Objectivos:

◉◉◉◉ Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula

◉◉◉◉ Definir e analisar a metodologia usada na:

-Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de fluorescência;

-Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; -Microscopia Electrónica de Transmissão e de Varrimento.

◉◉◉◉ Listar e descrever a preparação do material biológico para a microscopia óptica e electrónica

Métodos instrumentais de análise para o estudo de células e tecidos - Microscopia

BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Poder de resolução

�Microscopia depende de: - técnicas de preparação das amostras biológicas - poder de resolução dos microscópios

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Algumas descobertas importantes na

história da microscopia

1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto

1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem técnicas de coloração e lançaram os fundamentos da anatomia microscópia

1879 - Flemming descreve o comportamento dos cromossomas na mitose de cél animais.

1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1ªx uma bactéria

1882 a 1899 – Klebs e Pasteur utilizando variados corantes identificam importantes agentes patogénicos.

1886 – Zeiss constroi uma série de lentes q permite revelar estruturas nos limites teóricos da luz visível

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na

histhisthisthistóóóória da microscopiaria da microscopiaria da microscopiaria da microscopia

1932 – Zernicke inventa o microscópio de contraste de fase

Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam vistas em detalhe pela 1ª vez

1981 – Allen e Inoué – aperfeiçoam o microscópio óptico de contraste com sistema de vídeo avançado

1988 – Microscópios confocais de varredura comerciais passam a ser amplamente utilizados

1898 – Golgi descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois da coloração das células com nitrato de prata

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Detalhes revelados pelo microscópio óptico

O limite máximo de resolução de 1 microscópio óptico é determinado pelo comprimento de onda da luz visível, q varia de 0,4 µµµµm (violeta) a 0,7 µµµµm(vermelho).

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Limite de resolução – é o limite de separação pelo qual 2 objectos podem ser distinguidos.

Limite de resolução depende de:

- comprimento de onda da luz (λλλλ)

- abertura numérica do sistema de lentes (an)

Detalhes revelados pelo microscópio óptico

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

A abertura numérica – é a capacidade do sistema de lentes recolher a luz.

- lentes secas - an não pode ser maior que 1

- lentes de imersão – an pode chegar a 1,4

Qto > a an > a resolução e > a luminosidade.

Detalhes revelados pelo microscópio óptico

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Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Fixação

A fixação imobiliza,

mata e

preserva e endurece as células.

torna-as permeáveis aos corantes e

produz uma ligação cruzada entre as suas

macromoléculas, permitindo que estas

permaneçam estabilizadas nas suas posições

naturais

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Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Fixação

Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicoscomo o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴∴∴∴ usados em combinações.

Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das proteínas produzindo ligações cruzadas.

Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura da célula ou das suas moléculas ∴∴∴∴ uma alternativa é o congelamento rápido.

Vantagens- proteínas bem preservadas

Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais de gelo

O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomomantido numa câmara a ↓↓↓↓ T)

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Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Embebição

Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e precisam de ser embebidos em ceras MO

resinas, ME

1º na forma líquida de seguida na forma sólida (por esfriamento ou polimerização).

O material biológico embebido é seccionado com um micrótomo/ultramicrótomo

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Embebição

O micrótomo – é um aparelho com uma lâmina metálica afiada

As secções:

- de 1 a 10 µm de espessura,

- colocadas sobre a superfície plana de uma lâmina de vidro

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Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Coloração

Depois de fixado e seccionado, o material biológico tem que ser coradopara poder ser observado ao microscópio.

Uma vez que que os corantes têm diferentes afinidades e poderes de penetração têm que ser utilizadas em combinações.

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Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos de coloração mais selectivos e racionais, particularmente a métodos que revelem proteínas específicas ou outras macromoléculas na célula.

Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Coloração

Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células através da sua actividade catalítica.

Regiões mais sensíveis podem ser avaliadas através de fluorocromos

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Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência

Moléculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado λλλλ e emite um λλλλ + longo, visualizado através de 1 filtro contra um fundo escuro

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência

O 1º permite a passagem de λλλλq excitem determinados fluorocromos

O 2º permite passagem de λλλλ emitidos qdo o corante fluoresce

Os fluorocromos são detectados em microsc de fluorescência q difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 conjuntos filtros:

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Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência

Imagem de FISH com fluoresceine rodamina

A fluoresceina emite fluorescência verde qdo excitada com luz azulA rodamina “ “ vermelha “ “ “ “ amarel/verde

As 2 cores são vistas separada/ alternando conjuntos de filtros

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Microscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de Fase

Qdo se fixa 1a cél ela perde alguns componentes ou

são simples/ distorcidos

∴∴∴∴ a forma + correcta de examinar as células seria quando estas ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar.

Qdo a luz atravessa 1a cél viva a fase do λ é alterado de acordo com o índice de refracção da cél. A luz ao passar através do núcleo é retardada e deslocada em relação àluz que atravessam áreas + delgadas.

O microsc de contraste de fase explora os efeitos da interferência qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da célula

Microscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de Fase

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

A luz q passa através de 1a célnão corada

sofre pouca alteração de amplitude e ∴

os detalhes das estruturas não se conseguem ver

As partes coradas da cél

Reduzem a amplitude e ∴

A imagem colorida da cél é vista

Microscopia Microscopia Microscopia Microscopia ConfucalConfucalConfucalConfucal

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Para a microscopia óptica 1 tecido tem q ser cortado em secções q, qto + fina a secção + nítida é a imagem.

Neste processo a informação 3D é perdida.

Com o Mic confucal de varrimento a partir de 1a série de secções tiradas em ≠≠≠≠s profundidades e armazenadas em computador é fácil reconstruir a imagem 3D

o Mic confucal de varrimento é para o microscopista o que o CAT scanner épara o radiologista. Ambos fornecem imagens seccionadas detalhadas do interior de uma estrutura intacta. Gastrula – Drosophila

mic convencional e de fluorescênc confucal

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Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)

TEM TEM TEM TEM –––– ‘‘‘‘TransmissiomTransmissiomTransmissiomTransmissiom ElectronElectronElectronElectron MicroscopeMicroscopeMicroscopeMicroscope’’’’

Teorica/ tem 1a resolução 10 000x > q o MO e 1 poder de resolução - 1Å

Na prática tem 1a resolução 100x > q o MO e 1 poder de resolução 20Å

Porquê? Devido a problemas na preparação da amostraContraste eDanos causados pela radiação

No TEM os electrões atravessam a amostra para formar a imagem

Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na

histhisthisthistóóóória da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electróóóónicanicanicanica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

1897 – J. Thompson anuncia a existência de partículas carregadas –va/ + tarde denominadas “electrões”

1931– Ruska et al constróem o 1º TEM 1935 – Knoll demonstra a viabilidade do mic electrónico de varredura 1939 - Siemens produz o 1º TEM para fins comerciais

1945 – Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar célula em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO4

1948 – Pease e Baker, preparam secções de mat biológico de 0,1 a 0,2 µµµµm

1952 – Palade, Porter e Sjöstrand desenvolvem métodos de fixação e corte q possibilitam pela 1ªx a visualização de várias estruturas intracelulares

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na

histhisthisthistóóóória da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electróóóónicanicanicanica

1953 – Porter e Blum desenvolvem o 1º ultramicrótomo

1956 – Glauert et al propõem a resina epoxi araldite como agente de inclusão. 1961 – Luft introduz a resina Epon

1957 – Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana celular vista pela 1ªx no TEM

1959 – Singer usa anticorpos acopolados à ferratina para detectar moléculas da célula

1965 – Cambridge instruments produz o 1º microscópio de varrimento

1968 – De Rosier e Klug descrevem técnicas para a reconstituição de estruturas 3D a partir de micrografias electrónicas

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Preparação do material biológico para a

microscopia electrónica

1º com gluteraldeído que faz com que as moléculas de proteínas façam ligações covalente/ cruzadas com os seus vizinhos

2º com tetróxido de ósmio q se liga e estabiliza as bicamadaslipídicas assim como as proteínas

FixaFixaFixaFixaççççãoãoãoão

DesidrataDesidrataDesidrataDesidrataççççãoãoãoão

Como a amostra é exposta ao vácuo mto forte não pode ser analisada viva, com H2O, ∴∴∴∴ é feita a desidratação numa série crescente de alcoóis

Preparação do material biológico para a

microscopia electrónica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

EmbebiEmbebiEmbebiEmbebiççççãoãoãoão

Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco sólido de plástico

CorteCorteCorteCorte

Cortes ultrafinos (na ordem dos 50 a 100nm de espessura) feitos num ultramicrótomo e colocados numa grelha

ContrastaContrastaContrastaContrastaççççãoãoãoão

Feito com sais de metais pesados como o urânio e o chumbo

Preparação do material biológico para a

microscopia electrónica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

mitocôndria

nucléolo

vacúolo

ribossomas

RE

Golgi

Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimento

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Secções finas obtidos por TEM são pedaços bidimensionais de tecidos e não transmitem de imediato a organização 3D dos componentes celulares

Este é conseguido usando o microscópio electrónico de varrimento, q é num aparelho <, + simples e + barato do q um TEM.

Utiliza os electrões q são dispersos ou emitidos da superfície da amostra ∴somente características da superfíciepodem ser examinadas e a resolução atingível não é mto alta macrófago

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimento

A amostra é fixada,

desidratada e

coberta com uma camada fina de metal pesado de

seguida

varrida por um feixe de electrões.

A quantidade de electrões emitidos é medido para controlar a intensidade de um 2º feixe, q se move em sincronia com o 1º e forma a imagem num écran.

Como a imagem tem brilhos e sombras dá 1a aparência 3D.

Cílio do ouvido interno do boi