MIOPATIAS MITOCONDRIAIS

Carolina Fischinger Moura de Souza

cfsouza@hcpa.ufrgs.br

A MITOCÔNDRIAGlicose

Responsável pela energia celular

Possui seu próprio DNA

mtDNA

Local de várias rotas metabólicas

A MITOCONDRIAGlicose

Responsável pela energia celular

Possui seu próprio DNA

mtDNA

Local de várias rotas metabólicas

Espaço intermembranas

Matriz: diversas proteínas e ciclo de Krebs e o mtDNA

Membrana

interna: CRM

Membrana

externa crist

a

Subunidades codif.pelo mtDNA

Subunidades codif.pelo nDNA

7 0 1 3 2 = 13

39 4 10 10 12 = 75

CADEIA RESPIRATÓRIA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIALMITOCONDRIAL

complexo I complexo II complexo III complexo IV complexo V

Succinato fumarato

gordura

carboidrato

proteínas

Dig

est

ão e

ab

sorç

ão

Ácidos graxos

+ glicerol

glicose

amino ácidos

MITOCÔNDRIA

Acetil CoA

Ciclo de

Krebs 2H

Beta -oxidação

ADP

ATP

O2

H2O

CRM

OXOPHOS: requer uma OXOPHOS: requer uma ação orquestrada de 5 ação orquestrada de 5 complexos enzimáticos complexos enzimáticos com transferência de com transferência de elétrons pelos carreadores elétrons pelos carreadores NADH e FADHNADH e FADH2 2 para a para a molécula de oxigênio molécula de oxigênio

gradiente eletroquímico que gradiente eletroquímico que converte ADP em ATPconverte ADP em ATP

Produção aeróbia de energia:

AS DOENÇAS MITOCONDRIAISAS DOENÇAS MITOCONDRIAIS

Patologias de expressão clínica Patologias de expressão clínica heterogênea caracterizadas por uma heterogênea caracterizadas por uma disfunção na produção de energia disfunção na produção de energia

CERÉBRO

MÚSCULO CORAÇÃO

MULTISSISTÊMICAS

MIOPATIAINSUF. MEDULA ÓSSEA

INSUF. HEPATICA

TUBULOPATIA RENAL

CARDIOMIOPATIA HIPERTRÓFICA

OU

DILATADA

DEFEITO DE CONDUÇÃO CARDÍACO

ALTERAÇÕES NA FIBRA MUSCULAR

FRAQUEZA

FADIGA

INTOLERÂNCIA AO EXERCÍCIO

NEUROPATIA PERIFÉRICA

ALT. TIREÓIDE

DIABETE MELITUS

BAIXA ESTATURA

ENCEFALOPATIA

CONVULSÕES

RETINITE PIGMENTAR

DEMÊNCIA

DEPRESSÃO

ATAXIA

ENXAQUECA

AVC

SURDEZ NEUROSSENSORIAL

HERANÇA MITOCONDRIALHERANÇA MITOCONDRIAL

nN

CÉLULA PROGENITORA

N

Proliferação mtDNA e Citocinese

Segregação Randomizada

90% 70% 50% 30% 10%

Limiar para a expressão fenotípica

FENÓTIPO FENÓTIPO

A herança materna:Cada célula

humana contém 100 mitocôndrias

e cada uma contém 2 a 10

cópias de mtDNA

37 genes:37 genes:

2 RNAs 2 RNAs

ribossômicos ribossômicos

22 RNAs22 RNAs

transportadorestransportadores

13 RNAs 13 RNAs mensageiros = 13 mensageiros = 13 genes que genes que codificam para as codificam para as proteínas da CRMproteínas da CRM

mtDNAmtDNA

DOENÇAS MITOCONDRIAISDOENÇAS MITOCONDRIAIS

Devido ao número variável de mitocôndrias e de Devido ao número variável de mitocôndrias e de mtDNA nos diferentes tecidos mtDNA nos diferentes tecidos co-existência de co-existência de mtDNA normal e mutado mtDNA normal e mutado Heteroplasmia.Heteroplasmia.

Mesma mutação Mesma mutação diferentes manifestações diferentes manifestações clínicas.clínicas.

Diferentes mutações Diferentes mutações manifestação clínica igual. manifestação clínica igual.

Crianças X adultos.Crianças X adultos.

Elevada freqüência: 1/5.000- 10.000 nascidos Elevada freqüência: 1/5.000- 10.000 nascidos vivosvivos(McFarland R. (McFarland R. et alet al, 2002)., 2002).

Causadas por mutações que envolvem o genoma Causadas por mutações que envolvem o genoma mitocondrial e nuclear.mitocondrial e nuclear.

deleções e duplicações

de larga escala

esporádico

CLASSIFICAÇÃO

Mutações do mtDNA

Mutações do DNA nuclear

CPEO - Oftalmoplegia Externa Crônica Progressiva

KSS - Síndrome de Kearns Sayre – alterações cardíacas, proteínorraquia elevada,

oftalmoplegia

PS – Síndrome de Pearson – alterações na medula óssea – pancitopenia, anemia sideroblástica

DOENÇA MULTISSISTÊMICA

PADRÃO MIOPÁTICO

CPEO –17 ANOS

KSS –35 ANOS

KSS–30 ANOS

KSS –35 ANOS

CPEO –30 ANOS

10 ANOS

8 ANOS

13 ANOS

13 ANOS

CLASSIFICAÇÃO

Mutações do mtDNA

mutações de ponto e microdeleç

ão

Herança materna > 200 tipos

diferentes

tRNA:tRNA:MELAS- Miopatia, Encefalopatia, Acidose Lática e

Episódios de Acidente Vascular Cerebral (Mutação A3243G)

MERRF- Epilepsia Mioclônica com Fibras Rotas Vermelhas (RRF) (Mutação A8344G)

NARP- Neuropatia, Ataxia e Retinopatia Pigmentar (mutação T8993G)

Síndrome de LEIGH (DE TRANSMISSÃO MATERNA)-

Encefalomiopatia Subaguda Necrotizante

mRNA: gene ATPase

DOENÇA MULTISSISTÊMICA

ENCEFALOPATIA PROGRESSIVA

MELAS – PACIENTE 18 ANOS

MELAS – PACIENTE 7 ANOS

LEIGH – PACIENTE 1 ANO RRF

CLASSIFICAÇÃO

Mutações do mtDNA

Mutações do DNA nuclear

defeitos bioquímicos

na CRM

Herança mendeliana

CLASSIFICAÇÃO

Mutações do mtDNA

Mutações do DNA nuclear

Defeitos de sinalização

intergenômica

deleções e duplicações de larga

escala

DIAGNÓSTICO DAS MIOPATIAS DIAGNÓSTICO DAS MIOPATIAS MITOCONDRIAISMITOCONDRIAIS

Manifestações Clínicas Músculo: CPEO, fraqueza, fadigaSNC: ataxia, surdez, atrofia óptica

HF sugestiva

Investigação Clínica

Sindrome mitocondrial?(MELAS, MERRF,NARP,LHON) SIM

Testar mutações comuns no sangue

Negativo

NÃO

BIOQUÍMICA

HISTOQUÍMICA

MOLECULAR

ASPECTOS HISTOQUÍMICOSASPECTOS HISTOQUÍMICOS

Corte transversal de tecido muscular: Paciente com S. de Kearns Sayre apresentando hiperatividade (RRF) em SDH e ausência de atividade em Citocromo C Oxidase

RRF na coloração de Tricromio de Gomori.

RRF representada na reação SDH.

Hipoatividade da citocromo C oxidase

ASPECTOS BIOQUÍMICOSASPECTOS BIOQUÍMICOS

Medida da atividade das enzimas da CRM por fluorimetria

Idealmente com homogeneizado de tecido muscular fresco - Medida dos Complexos I, II, III, IV, V

Trabalhoso

Custo elevado

Difícil padronização

Difícil interpretação

Defeitos isolados ou mistos

ASPECTOS MOLECULARESASPECTOS MOLECULARES

Mutações de ponto:

A3243G, 3271-T, A8344G, T8356C e T8993G PCR e digestão por endonuclease de restrição.

Deleção:

Extração de DNA (músculo) digestão com a PvuII separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose 0,8% transferência para membrana de nylon Hybond+ hibridização com sonda previamente marcada com o kit ECLTM Direct nucleic acid labelling and detection system auto-radiografia da membrana.

Seqüenciamento:

método da terminação por fluorescência em seqüenciador automático (ABI PrisMTM 310 - Applied Biosystems).

Canaleta 1: controle positivo; canaletas 3 e 7: pacientes com uma deleção no DNA mitocondrial; canaletas 2, 4, 5 e 6: pacientes que não apresentam uma deleção no DNA mitocondrial.

1 2 3 4 5 6 7 16.569 kb

11.592 kb

Auto-radiografia da detecção de deleções no mtDNA

Arpa, J. et al. Prevalence and Progression of Mitochondrial Diseases: a study of 50 patients

Muscle Nerv 28: 690-695, 2003

PROGNÓSTICOPROGNÓSTICO

TRATAMENTOTRATAMENTO

1) Acompanhamento multidisciplinar: neuro, oftalmo, endócrino, cardio, nefro, gastro, fisioterapeuta, outros.

2) Exercício físico regular individualizado e respeitando limites

3) Evitar stress físico e mental, frio, calor, uso de alcool, nicotina, medicações como corticóides, ác. Valpróico, barbitúricos, tetraciclina, cloranfenicol, etc.

4) Dieta: regular, evitar jejum prolongado, redução de gorduras e rica em CH.

TRATAMENTOTRATAMENTO

5) Vitaminas e outras medicações: sem comprovação científica, tto empírico, mínimo benefício:

• Aceptores de elétrons como a menadiona (vitamina K3) e filoquinona (vitamina K1), e ácido ascórbico (vitamina C) tem sido usados no sentido de melhorar o transporte de elétrons na cadeia respiratória,

• Riboflavina (vitamina B2), na dose de 50-100 mg/dia age como cofator dos complexos I e II.

• Coenzima Q10 (5-15 mg/kg/dia)

• Creatina 100-200 mg/kg/dia

• Dicloroacetato – redução dos níveis de lactato

UM ESTUDO CLÍNICO, BIOQUÍMICO,

HISTOQUÍMICO E GENÉTICO-MOLECULAR

DE PACIENTES COM DOENÇAS DO DNA

MITOCONDRIAL

VARIÁVEL PROBABILIDADEVARIÁVEL PROBABILIDADE

Alta

Combinação de sintomas multisistêmicos patognomônicos de doença mitocondrial, incluindo, no mínimo, 3 sistemas (neurologico, muscular, cardíaco, endócrino, gastrointestinal, renal, hematológico, otológico, oftalmológico ou hepático);

Apresentação de síndrome clássica como MELAS, MERRF, Kearns Sayre, Leigh com herança materna;

Baixa

Crianças com encefalopatia não específica apresentando crises convulsivas, acidose lática e/ou hipotonia;

Pacientes com evolução atípica de doença envolvendo SNC sem achados clínicos característicos e em que já foram excluídas outras patologias;

Sintomas isolados: AVC em pacientes jovens, cardiomiopatia, manifestações endocrinológica ou neurológicas;

43 pacientes

Triagem para 5 mutações de ponto PCR/RFLP

5 pacientes com mutação de ponto no mtDNA (11.6%)

38 sem mutação detectada no mtDNA (88.4%)

4 pacientes com A3243G 1 paciente com T8993G

Biópsia de músculo

SIM23 (53.5%)

NÃO15 (34.9%)

Sequenciamento do tRNALeu(UUR) and tRNAlys

Southern blot

12 pacientes com deleção (27.9%)

26 pacientes negativos para as mutações investigadas

(60,5%)

11 pacientes negativos(25.6%)

RESULTADOS – RESULTADOS – análise de mutaçõesanálise de mutações

Mutação no mtDNA: 17 (39,5%)

RESULTADOS – RESULTADOS – comparação dos positivos com comparação dos positivos com negativosnegativos

Positivo para mutação mtDNA

Negativo para mutação mtDNA

Valor p

Média de idade início dos sintomas 29.5* 17.1* < 0.001

Média de idade na avaliação 28.8* 17.5* 0.004

Média do lactato jejum 18.4* 13.5* NS

Média lactato pós-prandial 17.9* 13.0* NS

Diferença do lactato pré e pós prandial

20.1* 16.4* NS

% (N) % (N)

Sinais e sintomas clínicos:

óbito 23.5 (4) 11.5 (3) NS

alteração EEG 52.9 (9) 65.4 (17) NS

Alteração ENMG (miopatia) 46.7 (7) 11.5 (3) 0.032

Alteração TC ou RNM 64.7 (11) 42.3 (11) NS

Retinopatia pigmentar 41.2 (7) 3.8 (1) 0.007

Oftalmoplegia e ptose palpebral 70.6 (12) 19.2 (5) 0.002

Baixa estatura 59.0 (10) 23.1 (6) 0.04

Atraso no DNPM 35.3 (6) 53.8 (14) NS

Convulsões 41.0 (7) 65.4 (17) NS

Hipotrofismo 76.5 (13) 38.5 (10) 0.033

Acidose lática 82.4 (14) 34.6 (9) 0.006

Herança materna 5.9 (1) 19.2 (5) NS

* Média do Rank

RESULTADOS – RESULTADOS – comparação dos positivos com comparação dos positivos com negativosnegativos

Positivo para mutação mtDNA

Negativo para mutação mtDNA

Valor p

Média de idade início dos sintomas 29.5* 17.1* < 0.001

Média de idade na avaliação 28.8* 17.5* 0.004

Média do lactato jejum 18.4* 13.5* NS

Média lactato pós-prandial 17.9* 13.0* NS

Diferença do lactato pré e pós prandial

20.1* 16.4* NS

% (N) % (N)

Sinais e sintomas clínicos:

óbito 23.5 (4) 11.5 (3) NS

alteração EEG 52.9 (9) 65.4 (17) NS

Alteração ENMG (miopatia) 46.7 (7) 11.5 (3) 0.032

Alteração TC ou RNM 64.7 (11) 42.3 (11) NS

Retinopatia pigmentar 41.2 (7) 3.8 (1) 0.007

Oftalmoplegia e ptose palpebral 70.6 (12) 19.2 (5) 0.002

Baixa estatura 59.0 (10) 23.1 (6) 0.04

Atraso no DNPM 35.3 (6) 53.8 (14) NS

Convulsões 41.0 (7) 65.4 (17) NS

Hipotrofismo 76.5 (13) 38.5 (10) 0.033

Acidose lática 82.4 (14) 34.6 (9) 0.006

Herança materna 5.9 (1) 19.2 (5) NS

* Média do Rank