Mutação e Conservação Mi biMicrobiana§ões podem ser causadas por erros de cópia do...

Mutação e Mutação e Mutação e Mutação e Conservação Conservação Conservação Conservação Mi biMi biMicrobianaMicrobiana

MACROMOLÉCULAS DA INFORMAÇÃO CELULARMACROMOLÉCULAS DA INFORMAÇÃO CELULAR

GENÉTICA GENÉTICA –– BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR

Genética de ProcariotosGenética de Procariotos

• Ocupa apenas 10% do volume celular (1 mm comprimento)p p ( p )• Superenovelamento do DNA dupla fita helicoidal

SUPERENOVELAMENTO DO DNAU E EN VEL MEN D DN

- Estado de torção da molécula do DNA

-- POSITIVOPOSITIVO* Dupla hélice torna-se mais enoveladaDupla hélice torna se mais enovelada

-- NEGATIVONEGATIVONEGATIVONEGATIVO* Dupla hélice torna-se subenovelada* DNA torcido ao longo do seu eixo na direçãoDNA torcido ao longo do seu eixo na direçãooposta à da dupla hélice dextrógira* Forma mais encontrada na naturezaForma mais encontrada na natureza

QUEM FAZ?? Topoisomerase II (DNA girase)QUEM FAZ?? Topoisomerase II (DNA girase)

Replicação do DNA

O mecanismo de replicaçãoestá baseado no pareamentoestá baseado no pareamentodas bases da dupla hélice doDNADNA.

FITAS ANTIPARALELAS

A estrutura do DNA contéma informação necessáriapara perpetuar suap p psequência de bases

R li U id d d DNA d á d Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação

Replicon:

1. Origem + Término

2 d ú d l2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclocelular

3. O genoma de uma célula procariótica constitui umúnico repliconp

4. Cada cromossomo eucariótico constitui váriosreplicons e todos são ativados uma única vez noreplicons e todos são ativados uma única vez nociclo celular ainda que não simultaneamente

A replicação é bidirecional

REPLICAÇÃO DO DNA

1º PASSO = Retirar o superenovelamento do DNA1 PASSO Retirar o superenovelamento do DNA

2º PASSO = Desfazer a dupla hélice do DNAp

3º PASSO = Copiar a fita de DNA (sentido 5’ – 3’)

4º PASSO = Estabilizar a fita antiparalela e adicionarPRIMERS de RNAPRIMERS de RNA

5º PASSO = Ligar os fragmentos de Okasaki gerados na fitag g gantiparalela

6º P O R l DN6º PASSO = Renovelar o DNA

Polimerases: Enzimas que sintetizam DNA

A síntese de DNA ocorrepela adição de nucleotídeos ap çextremidade 3´OH da cadeiaem crescimento. O precursorem crescimento. O precursorda síntese é o desoxiri-bonucleosídeo 5´trifosfatobonucleosídeo 5 trifosfato

Sentido da síntese sempreSentido da síntese sempreé 5’ → 3’

A replicação é umprocesso extremamente fiel.As DNA-polimerases tematividade revisora

Fragmentos deFragmentos deOkasaki ocorrem nafita descontínua

A DNA polimerasep mIII é responsávelpela síntese damaior parte do DNAmaior parte do DNA

A DNA polimeraseI remove o primerde RNA e preenchede RNA e preencheas lacunas

A DNA ligase selaas quebrasq

O complexo de replicaçãop p ç

í (h l )A proteína DNA B (helicase)é responsável pelo movimentopara frente da forquilhapara frente da forquilha

d lí dCada core catalítico da DNAPolIII sintetiza uma das fitas-filhasfilhas

fO primossomo afasta uma dasfitas molde

Proteínas SSB mantem asfitas parentais separadas

A DNA ligase sela as quebras

T i ã d DNAT i ã d DNATranscrição do DNATranscrição do DNA

Sí t d RNA• Síntese de RNAm• RNA polimerase (adição de ribonucleotídeos)

Interações da RNA polimerase com sequênciasd t DNAde promotores no DNA

A DNA/RNA polimerase também erra, mas ... ReparaA DNA/RNA polimerase também erra, mas ... Repara

E se o erro não for reparado???E se o erro não for reparado???E se o erro não for reparado???E se o erro não for reparado???

MutaçãoMutação• O que é mutação???

Mu çMu çO que é mutação???

ã d ê i d l íd d i lSão mudanças na sequência dos nucleotídeos do materialgenético de um organismo (GENÓTIPO).g g

Mutações podem ser causadas por erros de cópia doMutações podem ser causadas por erros de cópia domaterial durante a divisão celular, por exposição a radiaçãoUV I i Q í i M ê i VíUV ou Ionizante, Agentes Químicos Mutagênicos ou Vírus.

A célula pode também causar mutações deliberadamentedurante processos conhecidos como hipermutaçãodurante processos conhecidos como hipermutação

MutaçãoMutação

Qual geração a mutação é detectada???

COMO DETECTAR UM MUTANTE?COMO DETECTAR UM MUTANTE?

Varredura x SeleçãoVarredura x Seleção

• Qualquer característica pode ser mutadaQualquer característica pode ser mutada• Mutações selecionáveis vantagens aoorganismoorganismo→ Cepa mutante suplanta a parental

R i tê i fá (→ Resistência a fármacos (comodetectar??)

ÃSELEÇÃO ferramenta poderosa

• Mutações não-selecionáveis alteraçõesno fenótipo visíveis sem vantagemno fenótipo visíveis sem vantagem→ Perda de pigmentaçãoVARREDURA observação visualVARREDURA observação visual

• Classes comuns de mutantes e metodologias empregadas paradetectar os mutantes

BASES MOLECULARES DA MUTAÇÃOBASES MOLECULARES DA MUTAÇÃOBASES MOLECULARES DA MUTAÇÃOBASES MOLECULARES DA MUTAÇÃO

MUTAÇÃO INDUZIDA x MUTAÇÃO ESPONTÂNEAMUTAÇÃO INDUZIDA x MUTAÇÃO ESPONTÂNEA

Naturalmente semintervenção

Realizada deliberadamente, intervenção humana

intervenção

PontualPontualFrameshift

E d L itErro de Leitura

A Base Molecular da MutaçãoCódigo genético para as tríades das bases no mRNA e o respectivo aminoácido que codificam

_________________________________________________________________________________EQB353 – Microbiologia Industrial Escola de Química / UFRJ

MutaçãoMutação

• Mutação de Ponto → alteração de um nucleotídeo

MutaçãoMutação

Mutação de Ponto → alteração de um nucleotídeo- mutação silenciosa (sem alteração do produto final)

ã i ( l ã d i á id )- mutação missense (alteração do aminoácido)- mutação nonsense (formação de um códon terminal)

• Mutação FrameshiftMutação Frameshift- deleção ou inserção de alguns pares de base

l ã d ód ê i i á i d fi l- alteração dos códons, sequência primária, produto final

• Mutação Espontânea- erro de leitura da DNA polimeraseerro de leitura da DNA polimerase

• Alteração de Fases (Frameshift)Alteração de Fases (Frameshift)

Inserção ou Deleção de Nucleotídeos = Alteração dos códonsInserção ou Deleção de Nucleotídeos = Alteração dos códons

Erros da Replicação (DNA) ouErros da Replicação (DNA) ouTranscrição (RNA)

Perda completa da funçãogênica

Se a mutação ocorrer em umgene vital a mutação sera fatalgene vital, a mutação sera fatal

Mutações por inserçõesMutações por inserções -Transposon

O P d M ãO Processo de Mutação

Mutação por alteração de fasesç p ç(frameshift)


O Processo de Mutação - Correção

C ã d d d l it (f hift)_________________________________________________________________________________EQB353 – Microbiologia Industrial Escola de Química / UFRJ

Correção do quadro de leitura (frameshift)

Mutação Espontânea

Ocorre ao acaso, sem causa aparente e é rara: 1 célula bacteriana em cada 106 a 1010 células são mutantes1 célula bacteriana em cada 106 a 10 0 células são mutantes

Taxa de mutações espontâneas em vários loci de diferentes microrganismos


• Mutagênese sítio-dirigidaMutagênese sítio dirigida

Eventos aleatórios não dirigidas a um gene específico (mutaçõesEventos aleatórios não dirigidas a um gene específico (mutaçõesclássicas)

b d d ífDNA recombinante = indução de mutações específicas em genesespecíficos

TRANSPOSONTRANSPOSON

Elemento transponível quep qse insere no interior de umgene (perda da funçãog (p çgênica) – utilização paracausar mutaçõescausar mutações

TAXAS DE MUTAÇÃOTAXAS DE MUTAÇÃO

• Grande variação dependendo do tipo de mutaçãoGrande variação, dependendo do tipo de mutação• Algumas mutações são praticamente impossíveis de seremdetect d s / utr s sã muit frequentes (pr blem s dedetectadas / outras são muito frequentes (problemas demanutenção das estirpes em estoque)

• Frequência de Erros 10-6 a 10-7 / par de quilobase durante 1único ciclo de replicação (um gene tem ≅ 1000 pares bases)

• Eucariotos taxa de mutação menorPOR QUE????

Homo sapiens = 80 anos / 4 gerações 2n = .......

Escherichia coli (g= 20 min) = 80 anos / 2.102.400 gerações n = 2.102.400

AGENTES MUTAGÊNICOSAGENTES MUTAGÊNICOS

• Taxa de mutações espontâneas são muito baixasA t í i fí i bi ló i t d t d• Agentes químicos e físicos ou biológicos aumento da taxa de

mutação

AGENTES QUÍMICOSAGENTES QUÍMICOS

a) Análogos Estruturaisg

- Pareamento incorreto das basesnucleotídicas

• Modificações químicas- Pareamento incorreto

Agem durante a replicação do DNA, modificando a mensagem proteica ou modificando a mensagem proteica ou impedindo sua duplicação.

Aumentam a freqüência das mutações pontuais

b) Á d N l DN él l d d d

AGENTES QUÍMICOSAGENTES QUÍMICOSb) Ácido Nitroso - altera o DNA em células que não estão se dividindo

através da remoção de grupos aminos das bases purinas edpirimidinas.

) l l õ d “ l k”c) Agentes alquilantes - promovem reações de “cross-link”entre asbases nitrogenadas, impedindo a abertura da

f d Dfita do DNA. Aumentam muito asmutações pontuais → substituição por grupos alquil.

E l E lf (EE ) E l lf (E )ex.: Etil-Etano-Sulfonato (EES); Etil-Metano-Sulfonato (EMS);Nitrosoguanidina (NTG)

d) Agentes intercalantes – se intercalam entre as bases nitrogenadas.f f d d lDeformam a fita de DNA ou provocam o deslocamento

do quadro de leitura.d fl P fl


ex.: Acridinas, Acriflavinas, Proflavinas

AGENTES QUÍMICOSAGENTES QUÍMICOS

nitrosoguanidinanitrosoguanidina

acriflavina Etil metanosulfonato

AGENTES FÍSICOSAGENTES FÍSICOS

•• RADIAÇÃORADIAÇÃORADIAÇÃORADIAÇÃO

Vári s f rm s de r di çã sã lt mente mut ênic s- Várias formas de radiação são altamente mutagênicas- Radiações Eletromagnéticas

IONIZANTERadiação gama, raios cósmicos, raios X

NÃO-IONIZANTERadiação ultra-violeta (amplamente empregada para induzirRadiação ultra violeta (amplamente empregada para induzirmutação)


•• RADIAÇÃORADIAÇÃO IONIZANTEIONIZANTERADIAÇÃORADIAÇÃO IONIZANTEIONIZANTE

I niz çã de á uIonização de águaEfeitos indiretos (radicais químicos livres – OH)

Danos no DNA dose da radiação (poucos danos) dose daradiação (letal para a célula)

Alto poder de penetração (diferentemente do U.V.)Pouco utilizada em processos de mutação – PERIGOSAPouco utilizada em processos de mutação PERIGOSA


•• RADIAÇÃORADIAÇÃO NÃONÃO--IONIZANTEIONIZANTERADIAÇÃORADIAÇÃO NÃONÃO--IONIZANTEIONIZANTE

F t t ã m b s s pú i sForte atuação em bases púricas epirimidicas

Dímeros de Timina adjacentes

DNA polimerase repara, porém sep p , pos erros forem muitos ...

Mutação e Reparo Mutação e Reparo –– Radiação UVRadiação UV

MANIPULAÇÃO DE GENES MICROBIANOSMANIPULAÇÃO DE GENES MICROBIANOS

•• MUTAÇÃOMUTAÇÃO SÍTIOSÍTIO--DIRIGIDADIRIGIDAMUTAÇÃOMUTAÇÃO SÍTIOSÍTIO DIRIGIDADIRIGIDA

Mut çã in vitr utiliz nd DNA sintétic e cl n em de DNAMutação in vitro utilizando DNA sintético e clonagem de DNApara introduzir mutações em genes sítios (sítios específicos)

Mutações manipuladas por engenharia genética

MSD ferramenta poderosap- Permite alteração de qualquer base em um gene específico- Síntese de pequeno iniciador oligonucleotídico de DNA contendoSíntese de pequeno iniciador oligonucleotídico de DNA contendoa mutação (alteração de base) → pareamento com uma fitasimples de DNA contendo o gene alvosimples de DNA contendo o gene-alvo.

•• APLICAÇÃOAPLICAÇÃO DADA MUTAÇÃOMUTAÇÃO SÍTIOSÍTIO--DIRIGIDADIRIGIDA

Avaliar a atividade de proteínas contendo substituiçõesconhecidas de aminoácidosconhecidas de aminoácidos

M d d i á id d d d i ( liMudança de um aminoácido de uma dada enzima (analisa-se ecompara-se com a enzima selvagem)

Muito aplicado em estudos de enzimologia (catálise, resistência,p gsusceptibilidade a agentes quimicos ou fisicos, interações comoutras proteínas)outras proteínas)

Quais aminoácidos são importantes no sitio catalítico de umaQuais aminoácidos são importantes no sitio catalítico de umaenzima

Ã Ã ÍÃ Ã ÍEXEMPLO DE APLICAÇÃO DA MUTAÇÃO SÍTIO EXEMPLO DE APLICAÇÃO DA MUTAÇÃO SÍTIO DIRIGIDADIRIGIDA

Mutação sítio dirigida no gene codificador para Lipaseç g g f p p

(LipA e LipC) produzida por Pseudomonas sp.42A2

Alteração do aminoácido Prolina no sítio catalíticoAlteração do aminoácido Prolina no sítio catalítico

foram feitas várias tentativas com diferentes aminoácidos

= CONSEQUÊNCIA???

P d d Ati id d P ?? P li i á id i t t- Perda da Atividade – Pq ?? Prolina aminoácido importante

estruturação

Bofill C, Prim N, Mormeneo M, Manresa A, Pastor FI, Diaz P Biochimie. 2010 Mar;92(3):307-16.

E E P E P Ã EXEMPLO DE APLICAÇÃO DA MUTAÇÃO INDUZIDA MUTAÇÃO INDUZIDA

Agentes físicos e químicosAgentes físicos e químicos

Aumentar a expressão da enzima celulase utilizando

mutação induzida em fungo Trichoderma sp.

Agentes Químicos e Agentes Físicosg Q g

Mutação com radiação U VMutação com radiação U.V.

Radiação UV

Tempo e distância

20 ml da suspensãoem uma concentraçãode 108 esporos/ml

Meio Sólido CMC

Mutação com NitrosoguanidinaMutação com Nitrosoguanidina

Tempo

Volume

1 ml de NTG a 0,1%+

9 ml da suspensão

Meio Sólido CMC

9 ml da suspensão

Seleção das estirpes mutantesSeleção das estirpes mutantes

Seleciona-se as placas correspondentes aos tratamentosp p m

onde o índice de sobrevivência dos esporos for de 90 a 99%.

A partir das placas selecionadas as colônias mutantes queA partir das placas selecionadas, as colônias mutantes que

tenham produzido hidrólise nos meios CMC, serão inoculadas

no meio de celulose-azure em tubos. Após a incubação a 28ºC

por 7 a 14 dias as culturas degradadoras do celulose azurepor 7 a 14 dias, as culturas degradadoras do celulose-azure

serão selecionadas.

Conservação de Micro-organismos

P ã l d d d d d- Preservar para evitar variação na qualidade e na quantidade daresposta, mantendo a linhagem com alto potencial de produção.

- Evitar contaminaçãoEvitar contaminação.

COLEÇÕES DE CULTURASCOLEÇÕES DE CULTURAS

Conservam micro-organismos com características conhecidas.

American Type Culture Collection (ATCC), USANorthern Regional Research Laboratory (NRRL) USANorthern Regional Research Laboratory (NRRL), USAInstituto Zimotécnico (IZ) da Escola Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz”, USP-Piracicaba


QuaisQuais osos métodosmétodos dede conservaçãoconservação dosdos micromicroQuaisQuais osos métodosmétodos dede conservaçãoconservação dosdos micromicro--organismos?organismos?

LIOFILIZAÇÃOLIOFILIZAÇÃOLIOFILIZAÇÃOLIOFILIZAÇÃOCONGELAMENTOCONGELAMENTORESFRIAMENTORESFRIAMENTORESFRIAMENTORESFRIAMENTOCRIOCRIO--CONGELAMENTOCONGELAMENTOÓLEOÓLEOÓLEOÓLEOAREIAAREIAÁGUAÁGUAÁGUAÁGUA

â d Pâ d PImportância da PreservaçãoImportância da Preservação

• armazenamento de culturas por longos períodos e utilização

óperiódica para pesquisa e/ou produção

– contaminação

– perda de viabilidade

t ã ( d d t í ti fi i ló i )– mutação (perda das características fisiológicas)

• solução → metodologia de preservação de longa duração

diminuição do crescimento e das atividades metabólicas– diminuição do crescimento e das atividades metabólicas

• crescimento em meio mínimo

• resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura

â d Pâ d PImportância da PreservaçãoImportância da Preservação

• preservação a longo prazo

– evita problemas com o novo isolamento de microrganismos

– economia de tempo, mão de obra e custos com material dep ,

consumo

• importante função da coleção de culturas

– pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para

preservação por períodos prolongadospreservação por períodos prolongados

– garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza

Escolha do Método de PreservaçãoEscolha do Método de Preservação

• pontos a serem considerados• pontos a serem considerados

– manutenção da viabilidade: perda de células no processo de

preservação e durante o armazenamento

– manutenção das propriedades originais: perda dep p g p

características de interesse científico ou industrial

pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo– pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo

– custos de preservação e manutenção

Escolha do Método de PreservaçãoEscolha do Método de Preservação

– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente

e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento

– importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas

com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método

– necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades

adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada paraq ç p ç q p

embalagem de envio e condições de transporte

– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros

Técnicas mais empregadas

1) Transferência periódica para meios de cultura novos( é d b l )(técnica das subculturas ou repiques sucessivos)Parâmetros relevantes: meio de cultura, T estocagem, Dt

transferênciastempo máximo estocagem = 6 meses.

Armazenamento R i d Armazenamento a 4 oC

Repique a cada 3 meses

2) Conservação de culturas sob camada de óleo mineralt á i t 12 tempo máximo estocagem = 12 meses.

Nas duas técnicas, o espaço ocupado nos arquivos é grande, mas os métodos são bastante simples usados em rotinas nos laboratórios


métodos são bastante simples usados em rotinas nos laboratórios


3) Secagem em suportes inertesd é l l é l íl é l dsuportes empregados: areia estéril, solo estéril, sílica, pérolas de

vidro ou de porcelana, sabugo de milho, entre outrostempo máximo estocagem = 6 a 10 anostempo máximo estocagem = 6 a 10 anos

Suporte Inoculação com I b ã Suporte esterilizado

Inoculação com suspensão de

esporos

Incubação em estufa

Secagem em Armazenamento Secagem em estufa por 2

semanas

Armazenamento a 4 oC

Metodologia normalmente empregada para esporos de fungos filamentosos e esporos de Clostridium ou Bacillus


p


4) Estocagem em baixa temperatura (congelamento)) g p ( g )

T= -20 a -1960C utilização de gelo seco ou N líquidoutilização de gelo seco ou N2 líquidouso de agente protetor (glicerol ou dimetil sulfóxido) tempo máximo estocagem = anosp g

C s i t l Crescimento das células em meio de cultura

Suspensão em solução de

glicerol 10%

Congelamento em ampolas fechadas g


Técnicas mais empregadas4) Conservação por liofilização

sublimação da água pré-congeladat á i st 10 20 stempo máximo estocagem = 10 a 20 anos

suspensão concentrada de

Frascos mergulha-dos em solução de

Liofilizador (vácuo -

células em pequenos frascos

çgelo seco e álcool( -780C)

provocando dessecamento)

frascos selados

Vantagens:

pelo fogo; estocagem a T

ambienteVantag n requer pouco espaço para a estocagem;o tempo de estocagem é bastante elevado; o produto final, com baixo teor de umidade, tem maior estabilidade;


pé de fácil transporte.

Ativação de Micro-organismosUma vez conservados devem ser ativados de maneira a produzir

altos teores do produto desejado e se manter vivo.

Técnicas mais empregadas:

1) Transferência periódica para meios de cultura novos(ou repiques sucessivos)

Lactobacillus casei aumenta sua produção em 90% após 9 repiques sucessivos

2) Choques térmicos - banho-maria por 1 minuto um cultivo de micro-organismo crescido em meio tioglicolato de sódio a 370C /4 dias

Obtêm-se cepas resistentes ao calor e produtoras de altos teores desolventes (Clostridium acetobutylicum)

3) Radiações – produção de penicilina por Penicillium chrysogenum


MUTAÇÃO ... A CHAVE DO SUCESSO PARA O FUTURO?

OU ... UM CAMINHO SEM VOLTA???

A PRESERVAÇÃO É FUNDAMENTAL PARA QUEM A PRESERVAÇÃO É FUNDAMENTAL PARA QUEM

TRABALHA COM BIOPROCESSOS!!!

OBRIGADO!!!OBRIGADO!!!

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