monografia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSACENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Henrique Freitas Santana

Atividade in vitro de extratos etanólicos de própolis sobre isolados de Staphylococcus aureus associados à mastite bovina

Viçosa - MG

Abril – 2009

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSACENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR



Monografia apresentada ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa como parte das exigências de conclusão do Curso de Bacharelado em Bioquímica

VIÇOSA - MG

Abril – 2009

ii



Monografia apresentada ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa como parte das exigências de conclusão do Curso de Bacharelado em Bioquímica

Aprovado em __ de __________ de 2009.

_____________________________Profª Miriam Teresinha dos SantosIntegrante da Banca Examinadora

______________________________Profo Hilário Cuquetto MantovaniOrientador

______________________________Profa Andréa Barros RibonCoordenadora da Disciplina eIntegrante da banca Examinadora

Viçosa – MGAbril – 2009

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de

Microbiologia, pela oportunidade de realização deste trabalho e ao CNPq pela

concessão da bolsa de iniciação científica. A todos os professores do Departamento

de Bioquímica e Biologia Molecular que contribuíram com a minha formação.

Agradeço a Deus por ter me dado saúde e força para conseguir terminar o

curso. Aos meus pais, José do Carmo e Thaïs, pelo carinho, amor, compreensão e

apoio durante todo o tempo. Aos meus irmãos Tomás e Lílian pelo companheirismo

e amor.

Agradeço muito a minha esposa Ana Paula, pela paciência, compreensão,

companheirismo e pelo amor incondicional que amenizou as dificuldades

encontradas durante a minha formação e conclusão deste trabalho.

Agradeço a todos os meus familiares que de forma direta ou indireta

contribuíram para a minha formação. Em especial aos meus avós paternos,

Adelaide e José Pinto (in memoriam) pelo grande apoio e incentivo durante todas as

etapas de minha vida.

Ao professor Hilário Cuquetto Mantovani pela orientação, confiança e

ensinamentos. Aos meus amigos de laboratório pelos momentos de descontração,

aprendizado e companheirismo. Em especial à Ana Andréia pela disponibilidade,

paciência e orientações.

Às professoras Andrea e Miriam pelas participações na banca examinadora.

Aos amigos da Bioquímica que dividiram momentos de alegria, apertos e

estudos durante a minha graduação.

Aos funcionários do Departamento de Microbiologia José Carlos, Sr. Cesário,

Pablo e José Reinaldo.

Aos Professores Sukarno e Maximiliano do Departamento de Física da UFV

pela disponibilidade, ajuda e ensinamentos na realização das imagens de MFA.

A todos que de forma direta ou indireta, contribuíram para a realização deste

trabalho.

iv

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................................VI

LISTA DE TABELAS............................................................................................................................VIII

RESUMO...................................................................................................................................................IX

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................................1

2 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................................3

2.1 MASTITE BOVINA.......................................................................................................................32.2 STAPHYLOCOCCUS AUREUS...............................................................................................................82.3 PRÓPOLIS....................................................................................................................................11

3 OBJETIVOS.....................................................................................................................................14

3.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................................................143.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................................14

4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................................15

4.1 MICRORGANISMOS E CONDIÇÕES DE CULTIVO..............................................................154.2 OBTENÇÃO DA AMOSTRA DE PRÓPOLIS............................................................................154.3 EFEITO DO TEMPO E TEMPERATURA DE EXTRAÇÃO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE PRÓPOLIS..................................................164.4 EFEITO DO EEP SOBRE O CRESCIMENTO DE S. AUREUS....................................................174.5 ATIVIDADE DO EEP SOBRE A MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE S. AUREUS EM TAMPÃO FOSFATO..........................................................................................................174.6 ATIVIDADE DO EEP SOBRE A MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE S. AUREUS EM LEITE..................................................................................................................................184.7 SELEÇÃO OU DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA À PRÓPOLIS POR S. AUREUS. . .194.8 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EEP SOBRE A MORFOLOGIA DE S. AUREUS POR MEIO DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (MFA)...........................................................................204.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS.......................................................................................................21

5 RESULTADOS.................................................................................................................................22

5.1 EFEITO DA TEMPERATURA E DO TEMPO DE EXTRAÇÃO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE PRÓPOLIS...........................................225.2 EFEITO DO EEP SOBRE A CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE S. AUREUS..........................225.3 EFEITO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE S. AUREUS INCUBADO EM TAMPÃO FOSFATO....................................................................................255.4 EFEITO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS SOBRE A MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE S. AUREUS EM LEITE....................................................................................................275.5 SELEÇÃO DE RESISTENTES OU DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA À PRÓPOLIS POR S. AUREUS.........................................................................................................................................295.6 ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA E ARRANJOS CELULARES DE S. AUREUS APÓS EXPOSIÇÃO AO EEP............................................................................................................................30

6 DISCUSSÃO.....................................................................................................................................32

7 CONCLUSÕES................................................................................................................................38

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................................39

APÊNDICE..................................................................................................................................................51

v

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Efeito antibacteriano dos diferentes extratos etanólicos de própolis

contra Staphylococcus aureus 2979. As extrações foram realizadas

a 25 °C (a), 45 °C (b), 60 °C (c) e 75 °C com uma duração de 1; 2; 5;

8; 14; 22 e 25 dias.

Figura 2. Efeito de diferentes concentrações do EEP sobre a viabilidade celular

de Staphylococcus aureus 2979 (colunas pretas) e 4118 (colunas

brancas) em tampão fosfato após 6 h a 37 °C. EEP foi adicionado

nas concentrações de 0 a 10 mg/mL em tampão fosfato e

aproximadamente 107 UFC/mL das estirpes de S. aureus foram

inoculadas nos tubos. Após 6 h de incubação a 37 °C, amostras

foram retiradas e o número de células viáveis foi determinado.

Figura 3. Efeito do EEP sobre a manutenção da viabilidade celular de

Staphylococcus aureus 2979 (● e ○) e 4118 (■ e □) em tampão

fosfato ao longo do tempo de incubação. EEP na concentração de

1 mg/mL foi adicionado ao tampão fosfato (■ e ●) contendo um

inóculo de aproximadamente 107 UFC/mL das estirpes de

Staphylococcus aureus. Os tubos foram incubados a 37 °C e nos

intervalos de tempos entre 0 a 24 h de incubação, retiraram-se

amostras e o número de células viáveis foi determinado. Os

tratamentos controles também são demonstrados (□ e ○).

Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de EEP sobre a viabilidade celular

de Staphylococcus aureus 2979 (colunas pretas) e 4118 (colunas

brancas) em leite após 6 h de incubação a 37 °C. EEP foi adicionado

de 0 a 20 mg/mL no leite e aproximadamente 107 UFC/mL das

estirpes de S. aureus foram inoculadas nos tubos. Após 6 h de

incubação amostras foram retiradas e o número de células viáveis foi

determinado.

23

25

26

27

vi

Figura 5. Efeito do EEP na viabilidade celular de Staphylococcus aureus 2979

(● e ○) e 4118 (■ e □) em leite durante o período de incubação a 37

°C. EEP (20 mg/L) foi adicionado ao leite (● e ■) e aproximadamente

107 UFC/mL das estirpes de S. aureus foram inoculadas nos tubos.

Após os intervalos de 0 a 24 h de incubação a 37 °C, alíquotas foram

retiradas e os números de células viáveis foram determinados. Os

tratamentos controles também são demonstrados (○ e □).

Figura 6. Sensibilidade das estirpes 2979 e 4118 ao EEP antes e após o

tratamento com doses subletais de 0,25 e 0,50 mg/mL do EEP,

respectivamente. a) Sensibilidade da estirpe 2979 antes do

tratamento com 0,25 mg/mL do EEP. b) Sensibilidade da estirpe

2979 após as 20 transferências em presença de uma concentração

de 0,25 mg/mL do EEP. c) Sensibilidade da estirpe 4118 antes do

tratamento com 0,5 mg/mLdo EEP. d) Sensibilidade da estirpe 4118

após as 20 transferências em presença de uma concentração de 0,5

mg/mL do EEP.

Figura 7. Fotos tridimensionais da microscopia de emissão atômica das

estirpes de Staphylococcus aureus. As estirpes de S. aureus 2979

(a e b) e 4118 (c e d) foram inoculadas (aproximadamente 107

UFC/mL) em tampão fosfato com a adição de 0,5 mg/Ml do EEP (b

e d) e incubadas a 37°C por 4 h. Após o tempo de incubação, foi

feito um esfregaço em uma lâmina de vidro e submetidas a IT-MFA.

Tratamentos controles sem a adição de EEP foram realizados (a e

c).

LISTA DE TABELAS

28

29

31

4

5

6

24

vii

Tabela 1: Produção brasileira de leite – por Unidades da Federação (milhões

de litros).

Tabela 2: Prevalência de microrganismos causadores de mastite bovina em

estudos realizados no Brasil.

Tabela 3: Principais agentes bacterianos causadores de mastites bovina

contagiosa e ambiental.

Tabela 4: Efeito da concentração do extrato etanólico de própolis no

crescimento de estirpes de Staphylococcus aureus cultivadas em

meio BHI.

RESUMO

viii

Staphylococcus aureus tem sido indicado como o principal agente

etiológico da mastite bovina, podendo comprometer a produção de leite e a

qualidade microbiológica de produtos lácteos. Devido aos desafios no controle

de infecções estafilocócicas, novas estratégias de controle têm sido propostas.

Dentre as alternativas sugeridas, destaca-se o uso da própolis. Neste estudo

foi testada atividade antibacteriana da própolis contra estirpes de S. aureus

isoladas da mastite bovina. Foram obtidos diferentes extratos etanólicos de

própolis a partir da variação do tempo (1 a 32 dias) e temperatura (25 a 75 °C)

de extração. Entretanto, não foi observada uma relação consistente entre

atividade antimicrobiana e temperatura ou tempo de extração da própolis.

EEPs em concentrações de 0,05 a 1 mg/mL resultou no decréscimo da

velocidade específica de crescimento e aumento na duração da fase lag dos

isolados testados. A fim de verificar o efeito do EEP sobre a manutenção da

viabilidade celular das estirpes de S. aureus, as estirpes 2979 e 4118 foram

inoculadas em tubos contendo tampão fosfato ou leite, com a adição de

concentrações crescentes de EEP. Os resultados obtidos indicaram que a

própolis possui efeito bactericida contra S. aureus, tanto em tampão fosfato (1

mg/mL) quanto em leite (20 mg/mL). Investigou-se o desenvolvimento e

seleção de estirpes resistentes ao EEP sendo que, após vinte transferências (±

60 gerações) na presença de doses subletais (0,25 e 0,5 mg/mL) do EEP, as

estirpes de S. aureus 2979 e 4118 não tornaram-se resistentes. Observações

por meio da microscopia de força atômica indicaram que células incubadas em

tampão fosfato por 4 h na presença de 0,5 mg/mL de EEP sofreram alterações

morfológicas, apresentando uma superfície celular irregular e perdendo o

arranjo característico quando comparado aos tratamentos controles. Estes

resultados indicam que a própolis tem potencial para ser utilizada no controle

da mastite bovina causada por S. aureus.

ix

1 INTRODUÇÃO

A mastite bovina é uma doença caracterizada pela inflamação da

glândula mamária, que resulta em uma diminuição na produção leiteira e em

mudanças na composição do leite, sendo a principal causa de perdas

econômicas para os produtores e para as indústrias de laticínios (COELHO et

al., 2007; SANTOS et al., 2008). Staphylococcus aureus destaca-se como um

dos microrganismos causadores da mastite clínica e, mais frequentemente, de

infecções subclínicas que normalmente evoluem para um estágio crônico

tornando difícil a erradicação por meio de terapias antimicrobianas

convencionais (SEARS; MCCARTHY, 2003). Além de causar a mastite, S.

aureus também é responsável pela produção de enterotoxinas

termorresistentes que podem ser encontradas no leite e em produtos lácteos

podendo causar intoxicação nos consumidores (SÁ et al., 2004).

O tratamento da mastite envolve administração de antibióticos

intramamários durante o período da lactação visando à eliminação dos

microrganismos patogênicos e a redução das conseqüências fisiopatológicas

da infecção (ERSKINE et al., 2002; ERSKINE; WAGNER; DEGRAVES, 2003).

Antibióticos também são utilizados na “terapia das vacas secas”, com o objetivo

de prevenir a ocorrência de novas infecções ao final do período de lactação

(ERSKINE; WAGNER; DEGRAVES, 2003; FARIA, 1995). Porém o uso

indiscriminado de antibióticos tem sido responsável pela seleção de patógenos

resistentes a esses antimicrobianos e pela presença de resíduos dos

antibióticos na cadeia alimentar (EKUTTAN et al., 2007; LACASSE et al.,

2008). A presença de resíduos de antibióticos no leite pode causar reações

alérgicas nos consumidores e grandes perdas econômicas para a indústria de

laticínios, devido à inibição de culturas starter (JONES; SEYMOUR, 1988).

Os problemas com a administração de antibióticos têm estimulado a

procura por novas estratégias de controle da mastite (COELHO et al., 2007;

WU; HU; CAO, 2007), tendo já sido relatado o efeito antimicrobiano da própolis

sobre os patógenos da mastite bovina (PINTO et al., 2001). A própolis é

constituída por várias substâncias resinosas, gomosas e balsâmicas de

1

consistência viscosa, recolhidas pelas abelhas de brotos e cascas de árvores

onde as abelhas modificam a sua composição, adicionando cera, secreções

salivares ou compostos resultantes da digestão do pólen (GHISALBERTI,

1979; WALKER; CRANE, 1987). Embora mais de 300 substâncias tenham sido

identificadas em amostras de própolis, a sua atividade biológica é relacionada a

poucas substâncias, como flavonóides, os ácidos caféico, cumárico, terpenos e

ferúlicos e os ésteres (BURDOCK, 1998).

Apesar da atividade antimicrobiana da própolis ser amplamente

reconhecida, o desenvolvimento ou seleção de resistência ainda é pouco

estudado (CUSHNIE et al., 2007; LU; CHEN; CHOU, 2005; MIORIN et al.,

2003). Estudos demonstraram que alguns componentes da própolis podem

causar perda de potássio intracelular e agregação das células de S. aureus

(CUSHNIE; LAMB, 2005; CUSHNIE et al., 2007). Entretanto, poucos estudos

avaliaram o efeito de extratos brutos de própolis sobre estirpes de S. aureus.

Os objetivos deste estudo foram: a) determinar o efeito da temperatura e do

tempo de extração sobre a atividade antimicrobiana da própolis; b) investigar o

efeito antimicrobiano do extrato etanólico da própolis (EEP) sobre o

crescimento e viabilidade celular de S. aureus isolados de vacas com mastite;

c) estudar a seleção ou desenvolvimento de resistência à própolis em isolados

de S. aureus e; d) avaliar o efeito da própolis sobre a morfologia das células de

S. aureus por meio de microscopia de força atômica.

2

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 MASTITE BOVINA

O Brasil é o sexto maior produtor de leite do mundo, sendo

responsável por 4% da produção mundial (CEI, 2000). No ano de 2007 o Brasil

produziu cerca de 26,1 bilhões de litros de leite, sendo que Minas Gerais

destacou-se como o maior produtor de leite no cenário nacional (Tabela 1)

(IBGE 2009). O Brasil possui um dos maiores rebanhos do mundo, porém com

média produtiva de leite de 3,8 kg/vaca/dia, abaixo da média mundial (7,8

kg/vaca/dia) e da média dos países desenvolvidos (13,8 kg/vaca/dia) (VIANA,

1999). Uma das razões apontadas para esse desempenho inferior é a mastite.

Esta doença destaca-se pela ampla distribuição nos rebanhos leiteiros,

detecção problemática e grandes perdas econômicas relacionadas à redução

na produção leiteira, às alterações na composição do leite, ao tratamento dos

animais e ao descarte do leite contaminado. Estima-se que mundialmente, os

prejuízos econômicos causados pela mastite estejam em torno de 35 bilhões

de dólares por ano (DEGRAVES; FETROW, 1993), sendo que a perda com

cada animal é de US$ 200 por ano (COSTA, 2003). Já no Brasil, estima-se que

a perda de produção esteja entre 12% e 15% (FONSECA; SANTOS, 2000), ou

aproximadamente 3,5 bilhões de litros de leite/ano. Calcula-se que os gastos

para a prevenção da doença sejam de R$ 24,55 /vaca/ano (COSTA, 2003).

A mastite caracteriza-se como uma inflamação da glândula mamária,

que pode ser causada por microrganismos e suas toxinas, traumas físicos e

agentes químicos irritantes, mas, na maioria dos casos, é resultante da invasão

do úbere por microrganismos patogênicos através do canal do teto (FONSECA;

SANTOS, 2000). A resposta inflamatória que se desenvolve no interior do

úbere tem a finalidade de destruir ou neutralizar os agentes infecciosos e suas

toxinas, e permitir que a glândula retome a sua função normal. Porém, em

muitos casos ocorre a destruição de células epiteliais responsáveis pela

síntese dos principais constituintes do leite, acarretando a redução da

capacidade produtiva do animal (FONSECA; SANTOS, 2000).

3

Tabela 1: Produção brasileira de leite – por Unidades da Federação (milhões de litros).

Estado 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 RO 409 422 476 644 559 646 692 637 708AC 37 41 86 104 100 109 80 98 80AM 36 37 38 40 42 43 44 45 19RR 10 10 9 8 8 7 6 6 6PA 311 380 459 582 585 639 697 691 643AP 3 4 3 3 3 3 4 4 6TO 153 156 166 186 201 215 220 217 214MA 143 150 155 195 230 287 321 341 336PI 73 77 78 75 74 76 79 80 76CE 325 332 328 341 353 363 368 380 416RN 129 145 143 158 174 201 212 235 214PB 96 106 106 117 126 137 149 155 170PE 266 292 360 388 376 398 527 630 662AL 215 218 244 224 241 243 236 228 243SE 122 115 113 112 139 157 191 243 252BA 672 725 739 752 795 843 890 906 966MG 5.801 5.865 5.981 6.177 6.320 6.629 6.909 7.094 7.275ES 368 378 362 375 379 406 418 434 438RJ 458 469 447 447 449 467 465 468 463SP 1.913 1.861 1.783 1.746 1.785 1.739 1.744 1.744 1.627PR 1.725 1.799 1.890 1.985 2.141 2.395 2.519 2.704 2.701SC 907 1.003 1.076 1.193 1.332 1.487 1.556 1.710 1.866RS 1.975 2.102 2.222 2.330 2.306 2.365 2.468 2.625 2.944MS 409 427 445 472 482 491 499 490 490MT 411 423 443 467 492 551 596 584 644GO 2.066 2.194 2.322 2.483 2.523 2.538 2.649 2.614 2.639DF 37 36 37 37 38 39 35 34 36

Brasil 19.070 19.767 20.510 21.643 22.254 23.475 24.572 25.398 26.134Fonte: IBGE – Pesquisa Pecuária Municipal (www.ibge.gov.br).

Embora fungos, algas e vírus possam provocar a doença, os

microrganismos predominantes são as bactérias existindo mais de 200 tipos

diferentes de microrganismos associados com a doença (TEIXEIRA; RIBEIRO;

SIMÕES, 2008). No entanto, as bactérias mais freqüentemente isoladas da

mastite bovina pertencem a um número limitado de espécies (Tabela 2), com

predominância de S. aureus (ANDRADE; DIAS FILHO; COSTA, 2007;

LANGONI et al. 1991).

4

Tabela 2: Prevalência de microrganismos causadores de mastite bovina em estudos realizados no Brasil.

Microrganismo isolado1) 2) 3)

Prevalência (%)

Staphylococcus aureus 44,00 % 19,20 % 35,53 %

Escherichia coli 4,00 % - 2,87 %

Streptococcus agalactiae 20,00 % 6,90 % 3,24 %

Staphylococcus epidermidis

- - 23,19 %

Streptococcus spp. (exceto S. agalactiae)

12,00 % 6,10 % 7,73 %

Corynebacterium spp. 6,00 % 55,20 % 13,72 %

Pseudomonas spp. - 0,10 % 2,37 %

Outros microrganismos 10,00 % 12,50 % 11,35 %

Não houve crescimento microbiano

4,00 % - -

Fonte:1) ALMEIDA; SOARES; SILVA; SILVEIRA; FIORINI; FONSECA, 2005.2) BRITO et al., 1999. 3) LANGONI et al., 1991.

As mastites de origem bacteriana podem ser classificadas em dois tipos:

mastite contagiosa e de origem ambiental (Tabela 3). Esta classificação leva

em consideração a epidemiologia dos agentes infecciosos, principalmente a

forma de transmissão entre animais e o modo de infecção (TEIXEIRA;

RIBEIRO; SIMÕES, 2008).

5

Tabela 3: Principais agentes bacterianos causadores de mastites bovina contagiosa e ambiental.

Microrganismos contagiosos Microrganismos ambientais

Staphylococcus aureus Escherichia coli

Streptococcus agalactiae Streptococcus uberis

Streptococcus dysgalactiae Pseudomonas aeruginosa

Corynebacterium bovis Citrobacter spp.

Mycoplasma spp. Enterobacter spp.

Klebsiella spp.

Bacillus cereus

Bacillus licheniformis

Pasteurella spp.

Streptococcus faecalis

Streptococcus spp. (exceto S. agalactiae)

Fonte: TEIXEIRA et al, 2008

A mastite contagiosa pode se manifestar na forma subclínica, clínica,

aguda ou crônica (BRAMLEY et al. 1996; TEIXEIRA; RIBEIRO; SIMÕES,

2008). A mastite clínica apresenta sinais evidentes, tais como: aumento de

temperatura e endurecimento do teto infectado, dor na glândula mamária,

grumos ou qualquer alteração nas características do leite (FONSECA;

SANTOS, 2000). Já na forma subclínica não ocorrem mudanças visíveis na

aparência do leite ou do úbere, sendo a identificação realizada através de

exames microbiológicos ou testes auxiliares como a contagem de células

somáticas ou realização do teste “California Mastitis Test” (TEIXEIRA;

RIBEIRO; SIMÕES, 2008). Na mastite aguda os sinais clínicos surgem

repentinamente, provocando recusa de alimento pelo animal, dor, dificuldade

6

de locomoção e desidratação. Além disso, podem surgir abscessos no úbere e

em último caso, óbito do animal. A mastite crônica normalmente é originada a

partir de infecções causadas por Staphylococcus aureus que persistem por um

longo período de tempo, mas normalmente sem grande intensidade. Na mastite

crônica o único sintoma visível no leite é que este se apresenta viscoso e de

cor alterada. O úbere pode apresentar-se duro à palpação, devido à formação

de tecido necrótico e cicatricial aglomerado (TEIXEIRA; RIBEIRO; SIMÕES,

2008). Entre os quatros tipos de mastite, a subclínica destaca-se como a que

possui um maior impacto na produtividade dos rebanhos leiteiros devido à sua

maior prevalência. Assim, as medidas para o controle da mastite subclínica

têm recebido grande atenção (PHILPOT; NICKERSON, 1991).

Os programas de controle da mastite envolvem medidas que visam,

principalmente, prevenir a ocorrência de infecções. Estes programas baseiam-

se em educar os ordenhadores e vaqueiros, identificar e corrigir as práticas de

manejo, higienizar os tetos antes da ordenha e realizar a desinfecção pós-

ordenha com solução iodada (pré e pós “dipping”). Além disso, a manutenção e

higienização das ordenhadeiras com sanitizantes, a realização de exames

clínicos, microbiológicos, e tratamentos profiláticos também são amplamente

utilizados no controle da doença (OLIVEIRA; CARNEIRO; SILVA, 2006).

Apesar dos cuidados que vêem sendo adotados na prevenção da

doença, a ocorrência de infecções nos rebanhos brasileiros ainda é

considerada elevada (BRITO et. al., 1998). Normalmente, os animais são

tratados com antibióticos, tanto no período de lactação como no período seco

(ERSIKE et al., 2002; ERSIKE; WAGNER; DEGRAVES, 2003; FARIA, 1995).

Alguns estudos demonstram que os antibióticos são eficazes no tratamento da

mastite (ANDRADE et al., 2000). Entretanto, Reis, Silva e Brescia (2003)

demonstraram que a antibioticoterapia durante a lactação não é efetiva para o

controle das mastites subclínicas. Zafalon et al. (2007) demonstram que o uso

de antibióticos é economicamente inviável no tratamento da mastite subclínica

bovina causada por S. aureus, durante a lactação. Além disso, o uso

indiscriminado de antibióticos tem selecionado patógenos resistentes e

7

resultado na presença de resíduos dos antibióticos na cadeia alimentar

(EKUTTAN et al., 2007; LACASSE et al., 2008).

A presença de resíduos de antibióticos no leite pode ser um problema

para a saúde pública, podendo causar reações alérgicas, discrasias

sanguíneas e distúrbios da microbiota intestinal nos consumidores (JONES;

SEYMOUR, 1988; ERSKINE; WAGNER; DEGRAVES, 2003). Além disto, pode

causar grandes perdas econômicas para as indústrias de laticínios devido à

inibição de culturas starter utilizadas nos processos de fabricação de lácteos

(JONES; SEYMOUR, 1988). Diante disso, tem sido sugerido o uso de novos

métodos para o controle desta doença (COELHO et al., 2007; WU; HU; CAO,

2007).

2.2 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus são cocos de aproximadamente 1 µm de

diâmetro, gram-positivos, coagulase positivos, β-hemolíticos, maltose e manitol

positivos, catalase positivos, anaeróbios facultativos, formadores de colônias

pigmentadas, não formadores de esporos e que fermentam a glicose

produzindo ácido láctico como principal produto final (JAY, 1994; LOWY, 1998;

TODAR, 2008). S. aureus cresce em temperaturas variando de 7 a 47,8°C,

tolera altas concentrações (p. ex. 15%) de NaCl, e apresenta temperatura e pH

ótimos de crescimento de 37°C e 7,0, respectivamente (JAY, 1994; TODAR,

2008).

S. aureus faz parte da microbiota da pele, mucosas e nasofaringe de

várias espécies animais, incluindo o homem, mas também está associado a

enfermidades. Staphylococcus aureus é o agente mais comum em infecções

piogênicas (formação de pus) (GARCÍA-LARA; MASALHA; FOSTER, 2005).

Estas infecções podem se localizar na pele ou em regiões mais profundas que

vão desde uma simples infecção (impetigo e foliculite) até infecções graves

(pneumonia, osteomielite, endocardite, síndrome do choque tóxico, septicemia,

e mastite) (SANTOS et al., 2007; TEIXEIRA; RIBEIRO; SIMÕES, 2008,

TODAR, 2008).

8

Nas infecções intramamárias, S. aureus é encontrado colonizando o

canal do teto, o interior da glândula mamária ou a pele do teto, especialmente

quando esta se encontra lesada. Uma característica importante de S. aureus é

a sua capacidade de invasão, que permite que este se instale em partes

profundas da glândula mamária. Além disso, geralmente há formação de tecido

fibroso no foco da infecção, impedindo o acesso de antimicrobianos ao sítio da

infecção. Isso confere uma das principais características do agente que são

infecções de longa duração, com tendência a se tornarem crônicas e com baixa

taxa de cura, mesmo com o uso de antibióticos (FONSECA; SANTOS, 2000).

As infecções causadas por S. aureus apresentam implicações

importantes em saúde pública, tendo em vista que este microrganismo produz

toxinas que são resistentes ao calor, podendo estar presentes nos produtos

lácteos. Essas toxinas são chamadas enterotoxinas, conhecendo-se,

atualmente, seis tipos imunologicamente distintos (SE-A, B, C, D, E e G). As

enterotoxinas induzem os sintomas clássicos de vômitos, diarréia e dores

abdominais (TODAR, 2008). Devido à produção destas toxinas em alimentos,

este microrganismo é considerado a maior causa de intoxicação alimentar no

mundo (SENA, 2000). S. aureus também causa a síndrome do choque tóxico

liberando a toxina TSST-1 (toxic shock syndrome toxin-1) que, ao atingir a

corrente sanguínea, atua como superantígeno estimulando a ativação

inespecífica de vários clones de linfócitos T. Essa resposta imunológica resulta

na liberação de grandes quantidades de interleucinas, com conseqüente

surgimento dos sintomas da doença (aumento da temperatura corpórea,

insuficiência renal, diarréia, entre outros) (CARDOSO; CARMO; SILVA, 2000;

LOWY, 1998).

O grande desafio no controle de infecções causadas por S. aureus se

deve à expressão de vários fatores de virulência relacionados com a aderência,

evasão de defesas, e a invasão e penetração das células do hospedeiro. Estes

fatores possuem diferentes funções e características: (a) proteínas de

superfície que promovem a aderência no tecido do hospedeiro (adesinas); (b)

invasinas que atuam como fatores de propagação da bactéria nos tecidos

(hialuronidase e leucocidinas); (c) fatores de superfície que inibem a fagocitose

9

pelas células do sistema imune (cápsula e proteína A); (d) propriedades

bioquímicas que auxiliam a sobrevivência da bactéria dentro das células

fagocitárias (produção da catalase); (e) escapes imunológicos (proteína A,

coagulase); (f) toxinas que rompem as membranas das células eucarióticas

(leucotoxina, hemolisina e leucocidina); (g) exotoxinas que danificam os tecidos

do hospedeiro ou provocam os sintomas da doença (SEA-G, TSST-1) e (h)

aquisição de resistência aos agentes antimicrobianos (beta-lactamases)

(SANTOS et al., 2007; TODAR, 2008).

O tratamento das infecções causadas por S. aureus envolve a

administração de antimicrobianos (tais como penicilinas, cesfalosporinas,

vancomicina, aminoglicosídios, tetraciclina e clorafenicol). Entretanto, esse

microrganismo torna-se facilmente resistente a várias drogas, principalmente

aos antibióticos β-lactâmicos (LANGONI et al., 1991). Com a descoberta da

penicilina por Alexander Fleming, em 1928, este antibiótico passou a ser

utilizado no tratamento de pacientes infectados por S. aureus. Porém, esse

patógeno rapidamente desenvolveu resistência a esse beta-lactâmico. O

mesmo ocorreu com a meticilina, (primeira penicilina semi-sintética lançada

para aplicação clínica em 1960), resultando na seleção de Staphylococcus

aureus meticilina-resistentes (MRSA) e com o glicopeptídeo vancomicina

(descoberto em 1956), contra o qual já existem estirpes de S. aureus

vancomicina-resistentes (VRSA) (SANTOS et al., 2007). Esse desenvolvimento

de resistência aos antimicrobianos pode ocorrer devido a mutações ou pela

aquisição de genes de resistência de outras bactérias através de plasmídios ou

transposons (BERNARD et al., 2004; TENOVER; MCDONALD, 2005). Esses

dados ratificam a necessidade da busca por métodos mais seguros e eficazes

para o controle do crescimento de S. aureus multirresistentes (TAVARES,

2002).

Na busca por métodos mais seguros e saudáveis para o controle do

crescimento de S. aureus, tem crescido o interesse pelo uso de substâncias

alternativas com atividade antimicrobiana (RUSSELL; MANTOVANI, 2002).

Vários produtos “naturais” são utilizados há décadas como agentes medicinais

e muitos compostos serviram como modelo para a indústria farmacêutica

produzir análogos biologicamente ativos, algumas vezes mais eficientes e com

10

menor toxicidade (MYLES, 2003). Diversos grupos de pesquisa vêm

demonstrando o efeito anti S. aureus da própolis (FERNANDES JUNIOR;

BALESTRIN; CUNHA, 2003; MIORIN et al., 2003). Sendo assim, a própolis

destaca-se por ser um exemplo de composto sugerido como alternativa para o

uso de antibióticos (PINTO et al., 2001; PINTO, 2008).

2.3 PRÓPOLIS

A própolis é uma substância utilizada pelas abelhas no reparo de frestas

ou de danos à colméia, sendo assim, empregada como uma proteção contra os

inimigos naturais (insetos, fungos e bactérias). Além disso, é utilizada para

embalsamar pequenos animais mortos, evitando assim a putrefação. A própolis

também é utilizada como material de construção no interior da colméia, colando

favos, quadros e no preparo de ambientes assépticos para a postura da abelha

rainha (MARCUCCI, 1996).

A própolis é constituída por substâncias resinosas, gomosas e

balsâmicas, coletadas pelas abelhas dos ramos, flores, pólen, brotos e cascas

de árvores (WALKER; CRANE, 1987). Na colméia, as abelhas adicionam cera,

pólen e produtos do seu metabolismo, como a enzima salivar β-glicosidase,

modificando assim sua composição e aumentando a sua ação farmacológica

(FRANCO et al., 2000; PARK et al., 2002; PINTO et al., 2001; STRADIOTTI

JÚNIOR et al., 2004). Suas características físicas e sensoriais (cor, sabor,

odor, consistência, composição química e sua atividade biológica) variam de

acordo com a origem botânica, a localização geográfica, as condições

climáticas e as estações do ano em que são coletadas (CASTRO; CURY;

ROSALEN, 2007; GHISALBERTI, 1979; MARCUCCI, 1995).

A própolis bruta coletada em uma colméia apresenta em sua

composição cerca de 50 - 60% de resinas e bálsamos, 30 - 40% de ceras, 5 -

10% de óleos essenciais, 5% de grão de pólen, 5% de detritos de madeira e

terra, além de microelementos como alumínio, cálcio, estrôncio, ferro, cobre,

manganês e pequenas quantidades de vitaminas B1, B2, B6, C e E

11

(BURDOCK, 1998; FUNARI; FERRO, 2006; MONTI et al., 1983; WOISKY;

SALATINO, 1998). A própolis apresenta uma composição química complexa,

sendo que mais de 300 constituintes já foram identificados em amostras de

própolis (BANKOVA; CASTRO; MARCUCCI, 2000; BURDOCK, 1998). Entre as

substâncias já identificadas, destacam-se os flavonóides, ácidos aromáticos e

ésteres, aldeídos e cetonas, terpenóides e fenilpropanóides, esteróides,

aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e vários outros

compostos em pequenas quantidades (BANKOVA et al., 1995; BONVEHÍ;

COLL; JORDÀ, 1994; MARCUCCI, 1995; WALKER; CRANE, 1987). Entre

essas classes de substâncias, preponderam os compostos fenólicos e os

flavonóides como os principais responsáveis pelas diversas atividades

biológicas da própolis. Entretanto, essas atividades também podem decorrer do

sinergismo entre seus diversos compostos químicos (KROL et al., 1993)

A própolis vem sendo amplamente estudada tendo sido demonstrado

seu grande potencial terapêutico. A própolis apresenta atividades

antimicrobiana (PARK et al. 1998), antiinflamatória (OZTÜRK et al. 2000),

antineoplásica (WENG; HO; LIN, 2005), antioxidante (MARQUELE et al., 2005),

antiviral (MARCUCCI, 1995), hepatoprotetora (LIN et al., 1999;), analgésica

(PAULINO et al., 2003), estrogênica (SONG et al., 2002a), antiangiogênica

(SONG et al., 2002b) e regenerativa de cartilagem e ossos (CARDILE et al.,

2003). O efeito antibacteriano da própolis têm sido uma de suas propriedades

mais extensivamente estudadas (KUJUMGIEV et al., 1999). Vargas et al.

(2004) analisando o efeito in vitro do extrato etanólico de própolis sobre o

crescimento bacteriano, constatou que as bactérias gram-positivas são muito

mais sensíveis à ação antimicrobiana da própolis do que bactérias gram-

negativas.

Vários pesquisadores têm demonstrado o efeito antibacteriano da

própolis sobre culturas puras de S. aureus (LU; CHEN; CHOU, 2005)

Staphylococcus sp. coagulase negativos e Streptococcus agalactiae (PINTO et

al., 2001) Streptococcus sp., Nocardia asteroides e Rhodococcus equi

(VARGAS et al. 2004), dentre outros. Entretanto, ainda não se conhece com

12

exatidão o mecanismo de ação da própolis na célula bacteriana (MIRZOEVA;

GRISHANIN; CALDER, 1997).

Estudos visando elucidar o mecanismo de ação da própolis

demonstraram que algumas substâncias bioativas presentes em amostras de

própolis inibem o crescimento microbiano. Mirzoeva, Grishanin e Calder (1997)

sugeriram que os flavonoides e o ácido cinâmico possuam efeitos similares aos

observados para os ionóforos, por alterarem a permeabilidade da membrana

citoplasmática, alterando o fluxo de íons e a geração de energia. Além do efeito

sobre a membrana, alguns compostos também agem como inibidores

enzimáticos (OHEMENG et al., 1993; KUPPUSAMY; DAS, 1992). Devido a

esses diferentes mecanismos de ação, é sugerido que a própolis bruta também

aja de várias formas sobre as bactérias, o que tornaria a própolis uma

substância com grande potencial para combater as infecções de mastite

causadas por bactérias que normalmente são resistentes aos antimicrobianos

clássicos.

13

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos de própolis

sobre o crescimento, viabilidade e integridade celular de S. aureus isoladas de

vacas com mastite.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Determinar o efeito do tempo de extração e temperatura sobre a

atividade antimicrobiana de extratos etanólicos de própolis (EEP).

b) Avaliar o efeito do EEP sobre o crescimento e viabilidade celular de

estirpes de Staphylococcus aureus.

c) Estudar a seleção ou desenvolvimento de estirpes de S. aureus

resistentes ao EEP.

d) Avaliar as alterações na morfologia e arranjo celular de culturas de S.

aureus tratados com EEP por meio de microscopia de força atômica.

14

4 MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia de

Anaeróbios, do Departamento de Microbiologia, da Universidade Federal de

Viçosa.

4.1 MICRORGANISMOS E CONDIÇÕES DE CULTIVO

Neste estudo foram utilizadas três estirpes bacterianas: S. aureus 2979,

S. aureus 4118 e S. aureus ATCC (American Type Culture Collection) 29213

(estirpe referência). As duas primeiras estirpes foram isoladas e caracterizadas

de acordo com os processos descritos por Brito e Brito (1999) e autenticadas e

cedidas pela EMBRAPA Gado de leite (Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil).

Elas foram escolhidas de acordo com a sensibilidade à própolis previamente

determinada por Pinto (2008): a estirpe 2979 é completamente inibida com uma

concentração de 18,75 mg/mL da própolis e as estirpes 4118 e a ATCC 29213

são completamente inibidas com uma concentração de 37.5 mg/mL. As

estirpes foram cultivadas em meio BHI (Brain Heart Infusion - Difco, Detroit, MI)

a 37ºC.

Para avaliação do grau de pureza das estirpes, elas foram submetidas à

coloração de gram e a análises microscópicas. Foram feitos estoques das

estirpes puras em meio BHI com 20% de glicerol, que foram mantidos a -20 °C.

No início de cada experimento, cada cultura foi reativada em meio BHI por 12 h

a 37 °C.

4.2 OBTENÇÃO DA AMOSTRA DE PRÓPOLIS

15

A amostra de própolis a ser estudada foi colhida em colméias de

abelhas africanizadas, Apis mellifera, de propriedade rural localizada na Zona

da Mata no Estado de Minas Gerais, por intermédio e supervisão do

Departamento de Biologia Animal da UFV. A composição dessa amostra de

própolis foi demonstrada por Pinto (2008). As amostras de própolis foram

mantidas congeladas a -20 °C.

4.3 EFEITO DO TEMPO E TEMPERATURA DE EXTRAÇÃO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE PRÓPOLIS

Para a obtenção do extrato etanólico da própolis (EEP), a mesma foi

triturada em liquidificador, pesada e dissolvida em etanol 70%, resultando em

uma concentração final de 300 mg/mL (p/v). As amostras foram

acondicionadas em frascos de vidro selados com rolhas de borracha e lacre de

alumínio. Estes frascos foram incubados em diferentes temperaturas (25, 45,

60 e 75 °C) durante 1, 2, 5, 8, 14, 22 e 32 dias. Após o término do período de

incubação um frasco de cada temperatura foi retirado, os extratos foram

filtrados e transferidos para outros frascos e armazenados à temperatura

ambiente para análises posteriores. Para verificar se os extratos estavam livres

de contaminantes, 200 µL de cada extrato foram inoculados em placas de petri

contendo meio BHI sólido (ágar 1,5 %). As placas foram incubadas a 37 °C e

após 24 h foi verificado o crescimento ou não de microrganismos.

A atividade dos diferentes extratos etanólicos foi testada pelo método de

disco-difusão em ágar, utilizando o isolado S. aureus 2979 como

microrganismo indicador. Os extratos foram diluídos sucessivamente em etanol

70% (incrementos de duas vezes) e posteriormente 10 µL de cada diluição

foram adicionados em discos de papel filtro estéreis (Whatman número 1), com

5 mm de diâmetro. Os discos foram incubados a 60 °C por 20 minutos para a

evaporação do solvente. Este procedimento foi repetido por mais uma vez e os

discos foram incubados na mesma temperatura por 2 h.

Para o teste de atividade, o isolado S. aureus 2979 foi crescido em meio

Müeller-Hinton sólido (ágar 1,5%) e uma suspensão de células foi preparada

16

em 5 mL de solução salina 1%, de modo a se obter uma turvação comparável

ao padrão 0,5 da escala de McFarland (1,5 X 108 UFC/mL). Essa suspensão

celular foi diluída para 1,5 X 107 UFC/mL e alíquotas de 100 µL foram

transferidas para placas de petri contendo meio Müeller-Hinton sólido. As

células foram espalhadas na superfície do meio e os discos contendo as

diluições dos extratos foram adicionados às placas. As placas foram incubadas

a 4°C por 12 h para a difusão da própolis e posteriormente a 37°C por 24 h

para o crescimento do microrganismo indicador. Após o crescimento do isolado

S. aureus 2979, zonas claras formadas ao redor dos discos foram examinadas.

As concentrações inibitórias (mg/mL) de cada extrato corresponderam à

concentração da maior diluição que inibiu o crescimento do microrganismo

indicador (formação de um halo de inibição ≥ 9 mm). Em cada placa foi

realizado um controle, onde foi adicionado um disco que foi impregnado com

20 µL de etanol 70%.

4.4 EFEITO DO EEP SOBRE O CRESCIMENTO DE S. aureus

Para verificar o efeito do EEP no crescimento de S. aureus, culturas

ativas dos isolados 2979, 4118 e ATCC 29213 foram inoculadas (100 µL/

aproximadamente 106 UFC/mL) em meio BHI contendo concentrações

crescentes do EEP (0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 e 1 mg/mL). Os tubos foram

colocados em banho maria a 37 °C e o crescimento bacteriano foi monitorado

pela leitura da densidade óptica (DO) a 600 nm (Spectronic 20D+, Thermal

Electron, Madison, WI, USA). A velocidade específica de crescimento, a

duração da fase lag o tempo de geração e o valor da DO máxima atingida a

600 nm foram determinadas.

4.5 ATIVIDADE DO EEP SOBRE A MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE S. aureus EM TAMPÃO FOSFATO

Para testar o efeito de diferentes concentrações do EEP sobre a

manutenção da viabilidade celular dos isolados de S. aureus, células em fase

estacionária foram centrifugadas (2096 X g/ 15 min/ temperatura ambiente)

17

(Labor Muszeripari Muvek, Hungary), lavadas duas vezes com tampão fosfato

de sódio (5 mM, pH 6.5) e ressuspendidas em solução salina 1%, de modo a

se obter uma turvação comparável ao padrão 3 da escala de McFarland (9 x

108 UFC/mL). Em seguida alíquotas de 1 mL da solução de células

padronizadas foram transferidas para tubos de ensaio contendo tampão fosfato

(5 mM, pH 6.5), acrescidos de diferentes concentrações de EEP (0; 0,1; 0,25;

0,5; 0,75; 1; 1,5 e 10 mg/mL) (volume final 10 mL). Os tubos foram incubados a

37 °C por 6 h. Após o período de incubação, alíquotas de 20 µL foram retiradas

e diluídas sucessivamente (incrementos de 10 vezes) em microplacas

contendo em cada poço 180 µL de meio BHI. As microplacas foram incubadas

a 37 °C e o número de células viáveis de S. aureus foi determinado após 24 h

de incubação.

Para verificar o efeito do EEP sobre a viabilidade de S. aureus ao longo

do tempo de incubação, aproximadamente 107 UFC/mL isolados foram

inoculados em tampão fosfato de sódio (5 mM, pH 6.5) contendo 1 mg/mL do

EEP. Os tubos foram incubados a 37 °C e nos intervalos de 0; 1; 1,5; 2,5; 3;

5,5; 6; 7; 8; 12 e 24 h de incubação foram retiradas amostras de 20 µL e os

números de células viáveis foram determinados como descrito acima. Um

tratamento controle sem adição de EEP também foi realizado.

Para determinar o crescimento nas diluições 10-1, das concentrações de

1,5 e 10 mg/mL de EEP foi necessário fazer um enriquecimento, pois essas

concentrações de própolis foram suficientes para turvar o meio nestas diluições

e interferir nas leituras visuais dos poços. Esse procedimento foi realizado pela

transferência de todo o volume presente em um poço para uma placa de petri

contendo 15 mL de meio BHI (ágar 1,5%). Essa placa foi incubada a 37 °C por

24 h e, posteriormente foi verificado se houve ou não o crescimento de S.

aureus.

4.6 ATIVIDADE DO EEP SOBRE A MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE S. aureus EM LEITE

18

Para verificar o efeito de diferentes concentrações do EEP sobre a

viabilidade celular dos S. aureus em leite, alíquotas de 1 mL da solução

padronizada de células (item 4.5) foram transferidas para tubos contendo leite

UHT integral (ultra-high-temperature) estéril, acrescido de diferentes

concentrações de EEP (0; 0,1; 0,5; 1; 2,5; 5; 10 e 20 mg/mL) (volume final 10

mL). Os tubos foram incubados a 37 °C por 6 h. O número de células viáveis foi

determinado como descrito anteriormente.

Para verificar o efeito do EEP sobre a manutenção da viabilidade de S.

aureus ao longo do tempo de incubação em leite UHT integral, alíquotas de 1

mL da solução de células padronizadas foram transferidas para tubos de

ensaio contendo leite UHT integral estéril mais EEP na concentração de 20

mg/mL (volume final 10 mL). Os tubos foram incubados a 37 °C e em intervalos

de tempo de 0; 1; 2; 4; 8; 12 e 24 h de incubação amostras de 20 µL foram

retiradas e o número de células viáveis foi determinado como descrito no item

anterior.

Para determinar se houve crescimento nas diluições 10-1 e 10-2, de todas

as concentrações de EEP, foi necessário enriquecer essas diluições, pois o

leite presente na amostra turvou o meio nestas diluições, interferindo assim na

leitura visual dos poços. Esse procedimento foi realizado pela transferência de

todo o volume presente em um poço para uma placa de Petri contendo 15 mL

de meio BHI (ágar 1,5%). Essa placa foi incubada a 37 °C por 24 h e,

posteriormente foi verificado se houve ou não o crescimento de S. aureus.

4.7 SELEÇÃO OU DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA À PRÓPOLIS POR S. aureus

Para verificar o desenvolvimento de resistência à própolis pelos isolados

S. aureus 2979 e 4118, os mesmos foram transferidos por 20 vezes

(aproximadamente 60 gerações) em meio BHI acrescido de concentrações

subletais do EEP. A concentração subletal para os isolados S. aureus 2979 e

4118 foi de 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL, respectivamente. As transferências foram

realizadas em intervalos de tempo de 12 h de incubação a 37 °C.

19

O desenvolvimento de resistência ao EEP foi avaliado pela

determinação da sensibilidade dos isolados antes e após as transferências na

presença das doses subletais. A determinação da sensibilidade foi realizada

pelo método de difusão em ágar, onde 200 µL da suspensão padronizada de

células (0,5 da escala de McFarland) foram inoculadas em 20 mL de meio BHI

(ágar 1,5 %) fundido e posteriormente vertido em placas de petri. Após a

solidificação do meio, orifícios de 5 mm de diâmetro foram feitos.

O EEP foi diluído sucessivamente em etanol 70 % (incrementos de duas

vezes) e 30 µL de cada diluição foram adicionados aos orifícios. As placas

foram incubadas a 4 °C para difusão do EEP e posteriormente a 37 °C por 24

h. Após a incubação as placas foram analisadas quanto à presença de zonas

claras ao redor dos orifícios. As concentrações inibitórias (mg/mL) do extrato

para as estirpes foram determinadas como a concentração da maior diluição

que inibiu o crescimento da estirpe (formação de um halo de inibição ≥ 9 mm).

Em cada placa foi realizado um controle, onde foram adicionados 30 µL de

etanol 70%.

4.8 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EEP SOBRE A MORFOLOGIA DE S. aureus POR MEIO DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (MFA)

Para verificar o efeito do EEP na superfície celular dos isolados de S.

aureus, células em fase estacionária foram centrifugadas (2096 X g /15

minutos/temperatura ambiente) e lavadas três vezes com tampão fosfato de

sódio (5 mM, pH 6.5) e ressuspensas em solução salina 1%, de modo a obter

uma turvação comparável ao padrão 0,5 da escala de McFarland. Uma alíquota

de 1 mL da suspensão de células foi transferida para um tubo de ensaio

contendo tampão fosfato de sódio acrescido de EEP na concentração de 0,5

mg/mL. Tratamentos controles sem adição de EEP também foram realizados.

Os tubos foram incubados a 37º C por 4 h. Após incubação, alíquotas de

1 mL foram retiradas e as células centrifugadas por 15 minutos em temperatura

ambiente e a 6149 x g (Ependorf, 5415 C, Hamburg, Germany). O

sobrenadante foi descartado e uma fina camada de células foi espalhada em

uma lâmina de vidro com área total de 1 cm2. As medidas topográficas das

20

células bacterianas foram realizadas em microscópio de força atômica NT-MDT

(Ntegra Prima, Moscow, Rússia) utilizando o modo intermitente, no qual a

ponta da agulha do microscópio fica em contato intermitente com a superfície

da amostra a ser analisada, o que aumenta o poder de resolução da técnica e

revela imagens detalhadas da superfície celular. As medições foram realizadas

no Laboratório de Nanoscopia do Departamento de Física, da Universidade

Federal de Viçosa.

4.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Todos os experimentos foram realizados duas vezes e em duplicata. Os

valores dos desvios padrões foram calculados e estão representados pelas

barras de erros nas figuras, ou pelo sinal de mais ou menos nas tabelas.

21

5 RESULTADOS

5.1 EFEITO DA TEMPERATURA E DO TEMPO DE EXTRAÇÃO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE PRÓPOLIS

A menor concentração de própolis necessária para inibir o crescimento

de S. aureus 2979 foi 75 mg/mL (Figura 1). Todos os extratos obtidos após 2

dias de incubação demonstraram a mesma concentração inibitória. O efeito da

temperatura de extração sobre a atividade antimicrobiana dos extratos de

própolis variou de acordo com o tempo de incubação. Entretanto, não foi

observada uma relação consistente entre atividade e temperatura ou tempo de

extração da própolis (Figura 1). Em razão da praticidade e comparação com

resultados reportados na literatura, optou-se por utilizar neste estudo extratos

etanólicos de própolis obtidos após extração a 45 °C por 48 h.

5.2 EFEITO DO EEP SOBRE A CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE S. aureus

As estirpes de S. aureus 2979, 4118 e ATCC 29213 cultivadas em caldo

BHI a 37°C apresentaram velocidades específicas de crescimento de 1,64;

1,61 e 1,48 h-1, respectivamente. Após 24 h de incubação, todas as estirpes

atingiram uma densidade óptica de aproximadamente 2,0 (Tabela 4). A adição

de concentrações crescentes de EEP (0.050 a 0.5 mg/mL) ao caldo BHI

reduziu a velocidade específica de crescimento (Tabela 4). Esta adição de EEP

também resultou no aumento do tempo de geração e na duração da fase lag

(Tabela 4). Esses efeitos foram mais significativos a partir da adição de 0,25

mg/mL de EEP para todas as estirpes. Comparando as três estirpes utilizadas

neste experimento, a estirpe 4118 foi a menos sensível ao efeito da própolis

em seu crescimento (Tabela 4). Quando concentrações de 1 mg/mL foram

22

adicionadas ao meio BHI, o crescimento bacteriano foi completamente inibido

por pelo menos 48 h de incubação (Tabela 4).

23

Figura 1. Efeito antibacteriano dos diferentes extratos etanólicos de

própolis contra Staphylococcus aureus 2979. As extrações foram

realizadas a 25 °C (a), 45 °C (b), 60 °C (c) e 75 °C com uma

duração de 1; 2; 5; 8; 14; 22 e 25 dias.

Tabela 4. Efeito da concentração do extrato etanólico de própolis no crescimento de estirpes de Staphylococcus aureus cultivadas em meio BHI.

24

Estirpes de

S.aureus

Concentração do EEP (mg/mL)

Velocidade especifica

de crescimento

(h-1)

Tempo de geração

(h)

Duração da fase Lag

(h)

Densidade óptica máxima

(600nm)

2979

0 1,64 ± 0,13 0,42 ± 0,03 0,63 ± 0,25 2,13 ± 0,13

0,05 1,35 ± 0,18 0,51 ± 0,07 1,22 ± 0,19 2,49 ± 0,03

0,1 1,21 ± 0,20 0,57 ± 0,1 1,59 ± 0,19 2,44 ± 0,04

0,25 0,51 ± 0,07 1,36 ± 0,19 3,65 ± 0,47 2,24 ± 0,08

0,5 0,36 ± 0,08 1,91 ± 0,4 5,20 ± 0 1,70 ± 0,09

1 - - - -

4118

0 1,61 ± 0,05 0,43 ± 0,01 0,98 ± 0,01 2,24 ± 0,09

0,05 1,46 ± 0,03 0,47 ± 0,01 1,09 ± 0,12 2,33 ± 0,03

0,1 1,41 ± 0,01 0,49 ± 0,01 1,31 ± 0,17 2,41 ± 0,01

0,25 0,98 ± 0,01 0,70 ± 0,01 2,05 ± 0,07 2,16 ± 0,11

0,5 0,68 ± 0,01 1,01 ± 0,02 2,22 ± 0,02 1,86 ± 0,11

1 - - - -

ATCC

29213

0 1,48 ± 0,21 0,47 ± 0,07 1,08 ± 0,25 2,09 ± 0,09

0,05 1,24 ± 0,21 0,56 ± 0,1 1,37 ± 0,25 2,02 ± 0,1

0,1 0,97 ± 0,13 0,71 ± 0,09 1,63 ± 0,20 2,09 ± 0,06

0,25 0,43 ± 0,09 1,62 ± 0,32 2,53 ± 0,47 1,62 ± 0,07

0,5 0,21 ± 0,01 3,27 ± 0,24 6,13 ± 0,06 1,21 ± 0,16

1 - - - -

5.3 EFEITO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE S. aureus INCUBADO EM TAMPÃO FOSFATO

As concentrações de 0,1; 0,25 e 0,5 mg/mL do extrato etanólico de

própolis reduziram o número de células viáveis das estirpes de S. aureus em

25

pelo menos 22, 99 e 99,999 %, respectivamente (Figura 2). Essa redução foi

mais significativa a partir da adição de 0,25 mg/mL dos EEPs. Quando

concentrações de EEP maiores ou iguais a 0,75 mg/mL foram utilizadas,

observou-se ausência de células viáveis nas suspensões de células incubadas

(Figura 2). Os tratamentos sem a adição do EEP (controles) mantiveram o

número de células viáveis em aproximadamente 107 UFC/mL, mesmo após 6 h

de incubação em tampão fosfato (Figura 2).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0,1 0,25 0,5 0,75 1 1,5 10

Concentração de EEP (mg/mL)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s vi

ávei

s (L

og

UF

C/m

L)

Figura 2. Efeito de diferentes concentrações do EEP sobre a viabilidade

celular de Staphylococcus aureus 2979 (colunas pretas) e 4118

(colunas brancas) em tampão fosfato após 6 h a 37 °C. EEP foi

adicionado nas concentrações de 0 a 10 mg/mL em tampão fosfato

e aproximadamente 107 UFC/mL das estirpes de S. aureus foram

inoculadas nos tubos. Após 6 h de incubação a 37 °C, amostras

foram retiradas e o número de células viáveis foi determinado.

Quando suspensões de células de S.aureus 2979 e 4118 foram tratadas

com EEP na concentração de 1 mg/mL houve a inativação de pelo menos 99%

das células após 12 h de incubação (Figura 3). Após 24 h de incubação,

verificou-se perda total de viabilidade tanto para a estirpe 2979 quanto para a

26

4118. O tempo necessário para eliminar a estirpe 4118 (> 12 h) foi cerca de

duas vezes maior do que o tempo necessário para eliminar a estirpe 2979 (6

h). Os tratamentos controles mantiveram o mesmo número de células viáveis

por pelo menos 24 h de incubação (aproximadamente 107 UFC/mL).

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tempo de incubação (h)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s vi

ávei

s (L

og

UF

C/m

L)

Figura 3. Efeito do EEP sobre a manutenção da viabilidade celular de

Staphylococcus aureus 2979 (● e ○) e 4118 (■ e □) em tampão

fosfato ao longo do tempo de incubação. EEP na concentração de

1 mg/mL foi adicionado ao tampão fosfato (■ e ●) contendo um

inóculo de aproximadamente 107 UFC/mL das estirpes de

Staphylococcus aureus. Os tubos foram incubados a 37 °C e nos

intervalos de tempos entre 0 a 24 h de incubação, retiraram-se

amostras e o número de células viáveis foi determinado. Os

tratamentos controles também são demonstrados (□ e ○).

5.4 EFEITO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS SOBRE A MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE S. aureus EM LEITE

27

Quando aproximadamente 107 UFC/mL das estirpes de S. aureus foram

inoculadas em leite com concentrações de EEP variando de 0,1 a 5 mg/mL, o

número de células viáveis de S. aureus reduziu em pelo menos 67 % após 6 h

de incubação (Figura 4). Com a adição de 10 mg/mL de EEP ao leite foi

observada uma redução no número de células viáveis para as estirpes 2979 e

4118 de pelo menos 90 %. Em 20 mg/mL de EEP as estirpes 2979 e 4118

apresentaram reduções no número de células viáveis de aproximadamente 100

%. Não foi observado redução na viabilidade celular nos tratamentos controles.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0,1 0,5 1 2,5 5 10 20


Nú

mer

o d

e cé

lula

s vi

ávei

s (L

og

UF

C/m

L)

Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de EEP sobre a viabilidade

celular de Staphylococcus aureus 2979 (colunas pretas) e 4118

(colunas brancas) em leite após 6 h de incubação a 37 °C. EEP foi

adicionado de 0 a 20 mg/mL no leite e aproximadamente 107

UFC/mL das estirpes de S. aureus foram inoculadas nos tubos.

Após 6 h de incubação amostras foram retiradas e o número de

células viáveis foi determinado.

A adição de 20 mg/mL de EEP aos tubos contendo 107 UFC/mL das

estirpes de S. aureus, resultou em uma redução superior a 99 % na viabilidade

celular após 8 h de incubação para as estirpes 2979 e 4118 (Figura 5). Não

28

foram detectadas células viáveis após 12 e 24 h de incubação para as estirpes

2979 e 4118, respectivamente. Não foi observada redução no número de

células viáveis quando as células não foram tratadas com EEP.

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tempo de incubação (h)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s vi

ávei

s (L

og

UF

C/m

L)

Figura 5. Efeito do EEP na viabilidade celular de Staphylococcus aureus 2979

(● e ○) e 4118 (■ e □) em leite durante o período de incubação a 37

°C. EEP (20 mg/L) foi adicionado ao leite (● e ■) e aproximadamente

107 UFC/mL das estirpes de S. aureus foram inoculadas nos tubos.

Após os intervalos de 0 a 24 h de incubação a 37 °C, alíquotas

foram retiradas e os números de células viáveis foram

determinados. Os tratamentos controles também são demonstrados

(○ e □).

5.5 SELEÇÃO DE RESISTENTES OU DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA À PRÓPOLIS POR S. aureus

Não houve alteração da sensibilidade das estirpes de S. aureus

2979 e 4118 ao EEP após 20 transferências das culturas em meio BHI

29

contendo doses subletais de 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL de EEP,

respectivamente (Figura 6). As estirpes 2979 (Figuras 6a e b) e 4118

(Figuras 6c e d), mantiveram a sensibilidade inicial e final ás

concentrações de 18,75 e 37,5 mg/mL do EEP, respectivamente.

Figura 6. Sensibilidade das estirpes 2979 e 4118 ao EEP antes e após o

tratamento com doses subletais de 0,25 e 0,50 mg/mL do EEP,

respectivamente. a) Sensibilidade da estirpe 2979 antes do

tratamento com 0,25 mg/mL do EEP. b) Sensibilidade da estirpe

2979 após as 20 transferências em presença de uma concentração

de 0,25 mg/mL do EEP. c) Sensibilidade da estirpe 4118 antes do

tratamento com 0,5 mg/mLdo EEP. d) Sensibilidade da estirpe 4118

após as 20 transferências em presença de uma concentração de

0,5 mg/mL do EEP.

5.6 ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA E ARRANJOS CELULARES DE S. aureus APÓS EXPOSIÇÃO AO EEP

30

A análise das imagens de MFA das estirpes de S. aureus no tratamento

controle (ausência de EEP) indicou que as células de S. aureus mantiveram a

forma e o arranjo característico do gênero Staphylococcus em tampão fostato

(Figura 7a e 7c). Quando S. aureus foi exposto ao EEP por 4 h, observaram-se

mudanças morfológicas significativas nas células tratadas. As células

apresentaram superfície irregular e perderam o arranjo característico (Figura 7b

e 7d). Além disto, as células tratadas com extratos de própolis também

apresentaram diminuição de tamanho quando comparadas ao tratamento

controle (Figura 7).

31

Figura 7. Fotos tridimensionais da microscopia de emissão atômica das estirpes

de Staphylococcus aureus. As estirpes de S. aureus 2979 (a e b) e

4118 (c e d) foram inoculadas (aproximadamente 107 UFC/mL) em

tampão fosfato com a adição de 0,5 mg/Ml do EEP (b e d) e incubadas

a 37°C por 4 h. Após o tempo de incubação, foi feito um esfregaço em

uma lâmina de vidro e submetidas a IT-MFA. Tratamentos controles

sem a adição de EEP foram realizados (a e c).

32

6 DISCUSSÃO

Staphylococcus aureus é um patógeno gram-positivo que causa

doenças em homens e animais que variam desde infecções superficiais até

septicemia (GARCÍA-LARA; MASALHA; FOSTER, 2005). As infecções

causadas por este microrganismo apresentam taxas de cura reduzidas, devido

ao seu caráter ubiquitário e ao potencial que estas bactérias possuem de

desenvolver resistência aos antimicrobianos utilizados em seu combate

(CLEMENTS; FOSTER, 1999; GUNDOGAN et al., 2005). Devido à importância

deste microrganismo na saúde pública, nos últimos anos diversos grupos de

pesquisa vêm sugerindo novas estratégias para controlar essas infecções

(HARRIS et al., 2002; BALABAN et al., 2000).

Muitos estudos têm proposto o uso da própolis como uma alternativa

para controlar S. aureus. Estes estudos demonstram que o efeito

antimicrobiano da própolis é bactericida (BURDOCK, 1998; CUSHNIE et al.,

2007). Takaisi-kikuni e Schilcher (1994) avaliaram o efeito do EEP no

crescimento celular de Streptococcus agalactiae através de medidas

microcalorimétricas e, observaram que o EEP inibia o crescimento bacteriano

por prevenir a divisão celular, e com conseqüente formação de Streptococcus

pseudo-multicelulares.

Segundo Mirzoeva, Grishanin e Calder (1997), o efeito bactericida do

extrato etanólico de própolis é causado pela presença de muitos ingredientes

ativos e lábeis no extrato. Assim, seria plausível inferir que a variação na

temperatura e no tempo de extração da própolis modificaria a composição dos

EEPs, influenciando na atividade antibacteriana dos mesmos. Além disso, tem

sido sugerido padronizar os processos de extração da própolis a fim de obter

extratos homogêneos e com maior atividade antimicrobiana.

Na literatura são relatados processos extrativos que utilizam

temperaturas variando desde a temperatura ambiente até 70°C e extrações

que duram de 30 minutos até sete dias (CASTRO; CURY; ROSALEN, 2007;

33

KUJUMGIEV et al., 1999; MIORIN et al., 2003; PARK et al. 1998). Neste

estudo não se observou uma relação direta entre a temperatura e o tempo de

extração com a atividade antimicrobiana dos EEPs. Esse resultado concorda

com o obtido por Cunha et al. (2004), que, ao variar o tempo de extração do

EEP, não observaram alterações significativas no teor de fenólicos totais dos

extratos. A ausência de diferenças significativas na atividade antimicrobiana do

EEPs pode estar relacionada com o fato dos frascos de extração terem sido

lacrados com rolha de borracha, o que evita a perda de compostos voláteis por

evaporação. Além disso, é provável que algumas substâncias menos voláteis

sejam responsáveis pela maior parte da atividade antimicrobiana da própolis

(PINTO, 2008). Considerando o custo, a rapidez, e a atividade antimicrobiana

dos extratos, sugere-se a extração da própolis a 45°C por 48 h.

No presente trabalho, quando a concentração de 1 mg/mL foi adicionada

ao meio BHI, não foi observado crescimento celular por pelo menos 48 h.

Esses resultados sugerem que o EEP inibiu a multiplicação celular, o que está

de acordo com os estudos de Takaisi-kikuni e Schilcher (1994). Quando

concentrações inferiores a 1 mg/mL de EEP foram adicionadas ao meio BHI, as

estirpes de S. aureus apresentaram diminuição nas velocidades específicas de

crescimento e aumento da duração da fase lag, sendo a estirpe 4118 a menos

sensível aos extratos de própolis.

Nos experimentos a fim de verificar o efeito do EEP sobre a viabilidade

celular de S. aureus em tampão fosfato, constatou-se um efeito bactericida,

porém nenhuma diferença significativa foi observada para as culturas testadas.

Quando o leite foi utilizado como meio de incubação, resultados similares foram

observados. Entretanto, foi necessária a utilização de uma dose de EEP vinte

vezes maior para causar efeito semelhante ao tratamento realizado em tampão

fosfato. Este resultado pode ser devido à interação entre substâncias presentes

na própolis e os constituintes do leite, como gorduras e proteínas, resultando

em uma menor homogeneidade da própolis e, conseqüentemente reduzindo a

concentração de substâncias antimicrobianas disponíveis para agir sobre a

célula bacteriana (JUVEN et al., 1994). O leite também é rico em nutrientes que

podem ser utilizados no metabolismo do S. aureus diminuindo o efeito deletério

34

da própolis e mantendo a homeostase celular. Embora várias estirpes de S.

aureus sejam isoladas do leite (SILVA et al., 2000), poucos estudos têm

avaliado o efeito de substâncias antimicrobianas contra células de S. aureus

incubadas nesta matriz.

O desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos é o maior desafio

no controle de infecções causadas por S. aureus. Muitos estudos demonstram

a capacidade e a facilidade que esses microrganismos possuem de adquirir

resistência aos antibióticos utilizados em seu controle (GUNDOGAN et al.,

2005; RUBIN et al., 1999). Porém, até a presente data não existem estudos

que indiquem que S. aureus pode tornar-se resistente à própolis. Neste estudo,

mesmo após 20 transferências na presença da própolis (aproximadamente 60

gerações) não foram observadas alterações nas sensibilidades das estirpes de

S. aureus testadas. Este fato pode ser explicado pela composição química

complexa da própolis, onde seus constituintes exercem diferentes mecanismos

de ação na célula bacteriana (CUSHNIE; LAMB, 2005; OHEMENG et al., 1993;

MIRZOEVA; GRISHANIN; CALDER, 1997; KUPPUSAMY; DAS, 1992;

HILLIARD et al., 1995). Essa característica diminui a probabilidade da bactéria

selecionar ou desenvolver resistência aos extratos de própolis.

As imagens de microscopia de força atômica das estirpes de S. aureus

demonstram que a própolis pode atuar no envelope celular. Esse efeito pode

ocorrer por meio da inibição de enzimas que participam da síntese do

peptideoglicano ou ao nível da membrana citoplasmática, formando poros na

membrana celular, e causando o extravasamento dos constituintes

intracelulares. Cushnie e Lamb (2005) investigando o efeito da galangina, uma

flavona encontrada em amostras de própolis, demonstraram que esse

composto causa a perda de potássio intracelular. Aqueles autores relacionaram

a perda de potássio com a ação deste composto na membrana citoplasmática

das células de S. aureus. Além disso, quercertina, uma outra flavona

constituinte da própolis (BONVEHÍ; COLL; JORDÀ, 1994), pode causar danos

à membrana citoplasmática bacteriana (MIRZOEVA; GRISHANIN; CALDER,

1997). Os compostos fenólicos, que também são encontrados na própolis, têm

sido relacionados com a desnaturação protéica (DENYER; STEWART, 1998),

35

com o extravasamento dos constituintes citoplasmáticos, com o rompimento do

peptideoglicano e com danos à membrana celular (HUGO; BLOOMFIELD,

1971a, HUGO; BLOOMFIELD, 1971b, HUGO; BLOOMFIELD, 1971c; JUVEN;

HENIS; JACOBY, 1972).

Além de agir no envelope celular de bactérias, a própolis também pode

interferir na atividade enzimática. Apigenina e a quercertina, que são

flavonóides presentes na própolis (BONVEHÍ; COLL; JORDÀ, 1994), inibem a

atividade da DNA girase (HILLIARD et al., 1995; OHEMENG et al., 1993). Essa

enzima atua durante os processos de replicação e transcrição do DNA

bacteriano, sendo responsável pela introdução do superenovelamento

negativo, dependente de ATP, no DNA bacteriano (FOTI, 2006). Certos

antibióticos, como as quinolonas, que atuam inibindo a atividade da DNA

girase, apresentam atividade bactericida e possuem amplo espectro de ação

contra cocos gram-positivos (FOX, 2006). Como a própolis possui compostos

que podem inibir a DNA girase, sua atividade bactericida contra estirpes de S.

aureus, pode ser devida a este efeito.

Nas bactérias existem metaloenzimas como as fosfatases (HAVSTEEN,

2002), cujos átomos de metais pesados formam complexos com os flavonóides

por meio de ligações fortes, interferindo na atividade enzimática (HAVSTEEN

2002). A carboxipeptidase é uma metaloenzima dependente de zinco

encontrada em bactérias (FOX, 2006; HENRIQUES; HIRATA; COZZOLINO,

2003). Essa enzima é essencial para síntese do peptideoglicano e atua

catalisando a hidrólise dos resíduos carboxi-terminais dos polipeptídios (FOX,

2006). O peptideoglicano é constituido por N-acetilglicosamina e de ácido N-

acetilmurâmico, ao qual se encontram ligadas cadeias peptídicas laterais que

formam ligações cruzadas que conferem grande resistência à lise osmótica

(BARBOSA, 2002). A formação de complexos entre os flavonóides presentes

no EEP e o átomo de zinco presente na carboxipeptidase pode impedir a

formação de ligações cruzadas durante a síntese de peptideoglicano. Este fato

pode explicar as alterações na morfologia das células de S. aureus tratadas

com EEP quando submetidas à análise por MFA.

36

A quercertina também inibe o citocromo P450, uma hemoproteína

encontrada em bactérias e organismos eucarióticos (KELLIS; VICKERY, 1984).

O citocromo P450 é essencial na biossíntese aeróbia de esterol em organismos

eucarióticos. Em muitas bactérias o citocromo P450 parece exercer uma

função essencial no metabolismo lipídico (SANSOM, 2003). O citocromo P450

também participa da destoxificação de xenobióticos mediada pelo metabolismo

oxidativo bacteriano (COSTA; OLIVEIRA; PIMENTA, 2004). Além disso, Bloch

(1983) demonstrou que S. aureus é capaz de produzir colesterol ou derivados

do lanosterol desmetilados, e essa atividade biossintética parece estar

relacionada com a presença do gene que codifica para o citocromo P450 no

genoma de S. aureus (NELSON, 1998). Existem alguns antimicrobianos que

inibem a síntese de lipídeos resultando na lise bacteriana, um exemplo de

antimicrobiano que atua desta forma é o triclosan (MCMURRY; OETHINGER;

LEVY, 1998). Considerando que o citocromo P450 participa do metabolismo

lípidico e a quercertina presente no EEP inibe esta hemoproteína, é provável

que a síntese de lipídeos tenha sido inibida nas células de S. aureus tratadas

com EEP, resultando na alteração da morfologia bacteriana (Figura 8) ou na

eventual lise celular.

A enzima hialuronidase é produzida por quase todos os microrganismos

patogênicos, incluindo o S. aureus (HYNES e WALTON, 2000). Esta enzima

degrada a matriz extracelular de mamíferos, composta de ácido hialurónico,

facilitando assim a invasão dos patógenos nos tecidos. Além disto, existe a

possibilidade da hialuronidase participar do metabolismo intracelular de

microrganismos patogênicos. Neste caso, a ação de clivagem do ácido

hialurônico (molécula polimérica) serviria para transformar esta macromolécula

em pequenos dissacarídeos, que seriam facilmente absorvidos pelo

microorganismo. Neste caso, a enzima passaria a ter um papel fundamental no

crescimento celular (HYNES e WALTON, 2000). Considerando que a

hialuronidase participa do metabolismo intracelular de S. aureus, esta enzima

seria outro alvo suscetível aos componentes da própolis, conforme

demonstrado por Park, Ikegaki e Alencar (2000).

37

Nagata, Kaito e Sekimizu (2008) identificaram um gene que regula a

virulência de S. aureus. Esse gene quando expresso resulta na formação de

uma proteína denominada CvfA que possui atividade de fosfodiesterase. Estes

pesquisadores analisaram mutantes de S. aureus com baixa atividade da

enzima CvfA e verificaram que esta atividade era necessária para a virulência

de S. aureus. Kuppusamy e Das (1992) demonstraram que a quercertina inibe

a ação da AMP cíclico fosfodiesterase. Assim, é possível que a própolis iniba a

atividade da CvfA de S. aureus, interferindo no processamento do RNA

bacteriano e diminuindo a virulência desta bactéria.

Estudos que analisam o modo de ação de compostos isolados da

própolis são importantes para elucidar o mecanismo de ação da própolis, mas

o uso do extrato bruto é mais aplicável considerando que os processos de

purificação dos compostos envolvem procedimentos laboriosos e caros

(HAYASHI et al., 1999). Além disso, o uso de constituintes isolados da própolis

pode aumentar a probabilidade de selecionar estirpes resistentes.

A contaminação do leite com resíduos de antibióticos é indesejável sob

vários aspectos (JONES; SEYMOUR, 1988). Entretanto, novas estratégias de

tratamento da mastite bovina têm sido sugeridas como uma alternativa para

reduzir o uso de antibióticos na pecuária leiteira. Os resultados obtidos neste

trabalho indicam que a própolis pode ser efetiva para o controle de S. aureus

associados à mastite bovina. Extratos etanólicos de própolis causaram perda

de viabilidade e alteração da morfologia celular de S. aureus in vitro.

Entretanto, observaram-se discrepâncias entre as doses inibitórias utilizadas

em meio sintético e em leite. Considerando os mecanismos de ação propostos

para a própolis, novos estudos deverão ser realizados com a finalidade de

caracterizar melhor o efeito dos extratos de própolis sobre sítios celulares

específicos.

38

7 CONCLUSÕES

A variação do Tempo e temperatura de extração da própolis não afeta o

efeito antimicrobiano dos extratos etanólicos de própolis.

O Extrato etanólico de própolis exerce um efeito bactericida sobre as

estirpes de S. aureus.

A atividade bactericida do extrato etanólico de própolis é menor em leite

do que em meio sintético.

O extrato etanólico de própolis não seleciona estirpes de S. aureus

resistentes a esse antimicrobiano.

O Extrato etanólico de própolis causa alterações morfológicas no

envelope celular e no arranjo das estirpes de S. aureus.

Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o extrato etanólico de

própolis pode ser aplicado no tratamento de infecções mastíticas

causadas por S. aureus.

39

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE

51

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1


De

ns

ida

de

óp

tic

a m

áx

ima

a 6

00

nm

Figura 1A. Efeito de diferentes concentrações de EEP na densidade óptica

máxima atingida pelas estirpes de S. aureus. As estirpes de S.

aureus 2979 (quadrados), 4118 (círculos) e ATCC 29213

(triângulos), foram incubadas em meio BHI com adições de

concentrações crescentes de EEP (0 – 1 mg/mL), após 24 h de

incubação as DO (600 nm) máximas atingidas pelas estirpes foram

determinadas.

52

0

0,5

1

1,5

2

0 0,25 0,5 0,75 1


Ve

loc

ida

de

es

pe

cíf

ica

de

c

res

cim

en

to (

h-1

)

Figura 2A. Efeito de diferentes concentrações de EEP na velocidade

específica de crescimento das estirpes de S. aureus. As estirpes de

S. aureus 2979 (quadrados), 4118 (círculos) e ATCC 29213

(triângulos), foram incubadas em meio BHI com adições de

concentrações crescentes de EEP (0 – 1 mg/mL) e as velocidades

específicas de crescimento das estirpes foram determinadas.

53

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6


Te

mp

o d

e g

era

çã

o (

h)

29213

2979

4118

Figura 3A. Efeito de diferentes concentrações de EEP no tempo de geração

das estirpes de S. aureus. As estirpes de S. aureus 2979

(quadrados), 4118 (círculos) e ATCC 29213 (triângulos), foram

incubadas em meio BHI com adições de concentrações crescentes

de EEP (0 – 1 mg/mL) e os tempos de geração das estirpes foram

determinados.

54

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6


Fa

se

lag

(h

)

2979

4118

29213

Figura 4A. Efeito de diferentes concentrações de EEP na duração da fase lag

das estirpes de S. aureus. As estirpes de S. aureus 2979

(quadrados), 4118 (círculos) e ATCC 29213 (triângulos), foram

incubadas em meio BHI com adições de concentrações crescentes

de EEP (0 – 1 mg/mL). A duração da fase lag de cada estirpe foi

determinada.

55

Figura 5A. Efeito de várias concentrações do EEP sobre o crescimento celular

de S. aureus 2979 (a), 4118 (b) e ATCC 29213 (c), em meio BHI.

57

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