MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS Monique Luiza... · Ao meu noivo, Camilo Lima, que além de noivo...
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS
PARA A SAÚDE
MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS
ESTUDOS QUÍMICOS-COMPUTACIONAIS, FARMACOCINÉTICOS E
TOXICOLÓGICOS IN SILICO DE DERIVADOS AZAINDÓIS DO
ÁCIDO HIDROXÂMICO, INIBIDORES DA ENZIMA INTEGRASE DO
HIV-1
NITERÓI
2014
MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS
ESTUDOS QUÍMICOS-COMPUTACIONAIS, FARMACOCINÉTICOS E
TOXICOLÓGICOS IN SILICO DE DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO
HIDROXÂMICO, INIBIDORES DA ENZIMA INTEGRASE DO HIV-1
Orientadora: Prof.ª Dr.ª MONIQUE ARAÚJO DE BRITO
Niterói
2014
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-
CAPS) da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para obtenção do Grau
de Mestre. Área de Concentração:
Desenvolvimento de Produtos para Saúde.
FICHA CATALOGRÁFICA
S237 Santos, Monique Luiza Aguiar dos.
Estudos químicos-computacionais, farmacocinéticos e
toxicológicos in silico de derivados azaindóis do ácido hidroxâmico,
inibidores da enzima integrase do HIV-1 / Monique Luiza Aguiar dos
Santos; Orientador: Monique Araújo de Brito. ‒ Niterói, 2014.
115f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal
Fluminense, 2014.
1. Medicamento 2. Síndrome da imunodeficiência adquirida
3. Inibidores de integrase de HIV I. Brito, Monique Araújo de II. Título
CDD 615.1
MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS
ESTUDOS QUÍMICOS-COMPUTACIONAIS, FARMACOCINÉTICOS E
TOXICOLÓGICOS IN SILICO DE DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO
HIDROXÂMICO, INIBIDORES DA ENZIMA INTEGRASE DO HIV-1
Aprovado em: 26 de fevereiro de 2014.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Monique Araújo de Brito (Orientadora)
Faculdade de Farmácia (UFF)
______________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Alessandra Mendonça Teles de Souza
Faculdade de Farmácia (UFRJ)
______________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Luiza Rosária Sousa Dias
Faculdade de Farmácia (UFF)
Niterói, 2014
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-
CAPS) da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para obtenção do Grau
de Mestre. Área de Concentração:
Desenvolvimento de Produtos para Saúde.
DEDICATÓRIA
A Deus,
“Porque Dele e por Ele, e para Ele, são todas as coisas;...”
(Romanos 11:36)
AGRADECIMENTOS
Ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo, por seu infinito amor e fidelidade em todos os
momentos, e por tornar possível a conclusão dessa importante etapa da minha vida. Toda
honra e toda a glória seja dada a Ele.
Aos meus pais, Noêmia e Lucivaldo, por todo amor e cuidado, pelo apoio em minhas
escolhas e pela torcida para que eu conquistasse os meus sonhos e objetivos. Mãe você é
minha maior incentivadora. Obrigada por acreditar sempre em mim.
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Monique Araújo de Brito, por ter me recebido de
braços abertos, pela amizade, confiança e crédito a mim concedidos, e por toda atenção e
disponibilidade.
À Prof.ª Dr.ª Magaly Girão Albuquerque, por sua imensa disposição e vontade de
ajudar, que me auxiliou a dar passos importantes nessa trajetória. Foi uma pessoa essencial
para que esse trabalho pudesse ser realizado.
Ao Prof. Dr. Ricardo Bicca de Alencastro pela agradável convivência e pelo suporte
de infraestrutura.
Ao meu noivo, Camilo Lima, que além de noivo foi professor, orientador, psicólogo,
amigo, companheiro, parceiro e namorado. Pela paciência nos momentos difíceis, e que com
todo carinho e cuidado sempre me incentivou a continuar e persistir, mesmo quando o
cansaço e o desânimo “batiam à porta”.
Aos amigos da Pós-Graduação, em especial à Ana Izabel Bezerra Santos, pela amizade
e companheirismo.
Aos amigos do LabMMol, Thaíssa, André, Eugênio, Daniel e Prof.ª Nadja Paraense
pela amizade e agradável convivência.
À coordenadora do PPG-CAPS, Prof.ª Kátia Lima, e à secretária executiva, Adelina
Iorio, por todo o suporte.
Aos professores do PPG-CAPS, pelos ensinamentos necessários a minha formação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos
recursos financeiros fornecidos.
À Banca Examinadora pelo aceite e pelas contribuições valiosas para este trabalho.
A todas as pessoas que não citei, mas colaboraram direta ou indiretamente para o
desenvolvimento deste trabalho.
RESUMO
A síndrome da imunodeficiência humana adquirida (AIDS, acquired
immunodeficiency syndrome) é causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV, human
immunodeficiency virus) que infecta as células do sistema imune, destruindo-as ou causando
prejuízos ao seu funcionamento. Dentre as enzimas do HIV, a integrase é responsável pela
inserção do DNA viral no DNA do hospedeiro. Atualmente, existem apenas três fármacos em
uso clínico pertencentes à classe dos inibidores de integrase: raltegravir (um derivado
pirimidinona carboxamida), elvitegravir (um derivado quinolina) e dolutegravir (um derivado
diazatriciclo carboxamida). Entretanto, diversos casos de resistência a estes fármacos são
descritos na literatura e as mutações da enzima responsáveis por este perfil são conhecidas.
Neste trabalho foram empregados estudos de relação entre a estrutura química e atividade
biológica (SAR) e docking molecular, aplicados a uma série de 68 derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico sintetizados e avaliados farmacologicamente como inibidores de integrase
do HIV (PLEWE et al., 2009; TANIS et al., 2010; JOHNSON et al., 2011). Entre os
resultados obtidos, no estudo da relação entre a estrutura química e a atividade biológica foi
observado que a ausência do hidrogênio ligado ao oxigênio da porção ácido hidroxâmico leva
a perda de atividade biológica. E as simulações de docking molecular revelaram que este
oxigênio deve possuir carga parcial -1 para realizar interação iônica com os íons Mg²+
presentes no sítio ativo da enzima integrase que funcionam como cofatores. A complexação
dos derivados azaindóis com estes íons leva a inibição enzimática. Os compostos mais ativos,
1c e 21c, foram os que apresentaram melhor perfil de interação com a enzima.
ABSTRACT
The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by the human
immunodeficiency virus (HIV) that infects cells of the immune system, destroying them or
causing damage to its operation. Among all the HIV enzymes, integrase is responsible for the
insertion of viral DNA in the host DNA. Currently, there are only three drugs in clinical use
that belong to the class of integrase inhibitors: raltegravir (a pirimidinone carboxamide
derivative, elvitegravir (a quinoline derivative) and dolutegravir (a diazatricyclo carboxamide
derivative). However, several cases of resistance to drugs of this class are described in the
literature, and the mutations of the enzyme responsible for this profile are known. In this work
were employed studies of structure activity relationship (SAR) and molecular docking,
applied to a series of 68 derivatives of azaindole hydroxamic acid synthesized and
pharmacologically evaluated as HIV-1 Integrase inhibitors (PLEWE et al., 2009; TANIS et
al., 2010; JOHNSON et al., 2011). Among the results obtained in the study of the relationship
between the chemical structure and the biological activity was observed that the absence of
hydrogen bound to oxygen of the hidroxamic acid takes to loss of biological activity. And
molecular docking simulations showed that this oxygen must have partial charge -1 to
perform ionic interaction with Mg²+ ions present in the active site of the integrase enzyme,
which act as cofactors. The complexation of azaindole derivatives with these ions takes to
enzymatic inhibition. The most active compounds, 1c and 21c, were the ones who presented
best profile of interaction with the enzyme.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 20
2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 20
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 21
3.1. HIV E AIDS .................................................................................................. 21
3.1.1. O HIV ........................................................................................................... 21
3.1.2. EPIDEMIOLOGIA ........................................................................................ 23
3.1.3. CICLO DE REPLICAÇÃO DO HIV ............................................................... 25
3.1.4. A ENZIMA HIV-INTEGRASE....................................................................... 27
3.2. INIBIDORES DA HIV-IN .............................................................................. 32
3.2.1. INIBIDORES EM USO CLÍNICO .................................................................. 32
3.2.2. DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO HIDROXÂMICO ............................. 39
3.3. ANÁLISE CONFORMACIONAL E MODELAGEM MOLECULAR ............... 50
3.4. DOCKING MOLECULAR ............................................................................. 52
4. OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 52
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 53
5. METODOLOGIA .......................................................................................... 53
5.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE ................................. 53
5.1.1. CONSTRUÇÃO 3D DOS INIBIDORES, OTIMIZAÇÃO GEOMÉTRICA E
ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS .......................................................... 54
5.1.2. CÁLCULOS DOS DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E
FARMACOCINÉTICOS ............................................................................................. 54
5.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN SILICO
54
5.2. DOCKING MOLECULAR ............................................................................. 54
5.2.1. PREPARAÇÃO DOS LIGANTES .................................................................. 54
5.2.2. OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO ... 55
5.2.3. MOLEGRO VIRTUAL DOCKER (MVD) ...................................................... 56
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 58
6.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE ................................. 58
6.1.1. ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS ............................................. 58
6.1.2. DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E FARMACOCINÉTICOS .... 60
6.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN SILICO
64
6.2. DOCKING MOLECULAR ............................................................................. 70
6.2.1. PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO ........................... 70
6.2.2. VALIDAÇÃO DOS PROTOCOLOS DE DOCKING POR RE-DOCKING ........ 74
6.2.3. SIMULAÇÕES DE DOCKING MOLECULAR ............................................... 76
6.3. MODIFICAÇÕES ESTRUTURAIS ................................................................ 93
7. CONCLUSÕES ............................................................................................. 94
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 95
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Morfologia do vírus HIV (Adaptada de PEÇANHA et al., 2002). .......................... 23
Figura 2: Prevalência global do HIV em adultos (15 a 49 anos) em 2011. ............................. 24
Figura 3: Ciclo de replicação do HIV (Adaptada de SOUZA; ALMEIDA, 2003). ................. 26
Figura 4: Representação esquemática dos domínios estruturais da enzima HIV-IN (Adaptada
de ARORA; TCHERTANOV, 2013). ................................................................................... 28
Figura 5: Esquema das etapas de processamento do terminal 3' e de transferência de cadeia do
processo de integração catalisado pela enzima HIV-IN (adaptada de NEAMATI, 2011). ...... 29
Figura 6: Reação de transferência de cadeia. ......................................................................... 30
Figura 7: Esquema da estrutura 3D da PFV-IN (Adaptada de IAVIREPORT, 2014). ............ 32
Figura 8: Estruturas químicas dos fármacos inibidores da HIV-IN raltegravir (1), dolutegravir
(2) e elvitegravir (3). ............................................................................................................. 33
Figura 9: Estrutura química do RAL, com destaque para os grupos farmacofóricos dos
inibidores da HIV-IN. ........................................................................................................... 35
Figura 10: Estruturas químicas dos componentes do Stribild®:
emtricitabina (4), tenofovir (5)
e cobicistat (6). A estrutura do ELV aparece na Figura 1. ..................................................... 36
Figura 11: Estrutura 3D do domínio catalítico da HIV-IN onde estão destacados os
aminoácidos relacionados à resistência aos fármacos inibidores (em amarelo), os aminoácidos
que fazem parte da tríade catalítica (em vermelho) e os íons Mg²+ (esferas verdes). .............. 38
Figura 12: Tipos de azaindóis. .............................................................................................. 40
Figura 13: Substituição do ácido carboxílico por ácido hidroxâmico. .................................... 40
Figura 14: Perfil geral dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico. .................................. 41
Figura 15: Estrutura química dos ligantes 1c, 21c, 19a, 24a e 18a. ........................................ 55
Figura 16: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 21c (amarelo), 11c
(verde), 13c (azul) e 12c (vermelho) sobrepostas. ................................................................. 58
Figura 17: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 8a (vermelho), 14a
(amarelo), 22a (laranja), 23a (azul) e 24a (verde) sobrepostas. .............................................. 59
Figura 18: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta) e 19a (verde). ............. 60
Figura 19: Estrutura química dos compostos, 1a, 2a, 16a, 17a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a e 24a,
com valores de IC50 (nM) entre colchetes. ............................................................................. 61
Figura 20: Gráfico de relação linear entre volume, área e peso molecular dos compostos 1a,
2a, 16a, 17a, 19-24a e atividade (pIC50). ............................................................................... 62
Figura 21: Comparação estrutural entre os compostos 19a e 1c. ............................................ 62
Figura 22: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL. ........... 65
Figura 23: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL. ........... 65
Figura 24: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL. ........... 66
Figura 25: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL. .............. 67
Figura 26: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL. ............. 67
Figura 27: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL. .............. 68
Figura 28: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série a e RAL. ................ 69
Figura 29: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série b e RAL. ................ 69
Figura 30: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série c e RAL. ................ 70
Figura 31: Estrutura da PFV-IN (código PDB = 3OYA), com destaque para o sítio ativo onde
está o fármaco RAL. ............................................................................................................. 71
Figura 32: Resultado do alinhamento da sequência primária dos sítios catalíticos da HIV-IN e
PFV-IN. ............................................................................................................................... 73
Figura 33: Sobreposição da melhor pose docada (rosa) no ligante do cristal (amarelo). As
esferas verdes representam os íons Mg²+. .............................................................................. 76
Figura 34: Estrutura geral dos dicetoácidos e estruturas químicas do RAL e do composto 1c,
com destaque para os hidrogênios ionizáveis. ....................................................................... 77
Figura 35: Interações do tipo ligação de hidrogênio detectadas para RAL (amarelo). ............ 79
Figura 36: Interações eletrostáticas entre RAL (amarelo) e os íons Mg²+ (verde). .................. 80
Figura 37: Interações hidrofóbicas do tipo π-π detectadas para RAL (amarelo). .................... 81
Figura 38: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 1c nas
simulações de docking molecular. ......................................................................................... 81
Figura 39: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 21c
nas simulações de docking molecular. ................................................................................... 82
Figura 40: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 19a
nas simulações de docking molecular. ................................................................................... 82
Figura 41: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 24a
nas simulações de docking molecular. ................................................................................... 83
Figura 42: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 18a
nas simulações de docking molecular. ................................................................................... 83
Figura 43: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 1c. ................ 85
Figura 44: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 19a. .............. 85
Figura 45: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 24a. .............. 86
Figura 46: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 18a. .............. 86
Figura 47: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto
1c. ........................................................................................................................................ 87
Figura 48: Interações eletrostáticas e suas respectivas distâncias (em Å) detectadas para o
composto 21c. ...................................................................................................................... 88
Figura 49: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto
19a. ...................................................................................................................................... 88
Figura 50: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto
24a. ...................................................................................................................................... 89
Figura 51: Estrutura tridimensional do composto 18a. .......................................................... 90
Figura 52: Sobreposição de 1c com RAL (amarelo). ............................................................. 90
Figura 53: Sobreposição de 21c com RAL (amarelo). ........................................................... 91
Figura 54: Sobreposição de 19a com RAL (amarelo). ........................................................... 91
Figura 55: Sobreposição de 24a com RAL (amarelo). ........................................................... 92
Figura 56: Sobreposição de 18a com RAL (amarelo). ........................................................... 92
Figura 57: Modificações estruturais propostas para o composto 1c. ...................................... 94
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Epidemia de AIDS no Brasil, por região, entre 2001 e 2011. ................................. 25
Tabela 2: Compostos da série a - Plewe e colaboradores (2009). ........................................... 42
Tabela 3: Compostos da série b - Tanis e colaboradores (2010). ........................................... 45
Tabela 4: Compostos da série c - Johnson e colaboradores (2011)......................................... 47
Tabela 5: Valores de MolDock, Re-Rank e Einter das soluções escolhidas para cada composto e
RAL. .................................................................................................................................... 78
Tabela 6: Distâncias das ligações de hidrogênio realizadas pelos derivados azaindóis nas
simulações de docking molecular. ......................................................................................... 84
Tabela 7: Distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π realizadas pelos derivados
azaindóis nas simulações de docking molecular. ................................................................... 87
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Alinhamento de resíduos da PFV-IN com HIV-IN. Os resíduos destacados em
amarelo fazem parte da tríade catalítica, e os destacados em rosa sofreram mutação. ............ 74
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Å Ângstron
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency
Syndrome)
ALH Aceptor de ligação de hidrogênio
cLogP Log do coeficiente de partição calculado
cLogS Log da Solubilidade Calculado
DLH Doador de ligação de hidrogênio
DNA Ácido desoxirribonucleico
DOL Dolutegravir
DST Doença sexualmente transmissível
EHOMO Energia do Orbital Molecular de Mais Alta Energia Ocupado (Highest
Occupied Molecular Orbital)
ELUMO Energia do Orbital Molecular de Mais Baixa Energia Desocupado (Lowest
Unoccupied Molecular Orbital)
ELV Elvitegravir
eV elétrons-Volt
FDA Agência que regulamenta medicamentos nos Estados Unidos (U. S. Food
and Drug Administration)
g/mol Grama por mol
gp Glicoproteico
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus)
HIV-IN Enzima integrase do vírus HIV
HIV-PR Enzima protease do vírus HIV
HIV-TR Enzima transcriptase reversa do vírus HIV
³H Trítio
HOMO Orbital Molecular de Mais Alta Energia Ocupado (Highest Occupied
Molecular Orbital)
IC50 Concentração de Inibição a 50% (Inhibition Concentration at 50%)
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LTR Regiões de repetições terminais longas (Long Terminal Repeat)
LUMO Orbital Molecular de Mais Baixa Energia Desocupado (Lowest Unoccupied
Molecular Orbital)
MMFF Merck Molecular Force Field
MPE Mapa de potencial eletrostático
MS Ministério da Saúde
MVD Molegro Virtual Docker
µ Momento dipolo
µM Micro molar
nM Nanomolar
OMS Organização Mundial da Saúde
PDB Banco de Dados de Proteína (Protein Data Bank)
PFV-IN Enzima integrase do Prototipe Foamy Virus
pIC50 Log negativo da concentração de inibição a 50% (Inhibition Concentration
at 50%)
pka Log negativo da constante de acidez (Ka)
PLP Potencial Linear por Partes (Piecewise Linear Potencial)
PM Peso molecular
PSA Área de superfície polar (Polar Surface Area)
R² Coeficiente de determinação
RAL Raltegravir
RMN Ressonância magnética nuclear
RMSD Desvio médio quadrático das posições atômicas
RNA Ácido ribonucleico
RTECS Registro de Efeitos Tóxicos de Substâncias Químicas (Registry of Toxic
Effects of Chemical Substances)
SAR Relação Estrutura-Atividade (Structure Activity Relationship)
SN2 Substituição nucleofílica bimolecular
SPA Ensaio de proximidade de cintilação (Scintillation Proximity Assay)
SUS Sistema Único de Saúde
UNAIDS Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/AIDS
2D Bidimensional
3D Tridimensional
LISTA DE ABREVIATURAS – AMINOÁCIDOS
C Cys Resíduo de cisteína
D Asp Resíduo de ácido aspártico
E Glu Resíduo de ácido glutâmico
H His Resíduo de histidina
I Ile Resíduo de isoleucina
K Lis Resíduo de lisina
L Leu Resíduo de leucina
N Asn Resíduo de asparagina
Q Gln Resíduo de glutamina
R Arg Resíduos de arginina
T Thr Resíduo de treonina
Y Tyr Resíduo de tirosina
20
1. INTRODUÇÃO
O vírus da imunodeficiência humana (em inglês, human immunodeficiency vírus, HIV)
é o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (em inglês, acquired
immunodeficiency syndrome, AIDS) (OMS, 2014). Seu ciclo de replicação é dependente das
enzimas virais transcriptase reversa (HIV-TR), protease (HIV-PR) e integrase (HIV-IN)
(ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012).
A enzima HIV-IN atua em uma etapa importante do ciclo, a integração, catalisando a
incorporação do DNA viral no DNA da célula do hospedeiro (BLANCO; MARTINEZ-
PICADO, 2012).
Atualmente, existem três inibidores da HIV-IN aprovados pela agência que
regulamenta medicamentos nos Estados Unidos (em inglês, U. S. Food and Drug
Administration, FDA): raltegravir (RAL), que foi o primeiro fármaco aprovado em 2007, e
dolutegravir (DOL) em 2013. Já o elvitegravir (ELV) foi aprovado em 2012, apenas em
formulações com os fármacos: emtricitabina, tenofovir e cobicistat (FDA, 2014).
Infelizmente, estudos clínicos relatam o aparecimento de vírus que são resistentes aos
inibidores da HIV-IN disponíveis para uso clínico (CALY et al., 2012; KURITZKES, 2011).
Portanto, é necessário o desenvolvimento de novos inibidores mais potentes e que possam
atuar em vírus resistentes.
Recentemente, Plewe e colaboradores reportaram a síntese e atividade antiviral de
derivados azaindóis do ácido hidroxâmico, que possuem a capacidade de quelar íons
magnésios presentes no sítio catalítico da HIV-IN (PLEWE et al., 2009), sendo esta classe o
objeto de estudo deste trabalho.
2. JUSTIFICATIVA
O tratamento da infecção pelo HIV é feito com a utilização de pelo menos três
antirretrovirais combinados, sendo dois medicamentos de classes diferentes, que poderão ser
combinados em um só comprimido (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). Entretanto,
existem inúmeros relatos de resistência adquirida e de intolerância por parte dos usuários aos
fármacos que compõem esse arsenal de medicamentos (OHRUI, 2011). Nessa perspectiva,
21
novos fármacos são necessários como alternativa e a enzima HIV-IN apresenta-se como alvo
terapêutico promissor.
Dois fatores importantes ratificam as pesquisas com inibidores da HIV-IN: (a) a
ausência de enzimas homólogas celulares em humanos, sugerindo certa especificidade para
essa enzima viral (MELO; BRUNI; FERREIRA, 2006); (b) os relatos de resistência aos
inibidores da HIV-IN em uso clínico (CALY et al., 2012).
Até o momento não há trabalhos científicos na área de modelagem molecular para os
derivados azaindóis do ácido hidroxâmico, objetos de estudo deste trabalho. Sendo assim,
configura-se o ineditismo do estudo de relação estrutura-atividade (Structure-Activity
Relationship, SAR) e docking molecular para estes compostos.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. HIV E AIDS
3.1.1. O HIV
O HIV é capaz de infectar células do sistema imunológico (ou imune), como
macrófagos e linfócitos T CD4+ (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012), destruindo-as ou
incapacitando-as, prejudicando o funcionamento normal deste sistema. Com o progresso da
infecção, o sistema imune torna-se praticamente inoperante e o indivíduo, mais suscetível às
infecções oportunistas (OMS, 2014).
Os alvos do HIV são as células T auxiliares CD4+, os macrófagos e as células
dendríticas (ABBAS et al., 2008). Estas células funcionam como um reservatório que
mantém a infecção viral por um longo período (LAHOUASSA et al., 2012).
O estágio mais avançado da infecção por HIV é a síndrome da imunodeficiência
adquirida (em inglês, acquired immunodeficiency syndrome, AIDS). Para desenvolver a
AIDS, um indivíduo infectado pelo HIV pode levar de 10 a 15 anos; os fármacos antivirais
podem retardar a evolução desse processo (OMS, 2014).
A transmissão do HIV pode ocorrer via relações sexuais sem o uso de preservativos,
da mãe infectada para o filho durante a gestação, o parto ou a amamentação (transmissão
vertical), uso da mesma seringa ou agulha contaminada por mais de uma pessoa, transfusão de
22
sangue contaminado com o HIV e instrumentos perfurantes ou cortantes, não esterilizados
(OMS, 2014).
Até o momento foram identificados dois tipos de HIV chamados HIV-1 e HIV-2. O
HIV-1 é a causa mais frequente da AIDS enquanto que o HIV-2 difere em sua estrutura
genômica e antigenicidade e causa uma síndrome clinicamente semelhante (ABBAS et al.,
2008). O HIV–1 é um retrovírus integrante da família Retroviridae. Retrovírus são vírus que
contém RNA (PEÇANHA et al., 2002) e pertencem ao subgrupo dos lentivírus, que
apresentam a capacidade de causar uma infecção latente de longo prazo nas células e efeitos
citopáticos em curto prazo. Todos os lentivírus são capazes de produzir doenças fatais de
progressão lenta, incluindo síndromes que provocam a degeneração do sistema nervoso
central (ABBAS et al., 2008).
O HIV apresenta forma esférica, com cerca de 10-4
mm de diâmetro, e dois envelopes
glicoproteicos (gp), sendo o maior extracelular (gp120), e o menor inserido na membrana
celular (gp41). Apresenta, também, dois nucleocapsídeos que protegem as duas fitas de RNA
viral e as enzimas virais: HIV-TR, HIV-IN e HIV-PR (ENGELMAN; CHEREPANOV,
2012).
De acordo com o mapa genético do HIV, ele pode ser dividido em três regiões
principais: a região gag, responsável por codificar as proteínas estruturais internas p17
(matriz), p24 (capsídeo), p7 (nucleocapsídeo) e p6; a região pol, responsável pela codificação
da enzimas HIV-PR (p11), HIV-TR (p66/p51) e HIV-IN (p31); e a região env, que codifica as
proteínas do envoltório, gp120 (superfície) e gp41 (transmembrana). Além dessas o genoma
do HIV-1 codifica ainda mais seis proteínas acessórias, sendo duas (tat e rev) relacionadas
com a regulação da expressão gênica (PEÇANHA et al., 2002).
A proteína p17 completa o envelope viral, localizada internamente em relação às
glicoproteínas de superfície (gp120 e gp41) e à membrana lipídica. O capsídeo viral é
envolvido pela proteína gag p24. No interior do capsídeo são encontradas duas cópias do
RNA genômico de fita simples, que supostamente existe na forma de uma ribonucleoproteína
contendo HIV-TR, HIV-IN e a proteína p7 (nucleocapsídeo) de ligação ao RNA. Nessa região
são encontradas ainda as proteínas p6, Vif, Vpr e Nef. A Figura 1 é uma representação da
morfologia do HIV (PEÇANHA et al., 2002).
23
Figura 1: Morfologia do vírus HIV (Adaptada de PEÇANHA et al., 2002).
3.1.2. EPIDEMIOLOGIA
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), desde o começo da epidemia
quase 70 milhões de pessoas foram infectadas com o HIV e cerca de 35 milhões morreram em
decorrência da AIDS no mundo (OMS, 2014). No ano de 2011, 34 milhões de pessoas
estavam vivendo com HIV, 1,7 milhões morreram de doenças relacionadas com a AIDS e
houve 2,5 milhões de novas infecções (OMS, 2014). Nesse mesmo ano a prevalência global
de adultos (15 a 49 anos) com HIV era de 0,8%, sendo a África o continente mais afetado
(Figura 2).
24
Figura 2: Prevalência global do HIV em adultos (15 a 49 anos) em 2011.
Fonte: (OMS, 2014).
A epidemia de AIDS na América Latina tem se mostrado estável. O número de
indivíduos vivendo com HIV em 2011 era de 1,4 milhões, enquanto que em 2001 eram 1,2
milhões. O número de novas infecções diminuiu de 93 mil em 2001 para 83 mil em 2011,
assim como o número de mortes relacionadas a AIDS que em 2001 foram 60 mil e em 2011
54 mil (WHO/UNAIDS, 2014).
No Brasil, estima-se que 630 mil pessoas vivem com o HIV (MORGADO; BASTOS,
2011). Desde o início da epidemia em 1980 até junho de 2012 foram registrados 656.701
casos de AIDS. Em 2011, houve a notificação de 38.776 casos da doença, sendo a taxa de
incidência de AIDS no Brasil de 20,2 casos por 100 mil habitantes (BRASIL, MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2013). Considerando as regiões brasileiras, entre os anos de 2001 e 2011, houve
redução da epidemia apenas no Sudeste, que é a região com o maior número de casos
acumulados (56%) (Tabela 1).
25
Tabela 1: Epidemia de AIDS no Brasil, por região, entre 2001 e 2011.
Taxa de incidência (casos/ 100 mil habitantes)
Região 2001 2011
Sul 27,1 30,9
Sudeste 22,9 21,0
Centro-Oeste 14,3 17,5
Nordeste 7,5 13,9
Norte 9,1 20,8
Fonte: (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
De acordo com o Ministério da Saúde (BRASIL, MINISTERIO DA SAÚDE, 2013),
houve uma redução significativa dos casos de AIDS no Brasil em crianças menores de cinco
anos, de 846 casos em 2001 para 745 em 2011. Esses dados confirmam a eficácia da política
de redução da transmissão vertical do HIV. Em relação à taxa de mortalidade, esta também
apresentou redução. A taxa de incidência baixou de 6,3 em 2002 para 5,6 a cada 100 mil
pessoas em 2011, representando uma queda de 12% (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2013).
3.1.3. CICLO DE REPLICAÇÃO DO HIV
O ciclo de replicação do HIV é composto por diversas etapas, sendo que, quatro dessas
são dependentes de macromoléculas que são alvos de fármacos em uso clínico (Figura 3).
26
Figura 3: Ciclo de replicação do HIV (Adaptada de SOUZA; ALMEIDA, 2003).
A etapa de fusão corresponde à entrada do vírus na célula através da interação da
glicoproteína viral gp120 com o receptor CD4+, localizado na superfície da célula do
hospedeiro. Essa etapa ocorre com a participação da glicoproteína viral transmembrana gp41
e dos co-receptores quimiocínicos CXCR4 e CCR5 (PINTO; STRUCHINER, 2006).
Após a fusão, há a liberação do conteúdo do capsídeo no meio intracelular, onde
ocorre a etapa de transcrição reversa. Nessa etapa, a enzima viral HIV-TR converte o RNA
viral em DNA (SOUZA; ALMEIDA, 2003), ocorrendo a formação do complexo de pré-
integração, que é transportado para o núcleo.
A etapa de integração corresponde à ação da enzima viral HIV-IN, associada ao
complexo de pré-integração, que promove a intercalação do DNA viral no DNA do
hospedeiro (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012).
O DNA híbrido, resultante da integração, é transcrito em RNA mensageiro, e este é
encaminhado ao citoplasma, onde é traduzido na forma de poliproteínas que são os
precursores das proteínas virais (SOUZA; ALMEIDA, 2003).
27
Após o brotamento das novas partículas virais ocorre a maturação, onde a enzima
HIV-PR promove a hidrólise dos polipeptídeos dando origem aos componentes estruturais
capsídeo, matriz e nucleocapsídeo; e às enzimas HIV-TR, HIV-PR e HIV-IN (ENGELMAN;
CHEREPANOV, 2012).
3.1.4. A ENZIMA HIV-INTEGRASE
A enzima HIV-IN é a responsável pela incorporação do DNA viral no DNA da célula
do hospedeiro. Ela atua em reações altamente específicas, necessárias para o processo de
integração (HAZUDA, 2012).
Ela possui 288 aminoácidos codificados pelo gene pol do HIV-1, sendo composta por
três domínios funcionais: N-terminal, catalítico e C-terminal (NEAMATI, 2011).
O domínio N-terminal é formado pelos aminoácidos 1 até 50 e a sua estrutura
monomérica consiste em quatro hélices-α estabilizadas pelo cátion Zn2+
, coordenado pelos
resíduos His12, His16, Cys40 e Cys43 (NEAMATI, 2011; ARORA; TCHERTANOV, 2013).
Esta região é conhecida como “HHCC zinc-binding motif” e seu papel primário é facilitar a
multimerização da HIV-IN, e de seus contatos extensivos com monômeros de núcleos
catalíticos adjacentes (BLANCO et al., 2011).
O domínio catalítico é constituído pelos aminoácidos 51 até 212, no qual está presente
a tríade catalítica (Asp64, Asp116 e Glu152), além do sítio de ligação do DNA viral
(BLANCO et al., 2011). Estruturalmente, este domínio consiste em uma mistura de seis
hélices-α e cinco folhas-β (ARORA; TCHERTANOV, 2013). Os resíduos que formam o sítio
ativo apresentam grupos carboxilato carregados negativamente coordenados com dois íons
metálicos Mg2+
(NOWOTNY, 2009; ARORA; TCHERTANOV, 2013).
Finalmente, os aminoácidos 213 até 288 formam o domínio C-terminal, que se liga ao
DNA do hospedeiro de forma inespecífica (BLANCO et al., 2011). Um monômero deste
domínio é formado por cinco folhas-β arranjadas de maneira antiparalela, formando uma
espécie de barril (em inglês, “β-barrel”) (NEAMATI, 2011). A Figura 4 é uma representação
esquemática dos três domínios da enzima HIV-IN.
28
Figura 4: Representação esquemática dos domínios estruturais da enzima HIV-IN (Adaptada
de ARORA; TCHERTANOV, 2013).
A HIV-IN catalisa reações de substituição nucleofílica do tipo SN2, com auxílio de
cofatores, que são cátions metálicos divalentes (Mg2+
) (HARE et al., 2010). Inicialmente,
ocorre a hidrólise do grupo fosfato de um ácido nucleico, resultando na formação do produto
3’-OH. Dois íons metálicos auxiliam a reação em diferentes regiões, sendo que um dos íons
auxilia no posicionamento e ativação do nucleófilo, enquanto o outro estabiliza o estado de
transição e o grupo de saída (NOWOTNY, 2009).
A atuação da HIV-IN pode ser dividida em duas etapas: processamento do DNA viral
por clivagem do nucleotídeo do terminal-3’ e transferência de cadeia, quando o DNA viral é
inserido no DNA da célula do hospedeiro (BLANCO; MARTINEZ-PICADO, 2012). O
esquema da Figura 5 é um resumo das duas etapas do processo de integração.
29
Figura 5: Esquema das etapas de processamento do terminal 3' e de transferência de cadeia do
processo de integração catalisado pela enzima HIV-IN (adaptada de NEAMATI, 2011).
30
A integração ocorre, inicialmente, no citoplasma. Após a conversão do RNA viral em
DNA, este passará pelo processamento 3’, sendo esta a primeira reação deste processo. A
HIV-IN reúne sequências específicas dentro de regiões de repetições terminais longas (long
terminal repeat, LTR) em cada região final da fita de DNA viral (HAZUDA, 2012). Ocorre
uma clivagem sítio-específica de dois nucleotídeos de cada extremidade 3’, dando origem a
um DNA processado com o final CA-OH-3’. O grupo hidroxila do terminal 3’-OH será o
nucleófilo que a HIV-IN necessita para a reação de transferência de cadeia, que ocorre após a
entrada do complexo de pré-integração no núcleo (HAZUDA, 2012). Essa reação consiste na
junção das terminações 3’-OH do DNA viral com 5’-fosfato do DNA do hospedeiro, seguida
de etapas de reparação e ligação (Figura 6) (SEO et al., 2011). O processamento inicial faz
com que as fitas se liguem covalentemente (DEEKS et al., 2008). Tanto o processamento 3’,
quanto a transferência de cadeia, dependem de íons metálicos divalentes que funcionam como
cofatores (SEO et al., 2011).
Figura 6: Reação de transferência de cadeia.
31
O processo de integração ocorre no intassomo, que é um complexo núcleo-proteico
composto pela HIV-IN associada ao DNA viral (MAERTENS et al., 2010). Nele estão
presentes dímeros da enzima HIV-IN, nos quais apenas uma subunidade de cada dímero se
liga a uma região final de DNA viral (HARE et al., 2010). O DNA do hospedeiro ou DNA
alvo acomoda-se entre os sítios ativos no interior do intassomo. Este fato provoca uma torção
no DNA do hospedeiro, que permite que os sítios ativos tenham acesso às ligações fosfo-
diéster do DNA alvo (MAERTENS et al., 2010).
Os íons metálicos, que estão coordenados aos resíduos de ácido aspártico e ácido
glutâmico, ativam o nucleófilo 3’-OH e desestabilizam as ligações fosfo-diéster, durante a
transferência de cadeia, facilitando a reação (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012). O
nucleófilo ataca as ligações fosfo-diéster, que estão em fitas opostas do DNA alvo, resultando
numa transesterificação e subsequente fusão das regiões finais 3’ dos DNAs do vírus e do
hospedeiro (HARE et al., 2010b).
A análise da atuação da enzima HIV-IN mostra que ela representa um importante alvo
para a pesquisa e desenvolvimento de novos antirretrovirais, visto que sua principal vantagem
é não apresentar nenhum homólogo celular em humanos, que possibilita o desenvolvimento
de fármacos potencialmente mais específicos (PEÇANHA et al., 2012).
Recentemente, foi elucidada a arquitetura do intassomo da integrase do Prototipe
Foamy Virus (PFV-IN) (Figura 7) (MÉTIFIOT et al., 2013). Ela apresenta a reunião dos três
domínios enzimáticos, dispostos em quatro subunidades num tetrâmero funcional, além de
conter o modo de ligação com DNA, assim como ocorre na HIV-IN (JOHNSON et al., 2012).
No Protein Data Bank (PDB) estão disponíveis estruturas individuais de cada domínio da
HIV-IN, combinações entre catalítico e C-terminal, e entre catalítico e N-terminal. Entretanto
estas não são suficientes para reproduzir a ação enzimática, que é dependente da formação do
intassomo (FERRO et al., 2009).
32
Figura 7: Esquema da estrutura 3D da PFV-IN (Adaptada de IAVIREPORT, 2014).
3.2. INIBIDORES DA HIV-IN
3.2.1. INIBIDORES EM USO CLÍNICO
Os inibidores da HIV-IN são uma nova classe de fármacos anti-HIV, apresentando
baixa toxicidade em relação a outros fármacos, como o efavirenz (inibidor não-nucleosídeo da
HIV-TR), que promove efeitos tóxicos no sistema nervoso central, e aos inibidores da HIV-
PR, que causam reações gastrointestinais indesejadas (CUNKHORN, 2012).
Algumas das razões que fazem dos inibidores da HIV-IN uma classe promissora no
tratamento da infecção por HIV, são: (i) atuação num alvo novo, a HIV-IN, que inibe a etapa
de transferência de cadeia do DNA viral para o DNA do hospedeiro, deslocando o DNA viral
do sítio ativo; (ii) atividade contra cepas de HIV-1 resistentes aos inibidores da HIV-TR e
HIV-PR; (iii) as células de mamíferos não apresentam enzimas integrase, o que torna essa
classe altamente específica contra o vírus e, portanto, de baixa toxicidade (BLANCO;
MARTINEZ-PICADO, 2012).
Desde que esta enzima se tornou um possível alvo terapêutico, vários compostos
apresentaram atividade inibitória in vitro sobre a mesma, porém, poucos passaram para a fase
33
de testes clínicos. Entre eles destaca-se o RAL (1, Figura 8) que foi o primeiro inibidor de
HIV-IN aprovado pelo FDA para o tratamento de HIV/AIDS, em outubro de 2007
(JOHNSON et al., 2011).
Os outros fármacos dessa classe são o ELV (3, Figura 8) e o DOL (2, Figura 8). O
ELV foi aprovado pelo FDA, em 2012, como um dos componentes do Stribild®, composto
também pelos fármacos, emtricitabina, tenofovir e cobicistat (FDA, 2014) Em agosto de
2013, o DOL foi aprovado pelo FDA (FDA, 2014b).
N N
OH
ONH
O
F
CH3
NHCH
3
O
NN
O
CH3
CH3
O
N
N
CH3
OOH
O
O
NH
FF
1 2
N
OH CH3
CH3
OH
OO
O
F
Cl
CH3
3
Figura 8: Estruturas químicas dos fármacos inibidores da HIV-IN raltegravir (1), dolutegravir
(2) e elvitegravir (3).
O fármaco RAL apresenta em sua estrutura um anel central de pirimidinona, e nas
extremidades dois anéis aromáticos (um oxadiazol e um p-fluorofenila). Essas três unidades
aromáticas são unidas por espaçadores amídicos. Ele é comercializado como um sal de
potássio e sua nomenclatura IUPAC é N-[(4-fluorofenil)metil]-1, 6- diidro- 5- hidroxi -1-
metil - 2 - [1 - metil-1-[[ (5-metil-1,3,4 -oxadiazol-2il) carbonil] amino] etil] -6-oxo-4-
pirimidinocarboxamida. Sua fórmula química é C20H20FKN6O5 e seu PM=482,51 g/mol
(BRITO, 2011b).
34
No Brasil, apenas RAL está disponível para uso clínico. Em setembro de 2008, ele foi
indicado pelo Comitê Assessor para Terapia Antirretroviral em Adultos Infectados pelo HIV
para uso no Programa Nacional de DST/AIDS. Desta forma, no início do ano de 2009, o RAL
começou a ser distribuído pelo Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2013b).
De acordo com a Nota Técnica nº 307 de 2008, emitida pelo Ministério da Saúde
(MS), o RAL deve ser utilizado apenas em pacientes que apresentaram quadro de falha
virológica. Além disso, pode ser incluído em esquemas compostos por medicamentos das três
classes de antirretrovirais que fazem parte do coquetel disponível no SUS, que são os
inibidores da HIV-TR e HIV-PR (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013b).
O RAL e os demais fármacos dessa classe inibem, preferencialmente, a transferência
de cadeia de DNA na etapa de integração (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012), pela
competição com o DNA do hospedeiro (ESPESETH et al., 2000). Os inibidores da HIV-IN
ligam-se no complexo integrase-DNA viral (intassomo) e não possuem a capacidade de se
ligar à enzima na ausência do DNA viral (HARE et al., 2010). Eles complexam os dois íons
metálicos presentes no sítio ativo, reduzindo a atividade enzimática, e também deslocam a
região final 3’-OH do DNA viral, que é o nucleófilo na reação de transferência de cadeia
(HAZUDA, 2012). Além disso, ainda impedem que o DNA do hospedeiro ligue-se ao
intassomo (ESPESETH et al., 2000).
Na Figura 9, utilizando como exemplo o RAL, são destacados os grupos
farmacofóricos dos inibidores da HIV-IN que complexam os íons metálicos do sítio ativo. A
região A é a responsável pela coordenação aos dois íons metálicos (KAWASUJI et al., 2012).
A região B é composta por um fragmento hidrofóbico, derivado de um extensivo estudo de
relação estrutura-atividade (em inglês, Structure-Activity Relationship, SAR) realizado por
diversos grupos de pesquisa, que concluíram que este deve ser um grupo benzila
(KAWASUJI et al., 2012). Este grupo é responsável por melhorar a afinidade e especificidade
do inibidor pelo intassomo (GROBLER et al., 2002). A região C é, comumente, muito
flexível e tolerável a modificações estruturais para otimização da farmacocinética
(KAWASUJI et al., 2012).
35
Figura 9: Estrutura química do RAL, com destaque para os grupos farmacofóricos dos
inibidores da HIV-IN.
A nomenclatura IUPAC do fármaco ELV é ácido 6-[(3-cloro-2-flúor-fenil)metil]-1-
[(2S)-1-hidróxi-3-metil-butan-2-il]-7-metóxi-4-oxo-1,4-diidroquinolina-3-ácido carboxílico.
Sua fórmula química é C23H23ClFNO5 e seu PM é 447,88 g/mol (CHEMICALIZE, 2013).
ELV é um monoceto-ácido que apresenta alta especificidade e eficácia contra a reação
de transferência de cadeia, com um IC50 = 7 nM (QUASHIE et al., 2012).
No ano de 2012, foi aprovado pelo FDA o Stribild®, um medicamento que combina
dois fármacos já utilizados na terapêutica, emtricitabina (4, Figura 10) e tenofovir (5, Figura
10) (ambos inibidores da HIV-TR, aprovados em 2004, e comercializados como Truvada®
) e
mais dois fármacos novos, ELV (3, Figura 8) (um inibidor da HIV-IN) e cobicistat (6, Figura
10) (um inibidor da CYP3A, enzima que metaboliza fármacos anti-HIV, que é utilizado para
prolongar o efeito do ELV) (FDA, 2014). Este medicamento foi desenvolvido para ser
administrado uma vez ao dia, simplificando o tratamento, sendo um benefício para os
pacientes (FDA, 2014).
36
S
OOH
N N
NH2
F
O
N
N
N
N
NH2
O
POH
O
O
CH3
P
OH
OH
O
4 5
S
N
CH3
CH3
N
NH
O
CH3
N
O
NH
O NH
O
O
N
S
6
Figura 10: Estruturas químicas dos componentes do Stribild®:
emtricitabina (4), tenofovir (5)
e cobicistat (6). A estrutura do ELV aparece na Figura 1.
O DOL, (3S,7R)-N-[(2,4-difluoro-fenil)-metil]-11-hidróxi-7-metil-12-oxo-4-oxa-1,8-
diazatriciclo[8.4.0.0{3,8}]tetradeca-10,13-dieno-13-carboxamida, possui fórmula química de
C20H21F2N3O4 e PM de 405,395 g/mol (FDA, 2014b).
Foi observado em ensaios enzimáticos que DOL inibe preferencialmente a reação de
transferência de cadeia, apresentando valor de IC50 = 2,7 nM (DI SANTO, 2014). Demonstrou
eficácia contra clones virais resistentes a RAL e ELV, assim como contra cepas isoladas de
HIV-1 e HIV-2 (DI SANTO, 2014).
Seu tempo de meia-vida plasmática de aproximadamente 14h permite que a
administração de apenas uma dose diária seja suficiente para sua ação farmacológica
(WALMSLEY et al., 2013).
37
Os fármacos inibidores da HIV-IN têm sido desenvolvido com o objetivo de impedir a
sua interação com o DNA do hospedeiro, contudo, nos últimos anos, vários casos de
resistência têm sido descritos (CALY et al., 2012). O desenvolvimento de resistência ao RAL
está relacionado a mutações na HIV-IN, localizadas no domínio catalítico (KURITZKES,
2011). Uma alternativa para minimizar este problema seria o desenvolvimento de inibidores
que impedissem a entrada da HIV-IN no núcleo da célula do hospedeiro (CALY et al., 2012).
Além disso, dados oriundos das avaliações clínicas indicam que as mutações
Y143C(R), Q148H(R)(K) ou N155H na HIV-IN (Figura 11), associadas a mutações
secundárias, podem resultar em resistência ao RAL (KURITZKES, 2011). Os resíduos Q148
e N155 estão localizados estrategicamente no centro do sítio catalítico, próximos aos três
resíduos ácidos presentes neste sítio, e Q148 interage com a região terminal-5’ do DNA viral
(MESPLÈDE et al., 2012). Desta forma, estas mutações (Q148H e N155H) são responsáveis
por provocar mudanças conformacionais no sítio catalítico que levam ao aumento da energia
de ligação dos fármacos inibidores da HIV-IN (MESPLÈDE et al., 2012). Outro ponto de
mutação, Y143, afeta diretamente a ligação do RAL, pois este resíduo interage com o fármaco
via interação do tipo empilhamento de elétrons π (pi-stacking). Esta interação ocorre entre os
anéis aromáticos da tirosina e do RAL (anel 1,3,4-oxadiazol) (MESPLÈDE et al., 2012).
38
Figura 11: Estrutura 3D do domínio catalítico da HIV-IN onde estão destacados os
aminoácidos relacionados à resistência aos fármacos inibidores (em amarelo), os aminoácidos
que fazem parte da tríade catalítica (em vermelho) e os íons Mg²+ (esferas verdes).
Acredita-se que a mutação do resíduo Q148, que é mais frequente, interage com a
adenosina terminal e a citosina pré-terminal da fita de DNA viral, diminuindo a
suscetibilidade aos fármacos inibidores da HIV-IN, e também a atividade da própria enzima
(BLANCO et al., 2011). A segunda mutação mais comum, N155H, interfere diretamente na
ligação da HIV-IN com os íons metálicos, visto que N115 está localizado na base do sítio
ativo e realiza uma interação do tipo ligação hidrogênio com o aminoácido E152 (BLANCO
et al., 2011).
Um estudo clínico realizado por Hatano e colaboradores em 79 pacientes tratados com
inibidores da HIV-IN, 73 usando RAL e 6 com ELV, ratifica que as mutações associadas a
resistência aos inibidores da HIV-IN de maior ocorrência são Q148H/K/R, N155H e
Y143R/H/C. Também foi observado que, entre os 29 indivíduos que apresentaram resistência,
esta apareceu de forma gradual. Outro ponto importante é que mesmo com a redução da
suscetibilidade aos fármacos, todos apresentaram diminuição da capacidade replicativa do
39
vírus. Isto mostra que a terapia com este inibidores pode conferir algum benefício num regime
de tratamento que promove a supressão parcial da replicação viral (HATANO et al., 2010).
Outro dado interessante é que as mutações associadas ao uso do RAL, N155H e
Q148H, podem conferir resistência cruzada para o ELV (KURITZKES, 2011); mas as
mutações E92Q e T66I, observadas com o uso do ELV, não conferem resistência cruzada para
o RAL (BLANCO et al., 2011).
As mutações conhecidas para RAL também foram observadas em ELV tanto em
cultura, quanto em pacientes. Isto impede sua utilização para a maioria dos vírus resistentes à
RAL. Alguns estudos demonstraram que apenas Y143C é suscetível ao ELV (QUASHIE et
al., 2012).
O DOL tem apresentado potente atividade in vitro contra cepas de vírus resistentes ao
RAL (KURITZKES, 2011). Embora nenhum dado sobre o aparecimento de resistência in vivo
tenha sido relatado, alguns experimentos in vitro demonstraram que as mutações L1011,
T124A e S153FY conferem resistência limitada ao DOL (SALADINI et al., 2012).
3.2.2. DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO HIDROXÂMICO
Os compostos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico foram descritos com
atividade antiviral anti-HIV-1, inicialmente, por Plewe e colaboradores (2009) e,
posteriormente, pelo mesmo grupo de pesquisa em outros dois trabalhos (PLEWE et al.,
2009; TANIS et al., 2010; JOHNSON et al., 2011).
O grupo azaindol é constituído por um indol com nitrogênio no anel benzênico. Podem
também ser chamados de pirrol-piridinas, de acordo com a nomenclatura IUPAC, ou ainda de
azaindenas (HYARIC et al., 2002). Dependendo da posição do nitrogênio, podem assumir
quatro formas diferentes (Figura 12). Podem ser aplicados na preparação de várias substâncias
biologicamente ativas como intermediários, pois muitos dos compostos isolados de
organismos marinhos e de plantas contêm o núcleo indólico e são bioativos (HYARIC et al.,
2002).
40
Figura 12: Tipos de azaindóis.
Conhecendo a capacidade dos ácidos hidroxâmicos de complexar com íons metálicos,
foi realizada a substituição da função ácido carboxílico dos ácidos azaindóis pela função ácido
hidroxâmico. Dessa forma, os compostos originais, capazes de complexar com apenas um íon
metálico, tornaram-se derivados capazes de complexar com dois íons metálicos
simultaneamente, sendo este um possível mecanismo de ação (Figura 13) (PLEWE et al.,
2009). Este fato foi de extrema importância para o desenvolvimento desses compostos, visto
que o sítio ativo da HIV-IN possui dois íons metálicos.
N
O
O
Mg2+
N N
O
NH
Mg2+
OMg
2+
N
Figura 13: Substituição do ácido carboxílico por ácido hidroxâmico.
A gênese da série teve início com a triagem de oito ácidos carboxílicos azaindóis,
empregando um ensaio enzimático chamado Integrase Strand-Transfer Scintillation
Proximity Assay (SPA), que utiliza uma pequena esfera como superfície sólida (SPA bead).
41
Esta esfera tem a capacidade de emitir luz quando moléculas radioativadas estão ligadas na
sua superfície (GROBLER et al., 2009). O método consiste, primeiramente, na incubação da
HIV-IN com o DNA viral, chamado de DNA doador, ocorrendo a formação do complexo
HIV-IN-DNA viral que é aderido à superfície da esfera. Em seguida, adiciona-se o DNA do
hospedeiro, chamado de DNA alvo, que recebe um pré-tratamento com um isótopo, podendo
ser o trítio (³H). O DNA alvo tritiado é adicionado à mistura reacional e incubado novamente.
A atividade enzimática é quantificada por um programa que detecta a emissão de luz. A
avaliação dos ácidos hidroxâmicos por este método revelou que 65 compostos apresentaram
IC50 entre 2,9 nM e 23 µM, e apenas 3 foram inativos (PLEWE et al., 2009; TANIS et al.,
2010; JOHNSON et al., 2011).
O perfil geral dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico está descrito na Figura
14. Os compostos foram numerados e agrupados em séries de acordo com o artigo em que
foram publicados: série a (1a a 24a) - Plewe e colaboradores (2009) (Tabela 2); série b (1b a
16b) - Tanis e colaboradores (2010) (Tabela 3); série c (1c a 28c) - Johnson e colaboradores
(2011) (Tabela 4).
NN
N
O
R2
OR1
Ar
R3
Figura 14: Perfil geral dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.
42
“(continua)”
Tabela 2: Compostos da série a - Plewe e colaboradores (2009).
NN
N
O
R2
OR1
Ar
# N
O
R2
OR1
Ar
IC50 (nM)
1a N
O
H
OH
FF 84
2a N
O
H
OH
F 137
3a N
O
H
OH
Cl
F
102
4a N
O
H
OH
Cl
F
F
131
5a N
O
H
OH
Cl
Cl
442
6a N
O
H
OH
S
Cl
387
7a N
O
H
OH
N
779
8a N
O
H
OH
N
OH
5730
9a N
O
H
OH
F CN
812
43
“(continuação)”
Tabela 2: Compostos da série a - Plewe e colaboradores (2009).
# N
O
R2
OR1
Ar
IC50 (nM)
10a N
O
H
OH
CN
1620
11a N
O
H
OH
NC
>10000
12a N
O
H
OH
F
NH2
O
1300
13a N
O
H
OH
F
NH2
O
608
14a N
O
H
OH
NH2
O
1720
15a N
O
H
OH
O
NH2
>10000
16a N
O
CH3
OH
FF 250
17a N
O
H
OCH
3
FF
356
18a N
O
CH3
OCH
3
FF >50000
19a N
O
CH3
OH
F 250
20a
N
O
OH
CH3
F
618
44
“(conclusão)”
Tabela 2: Compostos da série a - Plewe e colaboradores (2009).
# N
O
R2
OR1
Ar
IC50 (nM)
21a
N
O
OH
OH F
804
22a N
O
OH
CH3
CH3 CH
3 F
1700
23a N
O
OH
CH3
CH3 F
8000
24a
N
O
OH
F
23000
45
“(continua)”
Tabela 3: Compostos da série b - Tanis e colaboradores (2010).
NN
N
O
CH3
OH
R3
F
# R3
IC50 (nM)
1b N
OH
1421
2b N
N
CH3
534
3b N
NH
O
388
4b N
CONH2
466
5b N
CONH2
558
6b
OH
145
7b O
OCH
3
382
8b O
O
313
9b
OCH
3
242
46
“(conclusão)”
Tabela 3: Compostos da série b - Tanis e colaboradores (2010).
# R3
IC50 (nM)
10b O
OCH3
308
11b NH
O
N
O
503
12b N
O
OH
319
13b NH
O
CH3
CH3
251
14b N
O
559
15b
OH
340
16b
O
OCH
3
552
47
“(continua)”
Tabela 4: Compostos da série c - Johnson e colaboradores (2011).
NN
Ar
R3 N
O
OH
# R3
Ar
IC50 (nM)
1c H
F 2,9
2c H
NF
32
3c H
NF
F
18
4c H
F CN 50
5c H
F
Cl
CN
17
6c N
CH3CH
3
F 81
7c NCH
3
OH
F
15
8c N
F
15
9c NCH
3
OCH
3
F
26
10c
N
CH3
F 35
48
“(continuação)”
Tabela 4: Compostos da série c - Johnson e colaboradores (2011).
# R3
Ar
IC50 (nM)
11c N
F F
F
11
12c O
N
F
12
13c O
N
F
11
14c O
O
F
14
15c O
O
CH3CH
3
F 17
16c
O
N
F 14
17c O
F
F
16
18c
OH
O
F
13
19c N
O
F
13
49
“(conclusão)”
Tabela 4: Compostos da série c - Johnson e colaboradores (2011).
# R3
Ar
IC50 (nM)
20c
N
CH3
CH3
O
F
14
21c
CH3
CH3
OH
F 8,8
22c
O
O
F
14
23c
F
F
F
F
13
24c S
N
O
O
O
F
43
25c
S
NCH
3
O
O
O
CH3
F
66
26c S
NCH
3
O
O
CH3
F 13
27c S
N
O
O
F
22
28c
S
N
O
O
CH3
F
36
50
3.3. ANÁLISE CONFORMACIONAL E MODELAGEM MOLECULAR
Ae análise conformacional consiste em explorar os arranjos espaciais (conformações)
energeticamente favoráveis de uma molécula. Nesta análise pode-se utilizar mecânica
molecular, dinâmica molecular, cálculos químico-quânticos ou análises de dados estruturais
determinados experimentalmente por métodos como RMN e cristalografia por difração de
raios-X (SANT’ANNA, 2002; IUPAC, 1997).
O objetivo de uma busca conformacional é identificar as conformações preferenciais
de uma molécula, que irão determinar o seu comportamento. Estas conformações estão
localizadas em pontos mínimos de energia, encontrados através de métodos de minimização
de energia. Estes métodos localizam o mínimo de energia mais próximo à energia da estrutura
de partida (LEACH, 2001).
Ao realizar uma análise conformacional, o ideal seria identificar todas as
conformações de menor energia, combinando sistematicamente todos os ângulos de torção
relevantes da molécula. Esta técnica é chamada pesquisa de grade (grid search) ou análise
conformacional sistemática. Entretanto, um número excessivo de conformações podem ser
geradas em função do número de rotações livres existentes na molécula, o que limita esta
metodologia. O número de confôrmeros a ser analisado equivale a (360°/θ)n, onde θ é o
incremento (em graus) usado no processo de varredura de cada ângulo de torção e n é o
número de rotações livres avaliadas. Quanto menor for o incremento e quanto maior for o
número de rotações livres, maior será o número de conformações geradas, mas, na prática,
apenas alguns confôrmeros são importantes (LEACH, 2001).
O método de Monte Carlo também pode ser usado para explorar o espaço
conformacional (SANT’ANNA, C. M. R., 2002; IUPAC, 1997). Ele utiliza um gerador
numérico randômico, que seleciona várias conformações a fim de obter uma descrição
estatística do sistema (YOUNG, 2009).
O método de mecânica molecular envolve o cálculo das geometrias e energias
conformacionais de moléculas usando uma combinação de campos de força empíricos. O
cálculo das características geométricas e de energia de entidades moleculares é baseado em
funções de potencial empírico, cuja forma é tomada da mecânica clássica. (SANT’ANNA, C.
M. R., 2002; IUPAC, 1997).
51
A equação de Schrödinger é uma das aproximações utilizadas na mecânica quântica.
Entretanto, cálculos de mecânica quântica consomem muito tempo, principalmente quando
utilizados para espécies bioquímicas, porque levam em consideração todos os elétrons da
molécula, que são descritos por múltiplas funções de base. A mecânica molecular é uma
técnica computacionalmente mais simples que utiliza formulações algébricas em vez de
equações diferenciais, utilizadas na mecânica quântica (YOUNG, 2009).
O método de mecânica quântica ab initio usa equações exatas, sem aproximações, que
envolve a população eletrônica total da molécula, podendo ser aplicado a moléculas
relativamente pequenas e, por ser mais exato requer grande capacidade de memória e tempo
de cálculo do computador (LEACH, 2001).
Esse modelo emprega um conjunto de funções de bases nos cálculos. Uma função de
base mínima conteria exatamente o número de funções necessárias para acomodar todos os
orbitais preenchidos de um átomo. Na prática, uma base mínima inclui todos os orbitais
atômicos em uma camada (LEACH, 2001).
As bases mínimas são conhecidas por apresentarem diversas deficiências. Um
problema em particular ocorre com compostos contendo átomos do final do período, como
por exemplo, oxigênio e flúor. Estes átomos são descritos utilizando-se o mesmo número de
funções de base para os átomos do início do período, apesar de possuírem mais elétrons. O
simples aumento do número de funções não necessariamente soluciona o problema ou
aprimora o modelo. A solução mais comum deste problema é a introdução de uma base com
função de polarização. Funções de polarização possuem um número quântico angular mais
elevado, e assim correspondem à adição de orbitais p para átomos de hidrogênio e d para os
demais átomos (LEACH, 2001). O uso de bases contendo funções de polarização é indicado
por um asterisco (*). Assim, 6-31G* refere-se à base 6-31G com funções de polarização para
átomos pesados (isto é, não hidrogênio). Dois asteriscos (e. g., 6-31G**) indicam a aplicação
de funções de polarização (isto é, orbital p) para os átomos de hidrogênio e hélio. A base 6-
31G** é particularmente útil onde ocorrem ligações hidrogênio. Funções de base com
polarização parcial também foram desenvolvidas, por exemplo, 3-21G* que é a mesma base
mínima 3.21G com funções de polarização parcial (LEACH, 2001).
52
3.4. DOCKING MOLECULAR
A técnica conhecida como docking molecular simula o “encaixe” ou o “ajuste” de um
ligante numa macromolécula (e.g., proteína). Esta simulação pode ser feita de modo
automático com o uso de programas computacionais específicos como AutoDock, eHiTS,
Glide, GOLD, Molegro Virtual Docker. Em resumo, a técnica consiste em identificar
possíveis modos de ligação entre um ligante e uma proteína e estimar as respectivas energias
de interação. As diversas soluções (poses) encontradas correspondem a diferentes
conformações e orientações do ligante dentro de cavidades na proteína que equivalem a
possíveis sítios de ligação. As soluções com menores valores de energia de interação são
classificadas como as melhores soluções (KITCHEN et al., 2004).
Durante o processo de reconhecimento molecular, o ligante e a macromolécula
receptora sofrem mudanças conformacionais (MAGALHÃES et al., 2007). A consideração da
flexibilidade molecular da macromolécula e do ligante implica no tratamento de um número
muito elevado de graus de liberdade por parte dos algoritmos de docking. Além disso, o
reconhecimento molecular é um processo dinâmico e muito complexo, envolvendo um grande
número de interações intermoleculares entre o ligante, a macromolécula receptora e o
solvente. Devido à sua complexidade, os programas de docking trabalham com dois tipos de
funções: função de busca e função de pontuação. A função de busca realiza a predição da
conformação e orientação do ligante em relação ao sítio de ligação da macromolécula
receptora; e a função de pontuação discrimina corretamente o modo de interação de um
ligante em seu sítio de ligação e/ou determina, entre dois ou mais ligantes, aquele com maior
afinidade de interação para uma ou mais macromoléculas (LEACH, 2001; MAGALHÃES et
al., 2007).
4. OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como finalidade propor novos compostos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico, através de estudos: da relação estrutura-atividade a partir de descritores
calculados por mecânica quântica; das propriedades farmacocinéticas e toxicológicas
calculadas in silico; e do modo de ligação entre os derivados e a proteína por docking
molecular.
53
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudo dos perfis conformacionais e das conformações mais estáveis de cada inibidor;
Determinação dos seguintes descritores para a relação estrutura-atividade:
Mapa de potencial eletrostático (MPE),
Valores e mapas dos orbitais de fronteira de mais alta energia ocupado (em
inglês, Highest Occupied Molecular Orbital, HOMO) e de mais baixa energia
desocupado (em inglês, Lowest Unoccupied Molecular Orbital, LUMO),
Magnitude e direção do momento dipolo (µ),
Volume,
Área,
Solubilidade (clogS),
Área de superfície polar (em inglês, Polar surface area, PSA),
Parâmetros da “Regra dos Cinco” de Lipinski,
Peso molecular (PM),
Lipofilicidade (clogP),
Número de grupos aceptores e doadores de ligação hidrogênio;
Estudo farmacocinético in silico e perfis de Druglikeness e Drug-score;
Estudo toxicológico in silico com avaliação dos riscos mutagênico, tumorigênico,
irritante e efeito sobre o sistema reprodutor;
Docking molecular.
5. METODOLOGIA
5.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE
O estudo de Relação Estrutura-Atividade (em inglês, Structure Activity Relationship,
SAR) foi realizado com os valores dos descritores que foram obtidos através da modelagem
molecular e de parâmetros farmacocinéticos, com as atividades biológicas (pIC50) dos
compostos, a fim de averiguar se havia ou não relação direta dos mesmos com a atividade, e
com quais descritores esta relação era mais próxima. Os descritores que mantinham relação
direta com a atividade podiam ser usados como guia na proposição de outros derivados da
mesma classe.
54
5.1.1. CONSTRUÇÃO 3D DOS INIBIDORES, OTIMIZAÇÃO GEOMÉTRICA E
ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS
As estruturas tridimensionais (3D) dos inibidores foram construídas e otimizadas no
programa Spartan’10 (Wavefunction, Inc.), utilizando o método de mecânica molecular com o
campo de força MMFF. Após esta etapa, cada estrutura foi submetida à análise
conformacional pelo método de Monte Carlo. Em seguida, os confôrmeros de menor energia
foram otimizados pelo método ab initio Hartree-Fock 6-31G*.
5.1.2. CÁLCULOS DOS DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E
FARMACOCINÉTICOS
Após os cálculos, com auxílio do programa Spartan’10, foram obtidos os valores dos
descritores estéricos: volume, área e área de superfície polar (PSA); e eletrônicos: mapas de
potencial eletrostático (MPE), mapas e valores dos orbitais de fronteira de mais alta energia
ocupado (HOMO) e de mais baixa energia desocupado (LUMO), e momento dipolo (µ);
Os descritores farmacocinéticos: peso molecular (PM), lipofilicidade (cLogP),
solubilidade (cLogS) e número de aceptores (ALH) e doadores (DLH) de ligação de
hidrogênio foram obtidos no servidor Osiris® Property Explorer (SANDER et al., 2009;
Actelion Pharmaceutical Ltd.) e programa no Spartan’10.
5.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN
SILICO
Os perfis farmacocinéticos: druglikeness (semelhança com fármacos) e drug-score
(índice de aproximação para se tornar um potencial candidato a fármaco); e toxicológicos:
potenciais riscos mutagênico, tumorigênico, irritante e efeito sobre o sistema reprodutor, foram
obtidos no servidor Osiris® Property Explorer (SANDER et al., 2009; Actelion
Pharmaceutical Ltd.). Os valores encontrados foram comparados com o fármaco RAL.
5.2. DOCKING MOLECULAR
5.2.1. PREPARAÇÃO DOS LIGANTES
As estruturas 3D dos compostos em estudo foram preparadas conforme descrito
anteriormente para o estudo da relação estrutura-atividade, salvas no formato mol2 e
55
utilizadas como estruturas de partida para o docking. A estrutura 3D do RAL foi extraída do
complexo com PFV-IN, para o procedimento de re-docking.
Entre os compostos em estudo, cinco foram avaliados no docking molecular. Os
escolhidos foram: 1c, o mais ativo da série; 19a, análogo estrutural de 1c com diferença de
atividade significativa; 21c, segundo mais ativo, substituído na posição R3; 24a, o menos
ativo da série; e 18a, inativo. Suas estruturas 2D estão representadas na Figura 15.
1c
IC50 = 2,9 nM 21c
IC50 = 8,8 nM
19a
IC50 = 250 nM 24a
IC50 = 23000 nM
18a
IC50 = >50000 nM
Figura 15: Estrutura química dos ligantes 1c, 21c, 19a, 24a e 18a.
5.2.2. OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO
A estrutura cristalográfica do intassomo da PFV-IN foi extraída do PBD, onde está
depositada sob o código 3OYA (HARE et al., 2010b).
NN
F
N
O
OH
NN
F
N
O
OH
CH3
OH
CH3
NN
F
N
O
CH3
OH
NN
F
N
O
OH
NN
F
N
O
CH3
F
OCH
3
56
Para garantir que os resíduos localizados próximos ao ligante RAL fossem
semelhantes aos encontrados na HIV-IN, foi feito um alinhamento das sequências primárias
dos sítios catalíticos das duas enzimas, com auxílio do servidor T-Coffee (NOTREDAME et
al., 2000). Os resíduos posicionados numa distância de até 5 Å a partir do RAL incompatíveis
com HIV-IN foram mutados. A pesquisa foi executada no programa Discovery Studio
Visualizer (Accelrys, Inc.), e as mutações no programa Molegro Virtual Docker (MVD),
seguidas de minimização de energia dos respectivos resíduos, através da busca do melhor
ângulo diedro. No MVD, a minimização de energia é feita através de um campo de força que
utiliza o potencial linear por partes (em inglês, Piecewise Linear Potencial, PLP) para
interações do tipo estéricas e ligações hidrogênio, e o potencial de Coulomb para forças
eletrostáticas. Apenas ângulos de torção e cadeias laterais são modificadas durante a
minimização, todas as outras propriedades (como comprimentos de ligação e posições dos
átomos) são mantidas fixas.
5.2.3. MOLEGRO VIRTUAL DOCKER (MVD)
O Molegro Virtual Docker (MVD) ou MolDock é baseado num método de busca
heurístico, que combina algoritmos de evolução diferencial e de predição de cavidade. Foi
utilizada a licença teste, que é válida por 30 dias (MOLEGRO, 2013). Este programa foi
escolhido devido à facilidade de uso e interface amigável.
Os tipos de átomos e as ordens de ligação foram corrigidos para as estruturas dos
ligantes e da proteína, usando um módulo de preparação automatizado do MVD. Para cada
complexo, átomos de hidrogênio foram adicionados e as cargas atômicas parciais padrões do
MVD foram assinaladas. As ligações rotacionáveis dos ligantes foram mantidas flexíveis e a
enzima foi tratada como um corpo rígido. Durante os experimentos de docking, foram
mantidas apenas quatro moléculas de água que coordenam com os íons Mg²+.
Potenciais sítios de ligação (cavidades) foram detectados usando o algoritmo de
predição de cavidade baseado em grid. O tamanho da população, o número máximo de
interações, o fator de escalonamento e a probabilidade de crossover foram ajustados para 50,
1500, 0,50, e 0,90, respectivamente. Para cada complexo, foram executadas 50 corridas
independentes com o algoritmo MolDock SE, com cada corrida retornando um número
máximo de 15 soluções (poses) para os ligantes em estudo. No re-docking cada corrida
retornou uma única solução.
57
A região de ancoramento dos inibidores foi restrita a uma esfera de 10 Å de raio,
centrada nas coordenadas x = -38,35; y = 30,89 e z = -20,79, que é a região de ligação do
substrato.
A metodologia de docking molecular foi validada com cálculos de re-docking do RAL
presente no intassomo da PFV-IN depositada no PDB. Essa mesma metodologia foi aplicada
para a enzima mutada. O procedimento de re-docking consiste em retirar o ligante do
complexo enzimático e realizar o docking, com o intuito de avaliar se a conformação foi
reproduzida (LEACH, 2001). O re-docking é analisado em termos do desvio médio
quadrático das posições atômicas (RMSD), entre a estrutura do ligante encontrada pelo
programa e a obtida experimentalmente. Valores de RMSD menores de 2.0 Å são um
indicativo de que as soluções (poses) encontradas foram corretamente preditas (LEACH,
2001).
Neste trabalho foram utilizadas duas funções de pontuação: (a) a pontuação MolDock,
que usa um potencial linear por partes (em inglês, piecewise linear potential, PLP), que
considera o somatório das energias de interação intra (auto interação) e inter (ligante-proteína)
molecular (GEHLHAAR et al., 1995); (b) função de pontuação Re-Rank, que reclassifica as
melhores soluções de docking (poses), aumentando a eficácia do resultado.
A função de pontuação Re-Rank identifica as soluções mais promissoras entre as
obtidas pela função de pontuação MolDock, considerando o potencial a 12-6 de Lennard-
Jones e o termo de torção sp2-sp2 (MOLEGRO, 2011).
De acordo com Thomsen e Christensen (2006), a utilização da pontuação MolDock,
seguida por um procedimento de reclassificação, é um esquema adequado para a
identificação dos melhores modos de ligação, no lugar de esquemas de pontuação mais
avançados (THOMSEN; CHRISTENSEN, 2006).
As melhores soluções dos complexos obtidos por docking foram analisadas de acordo
com as interações intermoleculares (enzima-ligante), como ligação de hidrogênio,
eletrostáticas, van der Waals, hidrofóbicas e π-π stacking, empregando o programa MVD.
58
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE
6.1.1. ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS
Após a análise conformacional e otimização das conformações de menor energia pelo
método ab initio, foi feita uma comparação entre os confôrmeros mais estáveis de cada
composto.
Entre os compostos mais ativos, 1c, 21c, 11c, 13c e 12c, observa-se que suas
conformações se coincidem no núcleo azaindol e nos radicais R1 e R2, havendo alguns
desvios nos radicais Ar e R3. A Figura 16 mostra a sobreposição desses compostos.
Figura 16: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 21c (amarelo), 11c
(verde), 13c (azul) e 12c (vermelho) sobrepostas.
Ao sobrepor a conformação mais estável de 1c com as dos compostos menos ativos,
8a, 14a, 22a, 23a e 24a, observa-se que eles diferem de 1c por possuírem substituintes
volumosos em R2, fato que pode estar intimamente relacionado com a atividade. A Figura 17
mostra essa sobreposição.
59
Figura 17: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 8a (vermelho), 14a
(amarelo), 22a (laranja), 23a (azul) e 24a (verde) sobrepostas.
Ao analisar as conformações mais estáveis dos compostos 1c e 19a, que diferem
apenas no radical R2, observa-se que este radical ocupa posições diferentes no espaço nos
dois compostos. Esta pode ser uma possível explicação para grande diferença entre as
atividades, onde 1c possui IC50 = 2,9 nM, e 19a IC50 = 250 nM. Essas conformações estão
representadas na Figura 18.
60
Figura 18: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta) e 19a (verde).
Tanto na sobreposição dos compostos mais ativos quanto na dos menos ativos, foram
observadas variações nas posições espaciais ocupadas pelos radicais R1, R2, R3 e Ar. No caso
dos mais ativos, apesar de possuírem o mesmo radical Ar, observa-se que suas posições não
seguem um padrão. Provavelmente, isto ocorre em decorrência da variabilidade estrutural dos
radicais R3.
6.1.2. DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E FARMACOCINÉTICOS
Primeiramente foi realizada uma investigação da existência de linearidade entre cada
descritor e a atividade biológica, pela análise da regressão linear e avaliação do coeficiente de
determinação (R²). Para a confecção dos gráficos, os valores de IC50 foram convertidos em
pIC50 (-logIC50). Foi admitida a existência de relação linear para valores de R² iguais ou
maiores que 0,7. A fim de facilitar a análise, os compostos foram agrupados de acordo com
sua semelhança estrutural e variação de um mesmo radical (R1, R2, R3 ou Ar). Os compostos
inativos 11a, 15a e 18a não foram incluídos nessa análise.
Para os descritores estéricos volume e área, e o descritor farmacocinético peso
molecular foi encontrada relação linear com a atividade (pIC50) nos compostos 1a, 2a, 16a,
17a, 19-24a (Figura 19), que apresentam grupos Ar e R3 semelhantes e variação em R1 e
61
R2.9 Esses descritores traduzem a relação direta dos substituintes dos radicais R1 e R2 com a
atividade. Foi observado que quanto menor o volume, área e peso molecular maior a
atividade. O gráfico de relação linear e os valores de R² encontrados para cada descritor estão
representados na Figura 20.
Figura 19: Estrutura química dos compostos, 1a, 2a, 16a, 17a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a e 24a,
com valores de IC50 (nM) entre colchetes.
62
Figura 20: Gráfico de relação linear entre volume, área e peso molecular dos compostos 1a,
2a, 16a, 17a, 19-24a e atividade (pIC50).
Nos compostos 1a, 2a, 16a, 17a, 19-24a, analisando estrutura química e dos
respectivos valores de pIC50 mostra que é mais prejudicial adicionar um radical metil em R1
do que em R2, uma vez que o composto 17a apresenta pIC50 menor que 16a. Já o radical R2
deve ser pouco volumoso, pois na série 2a, 19-24a foi observado que seu volume é
inversamente proporcional à atividade.
O composto mais ativo de toda a série, 1c é análogo estrutural de 19a (Figura 21). A
única diferença entre eles está no radical R2, que em 1c é um radical etil ligado ao núcleo
azaindol, formando um anel de seis membros. A formação desse anel levou a um aumento
significativo da atividade, que não é explicado pelos descritores estéricos. Uma possível
explicação seria uma melhor interação com o alvo devido ao aumento da rigidez. Os
descritores estéricos de todos os compostos estudados estão disponíveis no Apêndice A.
Figura 21: Comparação estrutural entre os compostos 19a e 1c.
63
Após o cálculo das propriedades eletrônicas momento dipolo (µ), energias dos orbitais
HOMO (EHOMO) e LUMO (ELUMO) foi constatado que não há relação linear entre os valores
desses descritores e a atividade (pIC50).
Foi observado que houve pouca variação entre os valores de EHOMO, estando todos
compreendidos numa faixa entre -8,03 eV (composto 16b) e -8,91eV (composto 28c). A
variância calculada para esta propriedade foi de 0,0364. O composto mais ativo, 1c,
apresentou EHOMO = -8,48 eV, muito próximo da média que foi -8,47 eV.
Os valores de ELUMO também pouco variaram estando numa faixa entre 1,62 eV
(composto 9a) e 3,05eV (composto 16b). O compostos mais ativo, 1c, apresentou ELUMO =
2,84 eV, próximo ao valor médio de 2,68 eV. Os valores das propriedades eletrônicas obtidas
para todos os compostos estão disponíveis no Apêndice B.
A análise dos mapas de potencial eletrostático molecular (Apêndice D) e coeficientes
de distribuição dos orbitais de fronteira HOMO (Apêndice E) e LUMO (Apêndice F) dos
derivados azaindóis mostrou uma densidade eletrônica semelhante para todos os compostos.
Logo, a atividade biológica não pode ser explicada através de tais mapas.
Após o cálculo e análise dos descritores farmacocinéticos P. M., clogP, clogS, ALH e
DLH não foi observada relação linear direta com a atividade (pIC50).
Os valores de solubilidade foram obtidos no servidor Osiris Property Explorer, que
fornece uma estimativa da solubilidade em clogS que é o logaritmo na base 10 da solubilidade
medida em mol por litro. De acordo com o Banco de Dados do servidor 80% dos fármacos
disponíveis no mercado apresentam clogS maior que -4. Entre todos os compostos analisados
nenhum apresentou clogS menor ou igual a -4 (Apêndice C).
Comparando os cinco compostos mais ativos, 1c, 21c, 11c, 13c e 12c com os cinco
compostos menos ativos, 22a, 14a, 8a, 23a e 24a observa-se que os valores de clogP dos mais
ativos encontram-se numa faixa acima de 2,0 e abaixo de 3,0, enquanto que os menos ativos
apresentam clogP abaixo de 1,0 e acima de 3,0. Pode-se supor que a lipofilicidade numa faixa
entre 2,0 e 3,0 seja preferencial para o desempenho destes inibidores.
64
Todos os compostos analisados obedecem à Regra dos Cinco de Lipinski (LIPINSKI,
2004) (Apêndice C) que estabelece parâmetros para que um fármaco tenha boa absorção por
via oral. São eles:
Peso molecular menor do que 500 daltons;
cLogP menor do que 5;
Máximo de cinco grupos doadores de ligação hidrogênio;
Máximo de dez grupos aceptores de ligação hidrogênio.
6.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN
SILICO
Os estudos de farmacocinética e toxicologia in silico têm sido bastante utilizados e
auxiliam no processo de descoberta de novas entidades químicas (MAGALHÃES, 2013;
BRITO, 2010; PASSAMANI, 2009; AFONSO, 2008; MAGALHÃES, 2008; LAGORCE et
al., 2008; SELICK; BERESFORD; TARBIT, 2002).
No servidor Osiris® Property Explorer, o perfil farmacocinético é determinado pelo
parâmetro druglikeness (semelhança com fármacos), que é baseado nos fragmentos de 3300
fármacos comerciais e 15000 substâncias químicas disponíveis comercialmente.
De acordo com cálculos baseados nessa lista, cerca de 80% dos fármacos
apresentaram valores de druglikeness positivos, enquanto que os produtos químicos
apresentaram valores negativos. Portanto, para um candidato a fármaco, é desejável que ele
possua valores de druglikeness positivos, o que significa que ele possui fragmentos
semelhantes aos fármacos disponíveis no mercado (Osiris®
Property Explorer, SANDER et
al., 2009; Actelion Pharmaceutical Ltd.; BRITO, 2010).
Nas Figuras 22, 23 e 24 estão os gráficos do perfil de druglikeness dos cinco
compostos mais ativos de cada série dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.
65
Figura 22: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL.
Figura 23: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL.
Série a
66
Figura 24: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL.
O melhor perfil de druglikeness foi observado para a série c, onde estão os dois
compostos mais ativos, 1c e 21c, que apresentaram valores positivos. Os compostos 7c, 9c,
10c e 25c foram os que mais se aproximaram de RAL, e apresentam IC50 < 100 nM, estando
entre os compostos com melhor atividade biológica. Na série b, o destaque é o composto 2b,
único que apresentou druglikeness maior que RAL. Infelizmente, 2b não está entre os
compostos com melhor atividade biológica, com IC50 = 534 nM. Na série a, foram observados
os piores perfis de druglikeness. Mais da metade com valores negativos. Fazem parte desta
série os cinco compostos de menor atividade, 22a, 14a, 8a, 23a e 24a, além dos inativos 11a,
15a e 18a.
O parâmetro drug-score (índice de aproximação para se tornar um potencial candidato
a fármaco), combina os valores obtidos de druglikeness, cLogP (lipofilicidade), logS
(solubilidade), peso molecular e riscos de toxicidade em um único valor de modo a avaliar se
o composto tem potencial para se tornar um fármaco. Este parâmetro permite julgar de uma
forma mais completa o potencial de um fármaco. Valores de drug-score próximos de 1
garantem uma probabilidade teórica de sucesso (Osiris® Property Explorer, SANDER et al.,
2009; Actelion Pharmaceutical Ltd.; BRITO, 2010).
67
Nas Figuras 25, 26 e 27 estão os gráficos do perfil de drug-score dos cinco compostos
mais ativos de cada série dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.
Figura 25: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL.
Figura 26: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL.
68
Figura 27: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL.
A série c foi a que apresentou o melhor perfil de drug-score. Mais da metade dos
compostos com valores acima de 0,5 (metade de 1 – valor ideal), entre eles 1c o mais ativo. A
série b apresentou o pior perfil, e nenhum composto alcançou pontuação igual ou maior que
0,5. Na série a, os compostos 24a e 8a foram alguns dos poucos que alcançaram pontuação
igual ou maior que 0,5. Infelizmente, estão entre os cinco compostos com menor atividade
biológica.
Os perfis toxicológicos foram avaliados quanto aos potenciais riscos mutagênicos,
tumorigênico, irritante e efeito sobre o sistema reprodutor. A análise in silico foi feita no
servidor Osiris® Property Explorer (Actelion Pharmaceuticals Ltd.), que identifica fragmentos
estruturais pré-computados de compostos reconhecidamente tóxicos do banco de dados
RTECS® (Registry of Toxic Effects of Chemical Substances). O fragmento é considerado
tóxico se ele estiver na lista do RTECS e não estiver (ou estiver raramente) no banco de dados
dos fármacos comerciais (BRITO, 2010).
Nas Figuras 28, 29 e 30 estão o risco de toxicidade in silico encontrados para os cinco
compostos mais ativos de cada série.
69
Figura 28: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série a e RAL.
Figura 29: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série b e RAL.
70
Figura 30: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série c e RAL.
Houve redução do risco mutagênico de alto, em compostos da série a e b, para
moderado, nos compostos da série c. A principal diferença estrutural entre eles é a formação
de um ciclo entre o radical R2 e o núcleo azaindol. Este aumento da restrição conformacional
é, provavelmente, responsável por essa diferença.
6.2. DOCKING MOLECULAR
6.2.1. PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO
Para as simulações de docking molecular foi utilizada a estrutura do cristal do
intassomo da PFV-IN (código PDB = 3OYA) (Figura 31), composta pela enzima complexada
com seu respectivo DNA viral, tendo como ligante o fármaco de referência RAL. De acordo
com Johnson e colaboradores (2012), esta estrutura reproduz o modo de ligação com DNA
viral, assim como ocorre na HIV-IN (JOHNSON et al., 2012).
71
Figura 31: Estrutura da PFV-IN (código PDB = 3OYA), com destaque para o sítio ativo onde
está o fármaco RAL.
Foi feito alinhamento da sequência primária dos sítios catalíticos da PFV-IN (Uniprot
ID P14350) e da HIV-IN (Uniprot ID P12497), no servidor T-COFFEE, obtendo-se um score
igual a 94.
O programa T-COFFEE usa uma biblioteca primária de alinhamentos locais e globais
de pares de sequências, gerados pelos programas LALIGN (HUANG; MILLER, 1991) e
CLUSTALW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994), respectivamente. Em seguida,
numa etapa de otimização, é selecionado o alinhamento múltiplo mais ajustado aos
alinhamentos de pares de sequência da biblioteca primária, usando o método progressivo,
semelhante ao utilizado no CLUSTALW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994). Este
procedimento fornece um alinhamento múltipo global com menos tendência a erros
relacionados ao desalinhamento das sequências primárias de entrada.
A análise do alinhamento foi feita pelo programa Core, que avalia a qualidade do
pareamento múltiplo das sequências primárias pontuando o alinhamento múltiplo (POIROT,
O'TOOLE E NOTREDAME, 2003). Este programa utiliza uma escala de cores que varia do
azul ao vermelho para avaliar a qualidade do alinhamento. As regiões pareadas com alto grau
72
de identidade são destacadas em cor vermelha, enquanto aquelas com baixo grau de
identidade são destacadas nas cores azul e verde (Figura 32). A similaridade entre PFV-IN e
HIV-IN é limitada ao sítio ativo, uma vez que PFV-IN possui grau de identidade menor que
20% com HIV-IN, e uma extensão do domínio N-terminal não encontrada na HIV-IN (YIN;
CRAIGIE, 2010). Entretanto, os três domínios encontrados no intassomo da PFV-IN tem
essencialmente a mesma estrutura encontrada nos domínios individuais da HIV-IN. Portanto,
a estrutura do intassomo da PFV-IN representa um modelo confiável do intassomo da HIV-IN
(YIN; CRAIGIE, 2010).
73
T-COFFEE, Version_9.03.r1318 (2012-07-12 19:05:45 - Revision 1318 - Build 366)
Cedric Notredame
CPU TIME:0 sec.
SCORE=94
*
BAD AVG GOOD
*
sp|P14350|868-1 : 93
sp|P12497|1201- : 94
cons : 94
sp|P14350|868-1 1 RPQKPFDKFFIDYIGPLPP--SQGYLYVLVVVD 31
sp|P12497|1201- 1 VDCSPGI-WQL------DCTHLEG-KVILVAVH 25
cons 1 .* : : :* :**.*. 33
sp|P14350|868-1 32 GMTGFTWLYPTKAPSTSATVKSLNVLTSIAIPK 64
sp|P12497|1201- 26 VASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVK 58
cons 34 :*: * : . *. * *:. * 66
sp|P14350|868-1 65 VIHSDQGAAFTSSTFAEWAKERGIHLEFSTPYH 97
sp|P12497|1201- 59 TVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYN 91
cons 67 .:*:*:*: ***:*. . **: **. **: 99
sp|P14350|868-1 98 PQSGSKVERKNSDIKRLLTKLLVGRPTKWYDLL 130
sp|P12497|1201- 92 PQSQGVIESMNKELKKIIGQVR----DQAEHLK 120
cons 100 *** . :* *.::*::: :: : .* 132
sp|P14350|868-1 131 PVVQLALN----NTYSPVLKYTPHQLLFGID 157
sp|P12497|1201- 121 TAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDII 151
cons 133 ..**:*: : . : *:. : :..* 163
Na estrutura da PFV-IN assumindo o ligante RAL como referência, foi feita uma
pesquisa dos resíduos localizados num raio de até 5 Å, e comparados com HIV-IN, como
representado no Quadro 1.
Figura 32: Resultado do alinhamento da sequência primária dos sítios catalíticos da HIV-IN e
PFV-IN.
74
Quadro 1: Alinhamento de resíduos da PFV-IN com HIV-IN. Os resíduos destacados em
amarelo fazem parte da tríade catalítica, e os destacados em rosa sofreram mutação.
Resíduo – sequência primária
PFV-IN HIV-IN
Asp116 Asp64 (tríade catalítica)
Asp128 -
Tyr129 -
Asp185 Asp116 (tríade catalítica)
Gln186 Asn117
Pro211 Pro142
Tyr212 Tyr143
His213 Asn144
Pro214 Pro145
Gln215 Gln146
Glu221 Glu152 (tríade catalítica)
Os resíduos Gln186 e His213 foram ambos mutados para o resíduo Asn (asparagina),
no MVD, seguidos de etapas de minimização de energia. É importante ressaltar que os
aminoácidos mutados não estão próximos aos íons Mg²+.
6.2.2. VALIDAÇÃO DOS PROTOCOLOS DE DOCKING POR RE-DOCKING
Antes da realização do docking dos compostos em estudo em seu respectivo alvo, o
protocolo foi validado. Nessa validação o próprio ligante da estrutura cristalina de um
complexo ligante-proteína é submetido ao processo de docking molecular para tentar
reproduzir o modo de ligação original. A enzima foi considerada como um corpo rígido.
Em geral, a confiabilidade dos resultados de docking depende da similaridade entre o
modo de ligação experimental e a solução de menor energia. Um valor de RMSD ≤ 2,0 Å é
amplamente aceito como a distinção entre o sucesso e o fracasso em reproduzir um modo de
ligação conhecido (YUSUF et al., 2008). No re-docking, foi aceito como metodologia
validada, todo resultado que apresentou valor de RMSD ≤ 2,0 Å.
A validação do protocolo de docking foi realizada com as estruturas da PFV-IN
mutada e não mutada. Dessa forma, foi possível observar quaisquer modificações na enzima
decorrentes da mutação.
Além disso, foi testada a influência das moléculas de água na simulação de docking.
Um total de seis corridas foram efetuadas, três para a enzima mutada e três para a não mutada,
75
em ambientes distintos: presença de todas as moléculas de água, ausência de moléculas de
água e com apenas quatro moléculas de água que coordenam com os íons Mg2+
. Para essas
diferentes situações foram obtidas soluções com RMSD abaixo de 2,0 Å. Logo, a mutação
não prejudicou a interação do ligante com a enzima, assim como a presença ou ausência de
moléculas de água.
De acordo com Johnson e colaboradores (2012), a manutenção das moléculas de água
localizadas próxima ao sítio ativo é importante, pois elas fazem contato direto com os
inibidores ou íons Mg²+ (JOHNSON et al., 2012). A partir dessas informações optou-se pela
realização do docking na presença das moléculas de água que coordenam com os íons Mg²+,
pois elas podem ser importantes na manutenção da conformação ativa da enzima.
No re-docking com a enzima mutada e na presença das moléculas de água que
coordenam com os íons Mg²+, a melhor solução encontrada apresentou RMSD = 0,379 Å, e o
melhor valor de Re-Rank, -135,315.
Foi realizada a sobreposição da melhor pose docada na conformação correspondente
do ligante do cristal, como pode ser visto na Figura 33. Observa-se um bom encaixe das duas
estruturas.
76
Figura 33: Sobreposição da melhor pose docada (rosa) no ligante do cristal (amarelo). As
esferas verdes representam os íons Mg²+.
6.2.3. SIMULAÇÕES DE DOCKING MOLECULAR
Os derivados azaindóis do ácido hidroxâmico foram desenvolvidos com o intuito de
exercerem atividade de inibição da enzima HIV-IN através da complexação com os dois íons
Mg²+ presentes no sítio ativo, que funcionam como cofatores (PLEWE et al., 2009). Neste
estudo foram avaliadas as interações entre os complexos ligante-proteína dos seguintes
derivados: o mais ativo (1c), o segundo mais ativo (21c), um análogo estrutural do mais ativo
(19a), o menos ativo (24a) e um inativo (18a).
Foi atribuída a RAL e aos ligantes estudados, exceto 18a, carga parcial -1 para o
átomo de oxigênio da hidroxila da função ácido hidroxâmico, e para o átomo de oxigênio da
hidroxila ligada ao anel pirimidinona no caso do RAL. RAL possui pka = 2,13, e os
compostos possuem pka entre 8,2 e 8,6, logo há uma fração ionizada em pH = 7,2, no qual foi
realizado o ensaio de atividade enzimática (PLEWE et al., 2009; CHEMICALIZE, 2014).
Não foram observadas interações de RAL e dos derivados azaindóis com os íons Mg²+
em simulações de docking realizadas com tais compostos não ionizados. Sabe-se que os
dicetoácidos, primeiros compostos inibidores da HIV-IN descobertos, apresentam entre seus
grupos farmacofóricos um carboxilato que pode ser substituído por um bioisóstero
(ROGOLINO et al., 2012). De Luca e colaboradores (2011), consideraram a porção ácido
77
carboxílico como carboxilato em seus estudos de docking com dicetoácidos. Logo, há
influência do estado de ionização na interação com os íons Mg²+, sendo fundamental a
presença de hidrogênios ionizáveis em compostos inibidores da HIV-IN, como observado na
Figura 34.
Figura 34: Estrutura geral dos dicetoácidos e estruturas químicas do RAL e do composto 1c,
com destaque para os hidrogênios ionizáveis.
Para cada ligante foi gerado um grupo (cluster) com 15 soluções (poses). A melhor
solução foi escolhida levando em consideração o menor valor possível de Re-Rank e
sobreposição com RAL.
A função de pontuação Re-Rank foi utilizada porque a melhor solução obtida na
validação do protocolo de docking foi a que apresentou menor valor de RMSD e melhor Re-
Rank. O Re-Rank é uma função de pontuação que leva em conta um termo de torção sp2-sp
2 e
o potencial 12-6 de Lennard-Jones, que é utilizado para interações estéricas; para interações
eletrostáticas é utilizado o potencial de Coulomb. Ele identifica a mais promissora solução das
soluções obtidas pelo algoritmo de docking (MOLEGRO, 2011).
78
A Tabela 5 é um resumo das propriedades das melhores soluções escolhidas para cada
composto e RAL.
Tabela 5: Valores de MolDock, Re-Rank e Einter das soluções escolhidas para cada composto e
RAL.
Composto MolDock Score Re-Rank Score Einter (Kcal/mol)
RAL -210,93 -135,315 -218,286
1c -152,61 -97,70 -160,765
21c -183,58 -121,46 -184,873
19a -159,16 -100,43 -168,813
24a -187,86 -120,99 -203,29
18a -140,69 -92,6026 -164,528
Após a escolha da melhor solução obtida para cada composto, foi feita uma análise da
conformação e do modo de interação de cada ligante com a enzima, em comparação com
RAL, fármaco de referência.
O fármaco de referência RAL apresentou 10 interações do tipo ligação de hidrogênio:
i) Asp185-OD1 e RAL-O5 (distância O---O = 2,83 Å); ii) Tyr212-OH e RAL-O1 (distância
O---O = 2,19 Å); iii) Glu221-OE2 e RAL-O3 (distância O---O = 2,92 Å) iv) RAL-O4 e
Asp128-OD1 (distância O---O = 3,13 Å) v) RAL-O4 e Asp128-OD2 (distância O---O = 3,01
Å) vi) RAL-O4 e Glu221-OE2 (distância O---O = 2,96 Å) vii) RAL-O4 e H2O456-O1
(distância O---O = 3,18 Å) viii) RAL-O4 e H2O534-O1 (distância O---O = 2,97 Å) ix)
H2O401-O1 e RAL-O5 (distância O---O = 3,02 Å) x) H2O534-O1 e RAL-O5 (distância O---O
= 2,51 Å). Na Figura 35, estão representadas essas interações.
79
Figura 35: Interações do tipo ligação de hidrogênio detectadas para RAL (amarelo).
Obs.: As duas esferas verdes representam os íons Mg²+ e as pequenas esferas vermelhas são
moléculas de água.
Além das ligações de hidrogênio, foram detectadas interações do tipo eletrostáticas
entre o oxigênio ionizado do RAL e os dois íons Mg²+, que funcionam como cofatores
(distâncias O4---Mg1 = 2,031 Å e O4---Mg2 = 2,257 Å) (Figura 36). Essa interação é uma
das mais importantes para a atividade antiviral, uma vez que a inibição enzimática dos
fármacos dessa classe é caracterizada pela complexação com os dois íons Mg²+ presentes no
sítio ativo (HAZUDA, 2012).
80
Figura 36: Interações eletrostáticas entre RAL (amarelo) e os íons Mg²+ (verde).
Ainda foram observadas quatro interações hidrofóbicas do tipo π-π para RAL (Figura
37): i) entre o anel oxadiazol e o anel imidazol da base nitrogenada adenina (distância = 4,62
Å) ii) entre o anel oxadiazol e o anel pirimidina da base nitrogenada adenina (distância = 4,30
Å) iii) entre o radical p-fluorofenil e a base nitrogenada citosina (distância = 3,64 Å) iv) entre
o anel pirimidinona e o fenol de Tyr212 (distância = 3,65 Å).
81
Figura 37: Interações hidrofóbicas do tipo π-π detectadas para RAL (amarelo).
Foram observadas interações intermoleculares do tipo ligação de hidrogênio para os
derivados azaindóis, como representado nas Figuras 38, 39, 40, 41 e 42.
Figura 38: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 1c nas
simulações de docking molecular.
82
Figura 39: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 21c
nas simulações de docking molecular.
Figura 40: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 19a
nas simulações de docking molecular.
83
Figura 41: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 24a
nas simulações de docking molecular.
Figura 42: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 18a
nas simulações de docking molecular.
84
As distâncias das ligações de hidrogênio detectadas para os cinco derivados azaindóis
avaliados estão listadas na Tabela 6.
Tabela 6: Distâncias das ligações de hidrogênio realizadas pelos derivados azaindóis nas
simulações de docking molecular.
Ligação de hidrogênio
Composto Participantes Distância
1c
1c-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,37 Å
1c-O2 e H2O534-O1 O---O = 3,02 Å
1c-O2 e DNA-N O---N = 3,10 Å
21c
21c-O2 e DNA-N2 O---N = 2,94 Å
21c-O2 e H2O534-O1 O---O = 3,12 Å
21c-O3 e Tyr212-O O---O = 1,73 Å
19a
19a-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,60 Å
19a-O2 e H2O534-O1 O---O = 2,50 Å
19a-O2 e Asp185-OD1 O---O = 3,08 Å
24a
24a-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,68 Å
24a-O2 e H2O534-O1 O---O = 2,81 Å
24a-O2 e Asp185-OD1 O---O = 2,83 Å
18a 18a-N1 e H2O456-O1 O---N = 2,72 Å
18a-O2 e Asn213-N N---O = 2,21 Å
Interações do tipo sigma-π foram observadas apenas para o composto 1c, entre o
radical p-fluorofenil e o resíduo Pro214 (distância = 2,48 Å). O composto 21c não apresentou
interações do tipo π-π. Nas Figuras 43, 44, 45 e 46 estão as interações observadas para os
demais compostos.
85
Figura 43: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 1c.
Figura 44: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 19a.
86
Figura 45: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 24a.
Figura 46: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 18a.
As distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π detectadas para os cinco
derivados azaindóis avaliados estão listadas na Tabela 7.
87
Tabela 7: Distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π realizadas pelos derivados
azaindóis nas simulações de docking molecular.
Interação
π-π
Composto Participantes Distância
1c
Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 4,82 Å
Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,18 Å
Radical p-fluorofenil e citosina 3,51 Å
21c Não apresentou interações do tipo π-π.
19a
Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 5,02 Å
Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,19 Å
Azaindol (anel pirrol) e adenina (anel imidazol) 5,46 Å
Radical p-fluorofenil e citosina 3,52 Å
24a
Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 5,08 Å
Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,29 Å
Azaindol (anel pirrol) e adenina (anel imidazol) 5,55 Å
Radical p-fluorofenil e citosina 3,52 Å
18a Radical p-fluorofenil e citosina 4,80 Å
O oxigênio ionizado (O2) dos compostos 1c, 21c, 19a e 24a realizou interação
eletrostática com pelo menos um dos íons Mg²+
e resíduos da tríade catalítica. Essas
interações estão representadas nas Figuras 47, 48, 49 e 50.
Figura 47: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto
1c.
88
Figura 48: Interações eletrostáticas e suas respectivas distâncias (em Å) detectadas para o
composto 21c.
Figura 49: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto
19a.
89
Figura 50: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto
24a.
De acordo com Plewe e colaboradores os derivados azaindóis do ácido hidroxâmico
inibem a enzima HIV-IN através da complexação com os dois íons Mg²+ presentes no sítio
ativo (PLEWE et al., 2009). Entre os compostos analisados, apenas 21c apresentou interação
com ambos os íons. Foi observado que seu oxigênio ionizado (O2) encontra-se sobreposto ao
do RAL, e posicionado entre os dois íons Mg²+ (Figura 48). Nos demais compostos esta
sobreposição não foi detectada, inclusive no mais ativo, 1c, onde foi observada interação com
apenas um íon Mg²+.
Na estrutura química do composto 18a não há oxigênios ionizáveis (Figura 51). Os
radicais R1 e R2 são grupos metila. Logo, não houve interação com os íons Mg²+, o que
explica sua ausência de atividade biológica. Além disso, encontra-se distante do DNA,
realizando apenas uma interação do tipo π (distância = 4,80 Å), maior que a observada para os
compostos 1c, 19a e 24a (distância = 3,51 Å, 3,52 Å e 3,52 Å, respectivamente).
90
Figura 51: Estrutura tridimensional do composto 18a.
Ao comparar a conformação dos compostos estudados com RAL, apenas 21c
apresenta conformação diferente. Nos demais houve sobreposição com RAL, como pode ser
observado nas Figuras 52, 53, 54, 55 e 56.
Figura 52: Sobreposição de 1c com RAL (amarelo).
91
Figura 53: Sobreposição de 21c com RAL (amarelo).
Figura 54: Sobreposição de 19a com RAL (amarelo).
92
Figura 55: Sobreposição de 24a com RAL (amarelo).
Figura 56: Sobreposição de 18a com RAL (amarelo).
Pode-se observar que 1c, 19a e 24a estão posicionados na cavidade de forma
semelhante, com sobreposição entre os radicais p-fluorofenil do RAL e dos respectivos
compostos. Isto fez com que houvesse interação de O2 com apenas um dos íons Mg2+
. Em
21c, a presença de substituintes na posição R3 fez com que ele se posicionasse de modo
diferente dos demais, permitindo que O2 interagisse com ambos os íons Mg²+, semelhante ao
que ocorre com RAL.
93
O número de interações feitas por 21c e 1c pode explicar o fato de 21c ser
ligeiramente menos ativo que 1c, apesar de sua interação com ambos os íons Mg²+. Foram
detectadas três interações do tipo ligação de hidrogênio para ambos, mas 1c apresenta quatro
interações do tipo π, e 21c nenhuma. A conformação adotada por 1c na cavidade permitiu
uma melhor interação com a proteína-alvo, o que não ocorreu com 21c. É importante ressaltar
que RAL realiza interações do tipo π-π com a proteína-alvo nos mesmos locais que 1c.
Foi observado que 19a e 24a apresentaram perfis de interação semelhantes. A
flexibilidade do radical R2 parece dificultar a aproximação entre estes compostos e o DNA,
pois as distâncias interatômicas das interações π são maiores que as observadas para o
composto 1c. Ainda em relação às interações não foram observadas diferenças significativas
devido à diferença de volume do radical R2 em 19a e 24a.
6.3. MODIFICAÇÕES ESTRUTURAIS
Entre os compostos estudados, 1c poderia ser escolhido como composto protótipo.
Mas, foi observado durante as simulações de docking molecular que, ele interage com apenas
um íon Mg²+. Diante disso, podem ser propostas modificações estruturais para 1c (Figura 57).
A nova posição da função ácido hidroxâmico acarretaria na interação com ambos os íons
Mg²+.
94
Figura 57: Modificações estruturais propostas para o composto 1c.
7. CONCLUSÕES
Não foi observada relação direta com a atividade para os descritores calculados. O
melhor perfil farmacocinético e toxicológico foi apresentado pela série c. A principal
característica que a difere das demais é o radical R2 cíclico. Além de melhorar os valores de
druglikeness e drug-score, houve redução do risco mutagênico.
Considerando a estrutura geral dos derivados azaindóis, os substituintes em R1, R2,
R3 e Ar possuem relação com atividade apresentada. Pode-se sugerir que a presença de um
átomo de hidrogênio em R1 torna o composto ionizado, de maneira que haja complexação
entre o oxigênio carregado e os íons Mg2+
. Por outro lado, o radical R2 pode ser um grupo etil
para que forme um ciclo com o núcleo azaindol, pois essa ciclização melhorou o perfil
toxicológico e a atividade biológica da série, como citado anteriormente. A restrição
conformacional melhorou o acesso dos derivados ao sítio ativo enzimático. O radical Ar deve
ser o grupo p-fluorofenila, que semelhante ao RAL, faz interação com o DNA do tipo π-π, o
que favorece a manutenção da conformação ativa dos derivados azaindóis. E o radical R3
representa uma posição importante para a proposição de novos derivados. No docking
molecular o composto 21c adotou conformação diferente dos demais devido a este radical.
95
Com isso, seu oxigênio ionizado ficou entre os dois íons Mg²+. Apesar disso, apresentou
número menor de interações intermoleculares que 1c, o mais ativo.
É importante ressaltar que as modificações estruturais propostas, estão baseadas em
simulações de docking molecular realizadas com um modelo da enzima HIV-IN construído a
partir de mutações de aminoácidos do sítio catalítico da PFV-IN. Futuramente, pretende-se
construir um modelo da HIV-IN por modelagem comparativa, e com este modelo, avaliar os
derivados azaindóis do ácido hidroxâmico com técnicas de docking e dinâmica molecular.
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104
APÊNDICE A - Descritores estéricos dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.
# Volume (ų) Área (Ų) PSA (Ų) IC50 (nM) # Volume (ų) Área (Ų) PSA (Ų) IC50 (nM)
1a 275,88 296,09 55,271 84 11b 446,94 472,46 76,745 503
2a 271,36 291,33 55,063 137 12b 413,54 432,04 69,372 319
3a 284,93 306,02 55,243 102 13b 381,95 409,82 63,785 251
4a 289,17 308,64 55,265 131 14b 432,26 456,08 50,453 559
5a 293,53 313,17 55,052 442 15b 356,16 382,23 60,655 340
6a 267,99 289,93 55,072 387 16b 422,68 455,45 54,695 552
7a 260,53 280,36 61,851 779 1c 296,38 309,91 43,599 2,9
8a 285,37 303,47 80,231 5730 2c 290,07 305,81 50,511 32
9a 290,48 309,62 70,428 812 3c 331,32 335,44 50,537 18
10a 286,37 306,46 70,172 1620 4c 318,73 331,20 60,24 50
11a 286,33 306,16 70,172 >10000 5c 332,16 344,95 60,243 17
12a 301,54 321,64 91,680 1300 6c 363,64 380,73 45,755 81
13a 301,41 322,62 90,834 608 7c 389,06 407,44 64,465 15
14a 297,53 319,95 92,849 1720 8c 405,41 418,60 45,759 15
15a 297,52 319,81 92,915 >10000 9c 409,21 431,45 52,814 26
16a 295,88 316,22 40,964 250 10c 411,07 428,61 46,031 35
17a 297,00 320,51 41,525 356 11c 398,21 415,01 46,023 11
18a 316,68 339,10 28,005 >50000 12c 436,91 453,27 56,914 12
19a 291,08 310,25 40,666 250 13c 419,16 434,59 57,533 11
20a 327,85 350,55 40,087 618 14c 428,69 444,21 57,421 14
21a 334,31 353,66 54,409 804 15c 423,85 448,62 55,17 17
22a 345,38 364,82 37,725 1700 16c 455,42 473,88 57,004 14
23a 328,01 350,09 39,316 8000 17c 429,71 441,67 50,037 16
24a 374,68 391,02 40,003 23000 18c 360,24 376,65 77,017 13
1b 391,50 415,44 62,267 1421 19c 433,19 449,33 53,797 13
2b 417,71 441,47 46,462 534 20c 420,88 436,17 57,151 14
3b 400,04 415,21 68,721 388 21c 394,31 412,23 62,294 8,8
4b 417,49 438,26 79,840 466 22c 447,38 465,67 57,403 14
5b 417,49 438,26 79,840 558 23c 364,24 382,54 43,763 13
6b 319,62 343,17 60,637 145 24c 410,90 426,23 83,896 43
7b 386,20 418,44 55,587 382 25c 424,50 448,04 81,381 66
8b 409,48 432,16 55,103 313 26c 378,31 396,78 76,326 13
9b 339,86 364,87 48,267 242 27c 403,68 420,11 75,879 22
10b 404,44 434,20 55,121 308 28c 438,33 455,23 76,798 36
105
APÊNDICE B - Descritores eletrônicos dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.
#
µ (Debye) EHOMO (eV) ELUMO (eV) IC50 (nM)
#
µ (Debye) EHOMO (eV) ELUMO (eV) IC50 (nM)
1a 8,18 -8,55 2,78 84 11b 8,90 -8,56 2,65 503
2a 7,66 -8,57 2,79 137 12b 6,46 -8,76 2,52 319
3a 8,84 -8,58 2,6 102 13b 9,34 -8,6 2,65 251
4a 7,63 -8,55 2,47 131 14b 6,13 -8,18 2,9 559
5a 5,89 -8,73 2,64 442 15b 5,55 -8,38 2,79 340
6a 6,89 -8,68 2,69 387 16b 7,65 -8,03 3,05 552
7a 7,54 -8,58 2,79 779 1c 8,38 -8,48 2,84 2,9
8a 8,32 -8,4 2,92 5730 2c 9,21 -8,45 2,62 32
9a 5,54 -8,69 1,62 812 3c 8,73 -8,41 2,34 18
10a 9,09 -8,71 2,03 1620 4c 4,62 -8,59 1,66 50
11a 7,89 -8,77 2,03 >10000 5c 3,35 -8,66 1,37 17
12a 8,5 -8,45 2,25 1300 6c 8,42 -8,31 2,93 81
13a 7,5 -8,62 2,2 608 7c 9,67 -8,41 2,83 15
14a 6,08 -8,58 2,42 1720 8c 8,32 -8,29 2,93 15
15a 5,16 -8,65 2,44 >10000 9c 7,39 -8,33 2,9 26
16a 6,83 -8,44 2,87 250 10c 8,36 -8,28 2,94 35
17a 7,1 -8,43 2,87 356 11c 8,15 -8,43 2,79 11
18a 5,63 -8,27 2,96 >50000 12c 7,35 -8,33 2,96 12
19a 7,29 -8,48 2,87 250 13c 7,7 -8,3 2,75 11
20a 7,17 -8,48 2,87 618 14c 8,81 -8,49 2,77 14
21a 7,21 -8,66 2,63 804 15c 8,54 -8,18 2,96 17
22a 6,11 -8,42 2,93 1700 16c 7,97 -8,49 2,78 14
23a 6,34 -8,44 2,9 8000 17c 7,71 -8,27 2,91 16
24a 7,13 -8,49 2,85 23000 18c 6,81 -8,33 2,81 13
1b 3,51 -8,31 2,84 1421 19c 8,57 -8,21 2,85 13
2b 6,42 -8,23 2,93 534 20c 10,83 -8,14 2,9 14
3b 2,76 -8,45 2,72 388 21c 9,89 -8,16 3,01 8,8
4b 4,93 -8,44 2,82 466 22c 6,41 -8,26 2,87 14
5b 4,93 -8,44 2,81 558 23c 7,06 -8,51 2,67 13
6b 5,10 -8,4 2,78 145 24c 9,72 -8,86 2,41 43
7b 5,85 -8,34 2,82 382 25c 10,77 -8,79 2,54 66
8b 4,20 -8,34 2,84 313 26c 10,55 -8,81 2,48 13
9b 5,02 -8,35 2,81 242 27c 11,3 -8,74 2,53 22
10b 6,70 -8,2 2,97 308 28c 6,16 -8,91 2,41 36
106
APÊNDICE C - Descritores farmacocinéticos dos derivados azaindóis do ácido
hidroxâmico.
# P.M.
(uma) clogS clogP ALH DLH
IC50
(nM) #
P.M.
(uma) logS clogP HBA HBD
IC50
(nM)
1a 303,268 -2,74 2,38 5 2 84 11b 455,49 -1,42 0,89 9 2 503
2a 285,278 -2,43 2,22 5 2 137 12b 426,448 -2,12 1,3 8 2 319
3a 319,273 -3,16 2,78 5 2 102 13b 384,411 -2,6 1,94 7 2 251
4a 337,713 -3,47 2,94 5 2 131 14b 426,492 -1,88 2,39 7 1 559
5a 336,178 -3,58 3,18 5 2 442 15b 357,385 -2,19 2,27 6 2 340
6a 307,761 -2,86 0,96 6 2 387 16b 415,465 -2,24 2,47 7 1 552
7a 268,276 -1,34 1,41 6 2 779 1c 311,316 -2,27 2,44 5 1 2,9
8a 298,302 -1,22 0,52 7 3 5730 2c 312,304 -1,5 1,17 6 1 32
9a 310,288 -3,2 2,25 6 2 812 3c 330,290 -1,81 1,33 6 1 18
10a 292,298 -2,88 2,1 6 2 1620 4c 336,326 -3,04 2,47 6 1 50
11a 292,298 -2,88 2,1 6 2 >10000 5c 370,771 -3,78 3,03 6 1 17
12a 328,303 -2,51 1,13 7 3 1300 6c 368,412 -1,78 2,07 6 1 81
13a 328,303 -2,51 1,13 7 3 608 7c 398,438 -1,58 1,55 7 2 15
14a 310,313 -2,2 0,97 7 3 1720 8c 408,477 -2,74 2,8 6 1 15
15a 310,313 -2,2 0,97 7 3 >10000 9c 412,465 -1,7 1,91 7 1 26
16a 317,295 -2,23 2,62 5 1 250 10c 408,477 -2,6 2,79 6 1 35
17a 317,295 -2,74 2,74 5 1 356 11c 430,430 -2,92 2,53 6 1 11
18a 331,322 -2,24 2,98 5 0 >50000 12c 446,482 -2,94 2,67 7 1 12
19a 299,305 -1,92 2,46 5 1 250 13c 432,455 -2,83 2,38 7 1 11
20a 327,359 -2,49 3,28 5 1 618 14c 439,487 -3,02 2,2 7 1 14
21a 343,358 -1,98 2,22 6 2 804 15c 427,476 -2,88 2,41 7 1 17
22a 341,386 -2,71 3,33 5 1 1700 16c 460,509 -3,22 2,95 7 1 14
23a 327,359 -2,6 3,11 5 1 8000 17c 449,457 -3,92 3,8 6 1 16
24a 375,403 -3,24 4,19 5 1 23000 18c 383,379 -2,52 2,04 6 2 13
1b 398,438 -1,72 1,59 7 2 1421 19c 438,503 -2,23 2,36 7 1 13
2b 411,481 -1 1,84 7 1 534 20c 424,476 -2,45 2,03 7 1 14
3b 411,437 -1,35 0,7 8 2 388 21c 397,450 -3,02 2,78 6 2 8,8
4b 425,464 -2,05 1,17 8 2 466 22c 453,514 -3,35 2,75 7 1 14
5b 425,464 -2,05 1,17 8 2 558 23c 407,367 -3,78 3,74 5 1 13
6b 329,331 -1,8 1,57 6 2 145 24c 460,486 -1,48 0,32 10 1 43
7b 387,411 -1,85 1,78 7 1 382 25c 462,502 -1,33 0,57 10 1 66
8b 413,449 -2,62 2,07 7 1 313 26c 418,449 -1,41 0,72 9 1 13
9b 343,358 -1,93 1,93 6 1 242 27c 444,487 -2,09 1,04 9 1 22
10b 401,438 -2,15 2,12 7 1 308 28c 472,541 -2,52 1,78 9 1 36
107
APÊNDICE D – Mapas de potencial eletrostático (MPE) dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
108
APÊNDICE D – Mapas de potencial eletrostático (MPE) dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
109
APÊNDICE D – Mapas de potencial eletrostático (MPE) dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
110
APÊNDICE E – Mapas dos orbitais de fronteira HOMO dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
111
APÊNDICE E – Mapas dos orbitais de fronteira HOMO dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
112
APÊNDICE E – Mapas dos orbitais de fronteira HOMO dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
113
APÊNDICE F – Mapas dos orbitais de fronteira LUMO dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
114
APÊNDICE F – Mapas dos orbitais de fronteira LUMO dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.
115
APÊNDICE F – Mapas dos orbitais de fronteira LUMO dos derivados azaindóis do
ácido hidroxâmico.