Normas e Rotinas Operacionais Do

NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS DO

LABORATORIO DE ÁNALISES CLÍNICAS

Setor de Coleta e Recepção

Procedimento Operacionais Padrões (POP)

1. CADASTRO E INFORMAÇÕES

1.1 Identificar o paciente

A chegar à recepção do laboratório, o paciente devera estar portanto requisição

medica com os exames solicitados pelo seu medico, a recepcionista então irá

cadastra-lo, dando ênfase ao nome, idade, sexo, endereço e/ou telefone. O cadastro

do paciente acompanha a identificação numérico controle do laboratório.

1.2 Identificação de amostra

Cada cadastrado possui um numero de identificação, utilizando para etiquetas

os recipientes de coleta.

É importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a tampa,

principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de material.

1.3 Identificações dos exames a serem realizados

No laboratório as amostras são registradas em fichas internas de seus

respectivos setores, nestas fichas constam a identificação numérica, o nome e a

idade do paciente; em seguida as amostras e as fichas serão encaminhadas para os

devidos setores.

1.4 Informações ao paciente

Na recepção do laboratório o paciente irá receber as instruções de como deve

proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioquímica é o paciente é orientado

sobre o período de jejum, sendo também necessário o conhecimento dos

medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando.

Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforço fisico, o

paciente deve vir ao laboratório totalmente descansado para evitar qualquer alterações

nos resultados de seus exames.

2 COLETA DE SANGUE

O sangue colhido com o objetivo de estudar as freqüências alterações dos seus

componentes quando o organismo é acometido pôr doenças. No laboratório são

executados exames de vários paciente ao mesmo tempo, torna-se imprescindível que

uma sistematização bem organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de

um modo geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados.

Cuidados técnicos e de assepsia são também necessários a fim de evitar a

contaminação do paciente, do operador e do sangue colhido. A coleta é feita de

preferencia pela manha, com o paciente em jejum.

Muitos são os meios para obtenção do sangue usado para o exame

hematológico, como pôr exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial, punção da medula

óssea de ossos como o externo, tíbia, ilíaco e usado na maioria das vezes o venoso e o

capilar.

2.1 Sangue Venoso

A sua obtenção é feita pela função das veias mais acessíveis. As que são mais

facilmente funcionadas localizam-se nas regiões do antebraço (veia mediana, cefálica e

basílica), do pescoço (jugulares internas e externas) e inguinais (femural). Na criança,

também se realiza na região da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia é a preferida

nos exames rotineiros, pois apresenta freqüentemente bom calibre e sua função é

pouco dolorosa. Antes da punção, avalia-se a orientação do vaso pela visualização ou

pela palpação digital e fazer a agulha penetrar e aprofundar nessa direção.

2.2 Sangue capilar

É freqüente usado em crianças quando se empregam micrometodos ou em adultos

para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia e citoquimica celular. A

coleta se faz após punção da polpa digital dos dedos ou dos grandes artelho, na

criança. Pode-se ainda utilizar a regiões laterais do calcanhar, nos recem nascidos.

3. RECEPÇÃO AO PACIENTE

O paciente é recebido com cortesia e cordialidade; explicando os procedimentos aos

quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe tranqüilidade e segurança.

A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com seu cadastro,

confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados pelo paciente. A mesma

separa e identifica, na frente do paciente os tubos que serão utilizados para o material.

3.1 Condições para a coleta

Sala bem iluminada e ventilada;

Pia;

Cadeira reta com bracadeira regulável ou maca;

Garrote;

Algodão hidrófilo;

Álcool etílico a 70% ou álcool iodado a 1%;

Agulhas e lancetas descartáveis;

Sistemas a vácuo: suporte, tubo e agulhas descartáveis;

Tubo de ensaio com tampa;

Etiquetas para identificação de amostras;

Caneta;

Caixa descarpack;

Jaleco e mascara;

Luvas descartáveis;

Estantes para tubos.

3.2 Identificação da amostra

Identificam-se os tubos para colocação da amostra. Escreva na etiqueta os dados do

paciente: nome, numero do registro, data da coleta.

3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso

Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. Não tocando na

parte inferior da agulha;

Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar;

Ajusta o garrote e escolha a veia;

Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodão umedecido em álcool a 70% ou

álcool iodatdo a 1%. Não tocando mais o local desinfetado;

Retira a capa da agulha e faz a punção;

Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou cefálica, atingida a veia, aspira o

sangue;

Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em crianças coleta 2 A 5 ML;

Retira o garote e em seguida a agulha;

Comprime o local puncionado com algodão embebido em álcool;

Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos, quando for

transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita suavemente para facilitar a

mistura do sangue como anticoagulante;

Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante. Escorrer

delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este procedimento evita a hemolise da

amostra. Descarta as agulhas e seringas nas caixas de descarpack;

Orienta o paciente a pressionar com algodão a parte puncionada, mantendo o

braço estendido, sem dobrá-lo;

3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar

Faz assepsia da poupa digital com álcool iodado.

Deixar secar.

Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a primeira gota

de sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodão seco;

Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve pressão somente

quando necessário;

Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua pós capilaridade;

Limpar o dedo com algodão e aplicar anti-séptico.

Anticoagulantes.

O sangue é coletado com a proporção correta de Anticoagulantes utilizados.

EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.

Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue.

Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.

Citrato de sódio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue.

3.6 Biossegurança na coleta

Todo cuidado é pouco na manipulação de materiais biológicos, tais como soro,

sangue, secreções, fluidos orgânicos, tecidos, etc. Redobra-se as precauções, pois

esses materiais são potencialmente infectantes e muitas vezes estão contaminados

com agentes estiologicos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda

desconhecidos.

Usa-se sempre Equipamento de Proteção Individual (EPI): jaleco longo de

mangas compridas e punho retratil, luvas descartáveis evita a formação e dispersões

de aerossóis são micro partículas solidas e liquidas com dimensões aproximadas entre

0,1 e 0,5 micra que podem, no caso de conter microorganismos, permanecer em

suspensão e plenamente viáveis pôr varias horas.

Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento é uma das principais causas

da contaminação de profissionais de saúde por microorganismos, existentes no sangue

e em outros fluidos orgânicos, como por exemplo, o vírus da Hepatite B e o HIV. Após a

coleta é descartado esse material diretamente em caixas descarpack.

Reduz ao máximo o manuseio de resíduos, em especial os pefurocortantes.

Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em caixas descarpack.

4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAIS

Os laudos estão disponíveis no prazo acertado com o paciente, se por algum

motivo isto não for possível, há uma justificativa e, sempre que possível, o paciente é

informado no mais curto prazo possível.

Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente à vida do paciente, o

laboratório informa ao médico assistente e/ou ao responsável pelo paciente.

O laudo é datado e assinado por profissional legalmente habilitado com o seu

nome completo e legível, e o número do registro no conselho profissional.

4.1 Exames

Nome do exame;

Material utilizado;

Método;

Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de alerta;

Informações necessárias à interpretação dos resultados, quando indicada;

Conclusões, quando indicadas.

EXAMES DE SANGUE

Acido urico

Capac. Total de lig. do ferro

Albumina

Cetonemia

Colesterol fracionado:

HDL

LDL

VLDL

Aldolase

Cloretos

Ferro – colher pela amanhã

Amilase

Creatinina

Triglicérides

Bilirrubinas

Eletroforese de proteínas

Uréia

Cálcio

Fosfatase acida

Colesterol ( sem fracionamento)

Fosfatase alcalina

CPK total

Fósforo

CK – MB

Frutosamina

Gama GT

Glicose

Hemoglobina glicosilada

Lipase

Potássio

Magnésio

Sódio

Mucoproteinas

Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT

Velocidade de hemossedimentação (VHS)

Hemograma

Curva de fragilidade osmotica

Plaquetas

Tempo de protrombina

Tempo de tromboplastina parcial ativada – PTTa

Reticulocitos

Eletroforese de hemoglobina

Pesquisa de drepanócitos

Alfa 1 Glicoproteína acida

Fator reumatoide

Grupo sangüíneo e fator Rh

VDRL

Proteínas C reativa

Anti HBs

Anticorpos antireoidianos:

- antireoglobulina

- antimicrossomal

Antiestreptolisina O

- Monoteste

- Paul Bunnell Davidsohn

- Epstein Baar (IFI ou ELISA)

- Anti VCA – IgG e/ou IgM

Fan

HbeAg

Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI – HAI

HbsAg (Antigeno australia)

Chagas (T. Cruzii): - IFI – HAI – ELISA

HAV IgG/ IgM

Anti Hbe

Citomegalovírus IgG/IgM

HIV 1 e 2

EXAMES DE URINA ROTINA

1) Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o número de registro do mesmo.

2) Da as seguintes instruções ao paciente:

2.1 - Colher a primeira urina da manhã

2.2 - Antes de colher a urian, fazer um asseio com água e sabão na genitália

externa.

2.3 – Desprezar as primeiras porções da urina e colher o restante no frasco coletor

recebido do Laborátorio.

2.4 - Trazer imediatamente para o Laboratorio dentro do laboratório dentro do

horário previsto para recebimento de material ( 7:30 às 10:00 hs, manhã ).

Obs: Paciente Os sexo feminino não devem colher urina no período menstrual.

3) - Paciente feminino não deve coletar a urina no dia em que fizer Exame de

Conteúdo vaginal, pois a paciente deverá estar sem asseio e para a coleta de urina

terá que assia-se antes.

EXAMES PARASITOLÓGICO FEZES

1) Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o numero de registro do mesmo.

2) Colher o material e trazer para o Laboratorio no horário estipulado ( 7:30 às 10:00

hs).

3) Se houver dificuldade de colher o material pela manha no dia do exame marcado,

pode colher na véspera e colocar na geladeira o frasco coletor.

EXAMES DE SECREÇÃO VAGINAL E SECREÇÃO URETRAL

1) Se a paciente também tiver que realizar exame de URINA, o exame de Secreção

devera ser realizado no outro dia.

2) Para fazer exame de Secreção Vaginal a paciente deve vir ao Laboratorio sem

tomar banho ou sem realizar qualquer tipo de asseio.

3) Não manter relação sexual 24 hs antes da realização do exame, abstinência

sexual de 24 hs.

5. ENTREGA DE RESULTADO

1) Os exames de paciente particulares e SUS ficam no arquivo colocados em

ordem alfabética.

2) Os exames de paciente atendidos pelo hospital são entregues ao mesmo

colocados no prontuário.

3) Observa-se o nome completo, idade do paciente.

4) Confere se o nome do paciente no exame com o nome que está na requisição.

5) Retira-se o resultado e entrega ao paciente

6. EXAMES INCOMPLETOS

1) O exame só será liberado quando o paciente trouxer o restante do material para

complementar os tipos de exames que constam da requisição médica.

2) Solicitamos ao paciente que traga no máximo ate 48 hs. Após as analises

efetuadas, o exame é liberado normalmente.

Setor de Lavagem e Esterilização

PROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRÔES (POP)

A importancia de uma boa descontaminação de materiais (ESTERILIZAÇÃO) é peça

imprescindível para um melhor desempenho dos trabalhos a serem executados em um

laboratório de analises clinicas. O processo de esterilização o começo de tudo, sem a

mesma os resultados não serão satisfatorios. Faremos uma descrição dos métodos que

são utilizados para a esetrilização dos materiais do laboratorio.

1 OBJETIVOS

1.1 Gerais

Tomar conhecimento dos cuidados na manipulação de materiais contaminados.

Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem empacotamento e

esterilização de materiais reaproveitaveis.

1.2 Especificos

Uns dos objetivos mais importantes, é o conhecimento de como se deve usar as

maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAÇÃO E

TAMBÉM O DEIONIZADOR.

2. EQUIPAMENTO B´SICOS

Autoclave

Estufa de secagem

Estufa de esterilização

Deionizador

OBS: Há de se destacar também os materiais usados no processo de lavagem. São

estes:

Sabao

Hipoclorito 1%

3 METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS:

1. O 1º passo é colocar o material contaminado (coágulos e urina) são colocados

em frascos plásticos contendo hipoclorito a 1%, pôr duas horas vida média do

hipoclorito.

2. 2º passo os materiais reutilizáveis ex: vidrarias são colocados no hipoclorito a

1% pôr 30 minutos,

3. 3º passo sabão dextran pôr mais 30 minutos,

4. 4º passo lava-se em água corrente pôr 30 minutos,

5. 5º passo mais 30 minutos de molho em água deionizada,

6. 6º passo são colocados na estufa de secagem.

Matérias da microbiologia

1. Os materiais contaminados são colocados na autoclave pôr 45 minutos à 121ºC

2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos passos a partir do 3º

descrito acima;

3. Após a secagem, leva o material para o balcão de empacotamento e lá,

definitivamente separado. Ex: plástico, vidro, etc.

4. Depois de separado, o material é colocado na estufa de auto precisão para

esterilização com fita teste. Deve-se salientar que materiais plásticos não devem ir para

a estufa de esterilização, pois a mesma os danificará, devido sua alta temperatura que

gira em torno de 180ºC. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilização é

de 2 hs. E com relação ao material plástico este e embalado e colocado na autoclave

de 15 a 20 minutos.

OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos verificar a fita

teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos esses passos, nós faremos

uma boa esterilização, pois a mesma os danificará, devido sua alta temperatura que

girar em torno de 180ºC. O tempo que o material deve ficar na estufa de esterilização é

de 2 hs. E com relação ao material plástico este e embalado e colocado na autoclave

de 15 a 20 minutos.

É importante compreender a importancia da esterilização em todo o processo

de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos essenciais

(AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAÇÃO E SECAGEM E DEIONIZADOR), e

procedimentos de lavagem e descontaminação de materiais.

4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADO

Deve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no laboratorio, que

são aqueles despejos em estado sólido, semi-solido, liquido ou pastoso, apresentando

características de toxidade e/ou atividade biologica, que podem afetar direta ou

indiretamente os seres vivos ou causar contaminação das aguas, do ar e do solo.

Procedimento para com os materiais.

Agulhas (e capilares de hematócrito): Uma vez terminada a coleta do

sangue-amostra são desprezadas em caixas descarpack

Seringas: Após o termino da coleta do material, tambem são descartaveis em

caixas escarpack.

Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser descartados

em sacos de lixo branco e reforçados para posterior coleta pôr serviço especializados.

Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.: Proceder da

forma descrita acima.

Urina: Acrescentar uma parte de solução de hipoclotito de sodio a 1%. Deixa

em contatoo pôr 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os frascos devem ser

descaratados em sacos de lixo brancos reforçados para posterior coleta pôr serviços

especializados.

Fezes: descarta em saco de lixo reforçados.

Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus derivados

em um recipiente de plastico resistente. Adicionar solução de hipoclorito de sódio.

Deixar em contato pôr 2 horas. Devido à decomposição do hipoclorito em contato com o

sangue, deve-se adicionar mais hipoclorito, até não haver qualquer formação de

espuma.

Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o material o, a

esterilização em autoclave e descartar em lixo especial.

Lâminas e lamínulas: Não são descartas. Ao recuperá-las são submetidas a

um tratamento hipoclorito de sódio a 1% pôr 30 minutos. Apos o processo, proceder a

lavagem e recuperação.

PROCEDIMENTO DE ROTINA

HEMATOLOGIA MANUAL

HEMATOLOGIA

A hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e coagulação.

Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leucócitos e plaquetas)

permanecem em equilibrio sempre constante devido ao sistema hematopoiético, com

função de formação hemolítica ou de destruição das células sanguineas. (O. LIMA,

1992)

OBJETIVOS

O estudo no Laboratório de hematologia consiste em analisar células

sanguineas e a coagulação atraves de exames hematológicos, podendo assim

qualificar e diferenciar as células sanguineas.

Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo, auxiliando

clínico no tratamento de uma patologia pr deficiencia hematologica.

HEMATÓCRITO

Consiste em determinar em porcentagem a concentração de eritrócitos em

dados volume de sangue não coagula. È a razão entr o voluem deeritrócitos em relação

ao volume do sangue total. (O. LIMA, 1992)

MATERIAIS E MÉTODOS

- Tubo capilar

- Bico de bunsen

- Centrífuga para microhematócrito

- Tabela para microhematócrito

O tubo de microhematócrito é preenchido por capilaridade até ¾ da capacidade do

capilar. A extremidade vaziaé vedada pela chama do bico de bunsen. Colocar os

capilares na centrifuga para microhemat´crito, com o cuidado de coloca a parte aberta

contra o apoio de borracha para evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada fica

voltada para fora. É recomendável um centrifugação a 3.000 RPM/5 minutos.

Após a centrifugação, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o

plasma e uma coluna de eritrócitos. Devem ser medidos com o auxílio da tabela.

HEMOGLOBINA (Hb)

É o principal componente dos eritrócitos. É um conjugado de proteínas que

serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992)


- Tubos para centrífuga

- Padrão (HiCN – Cianetohemoglobina)

- Reagente de Drabkin

Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira:

B P A

Padrão - 20uL -

Amostra - - 20 uL

Reag. de Drabkin 5.0uL 5.0uL 5.0uL

Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos. Leitura a 540

nm no espectrfotômetro. Zerar com o Branco.

ESFREGAÇO

O exame de esfregaço sangüíneo é uma parte importante da avaliação

hematológica. Para obter esfregaços satisfatório, é indispensável que se tome certas

precauções:

- lâminas devem estar limpas e desengorduradas;

- a gota de sangue não deve ser muito grande. Quanto maior a gota, mais

espesso o esfregaço. O ideal é uma gota de 20uL;

- O esfregaço deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a coagulação. (O.

LIMA, 1992)


- Lâminas limpas e desengorduradas

- Lâminas de extensão (extensora)

Colocar uma gota de sangue no final de uma lâmina apoiada em uma superfície

plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da lâmina de extensão contra a

superfície da primeira lâminas. Empurra-se a lâmina de extensão a uma velocidade

moderada para frente até que o sangue tenha sido espelhado em um esfregaço

moderadamente delgado. As lâminas devem ser secas a temperatura ambiente e

depois corada para análise ao microscópio.

È conveniente confeccionar vários esfregaços ao mesmo tempo. Marcar

sempre os esfregaços usando agulha ou lápis dermográfico com o nome do paciente e

a data sobre a superfície do mesmo.

COLORAÇÃO

Os corantes de anilina usados em esfregaços sanguineos são de duas classes

gerais:

- corantes básicos, como o azul de metileno;

- corantes ácidos, como a eosina.

O núcleo das células toma as cores básicas, como o azul de metileno, enquanto

que os corantes básicos agem sobre os elementos citoplasmáticos. Pertencem a este

grupo os corantes de Romanowsky. Os derivados mais usados do corante primitivo de

Romanowsky são: Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o

corante Leishman. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Suporte para lâminas

- Corante de Leishman

Colocar a lamina sobre o suporte. Verter 20 gotas do corante sobre a lamina ou

o suficiente para cobri-la. O álcool metilico (metanol) da solução corante fixa o

esfregaço.

Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em água corrente e deixar secar.

Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

CONTAGEM GLOBAL

A contagem dos elementos morfológicos do sangue (eritrócitos, leucócitos e

plaquetas deve ser efetuado pala manhã. Consiste em trabalhar com material aferido

com a finalidade de determinar o número dos elementos morfológicos. Para isso, é

necessário diluir volume conhecido de sangue com determinada quantidade de líquido

diluidor. Conta-se as células na área reticulada da câmara destinada para cada tipo de

células (ver Anexos) (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Câmara de Contagem (Camara de Neubauer)

- Líquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amônia 1%)

- Pipetas graduadas e automáticas

- Lamínulas

Contagem Global de Leucócitos

Valores de Referencia:

5.000 – 10.000 mm3

- 0.38 mL do líquido de Turk

- 20uL sangue

- Diluição = 1/20

Depois de homogeneizar o líquido de Turk com o sangue, umedecer a câmara de

líquido de Turk com o sangue, baixo da lamínula, inserir com auxílio da pipeta

automática pequena quantidade da solução diluída. Cuidado para evitar presença de

bolhas. Esperar 5 minutos a fim de que os glóbulos se depositem. Observar ao

microscópio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa

objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a leucócitos.

Contagem Global de Plaquetas

Valores de Referêncisa:

150.000 – 400.000 mm3

- 0.38 mL oxalato de amôni 1%

- 20uL sangue

- Diluição = 1:20

Depois de homogeneizar o oxalato de amônia 1% com o sangue, umedecer a

câmara de Neubauer e cobri-la com lamínula. Pôr baixo da lamínula, inserir com o

auxilio da pipeta automática pequena quantidade da solução diluída. Cuidado para

evitar presença de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas se depositem.

Esperar em câmara úmida. Observar ao microscópio primeiramente com a objetiva de

menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes

destinados a plaquetas, que são os mesmo para contagem de eritrócitos.

VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS)

É a velocidade com o qual os glóbulos vermelhos vão para o fundo do tubo. Os

glóbulos vermelhos que sedimentam é porque a sua densidade é maior que a do

plasma. A velocidade com que eles sedimentam é porque a sua densidade é maior que

a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam varia, direta ou indiretamente com

vários fatores. (O. LIMA, 1992)


- Tubo de Westergren

- Estante de westergren

O método de Westergren modificado produz os mesmos resultados que o método de

Westergren original, mas emprega sangues naõ coagulado com EDTA ao invés de

citrato. Isso permite que o VHS seja realizado com a mesma amostra de sangue que os

outros estudos hematológicos.

2 mL de sangue com EDTA bem misturados são diluídos em 0.5 mL de cloreto de

sódio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sódio a 3.8%. Uma pipeta de Westergren é

completada até a marca 0 (zero) e colocada exatamente na vertical na estante à

temperatura ambientem, sem vibrações ou exposição direta à luz solar. Após

exatamente 60 minutos, a distancia do topoo da coluna é registrda em molímetros como

o valor da VHS. Se a demarcação entre o plasma e a coluna de células vermelhas é

distinta, o nível é lido onde a densidade total aparece primeiro.

Valores de Referência:

Homens: 3-15 mm

Mulheres: 3-20 mm

Crianças: 3-12 mm

CÉLULAS LE (Lupus Eritematoso)

Um anticorpo presente na fração globulina gama do soro dos pacientes de LES,

o chamado fator “LE”, reage com a nucleoproteína dos núcleos dos leucócitos. O

núcleo do fagócito acha-se comprimido na periferia da célula. A maior parte da região

protoplasmática é ocupada pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se à

estreita faixa na periferia do leucócitos. Na células “LE”, a estrutura da cromatina é

substituída pôr massa arredondada, homogênea, de coloração púrpura, de tamanho

variável, mas usualmente maior que a hemácia. O fagócito pode englobar mais de

núcleo. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Banho Maria a 37ºC

- Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a

37ºC/2hs. Depois realiza-se o esfregaço e observa-se ao microscopio. Deve-se

sempre realizar o exame FAN junto com o exame de células LE.

CONTAGEM DE RETICULÓCITOS

Os reticulócitos são células vermelhas imaturas não nucleadas que contêm

RNA e continuam a sintetizar hemoglobina após a perda do núcleo. O sangue incubado

rapidamente em uma solução de azul cresil brilhante ou azul metileno. No RNA é

precipitado como um complexo corante ribonucleoproteínas. O complexo aparece

microscopicamente como uma rede azul escura ou grânulos azuis escuros que

permitem a identificação e contagem de reticulócitos. (O. LIMA, 1992)

MATERAIS E MÉTODOS

- Esfregaço sangüíneo

Conta-se o número de reticulócitos em 10 campos diferentes. O esfregaço é feito a

partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil brilhante.

Valores de Referências:

0.5 - 2.0%

10 campos = total / 10 = número %

COAGULOGRAMA

Tempo de Sangria (TS)

É o tempo necessario para a cessação da hemorragia, ocasionando por

pequena incisão, de dimensão padronizada, praticada artificialmente. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Equipamento para punção digital

- Papel de filtro

- Cronômetro

Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lóbulo da orelha com a lanceta, fazer a

incisão e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no cronometro o início no

momento do aparecimento da primeira gota. Com o papel de filtro absorver de 30

em 30 segundos a gota de sangue formada sem tocar a incisão. Quando cessar o

fluxo de sangue, parar o cronômetro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar

cronômetro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota

representa do tempo de sangria.

Valores de referência:

1 – 6 minutos

Tempo de Protrombina Ativada (TAP)

É a prova de escolha para investigação do sistema extrínseco da coagulação

sangüínea. É uma prova de grande valor na demonstração de deficiência dos fatores de

coagulação I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Plasma citratado do paciente

- Solução de tromboplastina

- Banho Maria a 37°C

- Tubos de ensaio

- Solução de cloreto de cálcio a 0.025M

Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da suspensão de

tromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar rapidamente 100uL da

solução de cloreto de cálcio. Neste instante, acionar o cronômetro. Retirar o tubo do

BM e agitá-lo suavemente, de 2 em 2 segundos, até o aparecimento do coágulo,

parando simultaneamente o cronômetro. O tempo consumido em segundos constitui

o TAP.


11 – 13 segundos

Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

É a melhor prova para investigar as alterações do mecanismo da coagulação

sangüínea. Fatores que participam do sistema intrínseco estão envolvidos, com

exceção das plaquetas e do fator XIII, bem como do fator VII, do sistema extrínseco. (O.

LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Plasma citratado do paciente

- Solução de tromboplastina parcial

- Banho Maria a 37°C

- Cronômetro

- Tubos de ensaio

- Solução de cloreto de cálcio a 0.025 M

Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente. Homogeneiza e

encuba em Banho Maria a 37°C/3 min. Após esse tempo, adicionar rapidamente

100uL da solução de cloreto de cálcio. Neste instante, acionar o cronômetro. Agitá-

lo suavemente, de 5 em 5 segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e

agitá-lo suavemente, observando o aparecimento do coágulo, parando

simultaneamente o cronômetro. O tempo consumido em segundos constitui o TTPA.


35 – 45 segundos

CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS

Consiste em determinar a proporção existente entre as distintas variedades de

leucócitos. A contagem diferencial de leucócitos é dos mais valiosos métodos entre os

exames citológicos do sangue. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS

- Esfregaços corados

Deve-se observar a lâmina próximo à cauda o esfegaço onde quase não se

encontra “roleaux” e facilita a contagem. Total de 100 células.

FIBRINOGÊNIO


- Tubo capilar

- Plasma

- Microcentrífuga

- Tabela de Hct

- Banho Maria a 56°

Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a 56ºC/15 minutos.

Leva-se à centrífuga para microhematócrito por 5 minutos / 3000 RPM. Faz-se a leitura

na tabela para Hct e multiplica o resultado por 92.


200 – 400 mg/dL

INDÍCES HEMATIMÉTRICOS

VCM = Hct / Hem x 100 u3

HCM = Hb/ Hem x 100 pg

CHCM = Hb / 100%

PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA

MANUAL

SOROLOGIA

O melhor diagnóstico de um processo infeccioso é a demonstração do

patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Nem

sempre é possivel essa prática pela ausência do agente infeccioso ou pela pocua

sensibilidade dos métodos ou por longos períodos exigidos para uma resposta

laboratorial.

Métodos parasitológicos ou microbiológicos são deficientes para diagnóstico de

algumas patologias. São utilizados métodos imunológicos, sorológicos ou

imunoensaios. São técnicas para a detecção e quantificação de Ag ou Ac, podendo

utiliza-se de reagentes marcados ou não. Comumente são utilizados marcadores

radiotaivos, enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes.

Os testes sorológicos são feitos através de pesquisas de anticorpos pu

antígenos, sendo a reação Ag – Ac, visualizada pôr alguns métodos como aglutinação,

precipitação, floculação e outros. Esses testes de pesquisa de Ag – Ac desempenham

uma importante função de diagnóstico laboratorial clínico como complemento de outros

testes e provas, desde que sejam respeitadas suas indicações e limitações.

OBJETIVO

No setor de sorologia, o principal é demonstrar aos estagiários os princípios das

técnicas mais usadas nos testes sorológicos, assim sua importância e identificação.

A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no setor de

triagem sorológica para seleção de pacientes que podem vir a ser doadores e recptores

de orgãos, evitando transtornos pós-transfusionais.

A Ciência Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos

específicos auxiliando, assim, no diagnóstico individual de determinadas patologias com

também diferenciando as fases da doença.

Imunodifusão Radial Simples

- Príncipio – Antígeno ou Anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se

difunde, até haver um halo de precipitação formado pôr reação de Ag com o Ac ao

redor da inoculação.

- Materiais e Métodos – Toma-se uma placa com gel (ágar misturado com a diluição

apropriada de Ag específico para Ac determinado) contendo orifícios onde, com ajuda

da micropipeta, será adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em forma

invertida em câmara úmida, para que mantenha o meio úmida, pôr 48h a 72h.


IgG: 710 – 1520 mg/dL

IgM: 90 – 310 mg/dL

AGLUTINAÇÃO

A reação de aglutinação é caracterizada pela formação de agregados visíveis

como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que

contêm determinantes antigênicos em sua superfície.

A aglutinação pode ocorrer tanto com particulas que apresentam determinadas

antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como

com partículas inertes (látex, poliestireno, etc.), ou mesmo com células antigenicamente

não relacionadas (hemácias, bactérias) às quais se absorvem ou se fixam antígenos

solúveis.

As reações podem ser de aglutinação direta ou indireta.

A) TESTE DA AGLUTINAÇÃO DIRETA

- Princípio – Aglutinação de partículas antigênicas insolúveis, em sua forma

íntegra ou fragmentada, na detecção de anticorpos específicos. Teste bastante utilizado

para classificação sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose.

- Materiais e Métodos –

Bruceloso (Antígeno Rosa Bengala): é uma suspensão de bacilozs em

coloração rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo Ag – Ac se

aglutina.

Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota do soro do

paciente com o reagente que contém hemácias de cavalo (ag para mononucleose mais

Ac heterófilos).

Observa-se a presença de aglutinação. Como os anticorpos heterófilos, que

não são específicos para o vírus Epstein-Barr, podem aglutinar as hemácias de cavalo,

para o teste positivo realiza-se uma Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com células

renais de cobaia, as quais removam quase todos os anticorpos heterófilos da

mononucleose infecciosa.

B) TESTE DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA

- Princípio – As hemácias e as partículas inertes podem ser sensibilizadas por

adsorsão passiva, devida aos contatos direto com os Ag solúveis. São utilizados como

suportes na adsorção de proteína solúvel e Ag polissacarídeos, funcionando como

sistema indicador da reação Ag-Ac.

AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX

PCR (Proteína C Reativa): reação de aglutinação em lâminas, a qual particulas

de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas são aglutinadas em presença da

Proteína C Reativa.

- Materiais e Métodos -

a) Determinação Qualitativa: Numa lâmina de vidro, com àreas para diferentes

testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisões, 1 gota de soro positivo, 1 gota de

soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do reativo

látex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotação procedendo a

leitura após cinco minutos.

b) Determinação Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva, realizar

sucessivas diluição do soro até que se encontre a maior diluição que ainda fornece

aglutinação. O procedimento da análise é o mesmo do teste qualitativo, porém, utiliza-

se as amostras diluídas. Sendo a sensibilidade do teste de 7UI/mL, o cálculo semi

quantitativo é realizado da seguinte forma:

[ ] = 7 x (maior diluição positiva)

FR (Fator Reumatóide)


a) Determinação Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em uma área da

lâmina e , sobre ela, 1 gota da suspensão de látex sensibilizado com IgG humana

altamente purificada e estabilizada e suspensa em tampão glicina. Proceder da mesma

forma com os soros controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotação,

sob uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formação de aglutinação.

b) Determinação Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, realizar

sucessivas diluições do soro até que se encontre a maior diluição positiva. O cálculo

semi quantitativo é realizado da seguinte forma:

[ ] = 25 x (maior diluição positiva)

ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reação de aglutinação em lâminas, a qual

partículas de látex sensibiladade com estreptolisina “O” estabilizada são aglutinadas em

presença de anti-estreptolisina. O reativo é padronizado pôr comparação com o padrão

da OMS.

- Materiais e Métodos-

a) Determinação Qualitativa: Numa lâmina de vidro, com áreas para diferentes

testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisões, 1 gota de controle positivo, 1 gota

de controle negativo e1 gota do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do

latex sensibilidade com ASO. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotação.

Proceder a leitura em exatamente 2 minutos.

b) Determinação Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a partir da

diluição 1/20, realizar sucessivas diluições de razão 2 a té 2560 em tampão glicocola. O

procedimento da análise diluídas. O título de Ac ASO é calculado da seguinte forma:

UI/mL = inverso da última diluição positiva x 10.

HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA

Hemácias estão entre os melhores suportes de Ag para os testes de

aglutinação, pois uma serie de Ag que pode ser ligada à sua superfície para fornecer

um sistema indicador sensível na detecção de Ac, porém, sua superfície é complexa,

facilitando a ligação de muitos Ag e, frequentemente, acarreta a presença de Ac

heterófilos que devem ser removidos antes da execução do teste.

CHAGAS

- Princípio – Eritrócitos de aves estabilizados, sensibilizados com compontes

antigênicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinação quando

reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.


a) Determinação Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano úmido para

neutralizar as forças eletrostáticas. Usar 1 cavidade da placa pôr amostra, incluindo

sempre os controles positivo e negativo. Usar diluição do soro 1/32 com a solução

diluente com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da suspensão

homogênea de hemácias placa. Adicionar 25uL da suspensão homogênea de hemácias

em cada cavidade. Agitar a placa pôr vibração mecânica pôr 4 minutos. Deixar em

repouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em locar livre de vibrações. Fazer a

leitura. Reação positiva como um tapete e reação negativa quando se depositam no

fundo da cavidade formando um botão.

b) Determinação Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar

sucessivas diluições (titulação) a partir da diluição do soro de 1/32. Pipetar 25uL da

solução diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, até a

diluição que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluição, desprezar

os últimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em todas as

cavidades. Agitar a placa pôr vibração mecânica por 4 minutos. Deixar em repouso pôr

1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura.

TOXOPLAMOSE

- Princípio – Eritrócitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes

antigênicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados, mostram aglutinação quando

reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.


a) Determinação Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano úmido para

neutralizar as forças eletrostáticas. Usar cavidade da placa por amostra, incluindo

sempre os controles positivo e negativo. Usar diluição do soro 1/16 com a solução

diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e negativo.

Transferir 25uL da diluição 1/16 de cada amostra e controles para as respectivas

cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em cada

cavidade. Agitar a placa pôr vibração mecânica pôr 4 minutos. Deixar em repouso por 1

a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura. Reação

positiva quando as hemácias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e

reação negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um botão.

b) Determinação Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar

sucessivas diluições (titulação) a partir da diluição do soro de 1/32. Pipetar 25uL da

solução diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, até a

diluição que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluição, desprezar

os últimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em todas as

cavidades. Agitar a placa por vibrações mecânicas pôr 4 minutos. Deixar em repouso

pôr 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura.

FLOCULAÇÃO (VDRL)

O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de

colesterol que são sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de Ac na sífilis. É

classificado como um teste não treponêmico, usado como triagem ou controle da cura.

- Princípio – Reação imunológica de floculação utilizando antígeno de

cardiopina, lecitina e colesterol em solução alcoólica, onde as partículas de Ag floculam

ao entrar em contato com o soro ou plasma (reagina).


a) Determinação Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e eliminação dos soros

não reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas cavidades

devidamente identificadas para cada reação. Pipetar 50uL da amostra a ser analisada e

dos soros controle positivo e negativo. Adicionar-se 25uL da suspensão antigênica à

cada cavidade, que irá reagir com os Ac presentes. Colocar lâmina em agitador

mecânico pôr 4 minutos. Fazer leitura em microscópio com objetiva de 10x.

b) Determinação Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a pequenos

intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para tanto, deverá ser feita

diluição da amostra em solução salina. Proceder cada diluição do mesmo modo como

no teste qualitativo. O título da amostra será o da última diluição onde ainda se visualiza

a presença de agregados.

UROANÁLISE

Com a análise da urina, iniciou-se a medicina laboratorial. Foram encontrados

hieróglifos egípcios com desenhos de médicos examinado frascos de urina em forma

de bexiga. Muitas vezes, esses médicos nunca viam o paciente, apenas sua urina.

Embora não contasse com os sofisticados métodos atuais, eram capazes de obter

informações diagnósticas a partir de observações básicas como cor, turvação, odor,

volume, viscosidade e até mesmo presença de açúcar, ao observarem que certas

amostras atraíam formigas. É interessante notar que essas mesmas características

urinárias ainda são relacionadas pêlos laboratórios hoje em dia. Contudo os modernos

métodos de uroanálise ampliam seu campo de ação, abrangendo não só o exame físico

mas também a análise bioquímica e o exame microscópico do sedimento urinário.

(STRASINGER, 1998)

Analisaremos também o LCR (Líquido Cefalorraquidiano). Trata-se de um

sistema fisiológico destinado a distribuir nutrientes pelo tecido nervoso, retirar resíduos

metabólicos e servir de barreira mecânica para amortecimento dos traumatismos que

porventura atinjam o encéfalo e a medula espinhal. (STRASINGER, 1998).

Por fim, faremos também uma análise do líquido seminal. Com exceção da urina,

é o líquido recebido com mais freqüência em laboratórios de análises clínicas. As duas

principais razões para sua analise são avaliações de casos de infertilidade e do estado

pós-vasectomia. (STRASINGER, 1998)


COLETA (STRASINGER, 1998)

URINA – A amostra deve ser colhida em recipiente limpo e seco.

Recomenda-se o uso de recipientes descartáveis por serem econômicos e pôr

eliminarem a possibilidade de contaminação decorrente de lavagem incorreta.

O recipiente de amostra deve ser devidamente etiquetado, contendo data e

nome do paciente. As etiquetas devem ser postas sobre o recipiente e não sobre a

tampa.

A amostra deve ser entregue imediatamente ao laboratório e analisada

dentro de uma hora. A amostra que não puder ser entregue ou analisada dentro desse

tempo devera ser refrigerada ou receber conservante químico apropriado.

LCR – O LCR é normalmente colhido por punção lombar entre L3 e L4 ou

entre L4 e L5. As amostras geralmente são colhidas em tubos estéreis, marcados 1,2 e

3, na ordem em que são obtidos. O tubo 1 é usado par análises bioquímicas e

sorológicas, o tubo 2 destina-se á contagem celular e o tubo 3 em geral é usado par a

microbiologia, por ser o que menos probabilidade tem de conter células introduzidas

acidentalmente pelo procedimento de punção espinhal.

SÊMEN - Como a composição das frações do sêmen é variável, sua coleta

deve ser bem feita para que a avaliação da fertilidade masculina seja precisa. Para

isso, os pacientes devem ser bem orientados. As amostras devem ser colhidas em

recipientes estéreis após três dias de abstinência sexual. Não é recomendável o uso de

preservativos o uso de preservativos na coleta de amostras para os exames de

fertilidade, pois podem conter substancias espermaticidas. Sempre que possível, a

amostra deve ser colhida em laboratório, mas se isso não for viável, deverá ser mantida

em temperatura ambiente e entregue em até uma hora ao laboratório. Deverá ser

anotada a hora da coleta e não do recebimento.

CONSERVAÇÃO (STRASINGER, 1998)

URINA - O método de conservação mais utilizado é a refrigeração, capaz de

evitar a decomposição bacteriana da urina pelo período de uma noite. É preciso deixar

que a amostra volte à temperatura ambiente antes da análise química com fitas

reativas. Existem várias conservantes químicos que podem ser utilizados, portanto é

impossível escolher aquele que se ajuste melhor às necessidades da análise solicitada.

LCR - Amostras destinadas a outras análises bioquímicas e sorológicas devem

ser congeladas. O líquor da seção de hematologia deverá ser refrigerado se não for

possível fazer contagem celular do mesmo em uma hora; o da microbiologia mantido à

temperatura ambiente e analisado o mais depressa possível.

URINA TIPO I (STRASINGER, 1998)

TÉCNICA

- Num tubo uroanálise, colocar 10 mL de urina.

- Passar a fita reativa e anotar os resultados. Onde for positivo, colocar a

alteração.

- Calibrar o tubo e centrifugar a 2500 RPM por 5 minutos.

- Inverter o tubo no container até que reste 1 ml.

- Contar na câmara de Neubauer.

EXAME FÍSICO E FITA REATIVA

Analisa-se macroscopicamente alguns aspectos da urina. Mergulha-se a fita na

urina e através de uma reação de cor analisada-se os seguintes itens:

- Cor: Varia de amarelo claro a âmbar.

- Aspecto: Varia de levemente turvo a fortemente turvo.

- pH: Embora um indivíduo sadio geralmente produza a primeira urina da

manhã com pH ligeiramente ácido, entre 5.0 e 6.0, o pH normal das outras amostras do

dia podem varias de 4.5 a 8.0.

- Densidade: É uma medida da densidade das substâncias químicas dissolvidas

na amostra. Geralmente é medida na fita reativa ou pelo refratômetro. A densidade

normal da urina varia de 1.010 a 1.030.

- Proteínas: A constatação de proteínas nem sempre significa doença renal,

mas sua presença realmente exige a realização de outras análises para verificar a

normalidade ou anormalidade do quadro.

- Glicose: devido à sua utilidade na detecção e no controle do Diabetes melito, o

teste de glicosúria é a análise bioquímica realizada com maior freqüência na urina.

- Corpos cetônicos: Normalmente não aparecem em quantidades mensuráveis

na urina, pois toda gordura metabolizada é completamente degradada e convertida em

dióxido de carbono e água.

- Sangue: Pode estar presente na forma de hemácias íntegras ou de

hemoglobina. Se encontrar Hemoglobina e mioglobina na câmara, terá que aparecer na

fita. Daí pesquisa-se sangue oculto.

- Bilirrubina: Sua presença pode ser a primeira indicação de hepatopatia, e

muitas vezes é detectada bem antes do desenvolvimento de icterícia.

- Urobilinogênio: É um pigmento biliar resultante da degradação da

hemoglobina. Aparece na urina porque, ao circular no sangue a caminho do fígado,

pode passar pelos rins e ser filtrado pêlos glomérulos.

- Nitrito: É um método rápido de detectar infecções do trato urinário.

EXAME QUÍMICO E SEDIMENTOSCOPIA

Na câmara de Neubauer, conta-se os 4 quadrantes laterais (eritrócitos) e multiplica por

250 ou conta 1 quadrante e multiplica por 1000. Este último é mais utilizado. Faz-se

isso para contagem de hemácias e leucócitos. Procura-se por:

- Hemácias

- Leucócitos

- Células

- Cilindros: Pode ocorrer em exercícios físicos intensos. Conta-se os 4

quadrantes e multiplica por 110. Os mais encontrados são os epiteliais e os hialinos. Se

tem cilindros, tem proteínas.

- Bactérias: Podem apresentar bactérias nitrificantes e não nitrificantes. Se tem

bactérias, tem leucócitos.

- Leveduras: Ocorre quase sempre em glicosúria e conta-se em cruzes de 1a 4.

- Muco

- Cristais: Caso encontrados, soltar resultados em cruzes de 1 a 4. Em RN é

comum encontrar cristais de urato.

- Outros - Parasitas, espermatozóides, cálculos, artefatos, etc.

TESTES BIOQUÍMICOS

- Proteinuria

2 mL de Ac. Sulfossalicílico a 3%

0,5 mL de urina

Homogeneizar.

Resultado: +

Formação de turvação

- Proteína de 24 hs (Quantitativo)

Homogeneizar a amostra e medir o volume com precisão.

Branco Amostra

Ácido Sulfossalicílico - 2.0 mL

Água destiliada 2.0 mL -

Amostra 0.5 mL 0.5 mL

Homogeneizar, aguardar 10 minutos em TA e verificar a Abs. em 560 nm.

Resultado:

Ptn 24 hs: volume 24 hs x Fator (1.74) x Abs. A

V.R.: até 150 mg/dL

- Proteína Ortostática ou Postural

Ocorre em paciente que permanece, longos períodos sentados ou em pé, onde

os rins são comprimidos pelos órgãos superiores - diminuição da reabsorção de

proteína - proteinuria.

Coleta-se um amostra após o paciente ter permanecido um período sentado (2

hs) - RESULTADO POSITIVO.

Para confirmação, coleta-se uma outra amostra, a primeira da manhã -

RESULTADO NEGATIVO - Ptn Ortostática ou Postural.

- Proteína de Bence Jones

Mieloma múltiplo - Proliferação dos plasmócitos - Liberação de microglobulinas

(Bence Jones) - Baixo peso molecular - Proteinuria.

Levar cerca de 5 mL de urina ao BM 50 - 60ºC e levar ao BM 100º por 5

minutos. Se ficar límpida, confirma-se Proteínas de Bence Jones. Se continuar turvo,

pode ser qualquer outro tipo de proteína.

Característica: Desnatura aos 50-60º C e torna-se límpida aos 100º C. Se der

positivo, confirmar com eletroforese ou contraimunoeletroforese.

- Glicosúria

2 mL de Reativo de Benedict

4 gotas de urina

Homogeneíza. Coloca em banho fervente por 5 minutos.

+ Resultado:

Marron Tijolo: ++++

Verde com sedimento amarelo: +++

Verde sem sedimento amarelo: ++

Verde claro: +

Azul: Negativo

- Corpo Cetônicos

1 mL de urina

6 gotas de Reativo de Imbert

Homogeneizar

Acrescentar 1 mL de hidróxido de Amônia vagarosamente pelas bordas do

tubo.

Resultado

Formação de halo roxo entre duas fases.

URINA TIPO II (STRASINGER, 1998)

Faz-se a análise tipo II geralmente em casos de cirrose, hepatopatias, anemia

hemolítica. Pesquisa-se:

PESQUISA DE HCG (STRASINGER, 1998)

- Gravidez com resultado negativo

Estágio inicial

Gravidez ectópica

Trimestre final da gravidez

- Ausência de gravidez com resultado positivo (raro)

Menopausa - gonadotrofina hipofisária

Endocrinopatias - LH

-Resultado positivo com taxa elevada de HCH

Doenças trofoblásticas:

Mola hidatiforme

Coriocarcinoma

Reação de aglutinação em látex

Imunocromatocráfico (Ac monoclonal)

Observações:

- Esse hormônio aparece primeiramente no soro e, depois da sobrecarga

sanguínea, é excretado na urina.

- No trimestre final pode ocorrer HCG negativo em caso de aborto, com a placenta

inativa.

- Doenças trofoblásticas liberam grande concentração de HCG.

- Pesquisa de HCG em homens: suspeita de CA de testículo.

- Urobilinogênio

2,5 mL de urina

0,5 mL reativo de Erlich

Positivo se forma coloração vermelha. Caso de positivo, realizar diluição

sucessivas, começando com 1,0 mL de urina + 9,0 mL de água destilada. Diluição de

1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160.

Adiciona 1,0 mL de reativo de Erlich.

Resultado:

Urobilinogênio: 1/? EU (Unidade Erlich)

- Pigmentos Biliares

1,0 mL ácido nítrico

1,0 mL de urina, pelas bordas do tubo, vagarosamente.

Positivo se formar um halo verde.

- Pesquisa de Sangue Oculto

Centrifugar 10 mL de urina a 2000 RPM pôr 5 minutos.

Desprezar todo o sobrenadante

Acrescentar 6 gotas do Reativo de Benzidina

Positivo se formar um coloração de azul a verde.

Reativo de Benzidina:

Uma porçãode Benzina

1,0 mL H2O2

1,0 mL de ácida acético 50%

Homogeneizar

Preparar o reativo somente na hora do uso.

HCG de 24 horas

Sucessivas diluição a começar de 1 / 2.

Resultado:

Volume de 24 hs x ultima diluição positiva x 2,5 = ? UI/24 horas

LÍQUIDO CORPORAIS (STRASINGER, 1998)

- ANÁLISES DO LCR

A) Exame físico

Aspecto:

Antes de centrifugar: vermelho / turvo

Depois de centrifugar: deve diferenciar o LCR

Para diferenciar Punção Traumática de hemorragia Intracraniana.

1) Após centrifugação

PT: forma sedimento (botão de hemácias e sobrenadante límpido)

HI: não forma sedimento.

2) Distribuição desigual de sangue nos tubos

PT: a quantidade de sangue vai diminuindo nos tubos.

HI: Os três tubos permanecem vermelho por igual.

3) Formação de coágulo

PT: não forma coágulo

HI: forma coágulo

B) Exames microscópico

a) Contagem Global

- Leucócitos:--- mm³

- Hemácias: 0-5 / mm³; RN.: até 100/mm³

Homogeneizar o material e preencher a câmara de Fuchs Rosenthal.

Contar todos os quadrantes e dividir o número de células contadas por 3.

b) Contagem Diferencial

Concentrar o material e fazer esfregaço com a câmara de Suta.

Corar com Leishman, Wright ou Giemsa.

Contar 100 Células:

- neutrófilos (Meningite bacteriana)

- linfócitos (Menegite viral)

- eosinofilos (Neurocisticercose)

- monócitos (Meningite turbelosa e fúngida)

C) Exame químico

Glicose (60% glicose plasmática)

Proteína: 15 - 40 mg/dL

- ESPERMOGRAMA

A) Fases

1ª fase: Liquefação primária ou virtual

2ª fase: Coagulação (duração até 30 minutos)

3ª fase: Liquefação secundaria. Ausência dessa fase → INFERTILIDADE

B) Contagem Global

Homogeneizar a amostra e diluir em 1/40 (3.9 mL solvente fisiológico + 100uL

de esperma).

Preencher a câmara de Neubauer.

Contar SPTZ em objetiva de 40 X nos quadrantes laterais e central, multiplicar o

número o contado por 80.000.

Se a quantidade de SPTZ for muito elevado, contar apenas o quadrante central

e multiplicar por 400.000.

Resultados expressos em mL. V.R.: 60 milhões/mL

C) Viabilidade

Em um tubo, colocar uma gota de esperma e acrescentar 2 gotas de eosina +

2gotas de nigrosina.

Confeccionar esfregaço e secar rapidamente.

Verificar a quantidade de SPTZ vivos (brancos) e mortos (vermelhos) - Objetiva

de imersão.

Vivos: mais do que 70%

Mortos: menos do que 30%


PARASITOLOGIA

EXAME PARASITOLOGIA DE FEZES

O exame é utilizado no diagnóstico das parasitoses intestinais e tem como

objetivo o encontro de trofozoítas e cistos de protozoários e ovos ou larvas de

helmintos. Um resultado parasitológico negativo não exclui a possibilidade de infecção

por parasitas, levando em consideração a idade da infecção e as "fases negativas" de

determinados parasitas, como a Giárdia lamblia, por exemplo. Os ovos de Taenia sp.

(solitária) e Enterobius vermicularis (oxiúrus) raramente são encontrados nas fezes,

sendo mais comumente encontrados na região perianal.

Os seguintes parasitas intestinais são patogênicos e devem ser erradicados:

- Ascaris lumbricoides

- Capillaria hepática

- Clonorchis sinensis

- Blastocystis hominis

- Cyclospora

- Cryptosporidium (quando em imunodeprimidos)

- Dientamoeba fragilis

- Dipylidium caninum

- Diphyllobotrium latum

- Entamoeba hispolytica

- Enterobius vermiculares

- Giárdia lamblia

- Hymenolepis diminuta

- Hymenolepis nana

- Isospora belli

- Isospora spp.

- Microsporídia

- Progonimus westermani

- Strongyloides stercoralis

- Trichuris trihiura

- Schistosoma mansoni

- Ancilostomideos

Não é necessária medição quando são encontrados os seguintes parasitas não

patogênicos:

- Chilomastix mesnili

- Cryptosporidium (quando em imunocompetendes)

- Endolinax nana

- Entamoeba coli

- Entamoeba hartmani

- Iodanoeba bütschlii

MATERIAL / AMOSTRA

A amostra fecal deve ser colhida diretamente no frasco ou em um urinol, ou

ainda em jornal ou papel limpo, e transferidas diretamente para o frasco coletor. O

frasco coletor deve estar livre de anti-sépticos, agentes germicidas, de gotas de óleo e

de urina, para evitar a destruição de formas vegetativas dos parasitas. Fezes obtidas de

vasos sanitários não podem ser utilizadas.

Cada amostra deverá apresentar no mínimo, as seguintes informações: nome

do paciente, número de identificação, nome do médico, data e horário da colheita, e

deverá vir acompanhada do pedido médico indicando qual o procedimento laboratorial a

ser seguido.

Os recipientes com amostras fecais recebidos de pacientes com AIDS deverão

ser protegidos por um invólucro de plástico e identificados com etiquetas vermelha ou

HIV positivo.

O ideal para a certeza diagnóstica é a realização de exames em três amostras

obtidas em dias alternados.

O uso de laxantes só é indicado caso haja uma série de exames negativos em

pacientes com suspeita clínica. Nestes casos administrar laxantes salinos. Óleos

minerais (nujol etc.) e compostos de bismuto e magnésio não devem ser empregados

por interferirem no resultado dos exames. As fezes obtidas por uso de laxantes devem

ser levadas imediatamente ao laboratório.

O tempo de colheita da amostra fecal influência diretamente na identificação

dos parasitas. Por essa razão amostra fecais diarréicas e pastosas devem ser levadas

ao laboratório após no máximo, 30 minutos após a evacuação. As amostras fecais

sólidas devem ser entregues no laboratório até 2 horas sem refrigerar e no máximo até

14 horas se mantidas sob refrigeração (não congelar!).

Quanto ao uso de medicamentos, o ideal é não ter usado anti-parasitários e

antibióticos nas últimas 3 semanas e antidiarréicos e antiinflamatórios nas 72 horas que

antecedem a coleta.

METODOS

- Técnicas de concentração: métodos de Faust (centrifugação-flutuação em solução

saturada de sulfato de zinco) e método de Lutz ou Hoffman, Pons Er Janes)

sedimentação espontânea em água)

- Exame direto à fresco: realizado se a amostra for diarréica ou se apresentar muco,

pus ou sangue.

- Exame quantitativo para contagem de ovos de helmintos nas fezes: métodos de Kato-

Katz.

- Técnica de isolamento de larvas de nematódeos: métodos de Rgai.

PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES

O teste é realizado no auxilio ao diagnóstico de lesões sangrantes da mucosa

de porções baixas do trato digestório (especialmente lesões dos cólons) e como

métodos de triagem no diagnostico precoce do câncer dos cólons em indivíduos acima

dos 40 anos.

A pesquisa de sangue oculto nas fezes deve ser precedida de dieta rigorosa por

quatro dias, da qual se excluem as carnes, os vegetais verdes (clorofila) e os

medicamentos à base de ferro; e deve ser feita em amostra fecal recentemente emitida.

MÉTODO DE EXAME DIRETO À FRESCO

Um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo

observar as formas trofozoítas vivas dos protozoários. Os esfregaços com fezes frescas

e não fixadas são preparados com soluções salina fisiológica a 0,85% e de Iodo de

Lugol, separadamente. Os esfregaço deverão ser sistemáticos e completamente

examinados através de objetiva de microccópio de pequeno aumento (10x) e com

pequena intensidade de luz. A confirmação dos parasitas deve ser realizada com

objetiva de grande aumento (40 x).

SOLUÇÃO SALINA FISIOLÓGICA A 0,85%

Cloreto de sódio (NaCI) ---------------------------------------------------------------------------- 8,5 g

Água destilada-deionizada ----------------------------------------------------------------------1000 ml

MÉTODO DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO EM SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO

(MÉTODO DE FAUST et al., 1938)

Procedimento utilizado para diagnostico de cistos de protozoários e ovos de larvas de

helmintos, ovos grandes de trematódeos, de cestódeos e inférteis de Ascaris

lumbricoides não são concentrados por este método, devido à sua densidade ser maior

do que a da solução ser sulfato de zinco utilizada, não permitindo sua flutuação. É um

método impróprio para fazer contendo grande quantidade de gordura.

Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do boldo fecal em frasco

contendo 10 mL de água corrente.

Homogeneizar e filtrar a suspensão através de gaze dobrada quatro vezes, e

receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 mL.

Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar a

2.500 r.p.m por 60'.

Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de água corrente ao sedimento,

antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente 2/3 do volume do tubo,

agitar e centrifugar.

Repetir a etapa anterior até que o sobrenadante apresente-se relativamente

claro.

Depois que o último sobrenadante é descartado, adicionar a 1 a 2 mL de solução

de sulfato de zinco (d= 1,18 g/mL) e ressuspender o sedimento. Completar com

o mesmo reagente até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar.

Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação, colocá-lo em

uma estante em posição vertical.

Com uma alça de arame (diâmetro de 5 e 7 mm) tocar o centro da membrana

formada na superfície, transferindo varias alçadas para uma lâmina de

microscópica.

Colocar 1 gota de Lugol e lamínula. Examinar no microscópio óptico em aumento

de 100x.

SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO (d= 1,18 g/mL)

- sulfato de zinco (ZnSo4) ------------------------------------------------------------------------- 330 g

- água destilada-deionizada --------------------------------------------------------------------- 670 mL

Ajustar a densidade da solução com densitômetro pela adição de sal ou água e filtrar

em papel-filtro.

MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA EM AGUA

(MÉTODO DE LUZTZ, 1919; HOFFMAN, PONS E JANER, 1934)

Método é indicado para pesquisa de ovos e larvas de helmintos e cistos de

protozoários. Fundamenta-se na sedimentação espontânea em água, havendo uma

necessidade mínima de vidrarias e sendo dispensável o uso de reagentes e

centrifugação.

- Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em um corpo

graduado ou em bequer de 250 mL. Completar o volume de 50 a 60 mL com água

corrente e homogeneizar.

- Preparar a suspensão adicionando 100 mL de água corrente.

- Filtrar essa suspensão de gaze dobrada quatro vezes, recolhendo-se em cálices de

sedimentação com capacidade de 125 mL.

- Se necessária adicionar água corrente até completar aproximadamente 3/4 do volume

do cálice cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas.

- Com uma longa pipeta capilar ou em canudo plástico, colher uma pequena porção do

sedimento e depositar sobre uma lâmina de microscópica. Se o sedimento estiver muito

espesso, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente.

- Colocar 1 gota de Lugol e cobrir com lamínula. Examinar no microscópio óptico em

aumento de 100 x.

OBS: A amostra pode ser sedimentada por um tempo maior, a fim de aumentar a

concentração de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos no sedimento.

MÉTODO MODIFICADO DE KATO-KATZ

(KATO, 1960; KATZ, CHAVES & PELLEGRINO, 1972)

É um método de esfregaço espesso em celofane, amplamente utilizado na

rotina para determinar quantitativamente o número de ovos por grama de fezes (OPG).

- Colocar a amostra fecal sobre papel absorvente.

- Comprimir a tela metálica (60 ou 80 malhas) ou de náilon (105 malhas) sobre as

fezes, fazendo com que parte passe através das malhas.

- Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício de um

cartão retangular (3 cm x 4 cm x 1,37 mm, com orifício central de 6 mm de diâmetro),

colocado sobre uma lâmina de microscópica.

- Depois de preencher o orifício do cartão com a amostra, removê-lo com cuidado,

deixando as fezes na lâmina.

- Cobrir as fezes com uma lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina

sobre o papel absorvente.

- Deixar a preparação em repouso para clarificação da amostra durante 30 minutos a 34

- 40ºC ou à temperatura ambiente por 1 a 2 horas.

- Examinar a preparação no microscópio óptico em aumento de 100 x.

- Contar o número de ovos.

- O número de ovos presentes na preparação multiplicado pelo fator 23 dará o número

de ovos por grama (OPG) de fezes.

SOLUÇÃO AQUOSA GLICERINADA DE VERDE MALAQUITA

- solução aquosa de verde malaquita a 3% (m/v) ------------------------------------------- 1 mL

- solução aquosa de fenol a 6% (m/v) -------------------------------------------------------- 100 mL

- glicerina -------------------------------------------------------------------------------------------- 100 mL

MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE LARVAS DE NEMATÓIDEOS

(MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA, 1954)

Este método fundamenta-se no termo e hidrotropismo positivo das larvas de

nematódeos, indicado para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

- Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro

vezes, e repuxar as extremidades para trás.

- Encher, com aproximadamente 70 a 100 mL de água corrente aquecida a 40 - 50 ºC,

um cálice cônico de sedimentação (capacidade 125 mL).

- Transferir o recipiente com as fezes para o interior do cálice de sedimentação, de

modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para

não haver formação de bolhas de ar.

- Deixar em repouso durante 60 minutos.

- Colher o sedimento entre lâmina e lamínula no menor aumento do microscópio óptico,

ou em um vidro de relógio, com auxilio de uma lupa.

COPROTEST

- Princípio: Centrífugo-sedimentação.

- Finalidade: Pesquisa de ovos, cistos e larvas.

Abra o frasco cuidado cuidadosamente para não derramar o conteúdo;

Colher a amostra e colocar na cavidade do coletor;

Agite o frasco vigorosamente por mais ou menos 2 minutos;

Em um tubo graduado, colher 7 mL da amostra, acrescentando 1 gota de

detergente e 3 ml de acetato de etila comercial;

Tampe o tubo, agite e centrifugue a 1.500 RPM/ 2 minutos;

Despreze o sobrenadante com cuidado;

Acrescente 1 gota de lugol e 1 gota de solução fisiológica ao sedimento;

Ressuspenda o sedimento, colha 1 gota na lâmina e cubra com lamínula;

Observar ao microscópio com aumentos de 10X e 40X.


MICROBIOLOGICA

MICROBIOLOGIA

Nos últimos 30 anos, a Microbiologia e Imunologia evoluíram

extraordinariamente como ciência multidisciplinares, em relação estreita com a Biologia

Molecular.

No campo da Microbiologia Geral, enormes progressos foram realizados com

referência à anatomia química e morfológica da célula bacteriana, à biossíntese da

macromolécula e à genética de m. o. Tudo isso contribui fundamentalmente à Genética

Moderna. (BIER, 1990).

OBJETIVOS

O objetivo dos estudos no setor de Microbiologia é demonstrar aos alunos

estagiários uma visão ampla das principais técnicas e métodos dentro de um

laboratório, com fins diagnósticos. Observa-se também uma padronização e

simplificação da metodologia utilizada na identificação desses microorganismos.

MEIOS DE CULTURA

Para o cultivo de bactérias podem ser utilizados meios líquidos, sólidos ou

semi-sólidos. Meios líquidos permitem o crescimento indiferenciado de todas as

bactérias contidas na amostra promovendo turvação do meio. Meios sólidos

possibilitam crescimento de amostras de bactérias puras. Sua consistência sólida é

devido à adição de ágar e o simi-sólido contém menor quantidade ágar e é utilizado

geralmente para verificar a motibilidade das bactérias.

Meio sólido – 1.5% de agar

Meio semi-sólido – 0.4% de agar

Classificação

- Meio Diferencial – Permitem a distinção entre 2 ou mais tipos de bactérias pela

simples observação das características apresentadas pelas colônias que nele se

desenvolvem. Ex: Ágar Sangue; Meio de MacConkey.

- Meio Seletivo – Meios que contêm substancia capazes de inibir o crescimento de

determinados grupos de bactérias sem restringir o crescimento de outras. Ex: Ágar

Sangue; Meio de MacConkey.

- Meio de Enriquecimento – Rico em nutrientes que proporcionam o aumento do

número de bactérias.

Preparo de Meios

Forma preparados meios de cultura, para utilização durante o estagio, seguindo

a formula indicada pelo fabricante de cada meio.

Técnicas de Semeadura

- Esgotamento – Consiste em espalhar o material biológico com auxilio da alça, fazendo

estrias próximos até o esgotamento do material, para que haja um bom isolamento das

bactérias.

- Atapetamento – Geralmente utilizado para contagem de bactérias de amostra urinaria,

onde utiliza-se a alça da Dirigalsky.

- Espalhamento – Utilizado para espalhar todo o material biológico por toda a placa,

com auxílio da alça de platina em, pelo menos, 3 sentidos.

- Semeadura em tubos – Podem apresentar-se em forma de ágar inclinado, líquidos ou

semi-sólidos. Para a inoculação, usa-se a alça bacteriológica e na transferência de

cultura pura e placas para tubos usa-se agulha bacteriológica.

Coloração de GRAM

A maioria das amostras colhidas, quando se suspeita de infecção bacteriana,

deve se aplacada a lâminas de vidro, coradas pelo Gram e examinadas ao microscópio.

- A lâmina é fixada e tratada com solução de cristal violeta 1 a 2 minutos;

- Lavar com água e escorrer;

- Descorar rapidamente pelo álcool a 95%;

- Lavar com água e escorrer;

- Cobrir com solução de fucsina, durante 30 segundos para contra – corar;

- Lavar com água, secar com papel de filtro, observar na objetiva de imersão (100x).

Diferenciação de Bactérias

Para bactérias Gram positivas faz-se a prova da catalase, onde reação positiva

indentifica Staphylococcus e a reação negativa identifica Streptococcus.

1) Identificação de Bacterias

- PROVA DA CATALASE – Os staphylococcus produzem a enzima catalase

(peroxidase) que é capaz de decompor o peróxido de hidrogênio (H2O2) em O2O.

Execução: preparar um suspensão do crescimento bacteriano em H2O destilada

na superfície da lâmina e adicionar 1 a 2 gotas de H2O2 a 3%. O aparecimento de

bolhas indica reação positiva. O aparecimento de bolhas indica reação positiva.

Para a diferenciação entre as espécies de Staphylococcus, é necessário

proceder às provas bioquímicas, a partir de amostra isolada.

- PROCA DA COAGULASE – A coagulase ligada esta localizada na superfície da

parede células e reage com caldeias α e β do fibrinogênio plasmático, provocando a

formação de coágulo visível, resultando em uma reação positiva.

Coagulase + - S. aureus

Coagulase - - S. epidemeridis ou S. saprophyticus

- PROVA DA DNASE – Determina a atividade da enzima desoxirribonuclease produzida

por amostras de S. aureus.

Execução: Semeadura da amostra em ágar DNAase. Incubar a placa a 35 –

37ºC / 18-24 hs. Cobrir a placa com solução de ácido clorídrico a 1N. Resultado positivo

se dá pela formação de um halo ao redor da colônias e resultado negativo evidencia

truvação uniforme em toda superfície do meio.

- TESTE DE SENSIBILIDADE À NOVOBIOCINA – Diferencia os staphylococcus

coagulase negativos de importância médica.

Execução: Semeia-se o microorganismo em ágar sangue e aplica-se disco de

Novobiocina. Incuubar a placa a 35 – 37º C / 18-24 hs. Formando-se um halo de

sensibilidade caracteriza-se presença de S. epidermidis.

ESQUEMA:

Catalase + - Staphylococcus

Catalase - - Staphylococcus

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Coagulase + - -

DNAase + - -

Sensibilidade à

Novobiocina

Sensível Sensível Resistente

2) Identificação de Streptococcus

A designação mais utilizada tem por base os tipos de hemólise em placas de

ágar sangue:

- Hemólise total - β -hemolítico

- Hemólise parcial – α –hemolítico

- Ausência de hemólise – Y – hemolítico

As colônias podem ser repicadas para caldo HBI por 6 a 8 horas ou retiradas do

crescimento inicial em ágar sangue para realização das provas de identificação.

- TESTE CAMP – Principio dado pela atividade hemolítica do staphylococcus

produtor de beta lisina em eritrócito é fundamentada por um fator extracelular, de

constituição protéica, produzida pelo estrephytococcus de grupo “B”, chamado fator

CAMP. Uma reação beta-hemolítica é acentuada quando estes m.o. reagem

sinergicamente, em placas de ágar sangue.

Execução: Semeia-se uma estria de Staphylococcus aureus produtor de beta

lisina no centro de uma placa de ágar sangue feita com sangue de carneiro. Estria,

perpendicularmente, o strephytococcus a ser identificado, de modo que as estrias não

se toquem. Incubar a placa a 37ºC/ 24hs. Um alargamento da zona do lise no ponto de

interseção entre as duas estrias, que toma a forma de ponta de lança, evidencia-se

prova positiva para S. agalactiae, strephytococcus β – Hemolítico do grupo “B”.

- PROVA DA BILE ESCULINA – Os strephylococcus do grupo “D” em meio com

bile na concentração de 4%, hidrolisam a esculina, originando a esculitina a qual reage

com citrato férrico contido no meio, provocando o escurecimento do meio em torno das

colônias.

Execução: Semeia-se 2 a 3 colônias, da placa de ágar sangue, em tubo com

ágar bile esculina esculinado. Incubar a placa a 37º C/24hs. O escurecimento em torno

do crescimento evidencia-se prova positiva.

- PROVA DE TOLERÂNCIA A 6.5% DE NACL – Os strephytococcus do grupo

“D” em meio contendo 6.5% de NaCl e modificam sua coloração são classificados como

“enterococos” , os negativos são os “não enterococos”.

Execução: Inocula-se 2 a 3 colonias suspeitas em caldo HBI contendo 6.5% de

NaCl, 1% de glicose e um sistema indicador de pH. Incubar a placa a 37ºC/24hs. O

crescimento com conseqüente mudança de coloração do meio indica se tratar de

amostras E. faecalis.

- TETE BA BACITRACINA – Em concentração de 0.04 mg, a bacitracina age

seletivamente sobre os strephytococcus β – hemolítico do grupo “A” de Lacenfield

inibindo a síntese do peptidoglicano e alterando a seletividade da membrana celular.

Com isso, impedindo que as bactérias se desenvolvam na região do meio de cultivo

onde houve a difusão do sal, acarretando a formação de um halo de inibição.

Execução: Inocular na superfície de uma placa de ágar sangue colônias

suspeitas, vindas do caldo HBI ou da placa incial. Após secagem, aplica-se o disco de

bacitracina no centro da área semeada, pressionando levemente para conferiir

aderência. Incubar a placa a 37ºC/24hs. Resultado positivo para S. pyogens do grupo

“A” é conferido com o aparecimento de um halo de inibição.

- TESTE DA OPTOQUINA – A optoquina (cloridrato de estilhidrocupreína) altera

seletivamente a membrana celular do S. pneuminiae, servindo como os

estrephytococcus ao grupo “viridans”.

Execução: Semear de 2 a 3 colonias da bactérias suspeita em plac de ágar

sangue. Após secagem, aplica-se o disco de optoquina, na concentração de mg no

centro da área semeada, pressionando levemente para conferir aderência. Incubar a

placa a 37º C/24Hs, em jarra com vela. Crescimento de halo de inibição de 14 a 18 mm

indica sensibildade caracterisitca de S. pneumoniae. Em caso de resitencia à optoquina

com bile sculina negativa, trata-se de S. viridans.

Enterobacteias (bastonetes Gram negativos)

Os bastonetes Gram negativos encontrados em laboratórios são classificados

em 2 grupos:

- Produção de ácidos a partir da oxidação da glicose.

Principais gêneros: Pseudomonas, Alcaligenes e Acinetobacter.

- Produção de ácidos a partir da fermentação da glicose.

Principais genereos: família enterobacteriaceae (oxidase negativos) e os não

pertencentes a essa família (oxidase positivos).

PROVAS BIOQUÍMICAS

- URÉIA

Determina a capacidade de um m. o. em degradar enzimaticamente moléculas

de uréia do meio, formando carbonato de amônia. A hidrólise é catalisada de forma

especifica pela uréase produzindo 2 moléculas de amônia. O vermelho de fenol que

funciona como indicador, torna o meio rosa-avermelhado quando a reação for positiva.

- MILI

a) LISINA – Baseia-se na produção de lisina descarboxilase e liberação de gás

sulfídrico. A reação positiva é favorecida com o aparecimento de cor púrpura, que

coincide com a cor inicial do meio. Reação negativa é caracterizada por uma coloração

amarelada. A produção de H2S é evidenciada pelo aparecimento de um precipitado

negro.

b) MOTILIDADE – Caracterizada pelo aparecimento de turvação uniforme em

toda extensão do meio. Bactérias imóveis crescem apenas no local da inoculação.

c) INDOL – É evidenciado após degradação do aminoácido triptofano pelas

triptofanases. A positividade é conferida pela adição do Reativo de Kovacs, onde se

forma um anel vermelho na camada superficial do meio.

- CITRATO

Baseia-se na utilização do citrato como única fonte de carbono. Utiliza-se o

bromotimol como indicador de pH, que oferece coloração amarela em meio ácido e azul

em meio alcalino.

- TSI

Determina a habilidade de um m. o. em utilizar carboidratos específicos

existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S.

a) FERMENTAÇÃO DA GLICOSE – Observa-se no fundo do tubo a

degradação protéica que é insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, mantendo

o meio amarelo.

b) FERMENTAÇÃO DA LACTOSE E SACAROSE – o tubo permanece amarelo

no ápice do meio devido a alta concentração de ácidos produzidos.

c) PRODUÇÃO DE GÁS – Evidencia-se o aparecimento de bolhas ou

rachaduras no meio.

d) PRODUÇÃO DE H2S- Reação com sulfato ferroso contido no meio,

resultando em um precipitado negro.

- FENILALANINA

Para se fazer a leitura, deve-se adicionar 4 gotas de cloreto férrico que reage

com o ácido fenilpirúvico. Se positivo, promove coloração verde. Se negativo, promove

coloração amarela.

- VM

Para se fazer a leitura, acrescenta-se 5 gotas de vermelho de metila, eu por ser

um indicador ácido, indica o grau de acidez por modificação de cor. Reação positiva

dada por cor vermelha (pH = 4.5) e negativa com cor amarela (pH= 6.0).

- VP

Evidencia a capacidade da bactéria em produzir compostos neutros, a partir da

fermentação da glicose.

UROCULTURA

- Coleta – Faz-se assepsia no local antes da coleta. Coleta-se o segundo jato

usando frasco estéril.

- Conservação – Manter o material na geladeira pra inibir o crescimento

bacteriano.

Meios de Cultura

a) CLED – Meio não seletivo, diferencial para fermentação da lactose, formando

colônias azuis quando lactose negativa.

Utiliza-se como técnica de semeadura o método da alça calibrada de 0.01uL ou

0.001 uL, para que se possa fazer a contagem das colonias e posteriormente

diagnosticar se há infecção ou não.

- abaixo de 10.000 ufc/mL – contaminação

- entre 10.000 e 100.000 ufc/mL – suspeita

- acima 100.000 ufc/mL – infecção

TESTE DE SENSIBILIDADE À ANTIMICROBIANOS

I – Preparo do Inoculo

Com o auxilio da alça, toca-se em uma colônia tranferindo-as pra um tubo de

solução salina ou em caldo BHI para novo crescimento e depois em solução salina.

Posteriormente compara essa turvação com a escala 0.5 de Mac Farland.

II – Semeadura

Umedecer o “swab” estéril no inoculo aferido e aplicá-loo em varias direções na

placa com meio Mueller – Hinton, obtendo cresciemnto uniforme.

III – Técnica

Colocar os discos, com o auxilio de uma pinça, pressioná-los levemente contra

a superfície do meio, mantendo uma distancia de 20 mm da boda e de 30 mm entre

eles. Incubar a placa em posição invertida a 37ºC/ 18hs. A leitura deve ser feita com

halômetro ou régua através do fundo da placa.

CULTURA DE SECREÇÃO VAGINAL E URETRAL

A coleta da secreção vaginal e da uretral é feita no laboratório, se utilizado de

cureta (para a vaginal) ou alça de platina (para a uretral).

Uma parte do material é colocado em 1 mL de solução salina estéril, e outra

parte é olocada na forma de esfregaço na região central de uma lamina para

microscópio. Este material, em lâmina, é observado em microscópio óptico ao aumento

de 1000 vezes com óleo de imersão e descrito:

bactéria (morfologia e Gram);

leveduras;

parasitas;

muco;

células epiteliais;

flora aplobionte.

Para essa observação utiliza-se a Coloração de Gram, que é realizada nesse

esfregaço após o mesmo ter sido fixado passando-se lâmina 3 vezes por sobre a

chama do bico de busen. Feito isso, em um suporte próprio, cobre-se a lâmina com

uma camada de corante cristal violeta por aproximadamente 1 minuto; após, recobre-se

a lâmina com uma nova camada de lugol a 5% por mais 1 minuto. Em seguida

despreza-se o material que esta sobre a lâmina e recobre-se a lâmina com álcool

acetona, formando uma camada por sobre a lâmina, por 1 minuto. Após, enxaguar em

água corrente. Em seguida, recobre-se, novamente, a lâmina com fucsina para a

Coloração de Gram por mais 1 minuto. A seguir, lavar em água corrente, colocar em

suporte próprio para escorrer e secar.

Após feita a observação e determinados os parâmetros, seguir o esquema

descrito abaixo:

ESTREPTOCOCOS – NÃO BETAHEMOLITICO

Calatase (-)

(+)

Streptococcus sp

S. pneumoniase grupo D (S. faecalis e outros)

Caldo glicosado

gram

estreptococo

estafilococo Alfa ou gama hemolitico

Verificar registro de hemólise no ág ar-sangue primario

(R) à optoquina bile-esculina (-)

antibiograma

Verificar origem do material para originar provas

(S) à optoquina bile – solúvel

Bile-escilina (+)

(R) a 6,5% NaCI(R) à penicilia

(S) a 6,5% NaCI(S) à penicilia

CULTURA DE FEZES (COPROCULTURA)

Para a realização desse exame, as fezes são recolhias em recipiente próprio e

estéril e entregues ao laboratório num período Maximo de 2 horas após a coleta.

No setor, com uma alça de platina, é coletado uma porção das fezes e colocada

em caldo selenito, que vai à estufa a 37º C por um período de 24 horas. Após este

período, com uma alça de platina, recolhe-se parte desse caldo e semeia-se em estufas

a 37ºC por 24 horas. Havendo crescimento, faz-se o Gram e as provas bioquímicas

pertinentes conforme o esquema abaixo:

FEZES

CALDO SELENITO

BEM SS

GRAM

COCCOS BACILOS

NEG POS NEG POS

Tubo Rugai Sem importancia Tubo Rugai Calase

TSIclínica,

provavelmente TSI VM, VP

Mili contaminação Mili Plasmaco

Citrto CitratoHalo de hemólise

Indol Indol Nitrito

TSI

Citrato + = meio torna-se azul

TSI – H2 S + = meio torna-se negro;

- Gás ++ aparecimento de bolhas no meio;

- Lactose += A/A ou A/K K= alcalina=vermelho

(+)= K/K A= ácido=amarelo

Mili – motilidade ++ observa-se o caminho da bactéria no local da picada;

- lisina += o meio torna-se amarelo;

- indol += o reativo de Kovacs torna-se vermelho

CULTURA DE ESCARRO

Para a cultura do escarro, podemos encontrar apenas solicitações de

bacterioscopia como, por exemplo, pesquisa de BK; mas quando a solicitação for de

cultura de escarro, devemos proceder como na cultura de secreções (exceto a coleta);

Nas pesquisa de BK fazemos um esfregaço, na região central de uma lâmina,

de porção do escarro rica em material sanguinolento (hemoptíase). Após secar esse

esfregaço com a lâmina por sobre o a chama do bico de bunsen por 3 vezes,

realizamos a coloração de ziehl – Neelsen que se rezume em: cobrir o esfregaço com

uma camada de corante fucsina de ziehl e aquecer 5 minutos esta lâmina em chama

do bico de bunsen sem deixar ferver o corante )retirar frequentemente da chama. Após

isso, cobre-se a lâmina com álcool ácido por aproximadamente 1 minuto; enxaguar em

água corrente e, depois, cobrir a lâmina com azul de metileno por aproximadamente 1

minuto. Lavar, novamente, em água corrente. Observar em microscópio óptico em

aumento de 1000 vezes, utilizando óleo de imersão.

PESQUISA DE FUNGOS

Após coletar parte do material através de descamação com o bisturi ou coletar

através de biópsia parte do material obtido, colocar em uma lâmina, cobrir KOH a 10%

e sobre-por uma lamínula . Deixar por 10 minutos e observar ao microscópio óptico no

aumento de 100 a 400 vezes:

Hifas;

Micélio reprodutor;

Micélio vegetativo.

Em seguida, semia-se em ágar sabouraud por 48 a72 horas e, após o

crescimentom observam-se morfologia, textura da colônia e fungos. Após isso,

para a identificação, realização, realiza-se o auxograma e o zimograma conforme

o esquema abaixo:

OUTROS MATERIAIS: SECREÇÃO DE LESÕES, LÍQUIDOS SINOVIAIS E

PLEURAIS

Para estes casos a coleta é feita pelo médico que encainha os materiais sólidos

em saliva e os líquidos em recipiente estéril. Com a chegada da matéria, faz-se uma

lâmina para Gram e segue-se o esquema para secreções vaginal e uretral.

Em todos os exames acima descritos (exceto as pesquisas de fungos e as

bacteroscopias), devemos realizar o antibiograma feito em uma placa grande ágar

Nueller Hinton com 11 discos de antimicrobianos, padronizados a critério do diretor

clínico do hospital. Estes discos devem estar dispostos na placa de forma a

apresentarem uma distância maior que 2 cm entre os seus centros e distarem 1 cm da

borda de vidro da placa de petri. Efetuar a leitura dos balos de inibição de crescimento

utilizando um halômetro e tabela própria do fabricante dos discos, observando as faixas

de I (intermediária), S (sensível) e R (resistente).

PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS LAVADAS (5%)

1. Coloque em um tubo de ensaio (12 x 75) previamente identificado 0,5 mL de

sangue total

2. Encha o tubo com solução salina (0,9%) até 1 cm da borda do tubo.

3. Centrifugue durante 30 seg/3400 RPM.

4. Esvazie o tubo por inversão, homogenize o sedimento de hemácias, e repita

conforme os itens 2 e 3 por mais duas vezes

5. Após a terceira lavagem, retire completamente o sobrenadante

6. Em outro tubo de ensaio coloque 3 ml de solução salina (0,9%) e adicione 0,15

ml do concentrado de hemácias lavadas.

CLASSIFICAÇÃO DO GRUPO SANGUINEO ABO

A tipagem ABO dever ser realizado obrigatoriamente através de dois testes:

classificação direta e classificação reversa.

1. Classificação direta (TUBO): Identificação de aglutinógeos presentes na

membrana das hemácias, através de soros contendo anticorpos específicos:

Anti-A, ANTI-B e ANTI-AB;

TECNICA:

1.1 Prepare um suspensão de hemacias lavadas (5%) do sangue a ser classificado.

1.2 Identifique 3 tubos de ensaio: A, B e AB.

1.3 Coloque nos tubos, 1 gota dos soros reagentes: Anti-A, Anti_B e Anti-AB,

respectivamente;

1.4 Adicione a cada tubo, 1 gota da suspensão de hemácias lavadas (5%) a

classificar;

1.5 Homogenize e centrifugue 15 seg/3400 RPM

1.6 Proceda a leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre

um fundo iluminado (aglutinoscopio);

2. Classificação reversa (tubo): identificação de anticorpos presentes na amostra de

soro a ser testado, através da utilização de duas suspensões de hemácias

conhecidas: hemácias A1 e Hemácias B;

TECNICA:

2.1 Identifique 2 tubos de ensaio: HÁ e HB;

2.2 Coloque em cada tubo 2 gotas do soro a testar;

2.3 Adicione ao tubo HÁ, 1 gota de hemácias A1 e ao tubo HB, 1 gota de hemácias

B;

2.4 Homogenize e centrifugue 15 seg./3400 RPM;

2.5 Proceda leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente;

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DA CLASSIFICAÇÃO ABO

DIRETA REVERSA

ANTI A ANTI-B ANTI-AB ANTI-A1 H A1 HB HO GRUPO

0 0 0 0 +4 +4 0 O

+4 0 +4 + 0 +4 0 A1

0 +4 +4 0 +4 0 0 B

+4 +4 +4 + 0 0 0 AB

DISCREPÂNCIA

DIRETA REVERSA

ANTI A ANTI-B ANTI-AB ANTI-A1 H A1 HB HO GRUPO

+4 0 +4 0 0\+ +4 0 A*

+4 0 +4 + + +4 + A**

+4 +4 +4 0 0\+ 0 0 AB**

+4 +4 +4 + + + + AB**

A*\AB** PROVAVEL SUBGRUPO DE A

A**\AB** PROVAVEL ANTI-CORPO FRIO

NOTAS:

1. Nas determinações ABO de recém nascido não se realiza prova reversa;

2. Podem ocorrer discrepâncias entre as provas e reversa, neste caso deve-se

considerar a ocorrência de anticorpos frios, subgrupos ou erro técnico;

DETERMINAÇÃO DO FATOR Rh (D)

Na determinação Rh são utilizados os reagentes: soro reagente Anti-D e

controle e de Rh;

1. Prepare uma suspensão de hemácias lavadas (5%), do sangue a ser

classificado;

2. Identifique 2 tubos de ensaio: D e CTL;

3. Coloque em cada um dos tubos 2 gotas dos soros: Anti_D e controle de Rh;

4. Adicione a cada tubo, 1 gota de suspensão de hemácias lavadas (5%), a

classificar;

5. Homogenize e centrifugues 15 seg. 3400 RPM;

6. Proceda a leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre

um fundo iluminado (aglutinoscópio).

INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA DETERMINAÇÃO Rh:

ANTI A CONTROLE Rh RESULTADO

+ 0 Rh POSITIVO

0 0 Rh NEGATIVO

+ + ***

*** Não deve ser considerado Rh positivo, provável sensibilização das hemácias por

auto-anticorpo. Realizar o teste com Anti-D Salino conforme recomendações técnica do

fabricante.

NOTAS:

1. Os resultados Rh negativos devem ser submetidos à pesquisa do antígeno “D” fraco.

Deve-se pesquisar em paralelo a presença dos antígenos: E e C, utilizando-se o soro

Anti- CDE.

PESQUISA DOS ANTIGENOS: “D” FRACO

1. Repita os procedimentos: 1.A 5. Da determinação do fator Rh.

2. Leve ao banho maria à 37º C\30 minutos;

3. Centrifugues durante 15 seg\3400 RPM;

4. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre

aglutinoscópio;

5. Encha o tubo de ensaio com solução salina (0,9%) ate 1 cm da borda do tubo;

6. Centrifugues durante 30 seg\3400 RPM;

7. Esvazie o tubo por inversão, e repita a operação conforme itens 5 e 6 por mais 2

vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano;

8. Adicione a cada tubo, 2 gotas de soro reagente anti-globulina humana

poliespecifica;

9. Centrifugue durante 15 seg\ 3400 RPM

10.Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre

aglutinoscópio.

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (P.A.I)

(COOMBS INDIRETO)

A pesquisa de anticorpos irregulares, demonstra anticorpos antieritrocitários

irregulares, livres no soro ou plasma de doadores e pacientes, que possam provocar

reações pós-transfusionais. Deve ser realizada também no soro de gestantes, como

forma de prevenção da doença hemolítica do recém nascido.

A pesquisa deve ser realizada com soro fresco (não inativo).

São utilizadas suspensões de hemácias de triagem do grupo sanguíneo “O”,

previamente fenotipadas e que apresentam a maioria dos antígenos de importância na

clínica transfusional.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DA P.A.I

1. A positividade em qualquer tubo, em qualquer fase do teste indica provável

presença de anticorpo (s) irregulares (es);

2. Sempre que a pesquisa de anticorpos apresentar positividade, o (s) anticorpo )s)

deve (m) ser identificados (s), atraves da utilização de um painel de hemácias

fenotipadas.

TESTE DE COMPATIBILIDADE

(Prova cruzada maior)

A prova cruzada maior tem a finalidade de prevenir reações transfusionais e

garantir o aproveitamento máximo das transfusões de concentrados de hemácias, por

demonstrar a presença de anticorpos capazes de destruir as hemácias do doador

proposto.

O teste é realizado in vitro, colocando-se soro do receptor em contato com uma

suspensão de hemácias do doador, proporcionando condições adequadas de

reatividade para todos os anticorpos clinicamente significantes.

Deve-se utilizar amostra de soro fresco (não inativo), tendo a amostra validade

de 48 horas a contar do horário da coleta.

Vencido o prazo de validade, esta amostra não deve ser mais utilizada nos

testes de compatibilidade, porem armazena-se a amostra pelo prazo de sete dias.

TESTE DE COMPATIBILIDADE ( PROVA CRUZADA MAIOR )

TECNICA: ALBUMINA BOVINA 22%

1ª FASE

1. Prepare suspensões de hemácias lavadas (5%): do concentrado de hemacais a

ser transfundido e do paciente (recepto);

2. Identifique 2 tubos: Prova cruzada e AC (Auto controle);

3. Coloque em cada tubo 2 gotas do soro do paciente (receptor);

4. Adicione 1 gota da suspensão de hemácias do concentrado a ser transfundido

ao tubo de prova cruzada e 1 gota da suspensão de hemácias do paciente ao

tubo AC;

5. Homogenize e centrifugue durante 15 seg\3400 RPM;

6. Proceda a leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente sobre

aglutinoscópio e anote os resultados.

2º FASE

1. Adicione a cada tubo 2 gotas de albumina bovina 22%;

2. Homogenize e centrifugue 15 seg\3400 RPM;

3. Proceda leitura e anote os resultados.

3º FASE

1. Incube os tubos: prova cruzada e AC, em banho maria 37ºC\30 min;

2. Após incubação, centrifugue os tubos 15 seg.\3400 RPM;

3. Proceda leitura e anote os resultados.

4º FASE

1. Encha os tubos com solução salina (0,9%) ate 1 cm da borda;

2. Centrifuge os tubos durante 30 seg\3400 RPM;

3. Esvazie os tubos por inversão e repita as operações dos itens da 4º fase (1 e 2)

por mais 2 vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano;

4. Adicione a cada tubo 2 gotas do soro reagente antiglobulina humana

poliespecifica.

5. Homogenize e centrifugue 15 seg.\3400 RPM;

6. Proceda a leitura e anote os resultados;

7. Adicione 1 gota de suspensão de hemácias – controle de COOMBS, centrifugue

e proceda leitura.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE DE COMPATIBILIDADE

1. A positividade apenas no tubo de prova cruzada em qualquer fase do teste indica

presença de anticorpos (s) irregular (es);

2. A positividade no tubo AC (Auto controle) indica provável presença de auto

anticorpo.

3. Sempre que a prova cruzada apresentar incompatibilidade, ou seja, apresentar

positividade, o (s) anticorpo (s) deve (m) ser identificado (s);

4. Suspensão de hemácias – controle de COOMBS deve apresentar aglutinação,

caso contrario a prova de compatibilidade deve ser invalidada.

OBS: Não confundir a positividade do teste controle de COOMBS, com a última fase

da prova de comaptibilidade.

TESTE DE COOMBS DIRETO

O teste de COOMBS direto demonstra hemácias sensibilizadas por anticorpos

ou complemento, é utilizado no estudo de:

Anemia hemolítica auto-imune, doenças hemolítica do recém nascido e reação

hemolítica transfusional.

Procedimento técnico:

1. Prepare uma suspensão de hemácias lavadas (5%), do sangue a ser testado;

2. identifique um tubo de hemólise CD;

3. Coloque no tubo 1 gota da suspensão de hemácias (5%);

4. Adicione a este tubo 2 gotas dos soro reagente anti-globulina humana

poliespecifica;

5. Centrifugue o tubo durante 15 seg\3400 RPM;

6. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias do fundo do tubo

delicadamente, anote os resultados.

INTERPRETAÇÃO

A ocorrência de aglutinação, determina a positividade do teste.

Normas e Rotinas Operacionais Do

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