletivo de massa, modelo: Shimadzu QP 5000
Modo de ionização: impacto de elétrons ; Modo de aquisição: 55-550 u.m.a
Gás de arraste: Hélio com fluxo de 0,6 mL/min
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Temperatura(ºC)
Velocidade de aquecimento (ºC/min)
Tempo de isoterma
(min)
150 10 -
240 5 -
280 - 20 O tempo de análise total no CG foi de 37 minutos.
Programação de temperatura utilizada em CG-EM E CG-DIC(no forno da coluna)
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS
CG-DIC, solução oral B
Estudo inter-equipamento
CG-EM, medicamento F
1 – Psoraleno
2 - Bergapteno
3 - DT
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros
Especificidade
Os métodos demonstraram boa separação dos picos de interesse em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM sem interferentes.
Substâncias CLAE-UV CG-DIC CG-EM
Psoraleno 6,1 ± 0,04 4,25 ± 0,03
4,3 ± 0,05
Bergapteno 7,4 ± 0,03 6,35 ± 0,01
6,3 ± 0,04
DT 11,4 ± 0,03
16,55 ± 0,03
16,5 ± 0,05
Psoraleno Bergapteno DT
LD LQ LD LQ LD LQ
CLAE-UV
0,03 0,10 0,07 0,23 0,24 0,80
CG-DIC 1,3 4,3 0,6 2,0 1,5 5,0
CG-EM 0,10 0,33 0,09 0,30 0,24 0,80
Limites de detecção e quantificação
LD, limite de detecção; LQ, limite de quantificação.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Estabilidade
Soluções-padrão e soluções de análise.
Curva de calibração – padrão externo
CLAE-UV CG-DIC
Substâncias
Psoraleno Bergapteno
Psoraleno Bergapteno
FL (µg mL-
1)1-600 1-400 10-100 5-90
r 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997
n 9 9 10 10
CLAE-UV CG-EM
Substâncias
Psoraleno
Bergapteno
DT Psoraleno
Bergapteno
DT
FL (µg mL-
1)1-50 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50
r 0,9998 0,9999 0,9997 0,9998 0,9998 0,9997
n 10 10 10 10 10 10
•MÉTODO PARA SOLUÇÕES ORAIS•MÉTODO PARA CÁPSULAS E COMPRIMIDOS
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
• As quantidades determinadas de analitos nos medicamentos pela extrapolação da reta no eixo x das curvas de linearidade dos métodos foram semelhantes às encontradas empregando-se padrão externo.
Linearidade – Métodos de soluções orais e de cápsulas e comprimidos.• r2 = 0,9998 (n=5) nas matrizes dentro do intervalo das curvas de calibração.
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Acurácia
% Inexatidão= concentração obtida – concentração esperada
concentração esperada
% CV = desvio padrão das medidas
concentração média determinada
Precisão
1 - REPETITIVIDADE → Análises intradia
2 - PRECISÃO INTERMEDIÁRIA → Análises interdia
3 - ANÁLISE INTEREQUIPAMENTO → CG-DIC ou CG-EM3 repetições (n=5 para cada concentração trabalhada) Período de 1 dia3 repetições (n=5 para cada concentração
trabalhada) 1 repetição por dia → 3 dias
VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
ACURÁCIA E PRECISÃO → Soluções orais A, B e C
Acurácia e precisão intradia em CLAE (n=4 para cada amostra)PSORALENO BERGAPTENO
C. adicionada(µg mL –1)
C. determinada(µg mL –1)
(média ± DP)
Acurácia (%)
CV (%)
C. determinada(µg mL –1)
(média ± DP)
Acurácia (%)
CV (%)
4 3,9 ± 0,17 -2,5 4,35 3,8 ± 0,18 5,0 4,73
40 41,0 ± 0,83 2,5 2,02 42,0 ± 1,13 5,0 2,69
200 202,0 ± 2,39
1,0 1,18 203,0 ± 3,05
1,5 1,50Acurácia e precisão intrerdia em CLAE (n=5 para cada amostra)PSORALENO BERGAPTENO
C. adicionada(µg mL –1)
C. determinada(µg mL –1)
(média ± DP)
Acurácia (%)
CV (%)
C. determinada(µg mL –1)
(média ± DP)
Acurácia (%)
CV (%)
4 3,9 ± 0,16 2,5 4,10 3,9 ± 0,15 2,5 3,85
40 42,0 ± 2,07 5,0 4,93 42,0 ±1,79 5,0 4,26
200 204,0 ± 3,23
2,0 1,58 203,0 ± 3,91
1,5 1,93C., concentração.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
ACURÁCIA E PRECISÃO → Medicamentos E, F, G, H e I
Acurácia e precisão intradia em CLAE (n=5 para cada amostra)PSORALENO BERGAPTENO DT
C. adic.(µg mL –
1)
C. deter.(µg mL –1)
(média ± DP)
Ac.(%)
CV (%)
C. deter.(µg mL –1)
(média ± DP)
Ac. (%)
CV(%)
C. deter.(µg mL –1)
(média ± DP)
Ac. (%)
CV(%)
1 1,03 ± 0,05 3,00
4,85
1,01 ± 0,04 1,00
3,96
1,03 ± 0,05 3,00
3,96
20 19,51 ± 0,53
2,45
2,72
20,02 ± 0,47
0,10
2,35
20,08 ±0,57
0,40
2,84
40 39,32 ± 0,91
1,70
2,31
39,51 ± 0,85
1,23
2,15
39,43 ± 0,99
0,14
2,51
Acurácia e precisão interdia em CLAE (n=5 para cada amostra)PSORALENO BERGAPTENO DT
C. adic.(µg mL –
1)
C. deter.(µg mL –1)
(média ± DP)
Ac.(%)
CV (%)
C. deter.(µg mL –1)
(média ± DP)
Ac. (%)
CV(%)
C. deter.(µg mL –1)
(média ± DP)
Ac. (%)
CV(%)
1 1,05 ± 0,05
5,00
4,76
1,02 ± 0,05
2,00
4,90
1,03 ± 0,05
3,00
3,96
20 19,78 ± 0,59
1,10
3,01
20,06 ± 0,51
0,30
2,54
20,10 ± 0,42
0,50
4,20
40 39,50 ± 0,82
1,25
2,08
39,63 ± 0,79
0,93
1,99
39,50 ± 0,87
1,25
2,20
C., concentração; adic., adicionada; deter., determinada, Ac., acurácia
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
DETERMINAÇÃO DAS FURANOCUMARINAS – Soluções orais
Soluções orais
Psoraleno (µg mL-
1)Bergapteno (µg mL
-1)
A1 274 ± 4,3 65 ± 2,9
A2 272 ± 4,1 63 ± 2,1
A3 260 ± 4,9 66 ± 2,0
B1 530 ± 3,1 134 ± 3,6
B2 522 ± 5,9 128 ± 3,2
C1 265 ± 4,9 72 ± 2,8
C2 314 ± 6,7 84 ± 3,4
C3 325 ± 7,3 90 ± 2,1D 1052 483
A hidrólise enzimática realizada em triplicata (resíduo das soluções orais + β-glucosidase em tampão acetato 0,1mol/L, 37ºC por dois dias) com as soluções orais A, B e C não indicou presença de glicosídios furanocumarínicos nas amostras.
Não houve discrepâncias entre os lotes dos medicamentos A e B.
C → 20% diferença para as furanocumarinas.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
0
100
200
300
400
500
600
A1 A2 A3 B1 B2 C1 C2 C3
Co
nce
ntr
açã
o (
μg
mL-1
)
Psoraleno: CLAE-UV
Psoraleno: CG-DIC
Bergapeno: CLAE-UV
Bergapteno: CG-EM
Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE-UV e CG-DIC.
ANÁLISE INTEREQUIPAMENTO – Soluções orais
Não houve diferenças significativas entre os dois aparelhos.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
Medicamentos
Psoraleno (µg mL -
1)Bergapteno (µg mL -1)
DT(µg mL -
1)
E1 250 ± 1,4 83 ± 1,3 -
E2 249 ± 1,3 85 ± 0,9 -
E3 250 ± 1,4 80 ± 1,2 -
F1 210 ± 2,2 60 ± 1,7 10 ± 0,3
F2 213 ± 2,2 63 ± 2,1 12 ± 0,3
F3 210 ± 2,0 67 ± 1,4 14 ± 0,4
G1 172 ± 2,6 75 ± 1,9 -
G2 70 ± 1,1 72 ± 2,5 -
G3 237 ± 2,4 94 ± 3,3 -
H1 225 ± 2,2 55 ± 1,7 11 ± 0,2
H2 232 ± 2,2 56 ± 2,1 13 ± 0,3
H3 222 ± 2,0 53 ± 1,4 12 ± 0,4
I1 - - -
I2 - - -
I3 - - -
DETERMINAÇÃO DAS FURANOCUMARINAS – cáp e cpd
Não houve discrepâncias entre os lotes analisados dos medicamentos E, F e H.
150 – 240% 4 - 30%
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
0
50
100
150
200
250
300
E1 E2 E3 F1 F2 F3 G1 G2 G3 H1 H2 H3
Co
nce
ntr
açã
o (
µg
mL-1
)
Psoraleno: CLAE-UV
Psoraleno: CG-EM
Bergapteno: CLAE-UV
Bergapteno: CG-EM
DT: CLAE-UV
DT: CG-EM
Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno, bergapteno e DT nos diferentes lotes de medicamentos E, F, G, H e I por análise em CLAE-UV e CG-EM.
ANÁLISE INTEREQUIPAMENTO – cáp e cpd
Não houve diferenças significativas entre os dois apartelhos.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
CORRELAÇÕES
SOLUÇÕES ORAIS A, B e C (15 mL/dia):
UMA SEMANA: 53,38 mg de furanocumarinas.
SOLUÇÃO ORAL D: 160,65 mg de furanocumarinas / semana.
MEDICAMENTOS E, F, G e H (3 cáp ou cpd / dia):
UMA SEMANA: 25,76 mg de furanocumarinas.
DOENÇAS DE PELE (pessoa de 60kg) → 144 mg de bergapteno,
36 mg de xantotoxina ou 84 mg de trimetilpsoraleno / semana.
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
OUTROS ESTUDOS REALIZADOS
PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES
NOVAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
Amostra inteiraSolução oral A
Amostra inteiraSolução oral C
Amostra inteiraSolução oral B
Proposta para determinação das demais substâncias presentes nos medicamentos.
CONDIÇÕES ISOCRÁTICAS e em GRADIENTE para CLAE
CONDIÇÃO EM GRADIENTE
020406080
100
% s
olv
en
te
na
mis
tura
0 25 28 33 43 50
Tempo (min)
acetonitrilaágua
0
20
40
60
80
100%
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Tempo (min)
acetonitrila
água
CONDIÇÃO EM GRADIENTE
A
B C
ESTUDOS PRELIMINARES COM PLANTAS
Amostra Parte Psoraleno (%)
Bergapteno(%)
carapiá1 rizoma 0,62 0,11
carapiá2 rizoma 0,40 0,10
Dorstenia brasiliensis rizoma 0,69 0,17
mamica de cadela raiz <0,01 0,48
Brosimum gaudichaudii1
raiz 0,36 1,07
Extração com etanol absoluto e reextrações com clorofórmio.
1,020,04casca da raizBrosimum gaudichaudii30,161,10casca da raizBrosimum gaudichaudii23,492,09casca da raizBrosimum gaudichaudii1
CONCLUSÃO
Dois métodos para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos foram desenvolvidos e validados para CLAE e CG (segundo os parâmetros da ICH):
Ambos os equipamentos poderão ser utilizados;
Os métodos podem ser aplicados a outras formulações do mercado.
Foram encontradas furanocumarinas nos medicamentos A, B, C, D, E, F, G e H, sem que a informação estivesse presente nas bulas ou folhetos explicativos.
As quantidades de furanocumarinas encontradas nos medicamentos analisados sugerem que o uso destes fitoterápicos no tratamento de distúrbios menstruais e menopausa é considerado de alto risco devido os efeitos colaterais e a alta incidência de câncer provocados pelo uso das substâncias.
CONCLUSÃO
Como não foi detectada a presença de furanocumarinas no látex de 3 espécimes de B.gaudichaudii, sugere-se que o medicamento J seja formulado com outra parte da planta.
As amostras de carapiá e mamica de cadela adquiridas no mercado assemelharam-se às amostras de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii respectivamente, quanto à presença de furanocumarinas.
Uma nova condição cromatogrática para CLAE foi proposta para estudo das outras substâncias presentes nos medicamentos A, B e C.• Os espécimes de B. gaudichaudii analisados apresentaram grandes diferenças quanto às quantidades de furanocumarinas presentes.
Dedico a presente dissertação aos meus pais
Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires.
Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos.
As minhas irmãs Claudia e Fernanda.
A toda a minha família e amigos sempre presentes.
A Deus.
DEDICATÓRIA
DEDICATÓRIA
Dedico a presente dissertação aos meus pais
Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires.
Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos.
As minhas irmãs Claudia e Fernanda.
A toda a minha família e amigos sempre presentes.
À prof. Dra. Cláudia A. L. Cardoso, pela preciosa orientação deste trabalho, apoio e amizade.
Às prof. Dra. Neli K. Honda e Dra. Rosenei L. Brum, pelos ensinamentos, amizade e pelo laboratório onde foi realizado este trabalho.
Ao Leonardo Viana pela colaboração e pelos grandes ensinamentos de cromatografia líquida.
À mestra Roberta da INEP, pela realização de análises em cromatografia gasosa.
À prof. Dra. Conceição E. dos Santos Silveira e ao mestrando em Botânica Dario Palhares, da UnB, pelas coletas e identificação de amostras de Brosimum gaudichaudii.
Aos secretários do mestrado Celestino G. de Oliveira e Maria Otávia P. V. de Toledo pela colaboração.
À CAPES pela bolsa concedida.
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