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Noções Básicas de Seqüenciamento Genético

Maria do Carmo DeburLACEN/PR

domingo, 30 de maio de 2010

Determinar a seqüência de nucleo3deos do DNA


Métodos Clássicos

1976 – Allan Maxam e Walter Gilbert (EUA)

Método da Degradação Química(Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA

em nucleo9deos específicos)

1977 – F. Sanger e A.R. Coulson (Reino Unido)

Método enzimáQco, dideóxi ou do término da cadeia(Síntese enzimá@ca de uma fita complementar, cujo crescimento é

interrompido pela adição de um dideoxinucleo9deo)


Método de Sanger


Método de Sanger

Animação


Seqüenciamento X PCR

PCR:Amplificação exponencialDois primersdNTPs

Sequenciamento:Amplificação linearUm primerdNTPs e ddNTPs


Método de Sanger -‐ MANUAL


+ddGTP+ddCTP +ddTTPGATTCGAGCTGddAGATTCGddAGddA

GATTCGAGddCGATTddC

GATTCGAGCTddGGATTCGAddGGATTCddGddG

GATTCGAGCddTGATddTGAddT


Método de Sanger -‐ AUTOMATIZADO


Método de Sanger – AUTOMATIZADOELETROFORESE CAPILAR

20 – 100 µM interno



Os ácidos nucléicos migram para o ânodo, pois em pH neutro sua carga é nega@va



A separação das fitas de DNA é dependente:

Tempo de migração,

Temperatura,

Força iônica do tampão,

Intensidade do campo elétrico,

Viscosidade do meio.


Quais os passos necessários


SEQUENCIAMENTO

O que seqüenciar?

Produto de PCR Clone


PURIFICAÇÃO DNA


QUANTIFICAÇÃO DO DNA


REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO

Reagentes

QuanQdadeBigDye

Mix8 µL

Primer 4 µL (3,2 pmol)Água q.s.p. 20 µLDNA 5 µL


REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO

TERMOCICLAGEM:

Inicial: 96ºC – 1 min

25 – 40 ciclosDesnaturação: 96ºC – 15 segAnelamento: 50ºC – 15 segExtensão: 60ºC – 4 min

Final: 4-‐10ºC infinito

Rampa: 1ºC/seg para facilitar o anelamento do primer


PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO

T

T T

T

G

G G

GC

C

CC

CC

C

A

A

A A

A

A

Isopropanol 70%

Etanol/EDTA/Acetato de

sódio

Kit BigDye X-‐Terminator


PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO

ATGCTTCTGGCAGAT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCT

ATGCTTCTGGCAGATCT

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCTGATGCTTCTGG

ATGCTTCTGGCAG

ATGCTTCTGGCAGATCTG

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG

ATGCTTCTGGC

ATGCTTCTGGCAGATC

ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC

ATGCTTCTGGCA

ATGCTTCTGGCAGA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAATGCTTCTGGCAGATCTGAA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA

T

T T

T

G

G G

GC

C

CC

CC

C

A

A

A A

A

A

Isopropanol 70%

Etanol/EDTA/Acetato de

sódio

Kit BigDye X-‐Terminator


SEQUENCIAMENTO


Dado Bruto


Analisando o Cromatograma


O que fazer com estes dados????


Para conhecimento...


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