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MINISTÉRIO DA CIÊNCIA E TECNOLOGIA INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA Programa integrado de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais da Amazônia Curso Genética, Conservação e Biologia Evolutiva CARACTERIZAÇÃO IN SILICO DE BIOSSENSORES EM Colossoma macropomum: DIAGNÓSTICO MOLECULAR E MONITORAMENTO DE AMBIENTES IMPACTADOS FRIDA MESEL CASANOVA Manaus, Amazonas Abril, 2008
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MINISTÉRIO DA CIÊNCIA E TECNOLOGIA INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
Programa integrado de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais da Amazônia
Curso Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
CARACTERIZAÇÃO IN SILICO DE BIOSSENSORES EM Colossoma macropomum: DIAGNÓSTICO MOLECULAR
E MONITORAMENTO DE AMBIENTES IMPACTADOS
FRIDA MESEL CASANOVA
Manaus, Amazonas Abril, 2008
FRIDA MESEL CASANOVA
CARACTERIZAÇÃO IN SILICO DE BIOSSENSORES EM Colossoma macropomum: DIAGNÓSTICO MOLECULAR E MONITORAMENTO DE AMBIENTES IMPACTADOS ORIENTADOR: Dr. SÉRGIO RICARDO NOZAWA
Dissertação apresentada ao
PIPG-BTRN como parte dos
requisitos para obtenção do
título de mestre em Ciências
Biológicas, área de concentração
em Genética, Conservação e
Biologia Evolutiva.
Manaus, AM Abril, 2008
Casanova, Frida Mesel
Caracterização in silico de biossensores em Colossoma macropomum: Diagnóstico molecular e monitoramente de ambientes impactados/ Frida Mesel Casanova – Manaus, AM: INPA/UFAM 2008. 84 p. ilust. Dissertação de Mestrado - Área de concentração Genética de Organimos Tropicais 1. Peixes. 2. Expressão gênica. 3. Metais pesados. 4. Biblioteca de cDNA.
Sinopse:
Estudou-se o perfil genético do tambaqui frente a situações de estresse, além de avaliar alguns genes para o monitoramento de ambientes impactados. Palavras-chave:
Colossoma macropomum, metais pesados, biblioteca de cDNA, RT-PCR, qPCR
A José Luiz e Glauce Casanova, dedico.
“Uma das melhores coisas da vida é poder descobrir
sempre, seja lá o que for, mas é preciso estar renovando, recomeçando, rompendo e conquistando”
Edilmar Lima
AGRADECIMENTOS _______________________________________________________
Agradeço, primeiramente, à Deus, em quem acredito plenamente e confio.
Aos meus pais, José Luiz e Glauce Casanova, pessoas que sempre me
apoiaram plenamente em tudo que fiz durante minha vida, sendo meu porto seguro
durante os momentos mais difíceis.
Aos meus irmãos, Gabriel e André Casanova, mesmo distantes fisicamente,
sempre vibram com minhas vitórias.
Aos meus avós, Joseph e Léa Mesel, e tios, Ismar e Renata Kaufman, que me
estimularam e incentivaram, sem duvidar, em nenhum momento, de minha
capacidade.
Ao Felipe Lira, pelos incentivos e conselhos otimistas durante momentos
críticos e pelo amor, companheirismo, compreensão e atenção que me foram e me
são dados em todos os momentos. Obrigada pela paciência.
Ao meu orientador, Dr. Sérgio Ricardo Nozawa, que apostou em mim como
uma profissional e pela sua conduta clara e objetiva, propiciando bastante segurança
e seriedade no decorrer desse projeto, dando-me oportunidades das quais serei
sempre grata.
Á professora Dra. Mônica Stropa Ferreira Nozawa, pelo seu apoio e
disposição, embora não sendo co-orientadora oficial deste trabalho, ajudou-me sem
cogitar.
Ao Dr. Rubens Tomio Honda, sempre presente e imprescindível nas horas de
execução dos experimentos.
Aos meus companheiros e companheiras de laboratório Danival, Paulo Aride,
Susy, Kácio, Andréa, Jordânia, Zizi, pelas ajudas de última hora e descontração do
dia-a-dia.
Aos meus amigos de turma Gisele, Natasha, Rafaela, “Cacá”, Marco,
“Rafolia”, Angrizani e Eduardo por muitos dos momentos de descontração durante o
período das disciplinas.
Ao Centro Universitário Niltons Lins, à Pró-Reitoria de Pesquisa e à Pós-
Graduação por ter cedido o laboratório de Expressão Gênica, onde foi possível
realizar todos os experimentos.
Ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) do Instituto
Nacional de Pesquisas do Amazônia, por ter cedido o seqüenciador automático ABI
3130, equipamento imprescindível à realização do projeto.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela
bolsa concedida e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pela verba destinada ao projeto (processos 553219/2005-7 e
553913/2006-7), sem a qual seria impossível a elaboração desta dissertação.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, à coordenação do curso de
genética, conservação e biologia evolutiva, pela realização e conclusão do curso,
como também toda equipe de funcionários e professores.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente, achando que não
foram importantes, mas que fizeram grande diferença.
Agradeço ainda aos que não acreditaram no meu trabalho, pois esses
serviram de desafio na trajetória de realização desta pesquisa. Ensinaram-me que
não se deve mirar nos obstáculos para não perder de vista os objetivos.
]
RESUMO
Uma grande diversidade de peixes é encontrada na Bacia Amazônica, e estes
representam mais que metade das espécies de vertebrados aquáticos totais
conhecidos no mundo. O Colossoma macropomum (tambaqui) tem sido adotado
freqüentemente como espécie-modelo para o entendimento de processos fisiológicos
modulados por variáveis ambientais na Amazônia. Metais como o cobre e cádmio,
em ambientes aquáticos, podem interferir severamente nos processos biológicos dos
peixes em função da grande área branquial exposta ao meio. Juvenis de tambaqui
foram expostos a três diferentes tratamentos: (1) exposição de 1 e 3 horas a
concentrações subletais de cobre [CuSO4. 5H2O (20 µg/L)]; (2) exposição de 1 e 3
horas a concentrações subletais de cádmio [Cd(NO3).4H2O (10µg/L); (3) estresse
mecânico por 5 minutos diários durante 3 dias consecutivos. Foram extraídos fígado
(tratamentos 1 e 2) e músculo (tratamento 3) dos peixes expostos. No presente
estudo foram categorizados, através do BLAST2GO, os bancos de dados de Danio
rerio (zebrafish) e Ictalurus punctatus (bagre de canal), disponíveis no NCBI
(National Center for Biotechnology Information, USA, www.ncbi.nlm.nih.gov), e
usados para comparação das bibliotecas de cDNA de tambaqui expostos aos
referidos tratamentos. Paralelamente, foi verificada, por meio do RT-PCR, expressão
gênica em tambaqui das enzimas catalase, heat shock protein, glutamina sintase e
citocromo p450 obtidas do banco de dados do I. punctatus e D. rerio. Os genes rag 2
e trop foram selecionados da biblioteca de tambaqui e submetidos à análise de
qPCR. As atividades enzimáticas da GST e catalase foram dosadas em peixes
tratados com metais pesados. O banco de dados de Ictalurus punctatus mostrou
uma maior quantidade de genes (37%) agrupados em processos biológicos, da
mesma forma, apresentou-se o banco de Danio rerio (40%). As análises das
bibliotecas de tambaqui mostraram expressão de aproximadamente 900 gene,
dentre eles, o GST, catalase, CYP450 e HIF 2. Na reação de qPCR, o número de
transcritos dos dois genes, rag 2 e trop, destaca-se o aumento nos níveis de mRNA
ao ser exposto ao íon cádmio por 3 horas, enquanto que em músculo de peixes
submetidos a estresse mecânico, não houve alteração na expressão de transcritos
em relação ao controle. As atividades enzimáticas não mostraram diferenças, para
ambas enzimas, nos diferentes tratamentos.
ABSTRACT
The large diversity of fish found in the Amazon Basin represents over half the total
aquatic vertebrate species known in the world. Colossoma macropomum (tambaqui)
is frequently used as a model species in the study of physiological processes
modulated by environmental variables in the Amazon. Metals in aquatic
environments, such as copper and cadmium, may interfere with the biological
processes of fish severely due to their large branchial area exposed to the
environment. Juvenile tambaquis were exposed to three different treatments: (1) 1-
and 3-h exposure to subletal concentrations of copper [CuSO4.5H2O (20 µg/L)], (2) 1-
and 3-h exposure to subletal concentrations of cadmium [Cd(NO3).4H2O (10 µg/L),
(3) mechanical stress for 5 min daily during 3 consecutive days. The liver (treatments
1 and 2) and muscle (treatment 2) of treated fish were removed for cDNA library
construction and sequencing analysis. The data obtained were categorized through
BLAST2GO, the Danio rerio (zebrafish) and Ictalurus punctatus (bagre de canal)
databases available from NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA,
www.ncbi.nlm.nih.gov) and compared to the cDNA library of tambaqui exposed to the
same treatments. Simultaneously, gene expression of enzyme catalase, heat shock
protein, glutamine synthase, and cytochrome p450 obtained from the I. punctatus and
D. rerio, from ESTs. Databases were analyzed by RT-PCR. Genes rag 2 and trop
were selected from the tambaqui library and submitted to qPCR. The enzymatic
activities of GST and catalase in fish treated with heavy metals were determined. No
significant difference was found, possibly due to the short exposure time and the
expression of their respective mRNAs. The Ictalurus punctatus database provided a
larger amount of grouped genes (37%) in biological processes, similarly to the Danio
rerio (40%) database. The analysis of the libraries of tambaqui revealed the
expression of approximately 900 genes, including GST, catalase, CYP450, and HIF-
2. The number of transcripts of genes rag 2 and tropomyosin in the qPCR reaction
stood out for the increased levels of mRNA after the exposure of fish to cadmium ion
for 3 h, while the muscle of fish submitted to mechanical stress did not present
changes in the expression of transcripts in relation to the control.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Região Amazônica ................................................................................................................
1
1.2 A importância da biodiversidade ..........................................................................................
2
1.3 Piscicultura na Amazônia .....................................................................................................
4
1.4 O tambaqui ...........................................................................................................................
5
1.5 Toxicidade em peixes ...........................................................................................................
7
1.6 Metais pesados .....................................................................................................................
11
1.6.1 Cobre (Cu) ...................................................................................................................
12
1.6.2 Cádmio (Cd) ................................................................................................................
12
1.7 Justificativa ...........................................................................................................................
14
1.8 Objetivos ..............................................................................................................................
15
1.8.1 Objetivo geral ..............................................................................................................
15
1.8.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 15
2.
MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Análise e caracterização dos bancos de dados de Danio rerio e Ictalurus punctatus ...........
16
2.2 Busca de seqüências de genes de estresse em bancos de dados on-line e desenhos dos
oligonucleotídeos utilizados no RT-PCR ...............................................................................
17
2.3 Aquisição e aclimatação dos tambaquis .................................................................................
18
2.3.1 Indução de estresse por metais pesados e estresse físico ..............................................
18
2.3.2 Coleta e conservação dos tecidos ..................................................................................
19
2.3.3 Extração de RNA mensageiro .......................................................................................
20
2.3.4 Síntese de cDNA ...........................................................................................................
21
2.4 RT-PCR (Transcriptase reversa – Reação em cadeia da polimerase).....................................
22
2.4.1 Purificação dos fragmentos oriundos do RT-PCR ...................................................... 22
2.4.2 Ligação dos fragmentos purificados .............................................................................. 23
2.4.3 Transformação de bactérias ........................................................................................... 23
2.4.3 Extração de DNA plasmidial em microtubos ................................................................ 24
2.5 Reação de sequenciamento .................................................................................................... .
25
2.6 Construção da biblioteca de cDNA de Colossoma macropomum .........................................
25
2.6.1 Construção da biblioteca de cDNA ...............................................................................
25
2.6.2 Síntese da fita simples de cDNA ................................................................................... 26
2.6.3 Síntese da fita dupla de cDNA ...................................................................................... 26
2.6.4 Digestão com a enzima proteinase K ............................................................................
26
2.6.5 Digestão com a enzima Sfi I .........................................................................................
27
2.6.6 Ligação e transformação de bactérias ...........................................................................
27
2.6.7 Extração de DNA plasmidial em placa. ........................................................................
27
2.7 Análise computacional ...........................................................................................................
29
2.8 qPCR ........................................................................................................................ ..............
30
2.8.1 Desenho dos oligonucleotídeos utilizados na reação de q-PCR ....................................
30
2.8.2 Reação quantitativa em cadeia da polimerase ...............................................................
31
2.8.3 Elaboração da curva padrão ..........................................................................................
31
2.9 Dosagem enzimática ...............................................................................................................
31
2.9.1 Glutationa S-tranferase (E.C 2.5.1.18) .......................................................................... 32
2.9.2 Catalase (E.C. 1.11.1.6) .................................................................................................
32
3. RESULTADOS
3.1 Categorização dos bancos de dados de Ictalurus punctatus e Danio rerio ............................
35
3.2 Amplificação das amostras com oligonucleotídeos em eletroforese de gel de agarose .........
37
3.3 Biblioteca de cDNa de Colossoma macropomum ................................................................
39
3.4 qPCR ......................................................................................................................................
51
3.5 Dosagem enzimática ...............................................................................................................
53
4. DISCUSSÃO ...........................................................................................................................
54
5. CONCLUSÃO .........................................................................................................................
63
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................
63
7. ANEXOS............................................................................................................................. ...... 83
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Lista de Figuras
Figura 1. Tambaqui, Colossoma macropomum ............................................................................
7
Figura 2. Pipeline de bioinformática utilizado para anotação dos genes disponíveis nos bancos de dados .......................................................................................................................
16
Figura 3. Desenho experimental ...................................................................................................
18
Figura 4. Extração do tecido ........................................................................................................
19
Figura 5. Pipeline de bioinformática utilizado para anotação do sequenciamento dos fragmentos expressos ...................................................................................................
29
Figura 6. Categorização do banco de dados de Ictalurus punctatus utilizando software BLAST2GO, agrupando as seqüências em 3 categorias: componente celular, função molecular e processo biológico ....................................................................................
36
Figura 7. Categorização do banco de dados de Danio rerio utilizando software BLAST2GO, agrupando as seqüências em 3 categorias: componente celular, função molecular e processo biológico ........................................................................................................
36
Figura 8. Integridade do RNA utilizado no experimento. Expressão tecido-específica (fígado) de mRNA de HSP70, GLU, CAT e Citp450 em tambaqui, Colossoma macropomum, por RT-PCR .................................................................................................................
38
Figura 9. Freqüência dos genes encontrados nas bibliotecas de cDNA de tambaqui .................
41
Figura 10. Freqüência dos genes encontrados nas bibliotecas de cDNA de tambaqui .................
42
Figura 11. Freqüência dos genes encontrados nas bibliotecas de cDNA de tambaqui .................
43
Figura 12. Categorização do banco de dados de tambaqui (músculo) utilizando o software BLAST2GO ...................................................................................................................
45
Figura 13. Categorização do banco de dados de tambaqui (fígado) utilizando o software BLAST2GO ...................................................................................................................
46
Figura 14. Categorização do banco de dados de tambaqui exposto ao cádmio, utilizando o software BLAST2GO ....................................................................................................
48
Figura 15. Categorização do banco de dados de tambaqui exposto ao cobre, utilizando o software BLAST2GO .....................................................................................................
49
Figura 16. Categorização do banco de dados de tambaqui exposto ao estresse mecânico utilizando o software BLAST2GO .................................................................................
51
Figura 17. Expressão do mRNA, por meio de qPCR, do gene Rag 2 em tambaqui em resposta ao cobre, cádmio e estresse mecânico ........................................................................
52
Figura 18. Expressão do mRNA, por meio de qPCR, do gene tropomiosina de tambaqui em resposta ao cobre, cádmio e estresse mecânico .........................................................
52
Figura 19. Atividade enzimática da enzima glutationa s-transferase em tambaqui em resposta a cobre, cádmio em 3 horas de exposição e estresse mecânico ....................................
53
Figura 20. Atividade enzimática da enzima catalase em tambaqui em resposta a cobre, cádmio
e estresse em 3 horas de exposição e estresse mecânico ...........................................
53
Figura 21. Metabolismo do glutamato em Danio rerio ....................................................................
58
Lista de tabelas
Tabela 1. Seqüências dos oligonucleotídeos para RT-PCR .............................................................
17
Tabela 2. Concentração de cobre e cádmio total nas amostras dos tratamentos de exposição do tambaqui aos metais .........................................................................................................
19
Tabela 3. Oligonucleotídeos desenhados para análises de qPCR ..................................................
30
Tabela 4. Concentração final de formaldeído em 170 µL de reação para construção da curva padrão da catalase ............................................................................................................
44
Tabela 5. Análise em GO da biblioteca de músculo controle de tambaqui, Colossoma macropomum ....................................................................................................................
45
Tabela 6. Análise em GO da biblioteca de fígado controle de tambaqui, Colossoma macropomum......................................................................................................................
46
Tabela 7. Análise em GO da biblioteca de tambaqui, Colossoma macropomum, exposto ao cádmio ..............................................................................................................................
47
Tabela 8. Análise em GO da biblioteca de tambaqui, Colossoma macropomum, exposto ao cobre
49
Tabela 9. Análise em GO da biblioteca de músculo de tambaqui, Colossoma macropomum, exposto ao estresse mecânico .........................................................................................
50
1. INTRODUÇÃO ___________________________________________________________
1.1 Região Amazônica
A região Amazônica possui a maior bacia de drenagem do mundo, com cerca
de 7.000.000 Km2 (Santos & Ferreira, 1999). É formada por uma diversidade de
corpos d‟água, como grandes rios, lagos, paranás, igapós, várzea e inúmeros
pequenos riachos que constituem uma das redes hídricas mais densas do mundo.
Possui um quinto da disponibilidade mundial de água doce, com uma área total,
incluindo terras, águas e florestas, de 4.871.000 Km2 (Junk, 1983). Com exceção dos
rios maiores de águas brancas, cujas nascentes se encontram em altas cadeias de
montanhas andinas, quase todos os rios amazônicos resultam da junção de
pequenos riachos que drenam a floresta (Walker, 1991).
Os peixes representam mais da metade das espécies de vertebrados
aquáticos totais conhecidos no mundo (Nelson, 1984). Bem distribuídos pelo mundo
(Moyle & Cech, 1982), ele são explorados tanto no ambiente marinho quanto de
água doce devido ao seu significante valor econômico (Pitcher & Hart, 1996).
A América do Sul é o ambiente de um grande número de espécies de peixes,
entretanto, é sabido que há uma grande diversidade na Bacia Amazônica (Menezes,
1996). Böhlke e colaboradores (1978) igualaram o nível de conhecimento dos peixes
da América do Sul com o dos Estados Unidos e Canadá há 100 anos atrás. Segundo
Roberts (1972) há mais de 1.300 espécies na bacia, mais que em qualquer outra
bacia no mundo. Menezes (1996) colocou essas estimativas acima de 3.000
espécies.
A composição da ictiofauna Amazônica é baseada principalmente na super
ordem Ostariophysi, que inclui 85% das espécies amazônicas, onde 43% são
Characiformes, 39% Siluriformes e 3% Gymnotiformes. As espécies restantes
pertencem a 14 famílias de outras ordens (Lowe-McConnell, 1999).
A parte brasileira da Bacia Amazônica contém 68% do total de vertentes de
água. Avaliações da diversidade foram realizadas em diferentes regiões e Goulding e
Ferreira (1988) identificaram no mínimo 450 espécies de peixes no Rio Negro, mas
estimou que o total ultrapassa de 700 espécies onde diferentes biotipos são
amostrados. Santos (1986/1987) encontrou mais de 260 espécies nos rios Jamari,
Machado, Guaporé e Marmoré do Estado de Rondônia. Bayley (1982) encontrou
mais de 220 espécies nas várzeas dos Solimões, próximo de Manaus. Santos e
colaboradores (1984) registraram mais de 300 espécies no baixo Tocantins. Ferreira
e colaboradores (1998) listaram mais de 130 espécies comerciais de peixes na
região de várzea de Santarém. Algumas espécies estão largamente distribuídas,
particularmente peixes migratórios como o tambaqui (Araújo-Lima & Goulding, 1998)
e o grande bagre de canal. Outros são restritos a regiões específicas devido a
barreiras ambientais.
1.2 Importância da Biodiversidade
Vários fatores tem sido a causa da grande diversidade na Região Amazônica.
Eles são: a idade e o tamanho da vertente de água; uma grande heterogeneidade de
ambientes, promovendo uma grande escala de nichos, a escala de tempo geológico
e o intercâmbio da fauna através do influxo dos rios das bacias vizinhas (Lowe-
McConnell, 1999). O conhecimento da ictiofauna Amazônica se estende ao
conhecimento das espécies que são bem conhecidas dos pescadores da região. De
acordo com Reis e colaboradores (2003), não é difícil imaginar pesquisas futuras
revelando que, nas cabeças de água dos rios Amazônicos, um grande número de
espécies que eram consideradas as mesmas, são de fato, espécies diferentes. Isso
pode incluir peixes comuns como filhotes e piraíba (Brachyplatystoma filamentosum).
Goulding & Ferreira (1996) dividem o ecossistema que sustenta os peixes
Amazônicos em três componentes: áreas alagadas, canais dos rios e os estuários da
Amazônia. Cada um suporta milhares de espécies de peixes com diversos habitats
energéticos, reprodução sazonal e proteção contra predadores. A cadeia trófica dos
peixes amazônicos é sustentada por quatro forças principais de produção primária:
florestas alagadas, vegetação flutuante, fitoplânctons e perifíton.
Na Amazônia, três classes de água são reconhecidas em função de sua cor
(Sioli, 1968): água branca, água clara, e água preta. Em linhas gerais, águas brancas
são ricas em minerais dissolvidos, apresentando uma alta turbidez resultante da
erosão dos escudos andinos, com pH em torno de 6,5 a 7,5 (rio Solimões). As águas
claras variam com relação à concentração de compostos orgânicos e minerais
dissolvidos; seu aspecto óptico é transparente, pois a maioria dos compostos
húmicos presentes nas águas claras encontra-se adsorvidos (complexados) a
partículas de argila e/ou silte; o pH das águas claras situa-se na faixa de 5,5 a 7,0
(rio Tapajós). As águas pretas são singulares principalmente devido à baixa
concentração de íons e a elevada concentração de compostos contendo grupo de
SH, sendo tipicamente ácidas, com um pH variando em média entre 5,0 e 6,0 no
canal do rio Negro, e entre 3,0 e 4,0 nas florestas inundadas (igapós e igarapés) de
água preta (Walker, 1995).
Segundo Giacometti (1996), a perda da diversidade, como resultado da
destruição de habitats e exploração descontrolada das reservas naturais, pode ser
avaliada em termos de valores diretos e indiretos. Valores indiretos afetam a
sustentabilidade da população que depende desse recurso, assim como um dano no
pool genético. Essa é a principal forma de alcançar conseqüências para as espécies,
afetando seu potencial evolucionário por conta da redução da variedade genética.
Perdas nos valores diretos podem ser estimadas usando como base os valores de
produtos coletados e comercializados.
A destruição de habitats resulta na perda da biodiversidade. Entretanto,
existem poucos estudos que sugere o quanto desapareceu nas regiões.
Desflorestamento, poluição química, poluição orgânica, excesso de turbidez nos rios
causado pelas atividades de mineração, expansão urbana e agrícola, hidrelétricas
que bloqueiam o caminho migratório dos peixes são importantes fatores de impacto.
Por serem prejudiciais ao ambiente e difíceis de manejar, eles deveriam ser
controlados, caso contrário, danificarão todo o ecossistema, impactando a ictiofauna.
Nesse sentido, a extensão territorial, a complexidade de meio ambiente e
diversas atividades econômicas apresentam enormes desafios para o governo. O
sistema corrente, que é centralizado e não participativo, mostrou- se incapaz de uma
regulação eficaz do uso dos recursos naturais da Amazônia. Mesmo assim, o
homem da região tem convivido com esta realidade e está aprendendo a utilizar os
recursos biológicos. Tal aprendizado está sendo produzido por meio do convívio e da
necessidade, gerando um conhecimento precioso, o qual pode ser utilizado no que
denominamos manejo. Utilizar esses conhecimentos na atividade piscícola é uma
forma de fomentar a economia regional. Com isso, criam-se novas oportunidades
para a população local reduzindo-se os efeitos da sobre-pesca, que é prejudicial às
populações pesqueiras, e contribuindo para a promoção do desenvolvimento
sustentável da região.
1.3 Piscicultura na Amazônia
De acordo com a definição atualmente usada pela FAO - Food and Agriculture
Organization of the United Nations (2001), aqüicultura é o cultivo de organismos
aquáticos, incluindo peixes, moluscos, crustáceos e plantas aquáticas, com
intervenção no processo de criação dos mesmos visando o aumento da
produtividade. Tal intervenção pode ser realizada por meio de estocagem regular,
alimentação, proteção de predadores, etc.
A piscicultura é a atividade zootécnica relacionada com a criação dos peixes
em condições controladas ou semicontroladas, tendo em vista a qualidade do
produto somada à produção em massa. Tal atividade tem sido considerada como a
mais promissora quando o objetivo é aumentar a produção de alimentos ricos em
proteína (Stickney, 1979; Freitas, 2002).
Segundo Val & Honczaryk (1995), a aqüicultura, desde o final do milênio
passado, tem sido aprimorada com o auxílio da tecnologia e do conhecimento
desenvolvidos em áreas como a genética, a fisiologia, a bioquímica, a nutrição, a
ecologia e outras áreas afins. A adaptação e o desenvolvimento de tecnologias
específicas para as condições regionais são de suma importância para que a
aqüicultura se torne uma atividade promissora e de alta rentabilidade.
Se, por um lado, os avanços no conhecimento da biologia dos peixes
amazônicos têm se tornado evidentes, por outro, a maioria dos criadores ainda não
conseguiu fazer o uso adequado desse conhecimento. A piscicultura não é vista
ainda como uma atividade econômica de destaque, ainda que seja a atividade
aqüícola predominante (Freitas, 2002). Não se pode contestar, entretanto, as
potencialidades e as perspectivas de desenvolvimento da piscicultura na Amazônia.
Clima, solo, qualidade e quantidade da água e, em especial, a diversidade da
ictiofauna (mais de 3000 espécies) são fatores que favorecem a piscicultura neste
Estado (Melo et al., 2001; Freitas, 2002; Val & Honczaryk,1995).
Estudos técnico-econômicos realizados por Melo e colaboradores (2001) e
Izel & Melo (2004) com tambaqui (Colossoma macropomum), em viveiros e
barragens localizadas em áreas de produtores, mostraram que o ciclo de produção
pode ser concluído entre 10 a 12 meses, com densidade de produção de 10
juvenis/m2, taxa média de sobrevivência de 85%, densidade de engorda de 3.250-
4000 peixes/ha, peso médio de venda de 1,8 kg em 10 meses de engorda e 3,1kg
em 12 meses, com rendimento de 10.075 kg/ha/ano. Tais estatísticas mostram que
projetos relacionados à piscicultura na Amazônia são viáveis e bastante produtivos.
O conhecimento da biologia de cada espécie, bem como as principais
características do seu ambiente natural, são fatores importantes para o sucesso de
seu cultivo, visto que cada espécie possui hábitos alimentares, métodos
reprodutivos, crescimento, ciclo de vida e respostas diferenciadas às alterações
ambientais (Almeida-Val & Val, 1995; Baldisseroto, 2002).
1.4 O tambaqui
A espécie Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) pertencente a subfamília
Serrasalminae (Teleostei, Characiformes, Characidae), é um peixe nativo da Bacia
Amazônica, conhecido popularmente por “tambaqui” (Figura 1). O tambaqui tem sido
adotado freqüentemente como espécie-modelo para o entendimento de processos
fisiológicos modulados por variáveis ambientais na Amazônia (Val & Almeida-Val,
1995).
Figura 1: Tambaqui, Colossoma macropomum. Fonte: Casanova, F.M.
Atualmente, a espécie já consta na lista oficial de espécies protegidas durante
o defeso (IBAMA, 2003). No estado de Rondônia a pesca do tambaqui esteve
suspensa até maio de 2006, à exceção dos rios Guaporé e Mamoré, com fins de
recuperar os estoques naturais da espécie (MMA, 2005)
Sempre esteve e continua entre as espécies importantes, de alto valor
comercial, desembarcadas no mercado de Manaus (Bayley & Petrere Jr., 1989). É
considerado um peixe excelente para cultivo por apresentar qualidades zootécnicas
e de manejo que permitem um bom rendimento em cativeiro. Alcança porte máximo
em torno de 100cm de comprimento e peso superior a 30kg, atingindo maturidade
sexual entre o 4º e 5º ano de vida. Em cativeiro esta espécie atinge maturação
sexual em até três anos (Goulding & Carvalho, 1982; Araújo-Lima & Goulding, 1998).
Seu habitat favorito são os rios de águas brancas das bacias dos rios
Amazonas e Orinoco. Eventualmente, eles migram das águas claras para as
escuras para se alimentarem em florestas de áreas alagadas (Goulding, 1979, 1980,
1981; Goulding & Carvalho, 1982; Araújo-Lima & Goulding, 1998). Juvenis vivem em
áreas alagadas restritas por aproximadamente 5 a 6 anos. Quando adultos, ao invés
de se alimentarem periodicamente em florestas alagadas, eles raramente
permanecem em lagos de várzea quando esses são separados pela estação de
seca do rio principal (Costa, 1998).
O tambaqui apresenta uma combinação única de dentes molariformes, que
são adaptados a quebrar sementes duras e numerosas cerdas branquiais usadas
para retenção de zooplânctons (Goulding & Carvalho, 1982). Juvenis com tamanho
total inferior a 60 cm são em geral onívoros, se alimentando de frutas, sementes e
zooplânctons (Honda, 1974; Goulding, 1979, 1980; Goulding & Carvalho, 1982;
Villacorta-Corrêa, 1997). Os jovens podem também filtrar os fitoplânctons, e quando
adultos se alimentam exclusivamente de frutas como a Jauarí (Astrocaryum
january), e sementes, como as da Hevea spruceana, H. brasiliensis, o que faz
desses peixes um importante dispersor de sementes (Araújo-Lima & Goulding,
1997). Esses peixes aceitam facilmente alimentos artificiais, tem uma boa
reprodutividade e apresentam cuidado parental (Gomes et al., 2006).
Quando exposto a ambientes hipóxicos, o tambaqui usa sua principal
adaptação para esse tipo de estressor: tem a capacidade de expandir o lábio inferior
e o usa para captar a água da superfície, mais rica em oxigênio, e fazê-la passar por
suas brânquias. Além disso, sofre vários ajustes fisiológicos e metabólicos para
aumentar a eficiência na transferência de oxigênio do ambiente para os tecidos (Val
et al., 1998).
Na Amazônia, o gênero Colossoma se diferenciou precocemente entre os
demais gêneros da subfamília Serrasalminae (Ortí et al. 1996). As respostas
fisiológicas diferenciadas e um padrão gênico relativamente homogêneo, além de
sua ampla distribuição ao longo de toda bacia amazônica, candidatam o Tambaqui
como importante organismo para o biomonitoramento de ambientes impactados por
diferentes xenobióticos. O desenvolvimento de marcadores moleculares que
possam diagnosticar concentrações críticas de compostos petrogênicos através da
identificação de alterações no padrão de expressão é uma alternativa sensível e
com potencial investigativo das estratégias de desintoxicação utilizadas pelos
organismos aquáticos.
1.5 Toxicidade em Peixes
A contaminação aquática é um problema ambiental mundial (Kingston, 2002).
Organismos aquáticos expostos a xenobióticos podem exibir respostas bioquímicas,
fisiológicas e/ou comportamentais adversas nos próprios organismos aquáticos como
também em receptores ecológicos de nível trófico mais alto (Hamilton & Lemly, 1999;
Stevenson & NG, 1999; O‟Connor & Paul, 2000). Uma vez no ambiente aquático, os
xenobióticos podem ser absorvidos por quatro vias: alimentação, ingestão de água,
pela pele e/ou através das brânquias (Heath, 1995; Roesijadi & Robinson, 1994)
sendo que para os peixes amazônicos, devido aos processos de osmorregulação, a
alimentação e a tomada branquial são as principais (Val & Almeida-Val, 1997, 1999).
A ingestão de água é a principal forma de contaminação para peixes marinhos,
enquanto a via cutânea é importante para peixes que encontram-se em estado larval
(Health, 1995; Roesijadi & Robinson, 1994).
As respostas aos agentes estressores, em termos gerais, podem ser
classificadas em respostas primárias, secundárias e terciárias (Iwama et al., 1999).
Entende-se por respostas primárias aquelas que ocorrem imediatamente após a
percepção do estímulo pelo organismo. Nesse caso há liberação de catecolaminas,
corticoesteróides, adrenocorticotróficos e outros hormônios de estresse na circulação
do animal. Respostas secundárias são, em termos gerais, as mudanças metabólicas,
fisiológicas e estruturais como resultado da persistência do agente estressor no seu
ambiente. A exposição crônica ao agente estressor pode atingir níveis mais amplos
como estes: crescimento, resistência a doenças, reprodução, desempenho na
natação etc. Ocorrem, então, as respostas terciárias.
Em peixes, a magnitude e a duração da resposta ao estresse variam de
acordo com o grau de severidade do agente estressor, bem como com a duração da
exposição àquele agente (Strange et al., 1978; Barton et al., 1986; Foo & Lam,
1993). Além disso, as respostas podem variar de uma espécie para outra (Pickering
& Pottinger, 1989).
Ao passo que o estresse severo pode resultar em altas taxas de mortalidade,
o estresse subletal pode comprometer várias funções fisiológicas e
comportamentais, levando à supressão de resistência a doenças e taxa de
crescimento. Isto contribui muito para uma produção abaixo no nível considerado
ótimo (Iwama et al., 1997). Segundo Barton (1997), a noção de que o estresse
constitui um importante ponto a ser considerado na economia pesqueira é hoje idéia
comum entre os piscicultores. O estudo de indicadores de estresse em peixes tem
sido usado como uma poderosa ferramenta para boas práticas de manejo (BPM) em
sistemas de criação. Assim, por meio de contínuo monitoramento, situações de
estresse podem ser evitadas, melhorando-se o perfil zootécnico nas atividades da
piscicultura. O reconhecimento de estados de estresse, bem como o controle da
saúde do peixe, é, portanto, críticos para o sucesso de atividades em aqüicultura
(Iwama et al., 1997). De fato, em ambientes livres de estresse, a produtividade dos
sistemas biológicos é acentuadamente maior que em outros onde haja algum tipo de
agente estressor (Almeida-Val & Val, 1995).
A intensidade e a duração da exposição ao agente estressor podem, em
última análise, determinar se o animal está capacitado a superar o estresse. Muitos
impactos negativos, especialmente na saúde, podem surgir quando o peixe é
exposto a um agente estressor por períodos prolongados. Outro conceito que precisa
ser esclarecido é que o estresse é a resposta fisiológica do animal, enquanto o
agente estressor é o fator causador do estresse (Iwama et al., 1999).
Pesquisas sobre as respostas secundárias e terciárias em peixes submetidos
a agentes estressores em aqüicultura têm crescido rapidamente desde a década de
80 (Barton, 1997). Tais respostas têm sido amplamente usadas como indicadores de
estados alterados em peixes.
Martin Jr & Black (1996) estudaram os efeitos da contaminação de uma
refinaria de petróleo em bagres de canal (Ictalurus punctactus). Utilizando um
conjunto de biomarcadores para avaliação aguda de metais pesados, eles
detectaram um aumento significativo nos níveis de glicose sanguínea e em dois
parâmetros hematológicos: hemoglobina e ácido α – aminolevulínico desidratase,
essas alterações indicam estresse e foram associadas às altas concentrações de
chumbo encontradas em sedimento; este metal inibe a enzima alfa-aminolevulinato
desidratase (ALAD) requerida nos primeiros estágios da síntese de hemoglobina no
tecido hematopoiético. Esses distúrbios são etapas iniciais causadas pela presença
deste elemento.
A presença de uma combinação de xenobióticos em um ambiente aquático
gera efeitos deletérios em populações. Estes efeitos tendem a se manifestar apenas
depois de períodos mais longos de exposição. Quando finalmente o efeito torna-se
claro, o processo destrutivo pode ter ido além do ponto onde isto poderia ser
invertido por ações de recuperação. Desta forma, é melhor prever efeitos nos níveis
hierárquicos mais altos antes que ocorram e isto pode ser feito por meio de análise
de mudança nos processos biológicos em níveis hierárquicos mais baixos, com
identificação de biomarcadores de efeitos que se constituem na realidade em sinais
de advertência (Baker, 1991; Heath, 1995; Kingston, 2002).
Quando incorporados, esses contaminantes podem ser acumulados no
fígado, no rim, nas brânquias, no intestino e no músculo. Uma boa parte desses
elementos é transferida para o fígado e rim para serem biotransformados.
Aproximadamente, 30 enzimas diferentes catalisam reações envolvidas com o
metabolismo de xenobióticos, sendo esse processo bastante complexo. Uma das
reações envolvidas é a hidroxilação, catalisada por membros de uma classe de
enzimas chamada de monoxigenases ou citocromos P450 (CYP). Após esse
processo, o poluente torna-se mais hidrossolúvel e, desta forma, fica facilitada sua
excreção pelo organismo, quer seja pela pele, por meio do muco, pelo intestino, por
meio das fezes, por meio da urina, quer seja pelas brânquias (Heat, 1995; Roesjijadi
& Robinson, 1994; revisto por Oost et al., 2003).
Como se pode observar, alterações causadas por presença de contaminantes
no ambiente aquático atingem diretamente os peixes, causando mudanças adversas
nos mais variados níveis da organização biológica, desde o nível molecular até o
nível populacional (revisto por Oost et al., 2003). Porém, todos os efeitos de um
contaminante químico em um organismo vivo podem ser explicados por um evento
inicial no nível molecular/celular (Corcoran et al., 1994). Eles podem ligar-se a
proteínas de membrana alterando os processos celulares. Por conseguinte, são
afetados o status energético e os gradientes iônicos, dentre outras conseqüências,
conduzindo à interferência em importantes funções celulares, como exposto seguir.
Algumas proteínas que funcionam como fator de transcrição são ativadas por
meio de contaminantes ambientais, por exemplo, ao ligar-se ao contaminante, é
induzida a expressão de genes específicos. Exemplos bem conhecidos são: o
receptor de hidrocarbonetos aromáticos (AhR) e o receptor de estrógeno (ER).
Enquanto hidrocarbonetos aromáticos planares interferem com AhR induzindo
citocromo P4501A, substâncias químicas de estrutura diferente interagem com ER
havendo a indução de genes alvo de ER, tal como o gene para a proteína
vitelogênica de peixe (Billiard et al., 2002; Monk et al., 2003; Teraoka et al., 2003).
Outro exemplo é a indução da proteína heat shock 70 (hsp70), uma proteína rica em
cisteína. Embora sua indução fosse inicialmente associada ao choque térmico,
estudos recentes mostraram que a indução de hsp70 acontece em resposta a uma
variedade de agentes de estresse, incluindo contaminantes aquáticos como metais e
certos praguicidas (Ryan & Hightower, 1994, 1996; Williams et al., 1996). A
metalotioneína é uma outra proteína rica em cisteína capaz de fazer várias ligações
com metais. Contaminação com metais pesados como o cádmio induz a expressão
dessa proteína, indisponibilizando o metal para a célula (Hogstrand & Haux, 1990;
Hyllard et al., 1995; Soazig & Marc, 2003; Simes et al., 2003).
Muitas substâncias agem via membrana. Essa toxicidade basal responde por
mais de 70% de todas as substâncias acumuladas. O distúrbio da membrana celular
também afeta gradientes iônicos, em particular o de Ca+2, que é parte de uma
cascata de sinalização intracelular. Muitas enzimas, como proteases, nucleases e
lípases são reguladas via nível intracelular de Ca+2. O aumento do nível de Ca+2 é,
por exemplo, associado com a indução de apoptoses, incluindo a modificação da
expressão de muitos genes e proteínas (Farber, 1990; Nicotera et al., 1990; Reed,
1990; Pan et al., 2001; Ermak & Davies, 2002).
Os esclarecimentos de como os xenobióticos atuam em nível celular é
importante para o delineamento de estratégias para prevenção dos danos
ambientais (Anjos, 2003). De uma maneira geral, biomarcadores ou biosensores são
utilizados para elucidar o comportamento aquático de contaminantes ambientais,
identificando substâncias tóxicas com baixos níveis na água e avaliando a exposição
de organismos aquáticos.
Um outro fator importante, em se tratando de características dos rios
Amazônicos, é que os organismos precisam sobreviver em condições crônicas de
hipóxia. Variações extremas de níveis de oxigênio dissolvido na água são muito
comuns nos corpos de água de zonas temperadas. Embora variações sazonais de
O2 sejam observadas em sistemas de águas tropicais, variações extremas tendem a
ocorrer num pequeno espaço de tempo. Níveis de oxigênio podem chegar a zero
durante a noite em lagos de várzea e pode alcançar altos níveis de saturação até
meio-dia do dia seguinte (Kramer et al., 1978; Junk et al., 1983; Val, 1986). Essa
rápida variação de O2 disponível tem muitas implicações biológicas, particularmente
nas características respiratórias de animais aquáticos (Val & de Almeida-Val, 1995).
Estratificação termal diurna que é maior a tarde pode se desenvolver durante
estações de altos níveis de água resultando em hipóxia ou às vezes anóxia nas
camadas mais baixas de água (Junk, 1984).
1.6 Metais pesados
Metais como o cobre (Cu) e o cádmio (Cd) em ambientes aquáticos podem
interferir severamente nos processos fisiológicos dos peixes, em função da grande
área branquial exposta ao meio (Wood, 2001), sendo que os mecanismos de ação
tóxica destes metais em particular, a nível fisiológico, envolvem a inibição de
proteínas reguladoras do transporte de íons como a Na+K+ATPase (cobre) e
Ca2+ATPase (cádmio) (Laurén & McDonald, 1987; Verbost et al., 1989).
Segundo Playle e colaboradores (1993a,b), estes metais podem formar
complexos organometálicos com as substâncias húmicas (SH), as quais constituem
a maior parte da matéria orgânica dissolvida. Sendo assim, a toxicidade dos metais
aos organismos aquáticos, ao contrário do que se pensava anteriormente, não está
relacionada à sua concentração total na água, e sim, à sua forma livre (Campbell,
1995). A formação de compostos orgânicos e inorgânicos leva à redução da
toxicidade dos metais aos organismos simplesmente por diminuir a concentração da
forma livre (tóxica) na água que pode interagir biologicamente nos sítios ativos
(Matsuo, 2004)
A concentração de Ca2+ na água afeta a toxicidade do cobre e cádmio nos
peixes de água doce e, como regra geral, os efeitos adversos destes metais são
mais acentuados em águas com baixas concentrações de Ca2+ (Playle et al., 1993b;
Spry & Wiener, 1991; Wood, 2001). Isto pode ser explicado com base na interação
competitiva que existe entre o Ca2+ e os cátions metálicos pelos sítios de ligação nas
brânquias (Playle et al., 1993b; Campbell, 1995; Hollis et al., 1997)
1.6.1 Cobre (Cu)
O cobre é um metal que existe em quatro estados oxidativos: Cu0 (íon
metálico), Cu+ (íon cuproso), Cu2+ (íon cúprico) e Cu3+ (íon trivalente) (Lide &
Frederikse, 1993). Nriagu (1989) estimou que 66% das emissões deste metal no
ambiente eram de origem antropogênica. Sua distribuição no ambiente aquático
pode ocorrer também por meio da precipitação e carreamento para os corpos
d‟água. Este metal é liberado na água como resultado de desgaste ou erosão natural
do solo, descargas de indústrias e estações de tratamento de esgoto (ATSDR,
1990). As concentrações naturais de cobre em águas não contaminadas são
geralmente menores do que 20 µg.l- 1 (Nriagu, 1979). Em águas impactadas pelo
cobre na Amazônia, as concentrações do metal podem superar 1.000 µg.l -1
(Sampaio, 2000).
No ambiente aquático, a disponibilidade do cobre aos organismos depende
principalmente de fatores como o pH, as concentrações de Ca2+ e matéria orgânica
dissolvida (SH) (Playle et al., 1993a,b; Wood, 2001). A influência do Ca2+ e SH na
toxicidade do cobre podem ser explicadas com base na competição mútua que
existe entre estes „ligantes‟ pelos sítios branquiais (Playle et al., 1993b)
A homeostase do cobre nos organismos está sob um rigoroso controle, pois
ao mesmo tempo em que este metal é tóxico, o cobre é um elemento essencial em
vários processos bioquímicos, como nas enzimas envolvidas na respiração celular,
na defesa contra os radicais livres, na função de neurotransmissão, na síntese de
tecido conectivo e no metabolismo celular do ferro. O cobre pode atuar na
transferência de elétrons, como cofator ou como um componente alostérico das
enzimas (revisto por Linder & Hazegh-Azam, 1996).
1.6.2 Cádmio (Cd)
O cádmio é um metal que existe nos estados oxidativos Cd0 e Cd2+, sendo
que a forma tóxica é a forma livre Cd2+. O cádmio, diferente do cobre, não constitui
um elemento essencial ao metabolismo dos organismos e, portanto, pode ser
extremamente tóxico, mesmo em concentrações relativamente baixas (Wood, 2001).
A precipitação de cádmio atmosférico contribui com um grande aporte do metal nos
ecossistemas aquáticos (Nriagu & Pacyna, 1988). Apesar da escassez de dados
sobre a contaminação de cádmio em áreas industrialmente ativas na Amazônia, sua
presença pode estar elevada em função do descarte de efluentes no ambiente
(Matsuo, 2004).
Anualmente, estima-se que cerca de 25.000 a 30.000 toneladas de cádmio
são liberadas no ambiente, sendo que a maior parte resulta de atividades como
mineração e queima de combustíveis fósseis (ATSDR, 1999). Além disso, a
presença do cádmio na água de formação (efluente da indústria petroleira) na região
do rio Urucu (Coari, AM) é relativamente elevada (10 µg.l-1; CETESB). Mesmo que
estes resíduos contendo cádmio não sejam indiscriminadamente liberados no
ambiente aquático, o risco de contaminação está sempre presente.
A toxicidade do cádmio é afetada por vários fatores físico-químicos, entre os
quais o mais importante é a concentração de Ca2+ na água. O aumento na
concentração de Ca2+ também reduz a toxicidade do cádmio em peixes (Richards &
Playle, 1999), o que é explicado novamente com base na competição entre o Ca2+ e
o Cd2+ pelos sítios de ligação nas brânquias (Spry & Wiener, 1991; Hollis et al.,
1997)
A toxicidade do cádmio não é significativamente afetada pela presença de SH
(Playle et al., 1993b; Hollis et al., 1997), como ocorre para o cobre, porque a força de
ligação entre o cádmio e SH é cerca de 10 vezes menor do que entre cobre e SH
(Morel, 1983). Assim, no contexto da Amazônia, o eventual impacto do cádmio em
ambientes aquáticos, particularmente aqueles associados às baixas concentrações
de Ca2+ como as águas pretas, provavelmente resultaria em conseqüências
drásticas para a ictiofauna associada.
A atividade da Ca2+ATPase branquial nos peixes é extremamente sensível ao
cádmio, mesmo em concentrações baixas do metal. A inibição do influxo de Ca2+
transepitelial pelo cádmio é dependente do tempo e da concentração de cádmio
(Verbost et al., 1989). A extrema toxicidade do cádmio mesmo em baixas
concentrações pode ser explicada em função da alta afinidade com que este metal
se liga às brânquias (Playle et al., 1993b). A afinidade de ligação entre o cádmio e as
brânquias é maior do que entre o cobre e as brânquias (Reid & McDonald, 1991;
Playle et al., 1993b).
1.7 Justificativa
Nos últimos anos, a comunidade científica de um modo geral, e as populações
dos países mais industrializados, tem voltado suas preocupações para o impacto
ambiental causado por profundas modificações feitas pelo homem, em particular no
ambiente aquático. O interesse por esse assunto é um reflexo crescente da
consciência mundial de que a água doce é um recurso natural esgotável e suas
fontes são cada vez mais escassas.
Como exposto anteriormente, qualquer dano no organismo se inicia em um
nível molecular e em particular efeitos abaixo da toxicidade sub-aguda podem ser
detectados pelas medidas de marcadores apropriados. Esses marcadores podem
servir como indicadores de contaminação (biomarcadores), mas também indicam
uma exposição que pode ter efeitos crônicos e de longo prazo em organismos e
populações.
Devido a estas flutuações ambientais fortes, torna-se difícil calcular o impacto
da poluição no ecossistema e os riscos potenciais. Peixes são organismos
indicadores bem estabelecidos, uma vez que: (1) foram estudados extensivamente
em muitas áreas impactadas ao redor do mundo; (2) são de grande importância
econômica e nutricional para a população humana; (3) estão expostos diretamente a
contaminantes jogados na água ou lixiviados; (4) estão distribuídos no início, meio e
fim da cadeia trófica aquática e; (5) vários biomarcadores sob nível de toxicidade de
iolagentes químicos presentes em águas contaminadas estão disponíveis.
Portanto torna-se urgente a pesquisa e conhecimento relacionando impacto
ambiental e expressão gênica, pois, por um lado pode auxiliar no biomonitoramento
de ambientes impactados e por outro, vai gerar conhecimento específico de biologia
molecular para characiformes, sabidamente de ampla distribuição na região
neotropical.
1.8 Objetivos
1.8.1 Objetivo Geral:
Caracterizar in silico os biossensores em Colossoma macropomum para
diagnóstico molecular e monitoramento de ambientes impactados.
1.8.2 Objetivos específicos:
- Analisar e caracterizar bancos de dados disponíveis on-line de Danio rerio
(paulistinha) e Ictalurus punctatus (bagre de canal);
- Validar os dados obtidos através de ferramentas de bioinformática dos bancos de
dados citados acima por meio da técnica de RT-PCR em Colossoma macropomum;
- Construir bibliotecas subtrativas de cDNA de Colossoma macropomum (tambaqui)
e com o auxílio de análises de bioinformática, isolar potenciais genes biossensores
de cobre, cádmio e estresse por manuseio para monitorar a ictiofauna de uma região
impactada;
- Selecionar genes relacionados com ambientes impactados por metais pesados
(cobre ou cádmio) e estresse por manuseio nos bancos acima citados e validar
utilizando a técnica de qPCR;
- Dosar algumas enzimas do Colossoma macropomum que também servirão para
comprovar o nível de expressão gênica e o envolvimento com os vários tipos de
estresse citados.
2. MATERIAL E MÉTODOS__________________________________________________
2.1 Análise e caracterização do banco de dados de Danio rerio e Ictalurus
punctatus
As seqüências dos genes disponíveis nos bancos de dados de Danio rerio e
Ictalurus punctatus disponíveis no NCBI (National Center for Biotechnology
Information – www.ncbi.nlm.nih.gov), foram submetidas ao fluxograma de
bioinformática conforme exposto na figura abaixo.
Figura 2: Fluxograma de bioinformática utilizado para anotação dos genes disponíveis em bancos de dados.
As seqüências disponíveis nos bancos de dados foram enviadas para o
programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade, por meio da
ferramenta BLAST. Os resultados foram automaticamente submetidos para análise
por GO (Gene Ontology) (Hu et al., 2007) onde as seqüências foram categorizadas
por processo biológico (BP), função molecular (MF) e componente celular (CC).
EST (NCBI)
Anotação MYSQL
(banco de dados
da NL)
Blast2GO GO:
BP, MF
and CC
Search: Keywords, GO,
gi, etc
2.2 Busca de seqüências de genes de estresse em bancos de dados on-line e
desenho dos oligonucleotídeos utilizados no RT-PCR
Algumas seqüências de genes de estresses ambiental dos eucariotos Danio
rerio, Ictalurus punctatus, entre outras espécies depositadas no banco de dados do
NCBI foram usadas como base para busca de regiões consenso. Os
oligonucleotídeos foram construídos pelo alinhamento das seqüências encontradas
com o uso do programa ClustalW disponível no Software BioEdit Sequence
Alignment Editor versão 7.0.5.3. (Hall, 2001)
Os oligonucleotídeos (primers) redundantes no sentido forward e reverse
foram construídos para os genes das enzimas catalase (CAT), citocromo p450
(citp450), glutamina sintetase (GLU) e proteína de choque térmico 70 (Hsp70). O
RNA ribossomal 18S foi utilizado como controle da reação. Análises dos géis de
agarose foram realizadas com uso do software Sequentix
(www.sequentix.de/software.php). As análises estatísticas foram realizadas com o
uso do programa Statistica 6.0. Os níveis de expressão foram verificados através do
teste t de Student. O nível de significância foi mantido a 0,05 em todos os testes.
Tabela 1: Seqüência de oligonucleotídeos para RT-PCR. CAT: Catalase; Citp450: Citocromo p450; GLU: Glutamina sintase; HSP70: Heat shock protein 70; 18S: RNA ribossomal 18S. ∆*: Temperatura de anelamento de cada par de oligonucleotídeos.
Primer Forward 5’ – 3’ Reverse 5’ – 3’ ∆* Amplicon (pb)
CAT
AGAGCGGATACCAGAGAG GTGGATGAAAGACGGAAAC
48°C
320
Citp450
AAGGGATGGCAGCTGACC GTGATGAAGTCCTCCTCCAAGTT
60°C
400
GLU
ACTGTGGTGTGGGAGCGGAC CATTGTCCAGCCCTCCTTT
50°C
420
HSP70
CAGGTGGCCATGAATCCCC CGTCTTCAATGGTCAGGATGG
54°C
450
18S
AAGCATTTGCCAAGAATGTTTT TTAAGTTTCAGCTTTGCAACCA
42°C
100
.
2.3 Aquisição e aclimatação do tambaqui
Juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum), com tamanho em torno de
6,5 ± 0,5 cm de comprimento e peso de 12,0 ± 3,0 g, foram adquiridos de criações
artificiais da fazenda Litiara, Km 240 da estrada AM-010, Manaus, AM e
transportados para o laboratório onde foram acondicionados em tanques de 1000L
contendo aeração constante e alimentação ad libitum. Transcorrido o período de
aclimatação de uma semana, 12 animais foram transferidos para recipientes
individuais de 4,5 L contendo aeração constante, onde permaneceram por mais 24
horas (Figura 3).
Figura 3. Desenho experimental; Foto: Arquivo pessoal.
2.3.1 Indução de estresse por metais pesado e estresse físico
O experimento consistiu em quatro grupos, cada um com três tambaquis. Os
grupos não expostos (controle) foram comparados com os três grupos
simultaneamente expostos. O primeiro foi exposto à água misturada com uma
solução de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4. 5H2O) na concentração de 20
µg/L do íon cobre (Julliard et al., 1995). O segundo grupo foi exposto ao nitrato de
cádmio pentahidratado [Cd(NO3).4H2O] na concentração de 10 µg/L de íon cádmio
(Hollis et al., 2000), ambos os grupos foram expostos durante uma e três horas. O
terceiro grupo foi submetido a estresse manual (mecânico) durante cinco minutos
diários por três dias consecutivos com intervalo de 24 horas entre as agitações
mecânicas. Valores iniciais e finais de oxigênio dissolvidos da água foram medidos
com o uso do oxímetro YSI550 A (YSI Incorporated), onde a concentração foi
mantinda em torno de 6,6 mg/L. A temperatura da água foi 29 ± 0,5 °C. Valores
iniciais e finais de cada metal na água foram analisadas em espectrofotômetro de
absorção atômica (AAnalyst 800, Perkin-Elmer), conforme orientação do fabricante.
Transcorrido o período de exposição, os animais foram removidos dos recipientes
sacrificados para retirada de tecidos.
Tabela 2: Concentrações de cobre e cádmio total nas amostras dos tratamentos de exposição do tambaqui aos metais (Média ± SEM).
Concentração nominal usada nos
tratamentos
Concentração do metal nos tratamentos analisados por AAS-GF (em µg/L)
[Controle] [Inicial] [Final]
Cobre 20 µg/L 2,51±0,12 8,49±0,17 6,87±0,97
Cádmio 10 µg/L 0,08±0,03 5,62±0,07 5,04±0,32
2.3.2 Coleta e conservação dos tecidos
A extração dos tecidos foi realizada com auxílio de material cirúrgico
adequado e em seguida, fígado e músculo foram colocados em microtubos de 1,5
mL e congelados em nitrogênio líquido e transferidos para um freezer -80 C (Figura
4).
Figura 4: Extração de tecido. Foto: cedida gentilmente por Susy Góes.
2.3.3 Extração do RNA mensageiro
A extração de RNAs de fígado e músculo foram extraídos com o uso do kit
Fast Track® Mag mRNA Isolation (Invitrogen), conforme instrução do fabricante. A
descrição de cada solução não foi fornecida pelo fabricante.
Para o preparo do tecido, foi adicionado o tampão de lise (L4) mais a enzima
proteinase K (20mg/mL), seguidos de homogeneização, posteriormente, as amostras
foram centrifugadas a 3000 x g, por 5 minutos, à temperatura ambiente.
Cuidadosamente, o sobrenadante foi transferido para um tubo de 1,5 mL estéril e
incubado 45°C por 10 minutos. Enquanto as amostras estavam sendo incubadas, foi
executado o procedimento de lavagem e ligação das esferas magnéticas.
No procedimento de lavagem e ligação das esferas magnéticas, as esferas
foram homogeneizadas com a pipeta, separando 30 µL em microtubos de 1,5 mL
estéreis para cada amostra de RNA extraído. Os tubos com as esferas foram
colocados na estante magnética e quando as esferas estavam claramente separadas
do líquido, este foi removido e descartado, sendo imediatamente adicionado 200 µL
de tampão de lavagem (W7) em cada tubo. Os tubos foram retirados da estante e as
esferas foram homogeneizadas com o auxílio da pipeta. Novamente, as esferas
foram colocadas na estante magnética e separadas do líquido e descartado.
Imediatamente, a lavagem com tampão (W7) foi repetida, seguida da separação do
líquido e descarte. Em seguida, foram adicionadas às esferas, as amostras de tecido
que estavam sendo incubadas a 45° C por 10 minutos, e 200 µL de tampão de
ligação (B6) previamente aquecido a 65 ou 70° C. Os tubos foram removidos da
estante e ressuspendidos na solução com ajuda da pipeta. As amostras foram
incubadas a 65 ou 70° C por 5 minutos e centrifugadas a 3000 x g por 10 minutos à
temperatura ambiente.
No procedimento de lavagem e eluição, os tubos foram inseridos na estante
magnética, quando o líquido tornou-se transparente, ele foi removido.
Imediatamente, foi adicionado 200 µL do tampão de lavagem (W6). As amostras
foram removidas da estante e as esferas ressuspendidas com auxílio da pipeta.
Adicionou-se 2 µL (2U) de DNase I, misturando cuidadosamente e incubando a 25°
C por 5 minutos. Os tubos foram reinseridos na estante e quando as esferas
estavam claramente separadas, o tampão de lavagem foi removido completamente e
descartado. Às esferas, adicionou-se imediatamente 200 µL de tampão de lavagem
(W7), ressuspendendo-as. Quando as esferas tornaram-se transparentes, o líquido
foi descartado. O procedimento de lavagem com tampão de lavagem (W7) foi
repetido mais 2 vezes. Após todo esse procedimento de lavagens das esferas, foi
adicionado 20 µL de água livre de RNA, ressuspendendo as esferas e incubando-as
a 37° C por 3 minutos. Os tubos foram colocados na estante e quando as esferas
ficaram claramente separadas do líquido, este foi recuperado e transferido para outro
tubo limpo. A etapa de eluição com água foi repetido com 10 µL e o líquido presente
nesta última etapa foi combinado ao sobrenadante anterior, gerando um volume final
de 30 µL de mRNA extraído por amostra. Os RNAs mensageiros foram
armazenados em freezer -80°C.
A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1% (m/v), com tampão TAE 1X,
corado com brometo de etídio, durante 30 minutos. O gel foi visualizado em
transiluminador de luz ultra-violeta (UV).
2.3.4 Síntese de cDNA
Após extração, as amostras de RNA foram convertidas em cDNA, por
tratamento enzimático com transcriptase reversa (M-MLV Reverse Transcriptase
(200 U/μL, USB). Para isto, foram misturados em um microtubo de 1,5 mL
aproximadamente de 2-5 µg RNAm, 1,0 µL de oligonucleotídeo dT(18) (1 μg), 1,0 µL
de dNTP mix (10 mM), tampão 5X M-MLV e água deionizada (q.s.p) para um volume
final de 50 μL, posteriormente, o tubo foi incubado 37° C por 1 hora para a conversão
e 70° C por 10 minutos para inativação da enzima.
Para confirmação da síntese de cDNA, foi realizada uma eletroforese em gel
de agarose 1% (m/v), com tampão TAE 1X, corado com brometo de etídio. O tempo
de corrida foi de 30 minutos e o gel foi visualizado em transiluminador de luz UV.
Com o sucesso da síntese de cDNA, as amostras foram quantificadas com
auxílio de espectrofotômetro utilizando comprimento de onda de 260nm. O cálculo da
concentração foi obtido pela multiplicação dos seguintes fatores: Abs260nm x 33 x
fator de diluição, onde 33 é o coeficiente de correção para cDNA fita simples
(Sambrook & Russel, 2001).
2.4 Transcriptase Reversa - Reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)
A transcriptase reversa foi conduzida para determinar a expressão relativa da
catalase, heat shock protein 70 (hsp70), glutamina sintase (GLU) e citocromo p450
em RNAs extraídos de tecidos de fígado de tambaqui.
Amostras com aproximadamente 2 µg de cDNA obtidas dos tecidos de
animais controle e submetidos ao estresses químicos e mecânico foram sintetizadas
em solução contendo enzima Paq5000 DNA polimerase (5U/μL), tampão de reação
10X Paq5000, 1,0 μL dNTP mix (10mM), primer F (5 pmol), primer R (5 pmol),
adicionando água para um volume final de 25 μL.
As amostras foram submetidas às temperaturas de 94° C por 30 segundos, 30
ciclos de 94° C por 20 segundos, ∆* por 45 segundos e 72° C por 1 minuto, extensão
de final de 72° C por 5 minutos.
Após término da PCR, a eletroforese foi realizada em gel de agarose 1,5%
(m/v), em tampão TAE 1X e corado com brometo de etídio. As bandas amplificadas
foram separadas durante 40 minutos. O gel foi visualizado no transiluminador de UV.
2.4.1 Purificação dos fragmentos oriundos do gel de RT-PCR
Após a eletroforese, os fragmentos amplificados foram recortados do gel com
auxílio de lâmina de bisturi estéril e purificados com o uso o Kit Concert Gel
Extraction Systems (GibcoBRL), para posterior clonagem e sequenciamento. Os
reagentes que compõem cada solução não foram disponibilizados pelo fabricante.
Antes de iniciar a purificação, o tampão TE (fornecido pelo kit) foi aquecido a
65° C. Os fragmentos excisados de um gel de agarose 1,5% (m/v) foram colocados
em tubos de 1,5 mL, lavados com 300 µL (30 µL para cada 10 mg de gel) de tampão
solubilizador de gel (L1) e em seguida, incubados a 50° C até que a agarose fosse
dissolvida (em torno de 8-10 minutos). Os filtros foram colocados em tubos coletores
(fornecidos pelo kit) e as amostras foram transferidas para os filtros, incubadas à
temperatura ambiente por 2 minutos e centrifugadas a 9000 x g por 1 minuto,
também à temperatura ambiente. O líquido foi descartado do tubo coletor e retornou-
se o filtro para o mesmo tubo para posterior lavagem. Foi adicionado, então, 700 µL
de tampão de lavagem (L2) e novamente incubado à temperatura ambiente por 5
minutos. As amostras foram centrifugadas a 9000 x g por 2 minutos à temperatura
ambiente e o líquido coletado foi descartado. A centrifugação foi repetida para que
todo resíduo de tampão de lavagem fosse removido. O filtro foi transferido para um
tubo de 1,5 mL e posteriormente adicionado 30 µL do tampão TE aquecido
diretamente no centro da resina. As amostras foram incubadas por 5 minutos à
temperatura ambiente seguido de centrifugação por 12000 x g por 5 minutos. O
filtrado foi armazenado a -20° C para posterior análise.
2.4.2 Ligação dos fragmentos purificados
Os fragmentos purificados (100-200 ng) foram ligados em 1 µL de vetor p-
GEM-T-easy 50 ng/µL(Promega) (Anexo I), pela ação de 1 µL de T4 ligase e 2 µL de
10X Tampão de ligação, totalizando um volume total de 20 µL. A reação foi
incubada a 16° C durante 22 horas.
2.4.3 Transformação de bactérias
Após a ligação, as amostras foram transformadas utilizando células
competentes da linhagem MosBlue {Genótipo: endA1, hsdR17(rk12-mk12) supE44, thi-
1, recA1, gyrA96 relA1, lac [F‟proA+B+, laclqZ∆M15:Tn10(TcR)]} preparadas com
cloreto de cálcio (Sambrook & Russel, 2001). O volume total de cada ligação foi
adicionado em bactéria competente. As bactérias permaneceram no gelo por 30
minutos, seguido de um choque térmico de 42°C por 40 segundos e dois minutos no
gelo. Após o choque, foram adicionados 800 µL de meio LB (Luria-Bertani) líquido
sem antibiótico (10 g Triptona; 5 g extrato de levedura; 0,2 g cloreto de potássio; 0,6
g cloreto de sódio; água q.s.p. 1000 mL, pH 7,4) em cada tubo, que foram levados a
estufa 37° C, onde incubaram por 1 hora. Decorrido o tempo, as amostras foram
centrifugadas 3750 x g por 5 minutos à temperatura ambiente. O excesso de meio foi
descartado e o precipitado foi estriado em placas de Petri (9 x 11 cm) contendo 20
mL de LB sólido (10 g Triptona; 5 g extrato de levedura; 0,2 g cloreto de potássio; 0,6
g cloreto de sódio; 1,5% (m/v) agar; água q.s.p. 1000mL, pH 7,4) sólido com
antibióticos seletivos tetraciclina (15 mg/mL) e ampicilina (50 mg/mL). Além dos
antibióticos, foi adicionado em cada placa 20 µL de IPTG 1M (isopropyl-β-D-
thiogalactopyranoside) e 20 µL (20 mg/ml) X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-
galactoside) para seleção de colônias transformadas (vetores com inserto) das não-
transformadas (vetores sem inserto). As placas foram incubadas a 37° C durante 18
a 22 horas até o desenvolvimento das colônias.
2.4.4 Extração de DNA plasmidial em microtubos
As colônias brancas (transformadas) foram selecionadas e isoladas em tubos
de 15 mL, tipo Falcon, contendo meio LB líquido com ampicilina (resistência do vetor
pGEM-T easy) e tetraciclina (resistência da bactéria Mos Blue) nas concentrações de
50 mg/mL e 15 mg/mL, respectivamente a 165 x g, 37º C por 22 horas.
Após o crescimento dos clones, foi realizada a extração de DNA plasmidial As
células cultivadas em tubo de 15 mL, tipo Falcon, foram transferidas para tubos de
1,5 mL e centrifugadas a 9000 x g por 1 minuto à 4° C. Em seguida, o meio foi
removido por aspiração, deixando o precipitado seco.
O precipitado foi ressuspendido em 100 µL de solução I gelada (Glicose
50mM; Tris-HCl 25mM, pH 8,0 contendo EDTA 10mM (pH 8,0). Após lavagem, foi
adicionado 200 µL de solução II [0,2N NaOH; SDS 1% (m/v)], misturado por inversão
e incubado no gelo por 5 minutos. Em seguida, foi adicionado 150 µL de solução III
(60 mL de acetato de potássio 5M; 11,5 mL de ácido acético; água para um volume
final de 100 mL), misturado por inversão e incubado no gelo por 5 minutos. As
amostras foram centrifugadas à 9000 x g por 5 minutos à 4° C e o sobrenadante
transferido para um tubo limpo.
Ao sobrenadante foi adicionado 5 µL de RNase (10 mg/mL) incubando a 65° C
por 1 hora e inativando-a à 85° C por 5 minutos. Em seguida, adicionou igual volume
de uma mistura fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Misturou-se em vortex e
em seguida centrifugou-se a 9000 x g por 2 minutos a 4° C para separação das
fases. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 1,5 mL estéril. O DNA foi
precipitado com 2 volumes de etanol e 1/10 volume de acetato de potássio 3M,
mantendo no gelo por 5 minutos. Novamente, centrifugou-se a 9000 x g por 5
minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido cuidadosamente e o precipitado lavado
com 200 µL de etanol 70% (v/v). O etanol foi removido e o precipitado seco a
temperatura ambiente. Em seguida, foi dissolvido em 30 µL de água estéril.
A extração do DNA foi verificada em gel de agarose 1% (m/v) corado com
brometo de etídio, corrido em tampão TAE 1X (TAE 50X – Tris base: 242 g; ácido
acético glacial: 57,1 mL; 100mL de EDTA 0,5M, ajustado o pH em 8,0; água
destilada q.s.p. 1000mL) por 30 minutos. O gel foi visualizado sob luz ultravioleta.
2.5 Reação de sequenciamento
A reação de sequenciamento constou da adição de 1 µL de Big Dye V3.1
(Applied Biosystems), 1,5 µL de tampão big dye 2X, 3 µL de DNA (aproximadamente
100 ng) e primer M13 reverso (CAGGAAACAGCTATGAC) (3,2 pmol/µL), em placa
de 96 poços, com as seguintes temperaturas: 96° C por 2 minutos e 39 ciclos de 96°
C por 30 segundos, 50° C por 20 segundos e 60° C por 4 minutos.
Em seguida, foi realizada a precipitação adicionando 40 µL de isopropanol
65% (v/v) à temperatura ambiente, deixando 15 minutos ao abrigo da luz.
Centrifugou-se durante 30 minutos a 3000 x g à temperatura ambiente e o
sobrenadante foi descartado. Em cada poço foram adicionados 200 µL de etanol
60% (v/v) à temperatura ambiente, seguido de 5 minutos de centrifugação a 3000 x
g. O sobrenadante foi descartado e as amostras secas por 30 minutos a 37° C,
protegido da luz. As amostras foram ressuspendidas em 10 µL de formamida Hi-Di
(Applied Biosystems), aquecida a 95° C por 5 minutos e levadas ao gelo por mais 2
minutos. As amostras de DNA foram seqüenciadas com auxílio do seqüenciador
automático de 4 capilares - ABI 3130 Sequence Analizer (Applied Biosystems)
localizado no Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia.
2.6 Construção das bibliotecas de cDNA de Colossoma macropomum
2.6.1 Construção da Biblioteca de cDNA
Para construção da biblioteca de cDNA foi utilizado o kit Creator™ SMART™
cDNA Library Construction (Clontech Laboratories, Inc.), conforme instruções do
fabricante. Cinco bibliotecas foram construídas: 1. controle de fígado (CF), 2.
controle de músculo (CM), 3. fígado de tambaqui expostos ao cobre por 3 horas
(Cu), 4. fígado de tambaqui expostos ao cádmio por 3 horas (Cd) e 5. músculo de
tambaqui submetido ao estresse mecânico (A).
2.6.2 Síntese da fita simples de cDNA
Após síntese de mRNA com uso do kit “Fast TrackMAG micro RNAm
isolation”, foi realizada a síntese da fita simples das cDNA com uso de 3 μL de
mRNA (0.1 – 0.5 μg), adicionado a 1 μL de SMART IV Oligonucleotide e 1 μL de
CDS III/3‟ PCR Primer. As amostras foram incubadas a 72° C por 2 minutos e
geladas em gelo por 2 minutos. Em seguida, foram acrescentados aos tubos 2 μL de
5X First-strand Buffer, 1 μL de DTT (20mM), 1 μL de dNTP Mix (10mM) e 1 μL de
PowerScript Reverse Transcriptase, totalizando um volume final de 10 μL de cada
amostra. As amostras foram novamente incubadas a 42° C por 1 hora.
2.6.3 Síntese da fita dupla de cDNA
Para síntese da fita dupla das amostras de cDNA, os seguintes componentes
foram combinados: 2 μL da fita simples de cDNA, 80 μL água deionizada, 10 μL de
10X Advantage 2 PCR buffer, 2 μL de 50X dNTP mix, 2 μL 5‟-PCR primer, 2 μL CDS
III/3‟-PCR primer e 2 μL de 50X Advantage 2 Polymerase mix. A mistura foi incubada
segundo o programa do termociclador: 1 minuto a 95° C (hot start) e 26 ciclos de: 15
segundos a 95° C e 6 minutos a 68°C.
Após a finalização dos ciclos, 5 μL do produto de PCR foi verificado em gel de
agarose 1% (m/v) preparado com tampão TAE 1X contendo brometo de etídio foi
utilizado para visualização do cDNA através da luz ultravioleta.
2.6.4 Digestão com proteinase K
Num tubo estéril, 2 μL da enzima proteinase K (20 μg/μL) foi adicionada em
50 μL do cDNA (0,1 – 4kb) fita dupla oriundo da etapa anterior (2-3 μg) e incubada a
45° C por 20 minutos. Foi adicionado ao tubo 50 μL de água deionizada e 100 μL de
uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Em seguida, as
amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 10500 x g a temperatura ambiente. A
fase superior aquosa foi removida para um tubo estéril e adicionado 100 μL de uma
solução de clorofórmio:álcool isoamilico (24:1) e novamente, foi centrifugado a 10500
x g por 5 minutos a temperatura ambiente. A fase aquosa foi removida e adicionado
10 μL de acetato de sódio 3M, 1,3 μL de glicogênio (20 μg/μL) e 260 μL de etanol
95% (v/v) a temperatura ambiente. Imediatamente, foi centrifugado a 10500 x g por
20 minutos a temperatura ambiente. No final desta etapa, o sobrenadante foi
descartado e o precipitado lavado com 100 μL de etanol 80% (v/v). O precipitado foi
secado para evaporar resíduo de etanol e ressuspendido em 79 μL de água
deionizada.
2.6.5 Digestão com enzima SfiI
A amostra digerida com a proteinase K foi combinada a 10 μL de 10X SfiI
buffer, 10 μL da enzima SfiI e 10 μL de 100X BSA gerando um volume final de 100
μL de amostra. Essas amostras foram incubadas por 2 horas a 50° C.
2.6.6 Ligação e transformação
Após as amostras serem digeridas com as enzimas proteinase K e SfiI, o DNA
foi ligado a 0.1μg/μL do plasmídeo pDNR –LIB (Clontech) (ANEXO II) pela ação da
enzima T4 DNA ligase. Os DNAs ligados foram incubados na presença de tampão
de ligação 10X. O volume final da reação de ligação foi de 10μL. A ligação foi
incubada a 16° C durante 22 horas. A transformação foi realizada por choque
térmico em bactérias competentes da linhagem MosBlue, conforme citado
anteriormente (item 2.4.3, transformação de bactérias). As bactérias foram estriadas
em meio LB sólido contendo tetraciclina (resistência da bactéria) e cloranfenicol
(resistência do vetor pDNR-LIB) nas concentrações de 15 mg/mL e 10 mg/mL,
respectivamente. Os transformantes foram incubados a 37°C por 15 horas. Devido
ao vetor possuir um gene suicida, as bactérias cujos vetores não apresentaram não
sobreviveram.
2.6.7 Extração do DNA plasmidial em placas
A micro-prepeparação de DNA plasmidial de placa de 96 poços foi realizada
adicionando, em cada poço da placa de “deep well”, 800 µL de LB líquido contendo
tetraciclina e cloranfenicol nas concentrações 15 mg/mL e 10 mg/mL,
respectivamente. As colônias de bactérias transformadas foram transferidas para
cada poço da placa, sendo essa selada com adesivo aluminizado e mantida sob
agitação mecânica (165 x g) a 37° C por 22 horas.
A placa foi centrifugada a 3000 x g por 6 minutos a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi removido vertendo a placa bruscamente, deixando secar por 1
minuto. Em cada poço, adicionou-se 240 µL de GTE (Glicose 20% (m/v); EDTA
0,5M, pH 8,0 e Tris-HCl 1M, pH 7,4) e agitou-se em vortex por 2 minutos. Em
seguida, a placa foi centrifugada a 3000 x g por 6 minutos a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi removido vertendo a placa bruscamente sobre um papel
absorvente.
Em cada poço foi adicionado 80 µL de GTE e agitado em vortex novamente.
Em uma placa de poço com formato em “U”, foi adicionado 5 µL de RNAse (10
mg/mL) e transferido 60 µL das células ressuspendidas em GTE. Em seguida, foi
adicionado 60 µL de NaOH (0,2N) e dodecilsulfato de sódio (SDS) 1% (m/v). A placa
foi selada com adesivo aluminizado e misturada por inversão 10 vezes, incubada por
10 minutos e centrifugada a 3000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente.
Para precipitação do DNA cromossômico, foram adicionados 60 µL de acetato
de potássio 3M gelado (14,7g de KOAc; 0,75 mL ácido acético; água destilada q.s.p.
50mL), a placa foi selada com adesivo aluminizado e misturada por inversão 10
vezes, sendo incubada a temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, foi
realizada uma centrifugação de 3000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente, o
selo foi removido e a placa incubada a 90° C por 30 minutos. Após incubação, a
placa foi transferida imediatamente ao gelo por 5 minutos e centrifugada a 3000 x g a
20° C por 4 minutos.
Sobre uma placa de fundo “V”, foi colocada uma placa filtro (MAGV N22) e
transferido todo volume da placa fundo “U”, sendo centrifugada a 3000 x g por 4
minutos a 20° C. Em seguida, o filtro foi removido e adicionado ao filtrado 110 µL de
isopropanol em cada poço. A placa foi selada e misturada por inversão 10 a 20
vezes, seguida de 45 minutos de centrifugação a 3000 x g em temperatura de 20° C.
Para lavagem do DNA, o sobrenadante foi descartado e adicionado 200 µL de etanol
70% (v/v) gelado. A placa foi novamente centrifugada por 5 minutos a 3000 x g a
20°C. O sobrenadante foi removido e a placa, sem selo, secou a temperatura
ambiente por 60 minutos. O DNA foi eluído com 30 µL de água estéril e armazenado
a -20° C.
A extração do DNA foi verificada em gel de agarose 1% (m/v) corado com
brometo de etídio, corrido em tampão TAE 1X por 30 minutos. O gel foi visualizado
sob luz UV.
Após extração do DNA plasmidial, a reação de sequenciamento foi realizada
conforme descrito anteriormente (Item 2.5).
2.7 Análise computacional
Seqüências obtidas com o software Sequence Analysis (Applied Biosystems)
foram submetidas ao fluxograma de bioinformática conforme abaixo:
Figura 5: Pipeline de bioinformática utilizado para anotação do sequenciamento dos fragmentos expressos.
Os arquivos obtidos diretamente do seqüenciador foram aplicados numa
seqüência de softwares para atribuição de qualidade (Phred), agrupamento (Phrap) e
geração de contigs (CAP3). Os contigs foram enviados para o programa BLAST2GO
para busca de homologia e similaridade, através da ferramenta BLAST. Os resultados
foram automaticamente submetidos para análise por GO (Gene Ontology) onde as
Anotação MYSQL
(banco de
dados da NL)
Sim Não
Blast2GO GO: BP, MF
and CC
Blast2GO BLASTn, BLASTx,
tBLASTx
Arquivo .ABI do
sequenciador
Phred/Phrap
CAP3
1
2
3 4
5
seqüências foram categorizadas por processo biológico (BP), função molecular (MF) e
componente celular (CC). O valor de ponto de corte foi de e-value10-6. Em seguida,
todos os resultados obtidos nas etapas (3) e (4) foram armazenados no servidor do
Centro Universitário Nilton Lins, que possui um banco de dados desenvolvido para
comparar todas as informações obtidas com aproximadamente 1.500.000 ESTs
(Expressed Sequence Tags - Etiquetas de Genes Expressos) de peixes existentes em
outros bancos de dados da web.
2.8 qPCR
2.8.1 Desenho dos oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR quantitativo
As seqüências dos genes “recombination activating 2” (Rag2) e alfa-
tropomiosyna (Trop) de tambaqui, oriundas do sequenciamento da biblioteca de
cDNA, foram utilizadas para o desenho dos oligonucleotídeos. Todos os iniciadores
foram desenhados com o uso do Software Oligo Explorer 1.2 (Gene Link)
(http://www.genelink.com/tools/gl-oe.asp). Os primers amplificaram produtos entre 98
-102 pares de bases de comprimento, estando assim, dentro do parâmetro 50 -150
pares de bases requeridos pelo fabricante para uso do ensaio SYBER Green
(Applied Biosystems).
Tabela 3: Oligonucleotídeos desenhados para análises qPCR. rag2: Recombination activating gene 2; trop: Alfa tropomiosina
Primer
Forward 5’ – 3’ Reverse 5’ – 3’
Amplicon
(pb)
Rag2
CTGCGTGCCATCTCATTCTC TACCTTCGGGACTCACAATG
102
Trop
TGAGAAGGCTGCTGATGAGA GTATGGCACCTTGTTTCGCT
98
2.8.2 Reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR)
As reações de PCR, para a análise de expressão por RT-PCR em tempo real,
foram feitas utilizando o aparelho ABI Prism 7300 Sequence Detection System
(Applied Biosystems, CA). As reações de PCR foram feitas com 5 µL de SYBR®
Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 0,5 µL do iniciador 1
(1pmol/μL) e 0,5 µL do iniciador 2 (1 pmol/μL) e 200 ng de cDNA. As condições de
reação foram: um passo inicial de 95° C por 10 minutos, seguidos por 40 ciclos de
95° C por 15 segundos e 60°C por 30 segundos. As reações foram realizadas em
triplicata, permitindo a detecção de possíveis erros. Quando os resultados das
triplicatas apresentaram uma variação maior que um ciclo, novas repetições foram
feitas. Controles negativos também foram feitos como uma forma de detectar
possíveis contaminações. Todas as análises foram baseadas no cálculo dos valores
do threshold cycle time (Ct) dos produtos de pcr. O Ct é definido como o ciclo do
PCR onde o sinal fluorescente intercepta a linha de threshold que é estabelecida na
fase exponencial da curva de amplificação. Baseline e threshold foram obtidos
automaticamente com o uso do software de análise ABI Prism 7300 SDS software
versão 1.3.1.
2.8.3 Elaboração da curva padrão
A curva padrão é feita a partir de um PCR em tempo real de alíquotas de
concentrações conhecidas do DNA do clone e seus respectivos iniciadores em 7
pontos diferentes (500 ng/L até 500 fg/L), onde a partir da equação da reta,
fornecida pela curva padrão de cada par de oligonucleotídeos, foi feito o cálculo do
número de cópias de cada gene.
2.9 Dosagem Enzimática
As dosagens destas enzimas serviram para comprovar a expressão gênica e
as integrações de vias metabólicas mediante a exposição ao estresse.
2.9.1 Glutationa S-transferase (GST) (E.C 2.5.1.18)
A atividade da GST foi avaliada com auxílio do Glutathione S-Transferase
Assay Kit (Cayman Chemical), conforme instruções do fabricante.
Dez microlitros de tampão de reação concentrado foi diluído em 10 mL de
água deionizada (fosfato de potássio 100 mM, pH 6,5, contendo 0,1% de Triton X-
100). Cinco mililitros de tampão de amostra concentrado (fosfato de potássio 100
mM, pH 6,5, contendo 0,1% de Triton X-100, glutationa 1 mM e 1 mg/ml BSA) foi
diluído em 5 mL de água deionizada.
O tecido foi previamente lavado com solução PBS (tampão salino, pH 7,4)
para remoção de células vermelhas, em seguida, o tecido foi homogeneizado em 1
mL de tampão gelado (100 mM fosfato de potássio, pH 7,0 contendo 2 mM EDTA).
As amostras foram centrifugadas a 10000 x g por 15 minutos em temperatura de 4°C
e no final da centrifugação o sobrenadante foi removido e utilizado para realização
das análises.
O controle negativo foi amostrado com 170 L de tampão de reação e 20 L
de glutationa. Controle positivo (GST de fígado de rato) foi amostrado com 150 L de
tampão de reação, 20 L de glutationa e 20 L de GST diluída (10 L da enzima
diluída em 190 L de tampão de amostra previamente diluído). Às amostras, foram
adicionados 150 L de tampão de reação, 20 L de glutationa e 20 L de amostra. A
reação foi iniciada adicionando 10 L de 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) em
todas as amostras seguida de breve agitação. Cuidadosamente, a placa foi agitada
por poucos segundos. Em seguida, foram tomadas medidas de absorbância
utilizando comprimento de onda de 340 nanômetros. Para o cálculo da atividade foi
utilizado coeficiente de extinção molar (ε) de 9,6 mM-1.cm-1. Todas as amostras
foram analisadas em triplicata. A concentração final foi expressa em nmol/min/mL.
2.9.2 Catalase (CAT) (E.C 1.11.1.6)
A atividade da CAT foi medida com auxílio do Catalase Assay Kit (Cayman
Chemical), conforme instruções do fabricante.
O tampão de reação concentrado foi diluído em 18 mL de água deionizada (
fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0). Tampão de amostra concentrado foi diluído em
45 mL de água deionizada (fosfato de potássio 25 mM, pH 7,5, contendo EDTA 1
mM e BSA 0,1%). À catalase liofilizada, foi adicionado 2 mL de tampão de amostra
diluído. Cem microlitros da enzima catalase foi diluída em 1,9 mL de tampão de
amostra diluído. Quarenta microlitros de peróxido de hidrogênio (8,82 M) foi
adicionado a 9,96 mL de água.
A amostra foi preparada lavando o tecido com solução PBS (solução salina
pH 7,4) para remoção de células vermelhas. O tecido foi homogeneizado em 1 mL
de tampão gelado (100 mM fosfato de potássio, pH 7,0 contendo 2 mM EDTA). As
amostras foram centrifugadas a 10000 x g por 15 minutos à 4°C. O sobrenadante foi
removido e utilizado para realização das análises.
Os padrões de formaldeído foram preparados com 10 L de formaldeído
diluído em 9,99 mL de tampão de amostra (diluído) para obter uma solução estoque
de 4,25 mM. Quantidades do estoque de formaldeído e tampão de amostra (diluído)
foram separados em tubos conforme descrito na tabela abaixo.
Tabela 4: * Concentração final de formaldeído em 170 L de reação para construção da curva padrão da catalase.
Tubo Formaldeído (L) Tampão de amostra (L) Concentração final
(µM formaldeído)*
A 0 1,000 0
B 10 990 5
C 30 970 15
D 60 940 30
E 90 910 45
F 120 880 60
G 150 850 75
Aos poços com formaldeído padrão, foi adicionado 100 L de tampão de
reação (diluído), 30 L de metanol e 20 L de padrão (tubos A-G) por poço
(duplicata). O controle positivo (F-G) foi preparado com 100 L de tampão de reação,
30 L de metanol e 20 L de catalase diluída em duplicata. Aos poços com amostras
a serem analisadas foram adicionados 100 L de tampão de reação diluído, 30 L de
metanol e 20 L das amostras (triplicata). A reação foi iniciada adicionando 20 L de
peróxido de hidrogênio diluído, cobrindo a placa com selo e incubando em agitação
por 20 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, foi adicionado 30 L de
hidróxido de potássio 10M para finalizar a reação e então aplicado 30 L de Purpald
(4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole em 0,5M de ácido hidroclorídrico). A
placa foi selada com selo transparente e incubada em agitação por 10 minutos em
temperatura ambiente. Após incubação, 10 L de 0,5M periodato de potássio foi
adicionado em cada poço, seguido de 5 minutos de agitação em temperatura
ambiente. A absorbância foi obtida a 540 nanômetros e a concentração foi
interpolada da curva padrão. A concentração foi expressa em nmol/min/mL.
3. RESULTADOS ___________________________________________________________
3.1 Categorização dos bancos de dados de Ictalurus punctatus e Danio rerio
Foram analisadas 11.721 seqüências únicas com ontologia do banco de
dados do bagre de canal (Ictalurus punctatus), disponível no NCBI. Dessas, 4.069
foram agrupadas na categoria de função molecular (MF) onde estão incluídas as
atividades estruturais das moléculas, atividades catalíticas, ligação, atividades de
transporte, atividades transdutoras de sinais, atividades regulatórias da transcrição e
atividades regulatórias enzimáticas. Na categoria de processos biológicos (BP), onde
estão 4.408 seqüências únicas, pertencem às funções de regulação do processo
biológico, processo fisiológico, processo celular, desenvolvimento e comportamento.
As 3.244 seqüências restantes foram agrupadas como componente celular (CC), da
qual fazem parte a célula, o meio extracelular e seqüências com funções
desconhecidas (Figura 6).
Do banco de dados do Danio rerio disponível no NCBI, foram analisadas
41.379 seqüências únicas com ontologia. Dessas, 10.790 agruparam-se na categoria
função molecular, constando de funções como ligação, atividades catalíticas,
atividade estrutural da molécula, atividade reguladora da transcrição, atividade de
transdução de sinais e atividade de transporte. Dentro da categoria de processos
biológicos, observou-se 16.643 seqüências únicas, das quais fazem parte processo
celular, processo fisiológico, regulação do processo biológico, desenvolvimento e
resposta à estímulos. E, por último, contendo 13.946 sequências, está a categoria
componente celular, onde estão inseridas as funções das células, organelas,
complexo protéico, região extracelular, envelope celular e membranas do lúmen
(Figura 7).
Ictalurus punctatus
14,10%
12,04%
17%13,50%
2,74%2,61%
16,50%
10%1% 5%
1,80%
1,20%
1,60%
0,90%
Ligação Atividade catalíticaAtividade estrutural da molécula Atividade de transporteFunção molecular obsoleta Atividade transdutora de sinalProcesso fisiológico Processo celularDesenvolvimento Regulação do processo biológicoCélula Função desconhecidaExtracelular Função com <1% representatividade
Figura 6: Categorização do banco de dados do Ictalurus punctatus (bagre de canal) utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
Danio rerio
9,93%
12,50%
12%5,14%4,80%
12,50%
9,90%
2,50%1%
7,01%1,70%
1,30%1,00%
1,90%
5%
2,27%5,64%
1,90%
1,50%
1,50%
Ligação Atividade catalíticaAtividade estrutural da molécula Atividade reguladora da transcriçãoAtividade de transdução de sinais Atividade de transporteProcesso celular Processo fisiológicoRegulação do processo biológico DesenvolvimentoResposta a estímulo ReproduçãoCélula OrganelasComplexo protéico Componente celular desconhecidoMembrana do lumen Região extracelularEnvelope celular Funções com <1% representatividade
Figura 7: Categorização do banco de dados do Danio rerio utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
3.2 Amplificação das amostras com oligonucleotídeos em eletroforese de gel
de agarose
Com quase 70 mil ESTs analisadas foi possível selecionar vários genes de
interesse para o comportamento da expressão gênica de tambaqui expostos a
estresses químicos com relação a exposição ao cobre e ao cádmio.
Foram avaliadas as variações de expressão dos genes heat shock protein 70
(hsp70), catalase (cat), glutamina sintase (glu) e citocromo p450 (citp450) em fígados
de tambaquis submetidos à exposição ao cobre e ao cádmio, separadamente, em
intervalos de tempo de 1 e 3 horas de exposição (Figura 8).
Um aspecto importante antes do início de cada experimento foi verificar a
integridade de cada RNA extraído (Gilsbach et al., 2006; Olsvick et al., 2007), como
mostrado na figura a seguir.
Figura 8: Integridade do RNA utilizado no experimento. Amplificação do RNA ribossomal 18S (A) foi usada como controle. Expressão tecido específica (fígado) de mRNA de Heat Shock Protein 70 (B), Glutamina sintase (C), Catalase (D) e Citocromo p450 (E) em tambaqui, Colossoma macropomum, por RT-PCR.
Em extrações de mRNA de fígado de peixe foi possível observar uma
expressão basal do gene HSP 70 no tecido controle (CF). Para os peixes expostos
ao cobre, em ambos os tratamentos (1 e 3 horas), o nível de expressão do gene
HSP70 foi elevado, mostrado ser um agente estressor intenso, Entretanto não houve
diferença significativa de expressão entre os tempos de exposição a este metal. Em
fígado de peixe exposto ao cádmio, pode-se observar um aumento dos níveis
transcricionais quando o peixe é submetido ao metal por 3 horas, em relação ao
exposto por 1 hora.
Quanto ao gene da glutamina sintase, nos tecidos de fígado controle (CF) foi
observado uma alta expressão dos transcritos. Nos tratamentos com cobre e cádmio,
embora seja possível observar um acentuado aumento em relação ao fígado (tecido
controle), esse aumento variou pouco em relação ao metal e nem ao tempo de
exposição.
Desde a situação controle é possível verificar expressão de mRNA da
catalase, variando conforme o tempo e o íon utilizado como agente estressor. Em 1
hora de exposição, para ambos os metais, houve um aumento de significativo da
expressão, mas diminui quando expostos por 3 horas.
Para a expressão do gene Citp450 em tambaquis controle e expostos, um
padrão de expressão foi observado. Embora na amostra controle de fígado (CF), foi
observada uma reduzida expressão deste gene, os tecidos cujos peixes foram
submetidos à exposição ao cobre por 3 horas apresentaram o dobro da expressão
em relação aos peixes submetidos ao cobre por 1 hora. No tratamento com o íon
cádmio houve uma expressão 2 a 3 vezes mais elevada no tratamento exposto por 1
hora em relação ao peixes expostos, neste solução iônica, por 3 horas. Todos os
genes analisados por RT-PCR foram seqüenciados e mostraram uma alta
similaridade com os genes de outras espécies de peixes dispostas no banco de
dados. (Figuras 9, 10 e 11).
3.3 Biblioteca de cDNA de Colossoma macropomum
Os resultados obtidos do sequenciamento e análise funcional dos genes
referentes às bibliotecas de cDNA em diferentes condições de tratamento estão
representados nas figuras 9, 10 e 11 onde é apresentado um resumo dos genes
obtidos e, pela diferença da cor, a freqüência de ESTs do gene encontrado em cada
biblioteca.
Cada seqüência das bibliotecas de cDNA construídas (aproximadamente 900
seqüências totais) foi comparada com aproximadamente 500 mil EST contidas no
Banco de Dados (FISH-DNA) do Laboratório de Bioinformática do Centro
Universitário Nilton Lins utilizando o pipeline mostrado anteriormente. Dentre os
transcritos obtidos podemos destacar a presença de algumas proteínas (traduzidas
destes transcritos) de interesse, como por exemplo: metaloproteinase 9, superóxido
dismutase, citocromo p450, CD4, CD45, CD6 e MHC classe II. Estes genes
correspondem, respectivamente, a genes da cadeia oxidativa e do sistema imune
que mostraram uma quantidade de transcritos maiores em situações submetidas ao
estresse.
Figura 9: Freqüência dos genes encontrados nas bibliotecas de cDNA de tambaqui. CM: controle músculo; CF: controle fígado; A: músculo agitado; Cu: fígado submetido a cobre; Cd: fígado submetido a cádmio. Tarja preta: transcritos encontrados em grande quantidade na biblioteca; tarja cinza escura: transcritos encontrados em quantidade mediana na biblioteca; tarja cinza claro: transcritos pouco expressos; tarja branca: não observado na biblioteca.
CM CF A Cu Cd
Putative uncharacterized protein
Putative membrane progestin receptor beta
Proteasome-macropain
PERK
Olfactory receptor 3
Nonspecific cytotoxic cell cationic anti-microbial
Nedd4 WW domain-binding protein
Natural resistance-associated macrophage protein
MHC class II antigen
Metabotropic glutamate receptor
Matrix metalloproteinase 9
GST
Latrophilin 2
Integrin beta
Galactosylceramidase
ER-resident chaperone calreticulin
Eif-1a
E2A2 transcription factor
MyoD2 protein
DNA-directed polymerase alpha
(+) (-)
Figura 10: Freqüência dos genes encontrados nas bibliotecas de cDNA de tambaqui. CM: controle músculo; CF: controle fígado; A: músculo agitado; Cu: fígado submetido a cobre; Cd: fígado submetido a cádmio. Tarja preta: transcritos encontrados em grande quantidade na biblioteca; tarja cinza escura: transcritos encontrados em quantidade mediana na biblioteca; tarja cinza claro: transcritos pouco expressos; tarja branca: não observado na biblioteca.
CM CF A Cu Cd
Heat shock protein 90 beta
Heat shock cognate 70 kDa protein
HIF 2 alpha
Cytochrome P450 19A1
Collagen a1(I)
CYP-1A
CD63
CD4-like protein 1
CD45
CBF1 interacting corepressor
Catalase
BRD2
Sox 8
Bradykinin receptor B2
Bifunctional aminoacyl-tRNA synthetase-like protein
Beta-1 integrin
Alpha 3 type I collagen
6-phosphofructo-2-kinase
60S ribosomal protein L24
40S ribosomal protein S30
(+) (-)
Figura 11: Freqüência dos genes encontrados nas bibliotecas de cDNA de tambaqui. CM: controle músculo; CF: controle fígado; A: músculo agitado; Cu: fígado submetido a cobre; Cd: fígado submetido a cádmio. Tarja preta: transcritos encontrados em grande quantidade na biblioteca; tarja cinza escura: transcritos encontrados em quantidade mediana na biblioteca; tarja cinza claro: transcritos pouco expressos; tarja branca: não observado na biblioteca.
O resultado da análise de similaridade e identidade (BLASTn e BLASTx)
foram submetidos, automaticamente ao software BLAST2GO que determina a
ontologia do gene [Gene Ontology (GO)] e consequentemente agrupadas em 3
categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo
biológico (BP).
Os transcritos encontrados na biblioteca de músculo controle foram
agrupados, em sua maioria, em genes relacionados aos componentes celulares
(45%), seguido de função molecular e processos biológicos, conforme exposto na
CM CF A Cu Cd
NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1
XAP-5 protein isoform 5-like
WW domain binding protein 2
Voltage-gated calcium channel subunit Cav2.2-2
Voltage-gated calcium channel subunit Cav2.2-I
unknow protein
Tyrosylprotein sulfotransferase-2
Tyrosinase
Tropomyosin
Taurine transporter
Superoxide dismutase
Stabilin 1-like
Spp1
Sodium channel 5
Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A
Ribosomal protein L13a
Rag-2
Rag-1
RAD 23B protein
Pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme 4
(+) (-)
figura 12 e tabela 5). De mesma maneira, foi possível observar para biblioteca
controle de fígado, onde também 42% dos transcritos foram reunidos no grupo de
componentes celulares (Figura 13, tabela 6). Isso sugere uma estabilidade na
transcrição de genes quando o organismo se encontra em uma situação normal, sem
estresse.
Na biblioteca de tambaqui exposto ao cádmio, pode-se observar e destacar a
expressão de genes relacionados à componente celular, categoria que comporta
30% dos transcritos (Figura 14; tabela 7). Enquanto que na biblioteca de tambaquis
expostos ao cobre, uma maior quantidade de transcritos são agrupados na categoria
de componentes celulares, 45% das ESTs (Figura 15; tabela 8). Na biblioteca de
tambaquis expostos a estresse mecânico, os resultados revelaram que 40% dos
genes foram agrupados na categoria de funções moleculares (Figura 16; tabela 9)
.
Tabela 5: Análise em GO da biblioteca de tambaqui, Colossoma macropomum.
Figura 12: Categorização do banco de dados de tambaqui (músculo) utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
GO Class ID Definições Fração
GO:0005575 Componente celular 20.00%
GO:0005623 Célula 17.50%
GO:0005886 Membrana plasmática 2.50%
GO:0005737 Citoplasma 1.25%
GO:0005576 Região extracelular 1.25%
GO:0005622 Intracelular 1.25%
GO:0005578 Matriz extracellular (sensu Metazoa) 1.25%
GO:0003674 Função molecular 10.62%
GO:0005216 Atividade de canais de íons 6.25%
GO:0004871 Atividade de transdução de sinais 2.50%
GO:0004872 Atividade de receptor 2.50%
GO:0005198 Atividade estrutural da molécula 1.88%
GO:0005488 Ligação 1.25%
GO:0008150 Processo biológico 8.75%
GO:0006810 Tranporte 8.75%
GO:0006811 Transporte de íons 6.25%
GO:0005215 Atividade de transporte 6.25%
Total 100.00%
Controle músculo
20%
18%
11%9%
9%
6%
6%
6%
3%3% 3% 2% 1% 1% 1% 1% 1%
Componente celular Célula Função molecular
Tranporte Processo biológico Transporte de íons
Atividade de canais de íons Atividade de transporte Atividade de transdução de sinais
Membrana plasmática Atividade de receptor Atividade estrutural da molécula
Citoplasma Região extracelular Intracelular
Ligação matriz extracellular
Tabela 6: Análise em GO da biblioteca de tambaqui, Colossoma macropomum.
GO Class ID Definições Fração
GO:0005575 Componente celular 28.68%
GO:0005623 Célula 10.87%
GO:0005622 Intracelular 2.85%
GO:0008150 Processo biológico 18.75%
GO:0008152 Metabolismo 6.66%
GO:0005215 Atividade de transporte 2.78%
GO:0006139 Metabolismo dos ácidos nucléicos 2.35%
GO:0006810 Transporte 1.51%
GO:0006811 Transporte de íons 1.36%
GO:0006350 Transcrição 1.20%
GO:0003674 Função molecular 7.48%
GO:0005488 Ligação 2.73%
GO:0003676 Ligação de ácidos nucléicos 1.04%
GO:0003677 Ligação ao DNA 1.01%
Função com <1% representatividade 10.73%
Total 100.00%
Figura 13: Categorização do banco de dados de tambaqui (fígado) utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
Controle fígado
28,68%
18,75%
10,87%
7,48%
6,66%
2,85%
10,73%1,20%
2,78%
2,73%
2,35%
1,51%
1,36%
1,01%1,04%
Componente celular Processo bio lógico Célula
Função molecular M etabolismo Intracelular
Atividade de transporte Ligação M etabolismo dos ácidos nucléicos
Transporte Transporte de íons Transcrição
Ligação de ácidos nucléicos Ligação ao DNA Funções com < 1% de representatividade
Tabela 7: Análise em GO da biblioteca de tambaqui exposto ao cádmio.
GO Class ID Definições Frações
GO:0005575 Componente celular 10.34%
GO:0005623 Célula 9.72%
GO:0005622 Intracelular 4.39%
GO:0005634 Núcleo 1.57%
GO:0005737 Citoplasma 1.25%
GO:0005886 Membrana plasmática 1.57%
GO:0005840 Ribossomo 1.25%
GO:0008150 Processo biológico 11.44%
GO:0008152 Processos metabólicos 4.08%
GO:0007165 Transdução de sinais 3.29%
GO:0007154 Comunicação celular 3.29%
GO:0006139 Metabolismo de ácidos nucléicos 1.88%
GO:0006350 Transcrição 1.25%
GO:0019538 Metabolismo de proteínas 1.25%
GO:0003674 Função molecular 13.64%
GO:0005488 Ligação 4.39%
GO:0004871 Atividade de transdução de sinais 3.92%
GO:0004872 Atividade de receptor 3.45%
GO:0003824 Atividade catalítica 3.29%
Função <1% representatividade 14.74%
Total 100.00%
Figura 14: Categorização do banco de dados de tambaqui (fígado) exposto ao cádmio ambaqui utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
Exposição à cádmio
13,64%
11,44%
10,34%
9,72%
4,39%4,39%4,08%3,92%3,45%3,29%
24,76%
3,29%
3,29%
1,25%
1,25%
1,88%
1,25%
1,25%
1,57%
1,57%
Função molecular Processo bio lógico Componente celular
Célula Intracelular Ligação
M etabolismo Atividade de transdução de sinal Atividade de receptor
Transdução de sinal Comunicação celular Atividade catalítica
M etabolismo de ácido nucleido M embrana plasmática Núcleo
Citoplasma Transcrição M etabolismo de proteínas
Ribossomo Funções com <1% resentatividade
Tabela 8: Análise em GO da biblioteca tambaqui exposto ao cobre.
GO Class ID Definições Frações
GO:0005575 Componente celular 29.39%
GO:0005623 Célula 13.18%
GO:0005622 Intracelular 2.77%
GO:0005886 Membrana plasmática 1.22%
GO:0008150 Processo biológico 16.35%
GO:0008152 Processos metabolismos 9.19%
GO:0007165 Transdução de sinais 1.49%
GO:0007154 Comunicação celular 1.49%
GO:0006629 Metabolismo de lipídeos 1.42%
GO:0003674 Função molecular 6.76%
GO:0005488 Ligação 2.36%
GO:0004871 Atividade de transdução de sinais 1.76%
GO:0003824 Atividade catalítica 1.69%
GO:0004872 Atividade de receptor 1.55%
GO:0016787 Atividade hidrolase 1.28%
Função com <1% representatividade
8.10%
Total 100.00%
Figura 15: Categorização do banco de dados de tambaqui (fígado) exposto ao cobre de utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
Exposição à cobre
29,39%
16,35%
13,18%
9,19%
8,10%1,49%
1,42%1,28% 1,22%
1,55%
1,49%
1,69%
1,76%
2,36%
2,77%
6,76%
Componente celular Processo bio lógico Célula
M etabolismo Função molecular Intracelular
Ligação Atividade de transdução de sinal Atividade catalítica
Atividade de receptor Transdução de sinais Comunicação celular
M etabolismo de lipídeos Atividade de hidro lase M embrana plasmática
Funções com <1% representatividade
Tabela 9: Análise em GO da biblioteca de tambaqui, Colossoma macropomum, exposto ao estresse mecânico.
GO Class ID Definições Frações
GO:0005575 Componente celular 8.61%
GO:0005623 Célula 7.94%
GO:0005622 Intracelular 2.34%
GO:0005634 Núcleo 1.84%
GO:0008150 Processo biológico 11.71%
GO:0007165 Transdução de sinais 5.02%
GO:0007154 Comunicação celular 5.02%
GO:0008152 Metabolismo 3.76%
GO:0006139 Metabolismo de ácidos nucléicos 2.34%
GO:0006350 Transcrição 2.34%
GO:0019538 Metabolismo de proteínas 1.09%
GO:0003674 Função molecular 13.55%
GO:0004871 Atividade de transdução de sinais 6.35%
GO:0004872 Atividade de receptor 5.43%
GO:0005488 Ligação 4.10%
GO:0003824 Atividade catalítica 2.68%
GO:0016787 Atividade de hidrolase 2.09%
GO:0005515 Ligação de proteínas 1.42%
GO:0008233 Atividade peptidase 1.34%
GO:0003677 Ligação de DNA 1.34%
GO:0003676 Ligação de ácidos nucléicos 1.34%
GO:0000166 Ligação de nucleotídeos 1.17%
GO:0005102 Ligação de receptores 1.00%
Função com <1% representatividade
7.18%
Total 100.00%
Figura 16: Categorização do banco de dados tambaqui (músculo) exposto ao estresse mecânico, utilizando o software BLAST2GO que determina a ontologia do gene [Ontology (GO)], agrupando as seqüências em 3 categorias de GO: componente celular (CC), função molecular (MF) e processo biológico (BP).
Assim, como foram destacados alguns genes expressos diferencialmente,
podemos destacar, também, algumas GO de interesse. Para isto foi realizado uma
mapeamento destas GOs utilizando o software (on-line) Gene Ontology Tools
(www.geneontololy.com).
3.4 q-PCR
Dentre os genes encontrados nas bibliotecas, o Rag-2 e tropomiosina foram
escolhidos e analisados por q-PCR. Nesta análise foi verificada a expressão dos
genes em diferentes tratamentos e exposição. O tratamento com cádmio (10 µg/L)
aumentou significativamente a expressão de mRNA do gene Rag-2. A máxima
resposta foi observada para o maior tempo de exposição (3h). Para este gene, o
número de transcritos em fígado de peixe submetido ao cádmio por 1 hora foi
elevado, enquanto que na exposição ao cobre por 1 hora não houve alteração. Em
músculo de animais estressados, houve um diminuição na expressão do mRNA
(Figura 17).
Exposição a estresse mecânico
13,55%
11,71%
8,61%
7,94%
6,35%5,43%5,02%5,02%
4,10%
3,76%
2,68%
1,34%1,34%
1,17%1,34%
1,09% 1,00% 6,18%
1,42%
1,84%
2,09%
2,34%
2,34%
2,34%
Função molecular Processo bio lógico Componente celular
Célula Atividade de transdução de sinais Atividade de receptor
Transdução de sinais Comunicação celular Ligação
M etabolismo Atividade catalítica Intracelular
M etabolismo de ácidos nucléicos Transcrição Atividade hidro lase
Núcleo Ligação de proteínas Atividade peptidase
Ligação de DNA Ligação de ácidos nucleicos Ligação de nucleotídeos
M etabolismo de proteínas Ligação de receptores Funções com <1% representatividade
0,001
0,01
0,1
1
10
C F C M C u1h C u 3h C d 1h C d 3h A
T ratamento
Ra
g2
(N
úm
ero
de
có
pia
s 1
01
0)
Figura 17: Expressão do mRNA do gene Rag2 (Recombination Activating gene 2) em fígado de tambaqui, Colossoma macropomum, em resposta ao cobre, cádmio e estresse mecânico; (CF) Controle fígado; (CM) Controle músculo; (Cu1h) Exposição ao cobre por 1 hora; (Cu3h) Exposição ao cobre por 3 horas; (Cd1h) Exposição ao cádmio por 1 hora; (Cu3h) Exposição ao cádmio por 3 horas; (A) Exposição a estresse mecânico (N=3)
O nível de transcritos do mRNA da tropomiosina em fígado aumentou na
exposição ao cádmio por 3 horas. A exposição ao cobre por 3 horas induziu uma leve
diminuição da expressão do gene em questão. Níveis elevados do gene podem ser
observados na situação onde o músculo (controle não exposto) e uma leve
diminuição do mesmo em músculo submetido a estresse (Figura 18).
0,00001
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
CF CM Cu 1h Cu 3h Cd 1h Cd 3h A
Tratamento
Tro
p (
Nú
mero
de c
óp
ias 1
01
0)
Figura 18: Expressão do mRNA do gene tropomiosina (Trop) em fígado de tambaqui, Colossoma macropomum, em resposta ao cobre, cádmio e estresse mecânico; (CF) Controle fígado; (CM) Controle músculo; (Cu1h) Exposição ao cobre por 1 hora; (Cu3h) Exposição ao cobre por 3 horas; (Cd1h) Exposição ao cádmio por 1 hora; (Cu3h) Exposição ao cádmio por 3 horas; (A) Exposição a estresse mecânico (N=3)
3.5 Dosagem enzimática
Não houve diferença estatística significativa das atividades da GST (Figura
19) e da catalase (Figura 20) nos tecidos do músculo e fígado dos animais expostos
ao cobre e ao cádmio,
Figura 19: Atividade enzimática da enzima glutationa s-transferase (GST) em fígado e músculo de tambaqui, Colossoma macropomum, em resposta a cobre, cádmio em 3 horas de exposição e estresse mecânico.
Figura 20: Atividade enzimática da enzima catalase em fígado e músculo de tambaqui, Colossoma macropomum, em resposta a cobre, cádmio em 3 horas de exposição e estresse mecânico.
GST- Glutationa s-transferase
0
50
100
150
200
Branco Controle
positivo
(kit)
Controle
fígado
Contole
músculo
Agitado Cobre 3
horas
Cadmio 3
horas
% d
e a
tivid
ad
e (
nm
ol/m
in/m
L)
Catalase
0
20
40
60
80
100
120
Branco Controle
positivo
(kit)
Controle
fígado
Contole
músculo
Agitado Cobre 3
horas
Cadmio 3
horas
% d
e a
tivid
ad
e (
nm
ol/
min
/mL
)
4. DISCUSSÃO _______________________________________________________________
A análise in silico de genes pode fornecer um conjunto de informações para
espécies, sempre considerando um laborioso processo de isolamento dos genes. O
projeto de EST em larga escala gera um perfil de expressão baseado nas
seqüências transcritas e esse tipo de abordagem é muito importante para pesquisas
no genoma de uma dada espécie, podendo ser utilizada em análises genômicas
comparativas por exemplo (Li et al., 2007). Estudos comparativos em sistemas de
defesa antioxidante em peixes são difíceis de serem feitos devido à diferenças
quantitativas reportadas em várias espécies analisadas (Marcon & Wilhelm, 1999).
O Daio rerio é utilizado constantemente em estudos de desenvolvimento
biológico e genética molecular e seu valor em toxicologia é reconhecido. São
conhecidas mais características em D. rerio que em qualquer outra espécie de peixe,
isso inclui morfologia, bioquímica e informações fisiológicas em todos os estágios de
desenvolvimento, tanto em juvenis quanto em adultos de ambos os sexos. Isso faz
do D. rerio um bom organismo modelo para pesquisas em toxicologia onde um dos
objetivos é identificar efeitos adversos por exposições químicas. Por conta dos
genes, receptores e processos moleculares serem altamente conservados no filo
animal, estudos em outros animais podem ser extrapolados ou deduzidos (Revisto
por Hill et al., 2005).
O bagre de canal (Ictalurus punctatus) também é uma importante espécie
modelo para estudos de imunologia comparativa, fisiologia reprodutiva e toxicologia.
O sistema imune desse organismo está entre um dos mais caracterizados em
peixes, pois houveram décadas de pesquisas direcionadas ao estabelecimento da
maquinaria da imunidade adaptativa em teleósteos. Vinte bibliotecas de cDNA foram
construídas do bagre de canal, gerando aproximadamente 20.500 seqüências, onde
1.067 pertencem ao fígado e 546 foram encontradas em músculos. Das 20.500
seqüências, 14963 foram consideradas ESTs únicas (Li et al., 2007), destas, 11721
foram comparadas no presente trabalho.
Comparações entre os bancos de ESTs de Danio rerio, Ictalurus punctatus e
Colossoma macropomum nos permitem concluir que não houveram diferenças entre
as funções apresentadas. Mas esse resultado é em função da análise de
aproxidamente 900 ESTs do tambaqui que foram seqüenciadas, ao contrário das
analisadas neste trabalho para D. rerio e I. punctatus, 41.379 e 11.721,
respectivamente. Um projeto genoma requer esforços e grandes investimentos, um
grande número de laboratórios e inúmeros pesquisadores qualificados. Para
obtenção do genoma do Danio rerio, foi formada uma equipe de aproximadamente
4500 pesquisadores em laboratórios ao redor do mundo, com investimentos do
Sanger Institute e iniciativa do Wellcome Trust
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/), numa cooperação estabelecida desde
2001 que se estende até os dias de hoje (The Zebrafish Model Organism Database -
www.zfin.org). O sequenciamento das bibliotecas de músculo e fígado de tambaqui
foi realizado em seis meses por um grupo muito pequeno de pesquisadores e
aproximadamente 800 clones ainda estão para ser seqüenciados. Sendo assim, é
preciso maiores esforços e investimentos no sequenciamento do organismo em
estudo, já que este organismo é uma das principais fontes de proteína animal na
região norte e possui grande valor comercial. Segundo Li e colaboradores (2007),
outros fatores devem ser considerados em comparações de genomas de diferentes
espécies. Primeiro, uma rápida diversificação intra-específica de família dos genes
apresenta homologia ainda obscuras entre as espécies estudadas. Segundo,
pequenas e/ou seqüências de proteínas divergentes podem ter sido excluídas com a
estringência de parâmetros usados (e-value 10-6). Terceiro, foram encontrados uma
grande número de ESTs com altos valores de qualidade, porém, não foram
observadas homologias em bancos de dados. Os fatores mencionados acima,
especialmente a diversificação de famílias gênicas, pode ser responsável pelo
modesto número de hits em tambaqui.
As comparações entre quantidade de ESTs analisadas em diferentes tecidos
de tambaqui nos sugere uma estabilidade de funções entre os tecidos controle de
fígado e músculo, isto é, houve uma constância nas atividades celulares, biológicas e
moleculares. Por outro lado, a expressão de novas funções em peixes expostos a
estresse, sugere uma resposta fisiológica do animal frente a um desafio ambiental.
em se adaptar ao novo estado. Em peixes expostos cádmio, houve a expressão de
genes de resposta ao estresse (GO:0006950). De forma diferente, peixes expostos
ao cobre apresentaram genes associados a respostas a estímulos endógenos (GO:
0009719). Quanto aos peixes submetidos a estresse mecânico, houve o
aparecimento de genes responsáveis pela morte celular (GO: 0008219) (dados não
divulgados).
A análise conjunta destes dados sugere que há diferentes respostas a
diferentes estímulos. Por exemplo, o cádmio é extremamente tóxico, mesma em
baixas concentrações, fato que é relacionado por não ser um elemento traço
essencial (Wood, 2001). Por outro lado, o cobre é um elemento traço essencial e
frequentemente está sob um controle rigoroso homeostase (revisto por Linder &
Hazegh-Azam, 1996). Portanto, estes fatores podem explicar os diferentes padrões
de expressões dos genes descritos para o tambaqui.
Segundo Bustin (2002), o nível de transcritos de apenas um gene pode ser
usado como biomarcador de estresse em animais. Exposições a metais como o
cobre e o cádmio induzem as proteínas de choque térmico em invertebrados e
peixes (Kohler et al., 1996; Williams et al., 1996). As proteínas de choque térmico
(HSPs) têm a função de manter a propriedade de enovelamento das proteínas
celulares agindo como chaperonas (Frydman & Hartl, 1996). A concentração de
HSPs na célula muda quando ela é submetida a estresse físico e químico (Sanders
& Martin, 1993). O gene Hsp70 é expresso sob condições não estressadas de
maneira tecido-específica (Ali et al., 2003). Assim, como observado em tambaqui, De
Boeck e colaboradores (2003) constataram que a exposição de Cyprinus carpio ao
cobre na concentração de 1.9 mM aumentou o nível de HSP70 em brânquias,
eritrócitos e fígado. Por meio de técnicas diferentes, como o “differential display”,
também pôde ser confirmado a mudança dos níveis de expressão desse gene em
fígado do peixe Chionodraco hamatus submetido a doses subletais de cádmio
(Carginale et al., 2002). Em Danio rerio, após 4 horas de exposição ao cobre e
cádmio, análises utilizando RT-PCR em fígado revelaram que, embora o cádmio seja
conhecido como indutor de Hsp, a expressão do gene não foi significantemente
afetada nesse tecido, em contrapartida a indução do cobre foi observada (Airaksinen
et al., 2003).
A enzima glutamina sintase catalisa a formação dependente de ATP da
glutamina oriunda da amônia e glutamato. Devido a esse papel importante no
metabolismo de nitrogênio, incluindo a biossíntese de nucleotídeo, aminoácido e
uréia, essa enzima possui uma longa história evolutiva (Kumada et al., 1993). A
enzima funcional é composta de 8 subunidades idênticas, com algumas
microheterogeneidade entre as unidades, possivelmente devido a modificações pós-
traducionais (Smirnov et al., 2000). Em peixes, a glutamina sintase é uma enzima
multifuncional, sendo um produto da glutamina, tem diferentes papéis metabólicos.
Segundo Iwata e colaboradores (2000), o fígado é um importante local de
detoxificação da amônia em peixes.
Por meio da análise de RT-PCR foi observado mostrado que o gene da
glutamina sintase é constitutivamente expresso. Para todos os tratamentos, o nível
de mRNA do gene foi induzido no fígado, na primeira e terceira hora de exposição,
em resposta aos metais usados nesse estudo. Um similar aumento nos níveis de
mRNA também foi observado em outras espécies. Em Arabidopsis, A glutamina
sintase foi induzida sob condição de ausência de aminoácidos e expostas a
herbicida (Zhao et al., 1998). Além disso, células selecionadas da planta alfafa, que
contém uma grande número de cópias do gene da glutamina sintase, mostrou um
aumento do nível de mRNA em resposta ao herbicida 1-phosphinothricin (Donn et
al., 1984).
Elevados níveis de expressão do gene, assim como observado no presente
experimento, suporta a hipótese de que a glutamina sintase possui um importante
papel no metabolismo intermediário de aminoácidos, colaborando com detoxificação
da amônia durante a exposição. Segundo Tanguy e colaboradores (2005),
diferenças no padrão de expressão da glutamina sintase em ostras do pacífico
(Crassoteras gigas) observado em exposições a hidrocarbonetos, hipóxia e
pesticidas podem ser parcialmente explicadas pelos diferentes processos de
desintoxicação ativado em resposta aos diferentes estresses usados. Num estudo
prévio desses autores (Boutet et al., 2004), observaram que o metabolismo
energético foi afetado pela contaminação de hidrocarbonetos e a glutamina sintase
que está envolvida na primeira e na segunda fase de detoxificação de xenobióticos
foi regulada. Todos esses processos fisiológicos em resposta a estresse geram
amônia que é parcialmente responsável pela ativação da glutamina sintase.
Por conta dos xenobióticos poder alterar o metabolismo de carboidratos, pelo
aumento do consumo de energia, isso pode aumentar a capacidade enzimática de
metabolizar proteínas do catabolismo para produção de glicose. A via do glutamato é
uma via alternativa para síntese de glicose quando existe esse carboidrato em
pequenas quantidades na célula. Quando o organismo está sob estresse, existe uma
tendência de ativação dessa via, dividindo com o ciclo de krebs o aumento do
potencial de oxidação da célula, conforme mostrado para enzima glutamina sintase
em Danio rerio (Figura 21, enzima destacada em vermelho).
Figura 21: Metabolismo do glutamato em Danio rerio. Fonte: www.genome.jp/kegg
O sistema de defesa antioxidante consiste de algumas enzimas, entre elas
está a catalase, que desempenha um papel importante na manutenção da
homeostase celular e defesa antioxidante pela remoção das espécies reativas de
oxigênio (ROS) (Rudneva, 1999). A catalase é uma oxidoredutase que quebra duas
moléculas de peróxido do hidrogênio em duas moléculas de água e oxigênio (2H2O2
→ 2H2O+O2), removendo assim, a toxicidade do peróxido de hidrogênio (Kashiwagi
et al., 1997)
O estresse oxidativo causado pelas ROS leva a peroxidação lipídica,
desnaturação protéica e dano no DNA nos constituintes do corpo. Isso também leva
a mudança, inibição e uma variedade de ativações enzimáticas que causa dano
celular e um desbalanço da célula, resultando em, por exemplo, apoptose (Choi et
al., 2007).
A atividade deste sistema pode ser ativada ou inibida sob estresse químico
(Cossu et al., 2000). Tanto uma resposta como outra irá depender da intensidade e
duração do estresse aplicado ao organismo, assim como da susceptibilidade deste
organismo ao agente estressor.
Análises de RT-PCR da catalase, em tambaqui expostos por 1 hora a cobre e
cádmio, sugerem que ativação do gene, em ambos os tratamentos, pode ser
considerada como um mecanismo do organismo a fim de enfrentar um estresse
ambiental, prevenindo assim a toxicidade. Quanto aos organismos expostos por 3
horas aos metais, houve uma diminuição dos níveis transcricionais, que pôde ser
gerada pela adaptação do organismo à nova condição ou indicando uma maior
susceptibilidade à contaminação química, podendo ser esperados efeitos adversos
neste caso (Ventura, 2004). Quanto à dosagem enzimática, realizada com o uso de
kits, peixes submetidos aos mesmos tratamentos citados acima, não apresentaram
mudanças de valores de atividade. Esse resultado pode ser em função de que o kit
dosa níveis de proteínas, sendo assim, o tempo de exposição dos organismos aos
agentes estressores foi insuficiente para produzir uma resposta a nível traducional.
A atividade da CAT, como indicadora de estresse oxidativo, tem sido utilizada
em alguns trabalhos no Brasil (Bainy et al., 1996; Wilhelm Filho et al., 2001) e em
outros países (Livingstone et al., 1993; Stephensen et al., 2000; Akcha et al., 2000;
Roméo et al., 2003, Jo et al., 2008). Apesar de grande parte dos trabalhos indicarem
que um aumento de sua atividade significa um mecanismo preventivo à ação de
espécies reativas de oxigênio, autores como Ventura (2004) tem demonstrado
inibição de sua atividade à exposição a certos tipos de poluentes ambientais.
O citocromop450 não é um gene constitutivamente expresso em vários
tecidos de mamíferos e peixes (Olsvik et al., 2007). Experimentos de qPCR em
Platichthys flesus, tratados com cádmio, foi constatado a diminuição da expressão do
gene (Sheader et al., 2006). Conforme observado em tambaqui, a exposição ao
cádmio por 1 hora levou a um aumento do nível de transcritos, seguido de
diminuição, após 3 horas de exposição. Em Anguilla anguilla L exposta ao cobre
numa concentração de 2.5 µM foi observado o aumento dos níveis de Citp450 no
fígado (Gravato et al., 2006), da mesma maneira, pôde-se constatar em tambaqui,
onde houve um aumento gradual de transcritos decorrente do tempo de exposição.
O PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica sensível e acurada para
comparar a expressão de mRNA de genes alvos em amostras transcritas
reversamente (Gilsbach et al., 2006). Os genes Rag 2 e tropomiosina foram
submetidos a análises por qPCR para verificação dos níveis de expressão do mRNA
nos tratamentos propostos.
De uma maneira geral, a diversidade de receptores de antígeno é gerada pelo
rearranjo aleatório entre os segmentos variáveis (V), diversos (D) e junção (J) –
V(D)J dos genes das células B e T em desenvolvimento. Essa diversidade de
receptores garante uma resposta imune eficiente a diversos tipos de agentes
estressores (Jankovic et al., 2004).
As proteínas RAG 1 e RAG2 catalisam a combinação V(D)J com o conjunto
de genes de anticorpos (Oettinger et al., 1990). O Rag se liga e cliva o DNA numa
seqüência de recombinação conservada que flanqueia a imunoglobulina (Ig) e
segmentos dos genes do receptor da célula (TCR). Essas proteínas são essenciais
para reação de recombinação e a perda de uma delas em camundongo e humanos
resulta no completo bloqueamento do desenvolvimento dos linfócitos (Jancovik et al.,
2004).
As proteínas Rag1 e Rag2 são co-expressas em linfócitos em
desenvolvimento e o nível de expressão é regulado de uma maneira estágio –
especifica (29,30). A expressão dos genes Rag é diminuída no ciclo pré-B das
células dos linfócitos, mas não se sabe ao certo se essa regulação é mediada a
níveis transcricionais ou pelo nível de estabilidade do mRNA (Jancovik et al., 2004).
A ausência da expressão deste gene foi explicada por Takeda e
colaboradores (2001) que demonstrou que camundongos mutantes para o gene rag-
2 podem sofrer de linfopenia celular dos linfócitos B e T, além do bloqueio na
maturação de células B e T em fases precoces, provocando um profundo déficit
funcional do sistema imunológico. Essa explicação aplicou-se a expressão do gene
em músculo de peixes controle (expressão elevada) e submetido a estresse físico
(diminuição da expressão), mas não foi aplicado em tambaqui expostos aos metais
pesados. Após 3 horas de exposição do tambaqui ao cádmio, o número de
transcritos do gene Rag 2 foi elevado (1000 vezes maior que o controle), o que pode
ser explicado pela inativação da expressão de genes responsáveis pelo sistema
imune, conforme observado nos genes expressos da biblioteca de tambaqui cujos
tecidos de fígado foram submetidos ao cádmio. Houve um aumento da freqüência de
transcritos do gene Rag 2, enquanto que, na biblioteca onde os peixes foram
expostos ao cobre, a freqüência do Rag 2 foi menor, além disso, houve a expressão
de genes do sistema imune, como o CD45, CD4 like–protein e CD63, não sendo
estes observados em peixes expostos ao cádmio (Figura 9), corroborando com a
explicação acima.
A tropomiosina é uma proteína regulatória que está alinhada dentro dos
pequenos filamentos em músculos (Matsunaga et al., 1999). Elas coordenam as
interações entre o complexo troponina e actina e regula as contrações de músculos
esqueléticos, dependentes da interação actina-miosina, entretanto, sua função em
músculos lisos e células não musculares não está bem elucidada (Toramoto et al.,
2004). A tropomiosina, proteína regulatória do músculo, desempenha um papel
fisiológico significante no processo regulatório da atividade ATPase da actimiosina e
na regulação da contração do músculo estriado (Squire & Morris, 1998).
Análises de qPCR em Fundulus heteroclitus submetidos a arsênio mostrou um
aumento dos níveis de mRNA de tropomiosina (Gonzales et al., 2006). No presente
estudo, a aplicação de cobre, durante 1 e 3 horas, levou a uma diminuição dos níveis
de mRNA de tropomiosina em fígado, enquanto que a exposição ao cádmio, durante
3 horas, houve uma aumento dos transcritos. Pode-se observar como resultado do
sequenciamento de tambaqui exposto ao cádmio, a expressão dos genes relativos à
abertura de canais de cálcio com uma alta frequência (Figura 11). A síntese de
cálcio, em humanos, pode se dar pela ativação dos fatores de transcrição NF-Kβ,
NFAT e AP-1, que por seguinte, estimulam a interleucina-2 (IL-2) e ativam as vias da
fosfolipase C e fosfolipase A2 (via proteína G). Dessa forma, há um aumento na
produção do cálcio no retículo endoplasmático causando aumento da contração
muscular (Nozawa, S.R., comunicação pessoal), o que condiz com o aumento dos
níveis de mRNA da tropomiosina em situações de estresse ao cádmio.
As GSTs são uma superfamília multigênica de enzimas diméricas,
multifuncionais, preferencialmente solúveis e bem distribuídas na natureza, sendo
encontradas em organismos desde bactérias até mamíferos, onde são mais
estudadas (Henson et al., 2000). As GSTs desempenham um papel importante no
processo de biotransformação de compostos derivados dos xenobióticos como:
antibióticos, vasodilatadores, herbicidas, inseticidas, analgésicos, agentes anti-
cancerígenos e carcinogênicos (Hodgson & Levi, 1994).
Sua função é tradicionalmente considerada como sendo a de desintoxicar os
eletrófilos pela conjugação da glutationa durante a fase II da biotransformação
(Strange et al., 2001). Pouco é sabido a respeito da indução de GST em peixes
expostos a vários elementos tóxicos (Olsvick et al., 2007). Segundo Van der Oost e
colaboradores (2003), a atividade da GST é um parâmetro complexo de ser avaliado,
devido ao fato desta enzima poder tanto ser ativada quanto inibida na presença de
certos tipos de contaminantes. No entanto, o aumento de sua atividade tem sido
relatado em vários estudos após a exposição de peixes a contaminantes do tipo
HPAs, BPCs, entre outros (Rodriguez-Ariza et al., 1993; Vigano et al., 1995; Otto &
Moon, 1996).
Possivelmente esta inalteração da GST esteja associada à diminuição do
“pool” citosólico de GSH (a qual não foi medida no presente trabalho), co-substrato
desta enzima, que poderia estar associada a uma condição de estresse oxidativo
hepático, comumente observada em peixes de regiões contaminadas (Bainy et al.,
1996). Um outro fator a ser considerado é que a dosagem se refere ao nível de
tradução da enzima, sendo a proteína expressa mais tardiamente, dessa forma, o
tempo de exposição pode ter sido um fator limitante para observação em nível de
tradução. Não pode deixar de ser comentado que o kit utilizado, tanto para dosagem
da GST quanto da catalase, é para dosagem da enzima em humanos, o que mostra
a necessidade de kits de diagnósticos para peixes para monitoramento de ambientes
impactados.
5. CONCLUSÃO___________________________________________ _________________
O estresse oxidativo causado pelo cobre e cádmio causou variações na
intensidade de expressão de mRNA de enzimas no tecido de fígado. A construção
das bibliotecas de ESTs de tambaqui expostos aos metais e estresse mecânico gerou
um grande número de genes importantes para o metabolismo do organismo, além
daqueles do ciclo oxidativo, expressos em situações de estresse ambiental. Foi
observada uma relação tempo-dependente entre as concentrações de cobre e cádmio
utilizadas para os testes de RT-PCR, o que nos leva a ter genes potenciais que
podem ser usados como indicadores ambientais. Análises de qPCR no Rag 2 e
tropomiosina corroboraram com os resultados encontrados nas bibliotecas cujos
tambaquis foram submetidos a estresse. Os resultados deste projeto abrem uma
gama de opções para novos trabalhos, uma vez que, genes nunca antes descritos
para o tambaqui foram observados. Então, é possível que mRNA de genes
antioxidantes, como a catalase e glutamina sintase, mRNA de genes do ciclo
oxidativo como o HSP70 e a citocromo p450 possam ser usados como biomarcadores
de metais pesados em ambientes contaminados por cobre e cádmio em tambaqui.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _______________________________________
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7. ANEXO_____ ________________________________________________________
1. Vetor pGEM-T Easy
Fonte: www.promega.com
2. Vetor pDNR-LIB
Fonte: www.clontech.com
