Obtenção e caracterização de fibras rotofiadas de...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Mecânica LAURILYN MAUREEN ROJAS FLOREZ Obtenção e caracterização de fibras rotofiadas de policaprolactona incorporando extrato de Rosmarinus officinalis e surfactantes visando aplicações antimicrobianas. CAMPINAS 2019
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Mecânica
LAURILYN MAUREEN ROJAS FLOREZ
Obtenção e caracterização de fibras rotofiadas
de policaprolactona incorporando extrato de
Rosmarinus officinalis e surfactantes visando
aplicações antimicrobianas.
CAMPINAS
2019
Laurilyn Maureen Rojas Florez
Obtenção e caracterização de fibras rotofiadas
de policaprolactona incorporando extrato de
Rosmarinus officinalis e surfactantes visando
aplicações antimicrobianas.
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia
Mecânica da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Mestra em Engenharia Mecânica, na Área de Materiais e
Processos de Fabricação.
Orientador: Prof.ª. Drª. Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia
Coorientador: Prof.ª. Drª. Maria Helena Andrade Santana
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO LAURILYN
MAUREEN ROJAS FLOREZ, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª.
CECÍLIA AMÉLIA DE CARVALHO ZAVAGLIA
CAMPINAS
2019
Agência: CNPq
Nº do Proc.: 137249/2017-9
ORCID: 0000-0002-9096-0974.
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Rojas Florez, Laurilyn Maureen, 1989-
R638o Obtenção e caracterização de fibras rotofiadas de policaprolactona
incorporando extrato de Rosmarinus officinalis e surfactantes visando aplicações
antimicrobianas / Laurilyn Maureen Rojas Florez. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
Orientador: Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia.
Coorientador: Maria Helena Andrade Santana.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia Mecânica.
1. Surfactantes. 2. Rosmarinus Officinalis. 3. Poli (caprolactona). 4. Fibras.
I. Zavaglia, Cecília Amélia de Carvalho, 1954-. II. Santana, Maria Helena
Andrade, 1951-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de
Engenharia Mecânica. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Obtention and characterization of polycaprolactone rotary jet
spinning fibers incorporating Rosmarinus officinalis extract and surfactants aiming
antimicrobial applications
Palavras-chave em inglês:
Surfactants
Rosmarinus Officinalis
Poly (caprolactone)
Fibers
Área de concentração: Materiais e Processos de Fabricação
Titulação: Mestra em Engenharia Mecânica
Banca examinadora:
Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia [Orientador]
Luís Alberto Loureiro dos Santos
Eliana Aparecida de Rezende Duek
Data de defesa: 15-10-2019
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Mecânica
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: 0000-0002-9096-0974.
- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/9040761804285628
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA
COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MANUFATURA E
MATERIAIS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ACADÊMICO
Obtenção e caracterização de fibras rotofiadas
de policaprolactona incorporando extrato de
Rosmarinus officinalis e surfactantes para
aplicações dérmicas
Autor: Laurilyn Maureen Rojas Florez
Orientador: Cecíla Amélia de Carvalho Zavaglia
Coorientador: Maria Helena Andrade Santana
A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Dissertação:
Prof. Dr. Cecíla Amélia de Carvalho Zavaglia ( Presidente da Banca)
DEMM/FEM/UNICAMP
Prof. Dr. Luis Alberto Loureiro dos Santos
DEMa/UFRGS
Profa. Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek
DEMM/FEM/UNICAMP
A Ata de Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema
de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Engenharia Mecânica da Facul-
dade de Engenharia Mecânica.
Campinas, 15 de outubro de 2019.
Dedicatória
A Deus, minha guia, meu amigo e ajudador;
A meus pais, Jorge e Sara, quem são a minha maior benção nesta terra;
A meus irmãos, Jorge e Estefany, pela amizade e cumplicidade;
A meu esposo, Alexandre Felipe, por seu amor incondicional.
Agradecimentos
Á Profa. Dra. Cecilia Zavaglia, pela oportunidade e confiança para continuar com os meus
estudos.
Á Profa. Dra. Maria Helena Andrade Santa, pelos ensinamentos, concelhos e ajuda durante a
pesquisa.
Ao Prof. Dr. Marcos José salvador pela infraestrutura para a obtenção do extrato, realização
dos ensaios antimicrobianos, e os concelhos em várias fases desta pesquisa.
Á Profa. Dra. Eliana Duek, pela realização da caracterização por espectroscopia de
infravermelho.
Ao Prof. Dr. Edvaldo Sabadini e ao técnico Victor Viela do laboratório de coloides e superfícies
do Instituto de Química da Unicamp pela realização dos ensaios de ângulo de contato.
Á Márcia de Oliveira Taipina, técnica do Laboratório Multiusuário de Caracterização de Ma-
teriais da FEM, pela ajuda prestada na caracterização térmica.
Ao Roman Ramirez Rueda, pela colaboração com os ensaios em microrganismos, conselhos e
amizade.
A Jessica Heline Lopes, pela amizade, conforto e ajuda nas correções da dissertação.
Aos meus companheiros Guilherme, Luiz e Edward, pelos concelhos e momentos de
descontração.
O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), número do processo 137249/2017-9
Resumo
As infecções em feridas crônicas e agudas na pele são a principal causa da inibição e atraso do
processo de cicatrização. Desta forma, são procurados sistemas de liberação de fármacos que
inibam o crescimento dos microrganismos no sitio alvo. Com o objetivo de prevenir e inibir as
infecções em feridas, o extrato de Rosmarinus officinalis foi incorporado em fibras de
policaprolactona (PCL) pelo processo de rotofiação. Para facilitar a liberação do extrato nas
matrizes hidrofóbicas de PCL foram adicionados na solução polimérica os surfactantes não-
iônicos Tween 20 ou Triton X-100. Nas fibras obtidas de PCL, PCL/extrato,
PCL/extrato/Tween 20 e PCL/extrato/Triton X-100 foram realizadas caracterizações por
espectroscopia de infravermelho (FTIR), calorimetria exploratória diferencial (DSC),
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e ângulo de contato. Nos resultados obtidos,
observa-se que a adição dos surfactantes nas fibras de PCL/extrato melhora a molhabilidade da
superfície, decresce o grau de cristalinidade e o tamanho dos diâmetros. Nos ensaios de
capacidade de incorporação do extrato não foram observadas diferenças estatísticas nas
diferentes formulações. Finalmente, conclui-se que a adição dos surfactantes Triton X-100 e
Tween 20 podem ser usados nas fibras compósitas de PCL/Rosmarinus com características
hidrofóbicas para modificar suas propriedades, visando facilitar e incrementar a liberação do
extrato para aplicações antimicrobianas.
Palavra-chave: Rotofiação, Policaprolactona, Surfactante, Rosmarinus officinalis.
Abstract
Infections in chronic and acute wounds in the skin are the main reason for the delay and
inhibition of the wound healing process. Therefore, microorganisms inhibition is investigated
by modified-release systems in the target site. With the aim to prevent and inhibit wound
infections, polycaprolactone rotary jet spinning fibers were incorporated with Rosmarinus
officinalis extract. To facilitate extract delivery in PCL hydrophobic matrix were added non-
ionic surfactants, Tween 20 or Triton x-100 in polymeric solutions before the rotary jet spinning
process. PCL, PCL/extract, PCL/extract/Tween 20 and PCL/extract/Triton X-100 fibers
characterizations were made by infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning
calorimetric (DSC), microscopy scanning electron (SEM) and contact angle. Obtained results
showed that surfactant addition in PCL/extract fibers improves surface wettability, decreases
the degree of crystallinity and their diameters. In extract loading capacity essays, no, statistical
differences were observed. Finally, it´s concluded that the addition of surfactants Triton X-100
and Tween 20 could be used in PCL/Rosmarinus composite fibers with hydrophobic
characteristics to modify their properties aiming to increase extract delivery for antimicrobial
applications.
Keys-word: Rotary jet spinning, Polycaprolactone, Surfactants, Rosmarinus officinalis.
Lista de ilustrações
Figura 2.1. Componentes principais de um sistema de Rotofiação (adaptado de Badrossamay
et al. 2010) ................................................................................................................................ 18
Figura 2.2. Etapas da Rotofiação. (i) Iniciação do jato, (ii) Extensão do jato, (iii) Evaporação
do solvente. Adaptado de: (Badrossamay et al., 2010). ........................................................... 19
Figura 2.3. Estrutura química do PCL ...................................................................................... 20
Figura 2.4. Aplicações do PCL e copolímeros. (Adaptado de Dash e Konkimalla, 2012) ..... 21
Figura 2.5. Planta de Rosmarinus officinalis. Fonte: https://www.crocus.co.uk ................... 22
Figura 2.6. Estruturas químicas dos principais compostos fenólicos presentes no extrato de
Rosmarinus (Pérez-Fons et al. 2006). ....................................................................................... 22
Figura 2.7. Imagem ilustrativa da molécula de surfactante. Adaptado de: (Jonsson, Lindman e
Kronberg, 1998) ....................................................................................................................... 24
Figura 2.8. Classificação de surfactantes segundo a carga do grupo de cabeça: (a)aniônico,
(b)catiônico, (c) zwitteriônico, (d) não-iônico. (Adaptado de Pearson, 2015) ........................ 25
Figura 2.9. Estrutura molecular dos surfactantes (A) Tritox-100 e (B) Tween 20.
Fonte: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ................................................................................. 26
Figura 3.1. Etapas de desenvolvimento da pesquisa. ............................................................... 29
Figura 3.2. Fluxograma das etapas de fabricação de obtenção do extrato de Rosmarinus
officinalis .................................................................................................................................. 30
Figura 3.3. Etapas usadas na avaliação antimicrobiana, concentração inibitória mínima, e
concentração bactericida mínima. ............................................................................................ 33
Figura 3.4. Soluções poliméricas preparadas para a obtenção das fibras por Rotofiação. ...... 35
Figura 3.5. Equipamento de Rotofiação usado na pesquisa ..................................................... 35
Figura 4.1. Cromatograma do extrato Rosmarinus officinalis Tr =5,854 min e do ácido
carnósico (Padrão) Tr =5,856 min, no comprimento de230 nm. .............................................. 40
Figura 4.2. Espectro de absorção UV-VIS: (A) do ácido carnósico presente no extrato
Rosmarinus officinalis e (B) ácido carnósico (padrão). ........................................................... 40
Figura 4.3. Imagens MEV das fibras de PCL, PCL/Tween 20 e PCL/Triton x-100. .............. 43
Figura 4.4. Diâmetro médio das fibras rotofiadas em suas diferentes formulações. ............... 44
Figura 4.5 Imagens MEV das fibras de PCL carregadas com 0,7% e 1,4% (m/m) de extrato
Rosmarinus officinalis com ou sem adição de 2% (m/m) dos surfactantes Tween 20 ou Triton
X-100. ....................................................................................................................................... 45
Figura 4.6 Micrografias MEV das fibras de PCL, PCL/T20, PCL/Tx-100 e PCL/0,7R......... 46
Figura 4.7. Micrografias MEV das fibras de PCL-extrato e PCL-extrato-surfactantes nas
diferentes formulações .............................................................................................................. 47
Figura 4.8. Espectro FTIR das fibras de PCL e 1,4%R/Tw 20, extrato de Rosmarinus e
Tween 20. ................................................................................................................................. 48
Figura 4.9 Espectro FTIR das fibras PCL e PCL/1,4%R/Tx-100, extrato de Rosmarinus e o
surfactante Triton X-100. ......................................................................................................... 49
Figura 4.10. Termogramas por DSC, durante o processo de resfriamento, apresentam as
temperaturas de cristalização das fibras de PCL, PCL-extrato, PCL-extrato-surfactante. ....... 51
Figura 4.11. Termogramas das fibras de PCL, PCL-extrato, PCL-extrato-surfactante durante
o segundo aquecimento. De esquerda à direita; temperaturas de cristalização e temperaturas
de fusão. .................................................................................................................................... 51
Figura 4.12. Ângulo de contato das fibras e filmes de PCL, PCL/0,7%R PCL/1,4% (m/m). 53
Figura 4.13. Representação esquemática da orientação das moléculas de surfactante na matriz
polimérica, os grupos de cabeça dos surfactantes estão orientados para a superfície das fibras.
.................................................................................................................................................. 54
Figura 4.14. Espectro de absorção do extrato Rosmarinus Officinalis na região UV-Vis. ..... 55
Figura 4.15 Curva de calibração do extrato Rosmarinus Officinalis no comprimento de onda
de 280 nm. ................................................................................................................................ 56
Figura 4.16. Capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus em diferentes tipos de
formulações, usando concentrações de extrato de 0,7 e 1,4 % (m/m) ...................................... 57
Lista de Tabelas
Tabela 2.1. Técnicas de obtenção de fibras poliméricas (adaptado de Nayak et al., 2012). ... 17
Tabela 4.1. Teste de microdiluição inicial para os diferentes extratos de Rosmarinus em
micro-organismos Gram-negativos e Gram-positivos e fungo. ............................................... 41
Tabela 4.2. Concentração inibitória mínima e concentração bactericida do Rosmarinus
officinalis. ................................................................................................................................. 42
Tabela 4.3 Resultados obtidos dos perfis de DSC correspondentes ao resfriamento e segundo
aquecimento. ............................................................................................................................. 52
Tabela 4.4.Ângulo de contato das fibras e filmes nas diferentes formulações ........................ 54
Lista de Abreviaturas e Siglas
Abreviações
AC Ângulo de contato
Anova Análise de Variância
CC Controle de crescimento
CI Controle de inibição
CD Controle de diluição
CE Controle de esterilidade
CLSI Clinical Laboratory Standard Institute
DMF Dimethylformamida
DMSO Dimetilsulfoxido
DSC Calorimetria exploratória diferencial
FDA Food and Drug Administration
FTIR Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MH Metformina
MHA Muller Hinton Agar
MHB Muller Hinton Broth
MPT Tartarato de metropol
MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina]
PBS Tampão fosfato salino (Phosphate-buffer saline)
MRSA Staphylococcus Aureus Resistente à Meticilina,
PEI Polieterimida
PEG Polietileno Glicol
PCL Poly (ε-caprolactona)
PHBV Ácidos poli (3-hidroxibutírico e-co-3-hidroxivalérico)
THF Tetrahidrofurano
Tx-100 Triton X-100
Tw 20 Tween 20
TTC Cloreto de Trifenil Tetrazólio
u.a. Unidades arbitrárias
UV Ultravioleta
Siglas
FDA Food and Drug Administration
Letras Latinas
∆𝐇𝐜 Entalpia de cristalização (J⁄g)
∆𝐇𝐦 Entalpia de fusão (J⁄g)
𝚫𝐇𝟎 Entalpia de fusao para 100% de cristalinidade (J⁄g)
𝛘𝐜(%) Grau de cristalinidade (%)
𝐓𝐜 Temperatura de cristalização (°C)
𝐓𝐠 Temperatura de transição vítrea (°C)
𝐓𝐦 Temperatura de fusão (°C)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 15
1.1 Objetivos .................................................................................................................... 16
2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 17
2.1 Técnicas de obtenção de fibras poliméricas............................................................... 17
2.1.1 Rotofiação ........................................................................................................... 18
2.2 Polímeros na liberação de fármacos .......................................................................... 20
2.2.1 Policaprolactona (PCL) .......................................................................................... 20
2.3 Rosmarinus officinalis Labiatae. ............................................................................... 22
2.3.1 Extratos e óleos naturais como agentes antimicrobianos ................................... 23
2.4 Surfactantes ................................................................................................................ 24
2.4.1 Classificação dos surfactantes segundo a carga da cabeça. ................................ 25
3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 28
3.1 Materiais .................................................................................................................... 28
3.2 Métodos ..................................................................................................................... 28
3.2.1 Obtenção do extrato de Rosmarinus officinalis .................................................. 30
3.2.2 Avaliação atividade antimicrobiana dos extratos de Rosmarinus officinalis ..... 31
3.2.3 Obtenção das fibras rotofiadas ........................................................................... 34
3.2.4 Caraterização das fibras PCL, PCL/R e PCL/R/surfactante ............................... 36
3.2.5 Quantificação da incorporação do extrato Rosmarinus officinalis ..................... 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 39
4.1 Obtenção do extrato Rosmarinus Officinalis ............................................................. 39
4.2 Avaliação atividade antimicrobiana dos extratos de Rosmarinus officinalis ................. 41
4.2.1 Avaliação da atividade antimicrobiana............................................................... 41
4.2.2 Determinação da concentração inibitória mínima e concentração bactericida
mínima 41
4.3 Caracterizações das PCL, PCL/R e PCL/R/surfactante.................................................. 43
4.4 Quantificação do extrato incorporado nas fibras ....................................................... 54
4.4.3 Capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus officinalis ......................... 56
5 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 57
5.1 Conclusões ................................................................................................................. 57
5.2 Sugestões para trabalhos futuros. ............................................................................... 58
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 59
15
1 INTRODUÇÃO
As infecções em feridas agudas e crônicas são as causas mais comuns do atraso e
inibição do processo de cicatrização. Esta inibição ocorre pela contaminação, colonização e
infeção do local da ferida por microrganismos que perturbam os múltiplos processos envolvidos
na cicatrização do tecido, chegando em casos graves a ocasionar resposta sistêmica séptica
ocasionando a morte (Negut et al., 2018). No processo de cicatrização as propriedades
mecânicas da pele são restauradas pela ação de diferentes tipos de células. Este processo é
dividido em quatro fases: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação (Bielefeld et al.,
2013). A presença de bactérias e endotoxinas prolonga a fase inflamatória produzindo a falha
da regeneração e degradação da matriz extracelular (ECM) e como consequência a ferida entra
em estado crônico (Ruth Edwards, 2007).
No tratamento de infecções em úlceras e queimaduras são usados cremes e unguentos a
base de metais e sais metálicos de zinco, cobre e prata como agentes antimicrobianos por seu
potencial biocida em baixas concentrações (Palza, 2015). Embora os metais apresentem boas
propriedades antibacterianas, sua presença no corpo causa alterações no DNA celular,
resultando na morte das células e aumentando o risco de câncer (Jadoon e Malik, 2017). Como
opção ao uso de metais como agentes antimicrobianos, as plantas e seus derivados se destacam
pelas propriedades antimicrobianas (Gupta et al., 2013), antioxidantes (Jordán et al., 2013),
anti-inflamatórias (Mwaheb et al., 2016), quimioterapêuticas (Kaur et al., 2016), cicatrizantes
(Anjum et al., 2016), biocompativéis (Saeed et al., 2017), que estão presentes em plantas como
a curcumina, aloe vera, Rosmarinus officinalis , orégano entre outras.
Uma das alternativas para melhorar a efetividade do tratamento de infecções na pele, é
o uso de sistemas de liberação de fármacos in situ, através de veículos que garantam a liberação
sustentada durante o tempo necessário. As vantagens do uso de veículos de liberação são:
redução da frequência de administração, toxicidade e os efeitos colaterais pela diminuição da
ingestão excessiva de fármacos (Hu et al., 2015). Com o objetivo de criar um veículo para a
liberação de extrato natural com propriedades antimicrobianas foram obtidas e caracterizadas
16
fibras de policaprolactona incorporadas com extrato de Rosmarinus officinalis e os surfactantes
não-iônicos Tween 20 e Triton x-100. Para tal fim, foi utilizado o polímero bioreabsorvível
policaprolactona (PCL) com alta hidrofobicidade (Abdo et al., 2016). A hidrofobicidade
presente nas superfície polimérica das fibras não favorece a adesão e o crescimento celular
(Chen, Yan e Zheng, 2018), além disso polímeros semicristalinos como o PCL apresentam
baixa liberação dos fármacos ao longo tempo, devido à baixa taxa de difusão das moléculas de
àgua no seu interior (Chou, Carson e Woodrow, 2015).
Por este motivo as propriedades físicas, químicas e superficiais das fibras de PCL-
Rosmarinus officinalis obtidas são modificadas pela adição dos surfactantes Tween 20 ou
Triton X-100 visando facilitar a liberação do extrato nas fibras. Nesta pesquisa são realizadas
diferentes caracterizações que permitem avaliar as propriedades das fibras obtidas por
rotofiação.
1.1 Objetivos
Objetivo Geral
Obter por rotofiação e caracterizar fibras poliméricas de Policaprolactona (PCL) com
incorporação de extrato de Rosmarinus officinalis e surfactante Tween 20 ou Triton x-100,
visando seu uso como veículo de liberação antimicrobiano.
Objetivos Específicos
• Determinar a capacidade inibitória do extrato de Rosmarinus officinalis contra diferentes
tipos de microrganismos.
• Verificar a influência da adição dos surfactantes nas fibras de PCL-Rosmarinus e nas
propriedades morfológicas, superficiais, térmicas e químicas.
• Determinar a capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus nas fibras poliméricas
com e sem adição dos surfactantes Tween 20 ou Triton x-100.
17
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Técnicas de obtenção de fibras poliméricas.
As fibras poliméricas são obtidas usando técnicas físicas e químicas. Nas técnicas físicas
se aplicam radiação, pressão mecânica, energia elétrica ou térmica, abrasão, evaporação ou
condensação (Gugulothu et al., 2019). Já entre as técnicas que usam métodos físicos destacam-
se a eletrofiação, rotofiação, deposição física de vapor e ablação por laser. Nas técnicas
químicas ocorrem reações químicas para obtenção de fibras poliméricas, as quais são obtidas
principalmente por: deposição química de vapor, sol-gel, síntese hidrotérmica, micro-ondas,
deposição eletroquímica, sonoquímica, microemulsões, deposição química por plasma (Nayak
et al., 2012). Na Tabela 2 .1 são sumarizadas algumas técnicas para obtenção de fibras
poliméricas.
Tabela 2.1. Técnicas de obtenção de fibras poliméricas (adaptado de: Nayak et al., 2012).
Processo de
manufatura Escalabil
idade
Repetibilidade Controle
diâmetro Vantagens Desvantagens
Eletrofiação
(solução)
Sim
Sim
Sim
Fibras longas e
contínuas Baixa produtividade,
instabilidade do jato
Eletrofiação
(Fusão)
Sim
Sim
Sim
Fibras longas e
contínuas
Degradação térmica
dos polímeros,
descarga elétrica
Meltblowing Sim Sim Sim Alta
produtividade
Degradação térmica
dos polímeros.
Sínteses por
molde
Não
Sim
Sim
uso de moldes
com diferentes
diâmetros
Processo complexo
Drawing
Não
Sim
Não
Processo
simples Processo descontínuo
Separação
de fase Não Sim Não
Equipamento
simples
Trabalha unicamente
com alguns
polímeros
Auto
agregação Não Sim Não
Produção de
diâmetros
pequenos
Processo complexo
Rotofiação
Sim
Sim
Sim
Não usa
corrente
elétrica
Algumas vezes
requer o uso de altas
temperaturas
18
2.1.1 Rotofiação
A Rotofiação é uma técnica física para a obtenção de fibras poliméricas em escalas
micrométricas e nanométricas. Esta técnica se destaca como uma alternativa à eletrofiação,
principalmente pela obtenção de fibras sem depender da condutividade da solução, não é
necessária a aplicação de potenciais elétricos elevados, motivo pela qual se reduz o risco de
acidentes, é uma técnica versátil onde são usadas emulsões ou suspensões poliméricas,
apresenta maior taxa de produção em relação a técnica de eletrofiação (Nayak et al. 2012).
Na Figura 2.1 é apresentado os componentes principais de um rotofiador. O sistema de
rotofiação é composto de um reservatório e um coletor. O processo é dividido em três etapas:
iniciação do jato, extensão do jato e evaporação do solvente. Durante o processo, o reservatório
gira a uma velocidade regulável, enquanto é alimentado continuamente com uma solução
polimérica. O reservatório possui orifícios pelos quais jatos da solução polimérica são expulsos,
estes passam do reservatório até o coletor formando as fibras; as fibras alinhadas se acumulam
no exterior do reservatório e as aleatórias são depositadas no coletor.
Figura 2.1. Componentes principais de um sistema de Rotofiação (adaptado de Badrossamay
et al. 2010)
Na Figura 2.2 são a presentadas as etapas para obtenção de fibras por rotofiação,
segundo Badrossamay et al., 2010 existem 3 etapas principais no processo de rotofiação, como
se explica a seguir:
19
Iniciação do jato:
O fluxo da solução polimérica através do orifício inicia-se pela combinação da pressão
hidrostática e da força centrífuga na extremidade do capilar que excedem a força de
capilaridade, que se opõe ao fluxo, impulsionando a solução polimérica através do orifício
capilar como um jato (Figura 2.2-i).
Extensão do jato:
Incrementa-se a área superficial do polímero propelido. O estiramento do jato
polimérico extrudado se produz devido à redução do diâmetro ao longo da distância do capilar
até o coletor (Figura 2.2-ii).
Evaporação do solvente:
Devido à inércia do movimento de rotação o jato polimérico viaja em trajetória
curvilínea até o coletor, durante esta trajetória o solvente se evapora, o jato polimérico se contrai
e se solidifica formando as fibras poliméricas. A evaporação do solvente ocorre pela difusão
interna através do polímero até à superfície da fibra (Figura 2.2-iii).
Figura 2.2. Etapas da Rotofiação. (i) Iniciação do jato, (ii) Extensão do jato, (iii) Evaporação
do solvente. Adaptado de: (Badrossamay et al., 2010).
20
2.2 Polímeros na liberação de fármacos
As fibras obtidas a partir de polímeros naturais ou sintéticos são pesquisadas para seu
uso como veículos de liberação de fármacos na engenharia tecidual, implantes e curativos
dérmicos. Estas fibras poliméricas apresentam características únicas, destacando-se: a melhoria
na eficiência da liberação dos fármacos devido à alta relação entre a área superficial/volume;
modulação da liberação em função da aplicação desejada, pela funcionalização das superfícies
das fibras através de diferentes técnicas (Yoo et al. 2009); liberação prolongada, diminuição da
frequência de aplicação do fármaco (Hu et al. 2015); resistência mecânica e maleabilidade
dependendo do polímero usado na obtenção das fibras, facilitando seu uso em aplicações
tópicas (Mohammadzadehmoghadam et al., 2015).
2.2.1 Policaprolactona (PCL)
A policaprolactona (PCL) é um poliéster linear, bioabsorvível, semicristalino,
sintetizado pela polimerização da abertura do anel do ciclo ε-caprolactona, com baixa
temperatura de fusão (Tm) na faixa de 56 a 65 °C e temperatura de transição vítrea (Tg) na
faixa de -60 a -55 °C (McKeen, 2012), alta estabilidade térmica, baixo custo e fácil
processamento (Mclauchlin et al. 2012). Estas propriedades favorecem o uso do PCL em
diferentes técnicas de obtenção de scaffolds poliméricos como eletrofiação (Hu et al., 2015;
Rychter et al., 2018), impressão 3D e rotofiação (Badrossamay et al., 2014), entre outras. Na
Figura 2.3 é apresentado a estrutura química do PCL.
Figura 2.3. Estrutura química do PCL
O uso do polímero policaprolactona foi aprovado pela FDA (Food and Drug
Administration) para aplicações em implantes e veículos de liberação controlada de fármacos
(Deitzel et al. 2001). Rai et al., 2016, obtiveram filmes de PCL junto com o antibiótico
21
Vancomicina, para o tratamento de osteomielites causada pela bactéria Staphylococcus
resistente à meticilina (SARM), este sistema permitiu a liberação sustentada do antibiótico e a
formação de novo osso em coelhos sem nenhum tipo de inflamação.
Grossen et al., 2017 encapsularam sulforafano em micelas do copolímero PCL/PEG
poli(etilenoglicol) para melhorar sua estabilidade química e permitir sua liberação passiva e
ativa como opção terapêutica no tratamento de várias doenças; Hu et al., 2015 obtiveram fibras
de PCL/PHBV (ácidos poli (3-hidroxibutírico e-co-3-hidroxivalérico)) utilizando a técnica de
eletrofiação-emulsão com o objetivo de modular a liberação dos fármacos: MH (cloridrato de
metformina) e MPT (tartarato de metoprolol) usando o surfactante Span 80. Outras formas de
aplicação do PCL são os hidrogéis termossensíveis de PCL/PEG usados na liberação sustentada
de fármacos para aplicações biomédicas (Deng et al., 2019), se uso permite a entrega do
fármaco a uma taxa especifica programada por um período de tempo prolongado (Alasvand et
al., 2017). Na Figura 2.4 são apresentados diferentes tipos de aplicações do PCL na liberação
de fármacos.
Figura 2.4. Aplicações do PCL e copolímeros. (Adaptado de Dash e Konkimalla, 2012)
22
2.3 Rosmarinus officinalis Labiatae.
A Rosmarinus officinalis, comumente conhecida como alecrim (Figura 2.5) é uma erva
nativa do mediterrâneo, distribuída em várias áreas do mundo incluindo o Brasil (Benincá et al.
2011). A composição fito-química do Rosmarinus officinalis é rica em polifenóis,
principalmente di-terpenóides, além de flavonóides, ácidos fenólicos, tri-terpenóides, ligninas,
entre outros (Mena et al., 2016).
Figura 2.5. Planta de Rosmarinus officinalis. Fonte: https://www.crocus.co.uk
O extrato de Rosmarinus officinalis destaca-se por suas propriedades anti-inflamatórias
(Altinier et al., 2007), cicatrizantes, regeneradoras (Abu-Al-Basal, 2010), antioxidantes (Bendif
et al., 2017) e antimicrobianas (Moreno et al. 2006). Muitas destas propriedades estão
relacionadas com a presença de compostos fenólicos. A Figura 2.6 apresenta alguns dos
principais compostos fenólicos presentes no Rosmarinus officinalis.
Figura 2.6. Estruturas químicas dos principais compostos fenólicos presentes no extrato de
Rosmarinus (Pérez-Fons et al. 2006).
23
A presença dos compostos fenólicos, carnosol, ácido betulínico e ácido ursólico
mostraram estar relacionados à atividade anti-inflamatória, inibição de leucócitos, exsudados,
enzimas pró-inflamatórias e seus mediadores (Benincá et al., 2011). Em outro estudo proposto
por Abu-Al-Basal 2010, ratos diabéticos com feridas tratados com óleos de Rosmarinus
officinalis apresentaram melhoria na redução da inflamação, aumento da cicatrização, re-
epitelização, regeneração do tecido granular, angiogênese e deposição do colágeno em
comparação com aqueles não tratados (Abu-Al-Basal 2010). Já o uso de di-terpenóides como:
o carnosol, rosmanol e genkwanina apresentaram atividade antioxidante, estes podem inibir a
penetração e propagação de radicais livres dentro das membranas, devido ao incremento da
ordem dos lipídios da membrana, aumentando sua rigidez. (Pérez-Fons et al. 2006).
Em relação às propriedades antimicrobianas do Rosmarinus Officinalis existem
diferentes estudos sobre a inibição do crescimento dos microrganismos usando extratos e óleos,
(Moreno et al. 2006; Angioni et al., 2004; Genena et al. 2008; Zaouali et al. 2010). Por exemplo,
a avaliação antibacteriana do carnosol, os ácidos carnósico e rosmarínico presentes no extrato
do Rosmarinus tiveram alta inibição de bactérias hospitalares multirresistentes, principalmente
usando carnosol, por outro lado o ácido rosmarínico apresentou baixa eficácia (Zampini et al.,
2013). A ação antimicrobiana dos extratos e óleos a base de Rosmarinus deve-se à presença
dos compostos fenólicos e as alterações que estes produzem na permeabilidade da célula
microbiana, danificando-a e produzindo interferência no sistema de geração de energia (ATP),
e na interrupção da força motriz de prótons ocasionando a morte celular (Friedly et al., 2009).
2.3.1 Extratos e óleos naturais como agentes antimicrobianos
Holban et al. 2017 relataram que a incorporação de óleos essenciais de Rosmarinus e
orégano dentro de fibras de acetato de celulose por eletrofiação apresentaram boas propriedades
antimicrobianas no tratamento de infecções produzidas por C. albicans, E.coli e S. aureus; além
da atividade antimicrobiana o uso do óleo de Rosmarinus ajudou na obtenção de diâmetros mais
uniformes e na diminuição das falhas nas fibras. Motealleh et al., 2013 obtiveram fibras
compósitas de PCL/Poliestireno incorporadas com extrato de camomila para a inibição dos
microrganismos S. aureus e C. albicans, usando 15% (m/m) de extrato atingiu-se o 95% de
cicatrização nos modelos in vivo em ratos e 90% de viabilidade em células tronco.
24
Da mesma forma Saeed et al. 2017 em estudo recente reportaram a fabricação de
curativos de PCL/curumim com uma camada intermediária de poli(acetato de vinila) (PVA)
ajudou na absorção de três vezes mais exsudados nas feridas em comparação com os curativos
convencionais; além disso a presença da curumim nos curativos teve ação antibacteriana contra
as bactérias Gram-negativa, E. coli e Gram-positiva, S. aureus.
2.4 Surfactantes
Os surfactantes são moléculas anfifílicas compostas por pelo menos duas partes, uma
parte solúvel em um solvente específico chamada liofílica e a outra parte insolúvel chamada de
liofóbica, quando o solvente usado é a água as partes que compõem os surfactantes são
chamadas de hidrofílicas e hidrofóbicas, respectivamente (Jonsson et al. 1998). A parte
hidrofílica do surfactante situa-se na cabeça e a parte hidrofóbica na cauda (Figura 2.7), estas
características estruturais permitem aos surfactantes serem considerados agentes ativos de
superfície, pois se caracterizam pela diminuição da energia de tensão interfacial promovendo a
molhabilidade (Hubbard 2003).
Figura 2.7. Imagem ilustrativa da molécula de surfactante. Adaptado de: (Jonsson, Lindman e
Kronberg, 1998)
Os surfactantes são usados em formulações para incrementar a solubilidade dos
fármacos hidrofóbicos através da solubilização no centro de micelas e outras microestruturas
organizadas; melhoram a biodisponibilidade e a degradação por hidrólises e modulam a taxa de
liberação (Hubbard 2003).
25
2.4.1 Classificação dos surfactantes segundo a carga da cabeça.
Na Figura 2.8 apresenta-se a classificação dos surfactantes segundo a carga do seu grupo
de cabeça.
Figura 2.8. Classificação de surfactantes segundo a carga do grupo de cabeça: (a)aniônico,
(b)catiônico, (c) zwitteriônico, (d) não-iônico. (Adaptado de Pearson, 2015)
Surfactantes Zwiteriônicos
Esta classe de surfactantes possui carga negativa e positiva no seu grupo de cabeça. Sua
carga positiva geralmente é de uma amina quaternária, enquanto sua carga negativa varia,
podendo ser de ácido carboxílico, sulfúrico ou fosfórico. A sua carga permanece invariável ou
não, segundo o valor do pH, afetando as propriedades como a molhabilidade, detergência,
formação de espuma (Pearson, 2015). Os surfactantes Zwitteriônicos apresentam excelentes
propriedades dermatológicas, também exibem baixa irritação e são frequentemente usados em
cosméticos e em outros produtos (Jonsson, Lindman e Kronberg, 1998)
Surfactantes iônicos
Os surfactantes iônicos dividem-se em aniônicos com carga negativa e catiônicos com
carga positiva, estes apresentam características comuns como: alta atividade superficial, a
formação de auto agregados, a alta dependência dos sais, o qual lhe confere oportunidades para
seu uso na liberação de fármacos. Entre os surfactantes aniônicos os mais comuns estão os sais
de ácidos graxos, sulfatos, ésteres de fosfato, éteres de sulfato. Os surfactantes catiônicos são
26
usados como agentes antibacterianos, no entanto frequentemente são irritantes e algumas vezes
tóxicos limitando seu uso na liberação de fármacos (Hubbard, 2003)
Surfactantes não-iônicos
Os surfactantes não-iônicos não possuem carga residual no seu grupo de cabeça, sendo
desta maneira menos sensíveis aos sais. A concentração micelar crítica (CMC), concentração
na qual os surfactantes formam micelas espontaneamente (Lee e Lee, 2019), geralmente é mais
baixa do que a dos surfactantes iônicos, portanto, são usadas menores concentrações, também
são menos irritantes e melhor tolerados do que os surfactantes catiônicos e aniônicos (Hubbard,
2003). Os surfactantes não-iônicos são mais efetivos na dissolução de fármacos hidrofóbicos
pouco solúveis em água do que os surfactantes iônicos, já que são lipofílicos por natureza
(Pearson, 2015). Czajkowska-Kosnik et al., 2015 avaliou citotoxicidade dos surfactantes não-
iônicos Tween 20, Tween 80 e cremophor na concentração de 1 e 5% (m/m) em solução aquosa
em fibroblastos humanos, o resultado obtido foi a alta viabilidade do surfactante Tween 20 em
comparação com o Tween 80 e o cremophor nas primeiras 24 horas foi de 80-60 % e em 48
horas de 70-55% . Na Figura 2.9 são apresentadas as estruturas moleculares dos surfactantes
de tipo não-iônicos, Tween 20 e Triton x-100.
Figura 2.9. Estrutura molecular dos surfactantes (A) Tritox-100 e (B) Tween 20.
Fonte: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
B A
27
2.4.2 Uso de surfactantes em fibras poliméricas
A adição de diferentes tipos de surfactante aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS),
catiônico brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) e não iônico Triton X-100 em solução
polimérica de fluoreto de polivinilideno (PVDF) resultou na diminuição dos diâmetros das
fibras com o incremento da concentração do surfactante (Zheng et al., 2014). Já o aumento da
concentração do surfactante Triton X-100 de 0.5 até 1.5% (m/m) na solução polimérica de
poli(eterimida) (PEI) ocasionou a diminuição da quantidade de beads e na redução da tensão
superficial das fibras (Abutaleb et al., 2017).
Fibras de polivinilpirrolidona (PVP) e polietileno glicol (PEO) incorporando o
microbicida Maravirovic incorporado, apresentaram rápida liberação do fármaco,
especialmente nas fibras em que se adicionou o surfactante Tween 20 como agente molhante,
resultando no incremento da taxa de liberação. Além disso, os ensaios de citotoxicidade in vitro
dos surfactantes: Tween 20, Tween 80, glicerol monolaurate e o nonoxinol 9 resultaram em 10
vezes mais tolerância usando os surfactantes Tween 20 e Tween 80 do que o glicerol
monolaurate e, 50 vezes mais do que o nonoxinol 9 nas células TZM-bl (Ball e Woodrow, Kim
A., 2014). Hu et al., 2015 usaram a técnica de eletrofiação-emulsão para obter fibras de PCL
com os fármacos hidrofílicos metoprolol e cloridrato de metformina e o surfactante span 80.
Durante o processo de obtenção das fibras, o surfactante fica na superfície e os fármacos no
interior. Desta maneira evita-se a rápida liberação de fármacos hidrofílicos.
28
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
Nos testes de avaliação antimicrobiana e antifúngica foram usados extrato da planta
Rosmarinus officinalis de obtenção própria e extrato comercial obtido da distribuidora Florien
(Piracicaba, SP). Para a obtenção das fibras rotofiadas foram empregados o polímero
poli(caprolactona) (PCL, Mn 80, 000 g/mol) do fornecedor Sigma Aldrich Brasil, o extrato de
Rosmarinus officinalis de fabricação própria, além dos surfactantes Tween 20 da empresa
Reagen (Rio de Janeiro), Triton X-100 da empresa Sigma Aldrich e o solvente Clorofórmio
(CHCl3, 99,8 % pureza) da empresa Labsynth do Brasil. Ácido carnósico (91% pureza) da planta
Rosmarinus Officinalis com massa molecular 332.43 g/mol da empresa Sigma-Aldrich usado
como padrão, os solventes usados na identificação do extrato foram: Metanol, Acetonitrila e
Ácido fórmico grado HPLC da empresa PanReac AppliChem, Espanha. Todos os materiais e
solventes foram usados sem nenhum tipo de purificação
3.2 Métodos
Na Figura 3.3 são apresentadas as etapas da metodologia seguida nesta pesquisa para
obtenção das fibras poliméricas de PCL carregadas com extrato de Rosmarinus officinalis nas
concentrações de 0,7 e 1,4 e 2.1 % (m/m) e adição dos surfactantes Triton X-100 ou Tween 20
.
29
Figura 3.1. Etapas de desenvolvimento da pesquisa.
Análise estatística
As análises estatísticas dos diâmetros, ângulos de contato e da capacidade de
incorporação das fibras foram realizadas usando o software Minitab (versão 17.0, USA). As
diferenças significativas existentes entre os diferentes tipos de formulações das fibras se
determinaram usando a análise de variância one way (ANOVA) com o método de Tukey para
múltiplas comparações. A probabilidade estatística do teste (p) estabeleceu-se em = 0,05.
Etapas
1ª Etapa: Obtenção do extrato Rosmarinus officinalis e
identificaçãoRotaevaporação
Verificação A. carnósico (HPLC-UV/DAD)
2ª Etapa: Avaliação atividade antimicrobiana dos extratos de
Rosmarinus officinalisTriagem inicial
Avaliação CIM e CBM
3ª Etapa: Obtenção das fibras Preparação das soluções. Rotofiação
4ª Etapa: Caraterização das fibras PCL, PCL/R e PCL/R/surfactante
Morfológica MEV
Química FTIR
Térmica DSC
Superficial AC
5ª Etapa: Quantificação da CI do Rosmarinus officinalis
Identificação bandas do extrato Rosmarinus officinalis (UV-VIS)
Curva de calibração
30
3.2.1 Obtenção do extrato de Rosmarinus officinalis
As partes aéreas (folhas e galhos) da planta Rosmarinus officinalis foram usadas para a
obtenção do extrato. Sua coleta ocorreu no herbário do Instituto de Biologia da Unicamp,
IB/UNICAMP, no mês de abril de 2018. Após a coleta, as partes aéreas foram secas na estufa
(Fanem 515-A) a 50°C por um período de 72 h e trituradas no moinho analítico (A11 Basic,
marca IKA). O pó seco obtido da trituração foi colocado em repouso com etanol P.A 100%
durante 1 dia. Posteriormente, esta mistura foi filtrada a vácuo, e o líquido obtido foi transferido
ao rotaevaporador (Heidolph Rotavac).
As condições usadas na rotaevaporação foram: pressão reduzida de 400 (mbar) e
temperatura de 50°C. O extrato obtido foi seco a 50°C na estufa (Fanem 515-A) para remoção
total do etanol, durante o período de secagem o peso do extrato foi monitorado até não existir
nenhuma variação e finalmente foi armazenado protegido da luz a 4°C. Na Figura 3.2 são
apresentadas as principais etapas para a obtenção do extrato de Rosmarinus officinalis.
Figura 3.2. Fluxograma das etapas de fabricação de obtenção do extrato de Rosmarinus
officinalis
Coleta partes aéreas
Rosmarinus officinals
Secagem (50°C)
Repouso em etanol (24 horas)
Filtração a vacuo
Rotoevaporação (50°C)
Secagem final (50°C)
Armazenagem (4°C)
Umidade
Sólidos
Etanol
31
3.2.1.1 Identificação do ácido carnósico presente no extrato por HPLC-UV/DAD
A verificação da presença do ácido carnósico, composto antimicrobiano presente no
extrato Rosmarinus Officinalis incorporado nas fibras, foi realizado usando cromatografia
líquida HPLC-UV/DAD, no equipamento Shimadzu, modelo LC-20AT com detector UV e
arranjo de fotodiodos, a coluna usada foi a HPLC-cartridge 100, LichroCART®2504. As
análises dos dados cromatográficos foram realizadas usando o software LC solution Shimadzu.
As condições cromatográficas foram: fase móvel: 65% Acetonitrila: 35% água + 0,1 % ácido
fórmico, em modo isocrático com fluxo de 1.5 mL/min, tempo de análise de 10 min, volume
de injeção: 20μL, comprimento de absorção no UV-VIS, λ=230 nm.
As amostras a serem analisadas foram preparadas da seguinte forma: 1mg de extrato de
Rosmarinus officinalis foi dissolvido em 1 mL de metanol-H2O mili-Q (50%:50%) e 25μg do
padrão ácido carnósico foram dissolvidos em 0,5 mL de metanol. Em seguida as amostras foram
transferidas para viales.
3.2.2 Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos de Rosmarinus officinalis
No Laboratório de Fisiologia Vegetal do Instituto de Biologia da UNICAMP foram
realizados os testes de atividade antimicrobiana e antifúngica. Os microrganismos usados nos
experimentos de susceptibilidade bacteriana e antifúngica foram escolhidos pela relevância e
recorrência em infecções de pele, destacando-se: Escherichia coli ATCC 35218, Pseudômonas
aeuroginosa ATCC 27853, Staphylococcus Aureus Resistente à Meticilina ATCC 43300
(SARM), Enterococcus Faecalis Resistente à Vancomicina ATCC 51299 (FERV) e Cândida
albicans ATCC 1023.
Inicialmente, a avaliação da susceptibilidade dos microrganismos foi realizada na
concentração de 2mg/mL dos extratos de Rosmarinus officinalis usando a técnica de
microdilução no meio Muller Hinton Broth (MHB), com base nestes resultados foram
realizados os ensaios da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida
mínima (CBM)
32
3.2.2.1 Avaliação da atividade antimicrobiana inicial.
Com o objetivo de avaliar o potencial antimicrobiano dos extratos de Rosmarinus
officinalis de obtenção própria e do obtido da distribuidora Florien (Piracicaba, SP), foi
realizada uma avaliação antimicrobiana inicial. A metodologia usada nos experimentos de
microdiluição foi da Clinical Laboratory Standard Institute para bactérias com crescimento
aeróbico (CLSI, 2015). Inicialmente as bactérias foram incubadas por 24 horas a 37°C no meio
de cultura Muller Hinton Agar MHA (Becton Dickinson); foi pesado 2 mg de cada tipo de
extrato de Rosmarinus Officinalis e dissolvidos em 50μL de Dimetil sulfóxido (DMSO) (marca
Synth) e 950μL de água destilada estéril, resultando em concentrações de 2mg/mL. Após a
preparação anterior foram adicionados a cada poço da microplaca: 100 μL de solução de extrato
anterior, 100 μL de meio de cultura MHB, e 10 μL de inóculo bacteriano; finalmente foram
feitos os controles de: inibição (CI), diluição (CD), crescimento (CC) e esterilidade (CE), por
fim a placa foi incubada a 37°C durante um período de 24 horas.
Na revelação dos resultados foram adicionados 10 μL de 2,3,5-Cloreto de trifenil
tetrazólio, (TTC, marca SIGMA) 5% V/V a cada poço da microplaca. Após duas horas foi
realizada a leitura da absorbância na microplaca usando o equipamento Biotek Synergy 2
(2006) no comprimento de onda de 570 (nm), Nos poços onde se observou a mudança de cor
de branco leitoso para roxo pela adição do TTC indicam a presença de bactérias vivas, enquanto
aqueles poços onde não foi observada alteração de cor o extrato inibiu o crescimento dos
microrganismos.
Nos experimentos com fungos foi usada a técnica de sensibilidade a terapia antifúngica
(fungos leveduriformes), baseada no padrão NCLSI-M27-A2 (NCCLS, 2012) adaptado para
trabalhar com extratos vegetais e óleos essenciais. Todos os testes foram realizados triplicata.
Na Figura 3.3 são apresentadas as principais etapas dos testes antimicrobianos usando os
extratos de Rosmarinus officinalis.
33
3.2.2.2 Ensaios de avalição da Concentração Inibitória Mínima e Concentração
Bactericida Mínima.
Com base nos resultados de avaliação da atividade antimicrobiana inicial da seção 3.3.1,
para determinar a concentração inibitória mínima CIM e a concentração inibitória mínima CBM
foi selecionado o extrato de Rosmarinus officinalis obtido no laboratório por apresentar boa
inibição na concentração de 2mg/mL contra os microrganismos SARM, EFVR e C. Albicans.
A metodologia foi da Clinical Laboratory Standard Institute para bactérias com
crescimento aeróbico (CLSI, 2015). 2 mg/mL de extrato de Rosmarinus officinalis foram
dissolvidos em 50μL de Dimetil sulfóxido (DMSO) e 950μL de água destilada estéril, para a
solução anterior foram realizadas diluições seriadas na concentração de: 1, 0,5, 0,25 (mg/mL),
a cada um dos poços da placa foram adicionadas 100 μL, 100 μL de meio de cultura, e 10 μL
de inóculo bacteriano; finalmente foram feitos os controles de inibição (CI), diluição (CD),
crescimento (CC) e esterilidade (CE), para cada concentração do extrato foram feitas triplicatas.
A microplaca foi incubada por 24 horas a 37°C e foi adicionado 10 μL de 2,3,5-Cloreto de
trifenil tetrazólio, 5% V/V, em cada poço, após duas horas foi feita a leitura da absorbância no
equipamento Biotek Synergy 2 (2006) no comprimento de onda de 570 nm. O experimento com
o fungo C. albicans foi baseada no padrão NCLSI-M27-A2 (NCCLS, 2012). Na Figura 3.3 são
apresentadas as principais etapas dos na avaliação antimicrobiana inicial, CIM e CBM.
.
Figura 3.3. Etapas usadas na avaliação antimicrobiana, concentração inibitória mínima, e
concentração bactericida mínima.
Repique dos microorganismos
Preparação das soluções de extratos
vegetais
Preparação placa de
microdiluição
Leitura da placa
34
3.2.3 Obtenção das fibras rotofiadas
3.2.3.1. Preparação das soluções
Na Figura 3.4 são apresentadas as diferentes soluções poliméricas preparadas para a
rotofiação. Inicialmente foram preparadas diferentes concentrações de policaprolactona e
clorofórmio como solvente, as diferentes soluções poliméricas foram homogeneizadas usando
agitação magnética (IKA-RH BASIC 1) durante 3 horas. As fibras obtidas por rotofiação foram
comparadas, obtendo-se fibras com maior resistência na concentração polimérica de 11%
(m/m)
Para a obtenção das fibras de PCL/Surfactante, após a adição do PCL foram adicionados
2% (m/m) dos surfactantes Tween 20 ou Triton X-100. As soluções poliméricas de
PCL/Rosmarinus foram preparadas usando 0,1, 0,2 e 0,3 gramas de Rosmarinus que
correspondem às concentrações: 0,7, 1,4 e 2,1% (m/m), estas concentrações foram
incrementando-se com o objetivo de atingir a máxima concentração de extrato possível de
incorporar na matriz polimérica.
Nas soluções poliméricas de PCL/Rosmarinus/surfactantes foram adicionadas
concentrações de extrato 0,7, 1,4 e 2,1% (m/m) e após 2% (m/m) dos surfactantes Tween 20 ou
Triton x-100. Imediatamente após as soluções serem preparadas, as fibras foram obtidas pelo
processo de rotofiação, com velocidade de rotação de 3500 (rpm).
35
Figura 3.4. Soluções poliméricas preparadas para a obtenção das fibras por Rotofiação.
Figura 3.5. Equipamento usado na rotofiação das fibras obtidas nesta pesquisa
11% (m/m) PCL
Surfactante
2% (m/m)
PCL/Tw20
PCL/Tx-100
Rosmarinus
0,7% (m/m)
PCL/0,7R
PCL/0,7R/Tw20
PCL/0,7R/Tx-100
Rosmarinus
1,4 %(m/m)
PCL/1,4R
PCL/1,4R/Tw20
PCL/1,4R/Tx-100
Rosmarinus
2,1% (m/m)PCL/2,1R
36
3.2.4 Caraterização das fibras PCL, PCL/R e PCL/R/surfactante
3.2.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura
Inicialmente as fibras foram recobertas superficialmente com uma fina camada de ouro
estimada em 92Å usando o Sputer Coater EMITECH, modelo: K450 (Kent, Reino Unido) com
corrente de 100 mA, durante 3 min e voltagem de operação de 20kV. Logo depois, foram feitas
as microfotografias usando o microscópio eletrônico de varredura com detector de energia
(marca LEO 440i, Cambridge, Inglaterra) disponível no Laboratório de Caracterização de
Biomassa, Recursos Analíticos e de Calibração (LRAC-UNICAMP). Os diâmetros das fibras
rotofiadas foram inferidos das imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura, para
cada tipo de formulação foram medidos 90 diâmetros usando o software de análises de imagens,
ImageJ.
3.2.4.2 Caracterização de Absorção na região do Infravermelho (FT-IR).
As análises de espectroscopia de absorção no infravermelho foram realizadas nas fibras
para determinar as novas interações que poderiam surgir entre o extrato, os surfactantes e a
matriz polimérica. O equipamento utilizado foi o espectrômetro de absorção Perkin Elmer,
modelo spectrum 65 com célula ATR (refletância total atenuada); cada amostra foi varrida 64
vezes no espectro de absorção de 500-4500 cm-1. As análises foram realizadas na Faculdade de
Ciências Médicas e da Saúde da PUC-Sorocaba.
3.2.4.3 Caracterização térmica (DSC).
A caracterização térmica das fibras foi realizada com a técnica de calorimetria
exploratória diferencial (DSC) no equipamento DSC modelo 200-F3 MAIA-Netsc, em
atmosfera de nitrogênio com fluxo de 50 mL/min e taxa de 10°C/min. 8 mg das fibras de PCL,
1,4%R, 1,4%R/Tw 20 e 1,4%R/Tx-100 foram colocadas em diferentes cadinhos de alumínio
de tampa furada, o ciclo térmico usado foi dividido em três etapas; primeiro aquecimento na
faixa de 25 a 160°C, resfriamento de 160°C a -90°C e um segundo aquecimento na faixa de -
90 a 160°C. Nos cálculos das entalpias de fusão e cristalização se usou-se o software Netzsch
37
Proteus Thermal Analysis 6.0. As análises foram feitas no Laboratório Multiusuário de
caracterização de materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica – UNICAMP.
3.2.4.3 Molhabilidade
A molhabilidade das fibras foi medida usando o tensiômetro Attension –Theta (Biolin
Scientific) equipado com uma câmera avançada que captura e analisa imagens, determinando
o ângulo de contato da gota de água com a superfície das fibras. Neste ensaio, sob a superfície
das fibras foi depositado uma gota de água deionizada de aproximadamente 10 μL, no total
foram realizadas três medições diferentes (três diferentes gotas) para cada tipo de fibra a 18°C.
Esta análise se realizou no laboratório de colóides e superfícies do Instituto de Química da
Unicamp.
Fabricação de filmes
Devido à influência da porosidade e rugosidade no valor do ângulo de contato, foram
determinados os ângulos de contato dos filmes de todas as formulações obtidos por evaporação
de solvente. Inicialmente, foi dissolvido 11% m/m de PCL em clorofórmio, após adicionou-se
0,7, 1,4 m/m do extrato de Rosmarinus officinalis e 2% m/m dos surfactantes Tween 20 ou
Triton X-100 segundo a formulação; finalmente cada solução foi depositada sobre uma placa
petri dentro de uma cuba saturada com clorofórmio durante 12 horas, após este período os
filmes foram retirados e seus ângulos de contato foram medidos usando o tensiômetro
Attension –Theta (Biolin Scientific).
3.2.5 Capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus officinalis
3.2.5.1 Identificação das principais bandas no extrato
A identificação do ácido carnósico, um dos principais compostos fenólicos presente no
extrato de Rosmarinus officinalis foi feita realizando a varredura na região 200 a 850 nm do
espectro de absorção (UV-VIS), para a leitura do espectro foi usado o equipamento Biotek
38
Synergy 2 (2006) que determina a quantidade de luz absorvida em diferentes comprimentos de
onda. Os picos de absorção resultantes foram comparados com os picos relatados na literatura
para os compostos presentes no Rosmarinus officinalis com inibição contra as bactérias,
SARM, EFVR e o fungo C. albicans.
3.2.5.2 Curva de calibração do extrato Rosmarinus officinalis.
Para a realização da curva de calibração foi preparada uma solução mãe de
concentração 7,5 mg/ml em etanol, a esta solução foram realizadas 7 diluições seriadas com
concentrações de: 3,75, 1,875, 0,937, 0,468, 0,234, 0,117, 0,0586 mg/ml. As absorbâncias das
soluções anteriores foram medidas usando o equipamento Biotek Synergy 2 (2006) na banda
de absorção de 280 nm. Esta banda foi escolhida com base nas comparações entre as bandas
de absorção do extrato e as bandas de absorção os compostos de interesse relatadas na
literatura (seção 4.3.1).
3.2.5.3 Capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus officinalis
A capacidade de incorporação (CI) é definida como a quantidade de extrato incorporado
por unidade de massa de fibra polimérica. A CI nas fibras poliméricas foi determinada de
acordo com a metodologia proposta por Moomand e Lim, 2014. de cada um dos diferentes
tipos de fibras foram submergidas 15 mg em 1 mL de etanol, para a remoção do extrato
incorporado por um período de 24 horas a temperatura ambiente. Após a liberação do extrato,
as fibras foram removidas e as absorbâncias das soluções foram medidas usando o leitor Biotek
Synergy 2 (2006) no comprimento de onda de 280 nm. Na medição da CI das fibras foram
usadas 6 amostras para cada tipo de formulação.
39
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Obtenção do extrato Rosmarinus Officinalis
4.1.1 Identificação do ácido carnósico presente no extrato de Rosmarinus officinalis
por HPLC-UV/DAD.
Na Figura 4.1. observam-se os cromatogramas do ácido carnósico e do extrato de
Rosmarinus officinalis. Este último apresentou boa separação entre os picos dos diferentes
compostos em um tempo de análise de 10 minutos, facilitando a identificação do ácido
carnósico. Para determinar a presença do ácido carnósico no extrato, foram comparados os
tempos de retenção dos diferentes compostos presentes no extrato Rosmarinus com o tempo de
retenção do ácido carnósico (padrão). O tempo de retenção do ácido carnósico foi de 5,48 min,
enquanto o extrato apresentou um pico no tempo 5,854 min, que poderia pertencer ao ácido
carnósico. Para realizar a verificação entre os compostos presentes nos dois picos, foram
comparados na
Figura 4.2 os espectros de absorção UV-VIS correspondentes a estes tempos de
retenção. Os espectros UV-VIS obtidos coincidiram em seus perfis de absorção e, portanto,
verifica-se a presença do ácido carnósico no extrato de Rosmarinus officinalis obtido. Este
composto apresenta atividade antimicrobiana (Del Campo et al., 2000; Repetto et al, 2013;
Zampini et al., 2013).
0 2 4 6 8 10
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Abso
rbân
cia
Tempo de retençمo (min)
Acido carnosico
Rosmarinus officinalis
5,48
Tempo de retenção (min)
40
Figura 4.1. Cromatograma do extrato Rosmarinus officinalis Tr =5,854 min e do ácido
carnósico (Padrão) Tr =5,856 min, no comprimento de230 nm.
Figura 4.2. Espectro de absorção UV-VIS: (A) do ácido carnósico presente no extrato
Rosmarinus officinalis e (B) ácido carnósico (padrão).
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-50
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
550
575
600mAU
5.50/ 1.00
260 313 386 443 652
207
284
326 655
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190mAU
5.39/ 1.00
260 515369 658
206
284
487383 669
B
A
Ab
sorb
ân
cia (
a.u
)
Comprimento de onda (cm-1)
41
4.2 Avaliação atividade antimicrobiana dos extratos de Rosmarinus officinalis
4.2.1 Avaliação da atividade antimicrobiana
Na Tabela 4.1 são apresentados os resultados da avaliação antimicrobiana dos extratos
Rosmarinus officinalis. Foi observado que as bactérias Gram-positivas, SARM e EFVR foram
suscetíveis à ação do extrato obtido no laboratório, no entanto as bactérias Gram-negativas, P.
aeuroginosa e E. coli não apresentaram inibição. Este resultado deve-se às últimas possuírem
uma membrana externa adicional do que as Gram-positivas.
Esta membrana externa possui uma bicamada de lipopolisacarídeos e fosfolipídios,
dentro dos quais são incorporadas porinas e canais inespecíficos. O empacotamento e a rigidez
das bicamadas dos lipopolisacarídeos presentes nas bactérias Gram-negativas são mais rígidas
do que as bicamadas normais. Afetando, por tanto, a permeabilidade de moléculas anfifílicas e
hidrofóbicas, e por consequência retardando a difusão passiva de moléculas hidrofóbicas
(Zgurskaya, Löpez e Gnanakaran, 2017). Por este motivo o extrato Rosmarinus officinalis com
presença de terpenóides com características hidrofóbicas (Ruchika, Naik e Pandey, 2019), não
apresentaram inibição contra as bactérias Gram-negativas.
Tabela 4.1. Teste de microdiluição inicial para os diferentes extratos de Rosmarinus em micro-
organismos Gram-negativos e Gram-positivos e fungo.
Microrganismo
Extrato
Rosmarinus laboratório
(mg/mL)
Rosmarinus
(mg/mL)
E. coli 3521 >2 >2
P. aeruginosa 27853 >2 >2
SARM 43300 <2 >2
EFVR 51299 <2 >2
C. albicans 1023 <2 >2
4.2.2 Determinação da concentração inibitória e bactericida mínima
Na seção 4.2.1 foi avaliada a atividade antimicrobiana usando a concentração de 2
mg/ml de extrato de Rosmarinus officinallis de fabricação própria, pois extratos vegetais com
concentrações inibitórias acima de 1,6 mg/mL são considerados inibidores médios e fracos
42
(Vieitez et al., 2018). Como resultado desta avaliação, o extrato Rosmarinus officinalis de
fabricação própria foi o único que apresentou eficácia. Por esta razão, só este foi usado na
avaliação da CIM e CBM.
Na Tabela 4.2 são apresentados os resultados dos testes de CIM e CBM do extrato de
Rosmarinus officinalis de fabricação própria. Este apresentou boa inibição nas bactérias Gram-
positivas, SARM, EFVR e o fungo C. albicans. Destaca-se o potencial bactericida obtido contra
SARM, o crescimento bacteriano foi inibido a uma baixa concentração de extrato, 0,25 mg/mL.
Esta bactéria é uma das principais causadoras de infecções em feridas de pacientes queimados
(Church et al. 2006). Este extrato também apresentou boa ação inibitória contra C. albicans,
um dos principais patógenos oportunistas, cuja presença tem incremento nos últimos anos
devido ao uso recorrente de antibióticos tópicos de alto espectro (Church et al., 2006).
O mecanismo pelo qual os di-terpenóides fenólicos como o carnosol e o ácido carnósico
presentes no extrato Rosmarinus officinalis exibem propriedades antimicrobianas não é bem
compreendido, mas acredita-se que estes compostos de natureza lipofílica se insertam na
membrana celular, onde um grupo doador da ligação hidrogênio (HBD) interage com os grupos
fosforilados da membrana e produzem sua perturbação (Souza et al., 2011); Repetto et al., 2013
observaram que o uso do ácido carnósico nas bactérias Enterococcus faeccalis e Staphylococcus
aureus resultou na redução e dissipação do potencial trans-membranal das bactérias inibindo as
bombas de fluxo de prótons ocasionando a morte bacteriana. Estas bombas são proteínas que
permitem o transporte ativo de agentes antimicrobianos desde o citoplasma para o meio
extracelular protegendo as bactérias de agentes antimicrobianos (Zgurskaya, Löpez e
Gnanakaran, 2017).
Tabela 4.2. Concentração inibitória mínima e concentração bactericida do Rosmarinus
officinalis.
Microorganismo CIM (mg/mL) CBM (mg/mL)
SARM 43300 0,25 0,5
EFVR 51299 0,5 0,5
C. albicans 1023 1 1
43
4.3 Caracterizações das fibras de PCL, PCL/R e PCL/R/surfactante
Para determinar a concentração máxima do extrato possível de se incorporar nas fibras,
foram preparadas soluções de PCL com as concentrações de extrato: 0,7%, 1,4% e 2,1% (m/m).
Nesta última concentração, o jato quebrava-se e não se alongava para permitir a formação das
fibras. Como consequência, não foram obtidas fibras com esta concentração.
4.3.1 Caracterização morfológica.
Fibras de PCL, PCL/Tween 20 e PCL/Triton X-100
Na figura 4.3 se observam as micrografias das fibras de PCL, PCL-Tween 20
e PCL-Triton x-100 com diâmetros médios de 6,73 ± 1,5, 7,37 ± 1,75 e 7,02 ± 1,61
µm, respetivamente. Nestas fibras não foram observados diferencias estatísticas
significativas entre seus diâmetros (p > 0.05). Da mesma forma, não foi observado
aumento da homogeneidade dos diâmetros devido a adição dos surfactantes Tween
20 ou Triton x-100.
Figura 4.3. Imagens MEV das fibras de PCL, PCL/Tween 20 e PCL/Triton x-100.
Fibras de PCL/Rosmarinus, PCL/Rosmarinus/Tween20 e PCL/Rosmarinus/TritonX-100
Na Figura 4.4 apresentam-se as micrografias das fibras s fibras de PCL, PCL/0,7R
e PCL/1,4R seus diâmetros obtidos foram 6,73 1,5, 6,5 1,78 e 6,13 1,79 µm,
respectivamente. Entre estes não foram observadas diferenças estatísticas significativas (p >
0,05) devido à adição ou incremento da concentração do extrato.
44
Já o diâmetro médio das fibras da formulação de PCL/0,7R/Tx-100 e
PCL/1,4R/Tx-100 diminui de 4,93 ± 1,83 a 3,65 ± 1,32 µm, respectivamente.
Também nas fibras de PCL/0,7R/Tw20 e PCL/1,4R/Tw20 com a adição do
surfactante Tween 20 foi observado a diminuição dos diâmetros de 5,43 ± 1,5 a 3,82
± 1,25 µm, respectivamente. Esta diminuição deve-se à interação existente entre o
extrato e o surfactante.
Segundo as pesquisas feitas por Badrossamay et al., 2010 diâmetros menores
nas fibras durante o processo de rotofiação são devido à diminuição da taxa de
volatilidade do solvente evitando a rápida solidificação do jato polimérico que
promove sua extensão
Chou et al., 2015 analisaram algumas estratégias para a liberação sustentada usando
fibras poliméricas, e discutiram a influência dos diâmetros das fibras no incremento da liberação
de fármacos. Destacando que as fibras de diâmetros menores apresentam taxas de liberação
maiores comparando as fibras de diâmetro maior. Este incremento na velocidade de liberação
explica-se pelo aumento da relação de área superficial por volume (Torres-Martinez et al.,
2018). Em adição, nos sistemas onde o mecanismo de liberação é por difusão, os diâmetros
maiores tem um caminho maior a ser percorrido para o fármaco ser difundido na fibra (Chou,
Carson e Woodrow, 2015). Na Figura 4.5 são observadas as morfologias das fibras obtidas por
rotofiação.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1,4R
TX-1000,7R
TX-100
1,4R
Tw 20
0,7R
Tw20
PCL
1,4R
PCL
0,7R
PCL
Tx-100PCL PCL
Tw 20
Diâ
met
ro m
édio
Figura 4.4. Diâmetro médio das fibras rotofiadas em suas diferentes formulações.
Formulação
(μm)
45
Figura 4.5 Imagens MEV das fibras de PC L carregadas com 0,7% e 1,4% (m/m) de extrato
Rosmarinus officinalis com ou sem adição de 2% (m/m) dos surfactantes Tween 20 ou Triton
X-100.
A formação de poros é um processo complexo dependente de diferentes fatores, entre
os principais são destacados: as propriedades do solvente, a umidade relativa do ambiente, os
mecanismos de separação de fases durante a formação das fibras (Megelski et al. 2002), e a
viscosidade (Lee et al., 2010). As Figura 4.6 e Figura 4.7 apresentam a variação da porosidade
das fibras em função da formulação. Na superfície das fibras de PCL são observados poros
alongados distribuídos aleatoriamente. Nas fibras de PCL foram observadas a diminuição da
46
porosidade nas fibras, sendo maior quando se incrementa a concentração do extrato de 0,7% a
1,4% (m/m).
Nas Figura 4.6 e Figura 4.7 se observam as fibras PCL/0,7 R/Tw 20, PCL/0,7R/Tx-100,
PCL/1,4/R/Tw 20 e PCL/1,4R/Triton x-100. Nestas fibras com adição do extrato nas
concentrações de 0,7 ou 1,4% (m/m) e os surfactantes Tween 20 ou Triton x-100, não foram
observadas superfícies porosas. Uma das causas da diminuição da porosidade deve-se
possivelmente ao decrescimento da taxa da volatilidade do solvente pela adição do extrato nas
concentrações 0,7 ou 1,4% (m/m) e os surfactantes na solução polimérica. Segundo Megelski
et al., 2002 o uso de solventes com maior volatilidade como o Tetrahidrofurano (THF),
incrementam a porosidade em maior proporção do que solventes com volatilidade mais baixa
como as misturas de THF/DMF, onde DMF corresponde a dimetilformamida.
Figura 4.6 Micrografias MEV das fibras de PCL, PCL/T20, PCL/Tx-100 e PCL/0,7R
47
Figura 4.7. Micrografias MEV das fibras de PCL-extrato e PCL-extrato-surfactantes nas
diferentes formulações.
4.3.2 Caracterização química por FTIR
Na Figura 4.8 é possível observar que as fibras de PCL apresentaram picos
característicos em 2944 e 2865 cm-1 pertencentes aos grupos alifáticos assimétrico e simétrico,
respectivamente. Além disso, detectaram-se picos do grupo carbonila do éster em 1721 cm-1 e
do éter assimétrico e simétrico em 1240 e 1162 cm-1, estes picos também foram observados na
literatura por Elzein et al., 2004. No espectro do surfactante Tween 20 se observaram os picos
característicos dos grupos metileno assimétrico e simétrico em 2923 e 2860 cm-1, os grupos
48
carbonila e carbonila estiramento do éster em 1734 e 1643 cm-1, e das vibrações stretching do
grupo éter em 1095 cm-1. Estes picos foram comparados com os reportados na literatura por
Tecante et al., 2018.
Nas Figura 4.8 e Figura 4.9 apresenta-se o espectro do extrato Rosmarinus officinalis,
na região entre os 3000-3700 cm-1 observa-se um amplo pico das vibrações por estiramento do
grupo hidroxila, como consequência da água absorvida durante a armazenagem do extrato. O
pico de absorção presente em 1687 cm-1 pode pertencer ao grupo carbonila dos aldeídos,
cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres ou éteres encontrados nos diferentes compostos do extrato.
Em 1453 cm-1 são observadas as vibrações do anel aromático (C-C) e de suas ligações C-H em
1237 e 1030 cm-1. Estes dados estão de acordo com o publicado na literatura por Imad et al.,
2016.
A Figura 4.8 apresenta o espectro de absorção da fibra 1,4%R/Tw20. Neste espectro
não foram observados novos picos de absorção comparando-os com o espectro correspondente
às fibras de PCL, pela adição do extrato ou surfactante Tween 20 na matriz polimérica. Portanto,
não há novas ligações químicas que possam ser atribuídas a estes.
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
v (C-H)
v (C-H) v (C-C)v (C=O)
vs(C-O-C)
vs(CH3)
v (C=O)
vas(CH3)
vs(C-O-C) vas(C-O-C)v (C=O) vs(CH
2)
vas(CH2)
PCL
Inte
nsid
ade
(a.u
)
Numero de onda (cm-1)
PCL/1,4%R/Tw20
Ext.
Rosmarinus
Tween 20
Figura 4.8. Espectro FTIR das fibras de PCL e 1,4%R/Tw 20, extrato de Rosmarinus officinalis
e o surfactante Tween 20 onde vs* estiramento simétrico, vas* estiramento assimétrico.
49
A Figura 4.9 apresenta o espectro do surfactante Triton X-100. Em 3458 cm-1 é
observado a absorção correspondente às vibrações por estiramento dos grupos hidroxila, e em
2941 e 2871 cm-1 dos grupos alifáticos assimétrico e simétrico, respectivamente. Os picos
pertencentes às vibrações por estiramento do anel aromático em 1512 cm-1 e as assimétricas
associadas com o éter aromático em 1245 e 1110 cm-1 pertencem ao Triton x-100, estes bandas
coincidem com os reportados na literatura por Yang et al., 2012.
Comparando os espectros de absorção das fibras de PCL e 1,4%R/Tx-100, destaca-se
nesta última a presença de um novo pico em 1512 cm-1 (Figura 4.9). O extrato Rosmarinus não
apresentou esse pico característico nessa região e, portanto, corresponde às vibrações stretching
do anel aromático do surfactante Triton x-100 (Yang et al., 2012). A aparição desta ligação
entre a matriz polimérica e o Triton x-100 também foi evidenciada por Segundo et al., 2015 em
fibras poliméricas de policaprolactona usando concentrações crescentes do surfactante Triton
x-100 desde 0,5 até 1,5% (m/m), onde a partir desta última evidencia-se o surgimento do pico
em 1512 cm-1.
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
v (C=O)
vs (CH2)
v (C-O)
vas (CH2)
v (C-O)
Ext.
Rosmarinus
Triton x-100
PCL
PCL/1,4%R/Tx-100
Inte
nsid
ade
(a.u
)
Numero de onda (cm-1)
1512
vs(C-O-C)vas(C-O-C)
v (C=O)
vs(CH2) vas(CH
2)
v (C-H)
v (C-H) v (C-C)v (C=O)
Figura 4.9 Espectro FTIR das fibras PCL e PCL/1,4%R/Tx-100, extrato de Rosmarinus
officinalis e o surfactante Triton X-100, onde vs* estiramento simétrico, vas* estiramento
assimétrico.
50
4.3.3 Caracterização térmica por calorimetria exploratória diferencial (DSC)
Os termogramas das fibras de PCL, PCL/1,4%R, PCL/1,4%R/Tx-100 e
PCL/1,4%R/Tw20 são apresentados nas Figura 4.10 e Figura 4.11. As temperaturas de
cristalização (Tc) determinaram-se no resfriamento, enquanto a temperaturas de transição vítrea
(Tg) e de fusão (Tm) foram determinadas no segundo aquecimento. O grau de cristalinidade
(Xc) foi calculado usando a equação 2 (Lönnberg et al., 2008), onde 𝐻𝑚 é a entalpia de fusão
e 𝐻𝑚0 é a entalpia de fusão para o PCL 100% cristalino, esta é 136,4 J/g (Lönnberg et al.,
2008).
𝑥𝑐(%) =𝐻𝑚
𝐻𝑚0 ∗ 100% (2)
Nas Figura 4.10 e Figura 4.11 entre as fibras de PCL e PCL/1,4%R não foram
observadas variações das Tm e Tc, assim também não existe variação nas fibras
PCL/extrato/surfactante quando os surfactantes Tween 20 e Triton x-100 foram adicionados.
Com a adição do surfactante Triton x-100 nas fibras de 1,4R/Tx-100 foram obtidas as
menores temperaturas de fusão e cristalização 54 e 27,7°C, respectivamente, enquanto que na
Tabela 4.3 se observa que as fibras de PCL/1,4R/Tw20 com adição de Tween 20 apresentaram
menores entalpias de fusão, 55 (J/g) e cristalização, 66 (J/g). Nas Figura 4.10 e Figura 4.11 se
observa que as temperaturas de transição vítrea nas fibras de PCL, PCL/1,4R/Tw20 e
PCL/1,4R/Tx-100 não aumentaram com a adição dos surfactantes, estas temperaturas foram –
62, -57,7 e -59 ºC, respectivamente. Assim também, Segundo, 2015 observou em seus estudos
em fibras poliméricas de policaprolactona e diferentes tipos de surfactantes incluindo o Triton
x-100, que a adição do Triton x-100 na concentração de 1,5% (m/m), aumenta levemente a
temperatura de transição vítrea de -64 a -61ºC.
51
-90 -60 -30 0 30 60 90 120 150
29,0
29,2
28,4
PCL/1,4R/TX-100
PCL/1,4R
PCL/1,4R/T20
Flu
xo d
e ca
lor
(mW
/mg)
Temperatura (C)
PCLEndo
27,7
Figura 4.10. Termogramas por DSC, durante o processo de resfriamento, apresentam as
temperaturas de cristalização das fibras de PCL, PCL-extrato, PCL-extrato-surfactante.
-90 -60 -30 0 30 60 90 120 150
54,2
53,3
53
PCL
PCL/1,4R/Tw-20
PCL/ 1,4R
-61,9
-61,5
-57,7
Flu
xo d
e ca
lor
(mW
/mg)
Temperatura ( C)
-59,0
Endo
PCL/1,4R/TX-100
51
Figura 4.11. Termogramas das fibras de PCL, PCL-extrato, PCL-extrato-surfactante durante o
segundo aquecimento. De esquerda à direita; temperaturas de cristalização e temperaturas de
fusão.
Como consequência da adição do extrato Rosmarinus officinalis e os surfactantes
Tween 20 ou Triton x-100, observou-se a diminuição de Xc das fibras de PCL/1,4R,
PCL/1,4R/Tw20 e PCL/1,4R/Tx-100 (Tabela 4.3). Este decréscimo é mais acentuado usando-
52
se o surfactante Tween 20, chegando à redução de 39% da cristalinidade em comparação das
fibras de PCL. Por outro lado, usando-se o surfactante Triton x-100 nas fibras PCL/1,4R/Tx-
100 foi observada a redução de 19,5% e de 17,5% nas fibras de PCL/1,4R em comparação com
as fibras de PCL.
O grau de cristalinidade indica a relação existente entre as regiões cristalinas e amorfas
da amostra, o aumento da cristalinidade no polímero contribui ao alinhamento parcial das
cadeias poliméricas, influenciando as propriedades físicas e químicas (Nazila et al., 2016). O
surfactante Tween 20 presente na formulação das fibras poliméricas de
PCL/Rosmarinus/Tween 20, ocasionou o decrescimento de aproximadamente 25% da
cristalinidade das fibras de PCL/Rosmarinus. A diminuição da cristalinidade, favorece a
liberação de fármacos, já que as regiões amorfas são as únicas que apresentam permeabilidade
e, portanto, permitem o acesso das moléculas da água na matriz polimérica (Nazila et al., 2016)
Segundo Bikiaris et al, 2011, além da diminuição da cristalinidade também se favorece a
permeabilidade do fármaco o que incrementaria a taxa de liberação e biodegradação da matriz
polimérica como consequência da maior acessibilidade à ligação éster das moléculas do PCL
(Niaounakis, 2013).
Tabela 4.3. Resultados obtidos dos perfis de DSC correspondentes ao resfriamento e segundo
aquecimento.
Amostra Tg (ºC) Tm (ºC) Tc (ºC) 𝑯𝒎 (J/g) 𝑯𝒄 (J/g) Xc (%)
PCL -62 56 29,0 90 85 66
PCL/1,4R -61 56 29,2 74 82 54
PCL/1,4R/Tw20 -57,7 55 28,4 55 66 40
PCL/1,4R/Tx-100 -59 54 27,7 72 71 53
4.3.4 Caracterização superficial
Na Figura 4.12, observam-se os ângulos de contato das fibras e filmes sem adição de
surfactantes. Nestas, não foram observadas o espalhamento das gotas de água sobre suas
superfícies, pois o polímero PCL e o extrato apresentam domínios hidrofóbicos orientados na
superfície das fibras.
53
PCL 0,7%R 1,4% R PCL 0,7%R 1,4% R
0
20
40
60
80
100
120
PCL/
1,4R
PCL/
0,7R
PCLPCL/
1,4R
PCL/
0,7R
PCL
Filme
An
gu
lo d
e c
on
tato
Fibra
Figura 4.12. Ângulo de contato das fibras e filmes de PCL, PCL/0,7%R PCL/1,4% (m/m).
Na Tabela 4.4, observa-se que as fibras sem adição de surfactantes na sua formulação,
os ângulos de contato foram maiores do que 90° e, portanto, foram classificadas como
superfícies hidrofóbicas. Enquanto os filmes apresentaram superfícies hidrofílicas com ângulos
menores do que 90°. As diferenças apresentadas entre os valores dos ângulos de contato das
fibras e filmes é consequência da rugosidade e porosidade das fibras.
Entre os ângulos das fibras de PCL e as de PCL/0,7R não foram observadas diferenças
significativas (p > 0,05). No entanto, nas comparações com as fibras de PCL/1,4R existem
diferenças. Este resultado deve-se à menor rugosidade ou porosidade apresentada nestas
últimas, de acordo com Jonsson et al., 1998, as características rugosas e porosas da superfície
influenciam no espalhamento da gota sobre a superfície sólida, resultando na alteração do
ângulo de contato.
Nos resultados apresentados na Tabela 4.4 observa-se que, os ângulos de contato das
fibras e filmes diminuíram com a adição do surfactante na formulação. As fibras passaram de
ter ângulos maiores a 90° a superfícies super-hidrofílícas com ângulos menores que 5°, e os
filmes de ângulos entre 65 - 71° a ângulos menores a 5°. Esta diminuição nos ângulos de contato
deve-se à orientação dos grupos de cabeça dos surfactantes na superfície das fibras e filmes
como apresentado na Figura 4.13, onde a tensão superficial existente entre as superfícies com
Formulação
54
o meio aquoso se reduz. Por outro lado, as caudas hidrofóbicas dos surfactantes interagem
fisicamente com a matriz polimérica e o extrato, os quais apresentam características
hidrofóbicas. Esta mudança na hidrofobicidade também foi observado por Zargarian., et al
2017, onde as fibras poliméricas de PCL-PEO-PPO obtidas apresentaram ângulos de contato
de 135°, ao adicionar o surfactante Pluronic p123 estas tornaram-se super-hidrofílícas com
ângulos menores do que 5°.
Tabela 4.4.Ângulo de contato das fibras e filmes nas diferentes formulações
Tipo de formulação Ângulo de contato fibra (°) Ângulo de contato filme (°)
PCL PCL/ Tw 20 PCL/ Tx-100
PCL/0,7 R PCL/0,7 R/ Tw 20 PCL/0,7 R/ Tx-100
PCL/1,4 R PCL/1,4 R/Tw20
PCL/1,4 R/ Tx-100
116,9 ± 2,4 < 5 < 5
118,7 ± 4,6 < 5 < 5
105,4 ± 2,3 < 5 < 5
65,2 ± 4,5 < 5 < 5
66,8 ± 1,5 < 5 < 5
70,9 ± 2,0 < 5 < 5
Figura 4.13. Representação esquemática da orientação das moléculas de surfactante na matriz
polimérica, os grupos de cabeça dos surfactantes estão orientados para a superfície das fibras.
4.4 Quantificação do extrato incorporado nas fibras
4.4.1 Identificação das bandas principais do Rosmarinus Officinalis por UV-VIS
Na Figura 4.14 observam-se as bandas de absorção pertencentes ao extrato Rosmarinus
officinalis no espectro UV-VIS. A varredura foi feita na faixa dos 200-900 nm. As bandas
encontradas no extrato foram: 280, 320, 420 e 670 nm. Segundo a literatura, as bandas de
55
absorção compreendidas entre os 280 - 285 nm correspondem aos compostos ácido carnósico
e carnosol (Ang et al., 2008; Herrero et al., 2010). Portanto, a absorção na banda de 280 nm foi
escolhida para a construção da curva de calibração do extrato a partir de diferentes
concentrações.
200 300 400 500 600 700 800
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Ab
sorv
ân
cia
(a
.u)
Comprimento de onda (nm)
280
Figura 4.14. Espectro de absorção do extrato Rosmarinus Officinalis na região UV-Vis.
4.4.2 Curva de calibração do extrato Rosmarinus officinalis.
Na Figura 4.15 observa-se a curva de calibração do extrato Rosmarinus officinalis em
etanol. Esta foi construída pelas medições das absorbâncias em 280 nm nas diluições em série
com concentrações de extrato: 1,875, 0,937, 0,468, 0,234, 0,117 e 0,058 mg mL. A equação da
reta obtida foi Y = 0,651X + 0,0177, com coeficiente de correlação de Pearson de R2 = 0,998,
indicando que existe correlação linear positiva entre a concentração do extrato e sua
absorbância.
56
Figura 4.15 Curva de calibração do extrato Rosmarinus Officinalis no comprimento de onda
de 280 nm.
4.4.3 Capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus officinalis
Para quantificar a massa de extrato incorporado nas fibras foi usada a equação da curva
de calibração do extrato, 𝑌 = 0,651𝑋 + 0,0177, Y corresponde à absorbância do extrato na
banda de absorção de 280 nm e X a concentração (mg/ml) do extrato. Com os valores da massa
de extrato incorporada em cada tipo de formulação e usando a equação 1, foi calculada a
capacidade de incorporação.
% Capacidade Incorporação =massa extrato liberado nas fibras (mg)
Pesso das fibras (mg)∗ 100% (1)
Na Figura 4.16 é mostrada a capacidade de incorporação (CI) do extrato para os
diferentes tipos de formulações. Nas formulações com extrato incorporado de 0,7% (m/m) e de
1,4% (m/m), não foram observadas diferenças estatísticas significativas na quantidade de
extrato incorporado (p > 0,05). Com este resultado, verificou-se que a adição dos surfactantes
Tween 20 ou Triton x-100 nas fibras de poliméricas de PCL com 0,7 e 1,4% (m/m) de
Rosmarinus Officinalis não influenciou sua capacidade de incorporação.
2,01,51,00,50,0
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
S 0,0187236
R-Sq 99,9%
R-Sq(adj) 99,8%
concentração extrato (mg/ml)
Ab
sorv
ânci
a (a
.u)
57
0
2
4
6
8
10
PCL
1,4R PCL
0,7 R
PCL/1,4R
Tx-100
PCL/1,4R
Tw-20
PCL/0,7R
Tx-100
PCL/0,7R
Tw-20
Ca
pa
cid
ad
e d
e in
co
rpo
raç
ao
(%
)
Tipo de formulaçao
% Encapsulaçمo
Figura 4.16. Capacidade de incorporação do extrato Rosmarinus em diferentes tipos de
formulações, usando concentrações de extrato de 0,7 e 1,4 % (m/m)
5 CONCLUSÕES
5.1 Conclusões
O extrato de Rosmarinus officinalis obtido e incorporado nas fibras de PCL apresenta
boas propriedades antimicrobianas contra as bactérias Gram-positivas SARM, EFVR e
o fungo C. Albicans.
A caracterização das fibras de PCL, PCL/1,4R, PCL/1,4R/T20 e PCL/1,4R/T100
permitiu determinar a influência da adição dos surfactantes Tween 20 e Triton X-100.
O estudo de molhabilidade mostrou a mudança na hidrofobicidade das superfícies das
fibras devido a adição dos surfactantes, apresentando ângulos menores a 5º, tornando as super-
hidrofílícas.
A adição do extrato-surfactante favorece a diminuição dos diâmetros das fibras obtidas
por rotofiação.
58
A adição do extrato como dos surfactantes resulta na redução da cristalinidade,
destacando-se a redução de 25% da cristalinidade nas fibras de PCL/1,4R/T20 em comparação
com as de PCL/1,4R.
Os resultados obtidos sugerem que os surfactantes Tween 20 e Triton x-100 podem ser
usados como modificadores das propriedades de matrizes poliméricas junto com extratos
hidrofóbicos visando facilitar a liberação do extrato.
5.2 Sugestões para trabalhos futuros.
• Realizar ensaios de liberação das fibras incorporadas com extrato e surfactantes para estudar
a influência do uso dos surfactantes Tween 20 e Triton X-100.
• Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato de Rosmarinus liberado das fibras nas
bactérias Gram-positivas: EFVR, SARM e C. albicans.
• Realizar ensaios de citoxicidade em fibroblastos do extrato Romarinus officinalis e das
fibras de PCL/Rosmarinus e PCL/Rosmarinus /Tween 2º ou Triton x-100 obtidas por
Rotofiação.
59
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