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MONITORANDO A CONTAMINAÇÃO NOS LABORATÓRIOS DE
HLA
ANA LUCIA VIEIRA MION
HC-UFPR
XII ENCONTRO DE HISTOCOMPATIBILIDADE E IMUNOGENÉTIC A
2009 1
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Contaminação por DNA:
genômico
fragmento de DNA amplificado (amplicon)
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Monitoração:
controle negativo (CN)
controle de tubo aberto (CTA)
teste do esfregaço (wipe test)
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Controle negativo:Objetivo: detectar contaminantes presente nos
reagentes.
Controle de tubo aberto:Objetivo: detectar contaminantes gerados por
aerosol.
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Capaz de detectar todos os amplicons
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Teste de contaminação
primers para região não polimórfica dos genes HLA de classeI e/ou classe II
OU
primers para gene usado como controle interno
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OBJETIVOSDetectar a presença de DNA contaminante em superfícies de trabalho, pipetadores e equipamentos.Efetuar a descontaminação, com hipoclorito de sódio 0,5 % ou HCl 1N, das áreas que se apresentarem positivas (contaminadas).
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FREQÜÊNCIA DE REALIZAÇÃO
PONTOS TESTADOS: mais críticosPuxadores de geladeira, freezer e armáriosMaçanetas de portasBancadas de trabalhoCentrífugas...
NÚMERO DE PONTOS
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Procedimento técnico:
1 – Selecionar os pontos; 2 – Identificar um microtubo para cada ponto;3 – Acrescentar água ultrapura em cada microtubo;4 – Colocar água ultrapura em um tubo cônico; 5 – Descontaminar a pinça;6 – Realizar os esfregaços;7 – Realizar a PCR e,8 – Interpretar.
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HCl 1 Nou
Hipoclorito de sódio 0,5 %
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Papel filtro autoclavado
Autoclavação: 30 dias
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Área ~ 10 cm2
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Incubar: 1h –56 a 60ºC
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Placa de amplificação:
Tubos PCR p/ teste de contaminação
Tubos PCR p/ teste de inibição
Tubo PCR p/ CTA (pelo menos um tubo)
Tubo PCR p/ controle negativo
Tubo PCR p/ controle positivo
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Teste de contaminação
líquido do esfregaço
+
mistura de reação
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Teste de inibição
Objetivo: validar resultados negativos
líquido do esfregaço +
DNA genômico ou pd amplificado diluído+
mistura de reação
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Controle positivo
DNA genômico ou pd amplificado diluído+
mistura de reação
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Controle negativo
água ultrapura+
mistura de reação
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“A monitoração de contaminantes é imprescindível para garantirmos a qualidade nas tipificações HLA.”
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Equipe do Laboratório de Imunogenética do Hospital de Clínicas da UFPR
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