Organização do Genoma HumanoOrganização do Genoma Humano

Disciplina: GenéticaIIDisciplina: GenéticaIIProfa. Dra. Ana Elizabete SilvaProfa. Dra. Ana Elizabete Silva

PROJETO GENOMA HUMANO

Projeto Epigenoma -2005

Nutrigenômica

1990

GENOMA

•Conjunto de genes???

•Número total de genes???

•Conjunto haplóide de

cromossomos (DNA)

•Informação genética total

nas células humanas

(conteúdo de DNA): 25

diferentes moléculas de DNA

Complemento total de

material genético da célula de

um organismo

EPIGENOMA

•Constitui a cromatina com suas modificações e associações de proteínas que fornece regulação epigenética

•EPIGENÉTICA: são alterações herdáveis na expressão gênica sem modificações na seqüência de bases do DNA - Reversíveis

GENOMA

EPIGENOMA

ONDE OS PROCESSOS ONDE OS PROCESSOS EPIGENÉTICOS OCORREM?EPIGENÉTICOS OCORREM?

• DNA METILAÇÃO PROMOTOR (ilhas CpG)

silenciamento

• HISTONAS ACETILAÇÃO

METILAÇÃO Compactação da cromatina

“Código de histonas”

Como ocorre: - Adição covalente de um grupo metil no carbono 5´ da citosina na molécula de DNA 5-metilcitosina

- Doador: S-adenosilmetionina (SAM)

- Catalisador: DNA-metiltransferases DNMTs (vários tipos e isoformas)

METILAMETILAÇÇÃO DO DNAÃO DO DNA

O resultado da metilação do DNA: silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação

METILAÇÃO DO DNAMETILAÇÃO DO DNA

• O silenciamento dos genes através de fenômenos epigenéticos nem sempre acarreta problemas.Exemplos de eventos em que isso ocorre:

1. Regulação da expressão gênica: - Inativação do X - Imprinting genômico2. Proteção do genoma contra invasão de seqüências de

fora do organismo, por exemplo DNA viral (inativado por adição de metila)

3. Processos neoplásicos

CONSEQÜÊNCIAS DOS CONSEQÜÊNCIAS DOS PROCESSOS EPIGENÉTICOSPROCESSOS EPIGENÉTICOS

PROJETO EPIGENOMA HUMANOParceria do Instituto Sanger (britânico) e empresa Epigenomics (alemã) - 2005

•Pretende esclarecer como fatores ambientais (dieta e estresse) podem interferir no funcionamento dos genes?

•Como o estilo de vida aciona ou silencia os genes?

•Como gêmeos idênticos (mesmo genoma) manifestam doenças diversas, como

esquizofrenia, diabetes ou câncer?

•A metilação do DNA é influenciada pela alimentação suplementação de vit B12,

ácido fólico e betaína ricos em grupo metil desativação gênica

http://www.vmr.ro/pg3-1307.htm

Nutrigenética: analisa as características genéticas individuais que podem influenciar a sua resposta aos alimentos. Nutrigenômica permite estudar ao longo do tempo a influência da dieta na expressão dos genes (relacionar dados genéticos entre indivíduos saudáveis e doentes com a sua dieta)

(99,995%)(99,995%)

30cm30cm(0,005%)(0,005%)

1-5% genoma ~3mm

A maior parte do genoma consiste em DNA repetitivo

MOLÉCULAS DE DNA E RNA

FORMAS DE DNA• A-DNA: hélice gira p/direita; dupla hélice

mais curta e mais grossa; 11pb p/completar uma volta na hélice (conformação A: pouca água)

• B-DNA: hélice gira p/direita; dupla hélice mais longa e mais fina; 10pb p/completar uma volta na hélice (conformação B: DNA em solução)

• Z-DNA: rotação p/esquerda; mais alongado e fino que o B-DNA; 12 pb p/completar uma volta na hélice; em eucariotos assume a conformação Z-DNA devido metilação

Conformações do DNAConformações do DNA

Giro Dextrógiro Sinistrógiro Dextrógiro

pb por giro

11 12 10,4

Diâmetro 25,5 A 18,4 A 23,7 A

Umidade 75% Pu/Py - CH3 92%

Observada

In vitro/vivo?

In vitro/vivo In vitro/vivo

CLASSES DE RNA

RNA codificador

Codifica proteínas:

mRNA (3%)

RNA funcionais

Não traduzidos:

-tRNA (15%)

-rRNA (70%)

RNA não codificadores

(ncRNA)

-snRNA(small nuclear): processamento de RNA transcritos (spliceossomo)

-snoRNA (small nucleolar): modificação do rRNA

-miRNA (micro): regulação da expressão gênica

-siRNA(small interfering): defesa do genoma contra vírus e transposons

RNA pequenos

Cromossomos EucariotosCromossomos Eucariotos

CromatinaCromatina:: DNA + nucleoproteínas + RNADNA + nucleoproteínas + RNA

NucleoproteínasNucleoproteínas -Histonas (H1, H2a, H2b, H3 e -Histonas (H1, H2a, H2b, H3 e H4)H4)

-Não Histonas (ácidas)-Não Histonas (ácidas)Empacotando o Empacotando o DNADNA

Como um filamento de 5cm Como um filamento de 5cm de DNAde DNA (tamanho (tamanho médio do cromossomo) é empacotado numa médio do cromossomo) é empacotado numa cromátide de 5cromátide de 5mm ? (Genoma total= 30 cm) ? (Genoma total= 30 cm) → → empacotamento de 10.000xempacotamento de 10.000x

Nucleossomo: 146pb de DNA + dímeros de histonas Nucleossomo: 146pb de DNA + dímeros de histonas H2a, H2a, H2b, H3 e H4 H2b, H3 e H4

Organização do GenomaCompactação do DNA

Cláudio C. SilvaBIO / UCG

DNA

Nucleossomos

Solenóide

Alças

Domínios

Cromátide do cromossomo metafásico

7x

40x

10.000x

Gene EucariotoGene Eucarioto

Gene sequência de DNA que gera um produto funcional (polipeptídeo ou RNA funcional)

Conceito de Gene: 1 gene 1 proteína ????

GENE GLOBINA BETA (HBB) www.ncbi.nlm.nih.gov National Center for Biotechnology Information

Organização do Genoma Humano

• Genoma humano: 3 bilhões pb

•No. genes: ~25 mil genes

• Cromossomos (23 pares): ~130 milhões pb

• Gene (média): 30 mil pb

• Sequencia codificante (média): 3 mil pb

• Unidade do código genético: 3 pb

• Densidade gênica: variável

Gene:Gene: DNA DNA RNARNA-RNAm-RNAm

-RNAt-RNAt

-RNAr-RNAr

GeralmenteGeralmente: DNADNA

RNAmRNAm

ProteínaProteína

5’

5’ 3’

3’

5’

5’ 3’

3’

DNADNA

RNAmRNAm

ProteínaProteína

e i e i e

e i e i e

Há correlação entre tamanho do gene e tamanho do produto?

5’

5’ 3’

3’

5’

5’ 3’

3’

DNA

RNAm

Proteína

DNA

RNAm

Proteína

e i e i e

e i e i e

Exceções: genes aumentam de tamanho conforme no. e tamanho dos introns: Ex.: globina e molécula de HLA Classe I ~ interferon, mas seus genes são 2 a 4 vezes maiores

Éxons: geralmente pequenos ~150 bases

Íntrons: grandes 1000 – 100.000 bases

Comparação entre os genes humanos da beta-globina, do fator VIII da coagulação e da HPRT (hipoxantina ribosil transferase): genes tamanhos diferentes, mas proteínas c/ tamanhos similares.

proteínas de tamanhos similares

33%

3%

4%

100x

• Cromossomos: variam de 55 a 250Mb (média 130 Mb)

• No. cromossomos: não está relacionado com o tamanho do genoma

• Ex.: Salamandra: genoma 30x maior que humano (90.000.000Kb), mas metade do no. de cromossomos (12 cr.)

TAMANHO DO GENOMA x No. CROMOSSOMOS

• Não há correlação exata tamanho do genoma (no. de genes) e complexidade do organismo:-genoma humano :

200x > levedura S. cerevisae (~12Mb -16 cr.)

30x < plantas e anfíbios220x < ameba (670 bilhões de pb )

• Diferenças devido maior número de sequências DNA repetidas nos genomas maiores

TAMANHO DO GENOMA x COMPLEXIDADE BIOLÓGICA

Paradoxo do valor C (conteúdo de DNA)

http://www.bioloja.com/info/info.asp?id=95

DENSIDADE GÊNICA

• Genes: distribuídos ± ao acaso nos cromossomos→ variação na densidade gênica

• Cromossomos 17, 19 e 22 - ricos em genes• Cromossomos 4 , 13, 18, Y - pobres em genes

• Bandas G claras ( ricas em GC) - ricas em genes → 6p21.3: Complexo HLA (70genes/0,9 Mb)

• Bandas G escuras (ricas em AT) – pobre em genes → Xp21 (2,4Mb): gene DM

DENSIDADES GENÔMICAS DIFERENTES

Complexo HLA - vários genes sobrepostos - 6p21.3

Gene distrofina – Xp21

NÚMERO GENES X PROTEÍNASSPLICING ALTERNATIVO

• Explica diferenças entre modesto tamanho do genoma humano e elevado proteoma:

• ~25 mil genes ≠ 100 mil a 1 milhão de proteínas

QUAL MECANISMO?• Maioria dos genes humanos → Encadeamento

Alternativo ou Recomposição Alternativa

• Alguns genes podem gerar milhares de isoformas de proteínas

• Conforme: sexo do organismo» estado de desenvolvimento» tecido» ambiente

Splicing alternativo: resulta em diferentes combinações da união de éxons → resultando em diferentes proteínas sintetizadas do mesmo pré-mRNA

60% genes humanos apresentam splicing alternativo

SPLICING ALTERNATIVO

SPLICING – EDITORAÇÃO OU PROCESSAMENTO

Introns: sequência consenso 5’ – GU

sequência consenso 3’ - AG

SPLICEOSSOMO

Complexo de snRNP (ribonucleoproteína nuclear pequena) e precursor do mRNA: remoção dos introns

http://www.youtube.com/watch?v=FVuAwBGw_pQ

Exons constitutivos (cinza) ;regiões de SA (vermelho); Introns linhas pretas; Tracejado indicam-se os eventos de splicing.

SPLICING ALTERNATIVO - TROPOMIOSINA

Distribuição de Genes HumanosDistribuição de Genes Humanos

Os genes se distribuem sobre uma das duas fitas do DNAOs genes se distribuem sobre uma das duas fitas do DNA

Como é essa distribuição?Como é essa distribuição?

-Genes dentro de íntrons-Genes dentro de íntrons-Genes sobrepostos-Genes sobrepostos-Genes agrupados-Genes agrupados

DNADNA

genesgenes região intergênicaregião intergênica

Genes dentro de introns: intron 26 contem 3 genes internos transcritos a partir da fita oposta

OGMP: glicoproteína mielínica do oligodendrócito;

EV12A e EV12B: genes humanos homólogos a genes murinos que podem estar implicados na leucemogênese

Genes intrônicos

GENE NF1 - Neurofibromatose

GENES SOBREPOSTOS

Genes das subunidades ATPase 6 e 8 mitocondriais parcialmente sobrepostos e traduzidos em fases de

leitura diferentes

DNA DNA genômicogenômico

Genes de Genes de Cópia Única Cópia Única

SeqüênciSeqüências as

repetitivrepetitivas as

funcionaifuncionaiss

SeqüênciSeqüências as

repetitivarepetitivas sem s sem função função

conhecidconhecid

aa

Famílias Famílias gênicas gênicas

organizadas organizadas em em

único/múltiplúnico/múltiplos os

agrupamentagrupamentososFamílias Famílias

gênicas gênicas dispersasdispersas

DNA DNA altamente altamente repetitivorepetitivo

VNTRVNTR

Elementos Elementos transponíveistransponíveis

DNA RepetitivoDNA Repetitivo

Organização Organização

gênica em tandemgênica em tandem

Organização Organização gênica em gênica em

agrupamento agrupamento

intimointimo Organização Organização gênica em gênica em

agrupamento agrupamento

compostocomposto

Elementos Classe IElementos Classe I

Elementos Classe Elementos Classe II II

50-75%

DNA REPETITIVO

Seqüências repetitivas funcionaisSeqüências repetitivas funcionais

--Famílias gênicas organizadas em um agrupamento Famílias gênicas organizadas em um agrupamento único ou em múltiplos agrupamentos gênicosúnico ou em múltiplos agrupamentos gênicos

-Organização gênica em tandem:-Organização gênica em tandem: Ex. RNAr (única UT – Ex. RNAr (única UT – 250 vezes) – cromossomos 13,14,15,21 e 22250 vezes) – cromossomos 13,14,15,21 e 22-Organização gênica em agrupamento íntimo:-Organização gênica em agrupamento íntimo: Ex. HbsEx. Hbs-Organização gênica em agrupamento composto -Organização gênica em agrupamento composto (genes (genes nãonão relacionados em função e seq.) - : Ex. Complexo HLA (Classe relacionados em função e seq.) - : Ex. Complexo HLA (Classe I e II e Complemento)I e II e Complemento)

--Famílias gênicas dispersasFamílias gênicas dispersas

Ex. histonas (61 genes)Ex. histonas (61 genes) RNAtRNAt (40 subfamílias) (40 subfamílias)

Organização gênica em Organização gênica em tandemtandem

FAMÍLIAS GÊNICAS AGRUPADAS

FAMÍLIA GÊNICA DISPERSAHISTONAS: 61 genes/11grupos

Famílias Gênicas Agrupadas com Pseudogenes:

PSEUDOGENES: sequência de DNA genômico similar aos genes normais, mas não-funcionais (19.000 pseudogenes)

MECANISMOS

Duplicação: •durante o processo de duplicação pode ocorrer modificações (mutações, inserções, deleções) → perda de função

Retrotransposição: transcrição reversa de um mRNA e subsequente reintegração do cDNA no genoma (90% dos pseudogenes)

•Pseudogenes não-

processados: cópias não

funcionais de um gene →

éxons e introns

DUPLICAÇÃO RETROTRANSPOSIÇÃO

•Pseudogenes processados: cópias não-funcionais de éxons de um gene ativo → encontrados em famílias gênicas dispersas → integração nos cromossomos de um cDNA (retrotransposição)

SEQÜÊNCIAS DE DNA REPETITIVAS SEQÜÊNCIAS DE DNA REPETITIVAS EXTRAGÊNICASEXTRAGÊNICAS

--DNA altamente repetitivo:DNA altamente repetitivo: DNA Satélite DNA Satélite--repetições curtas em tandem repetições curtas em tandem (regiões centroméricas e (regiões centroméricas e teloméricas)teloméricas)-não transcritas (heterocromatina)não transcritas (heterocromatina)

-VNTR:VNTR: Repetições em tandem de Número Variáveis Repetições em tandem de Número Variáveis - Minissatélites- Minissatélites

--STR:STR: Repetições em tandem Curtas Repetições em tandem Curtas - MicrossatélitesMicrossatélites

-Seq. Repetidas dispersas: (Elementos transponíveis)-Seq. Repetidas dispersas: (Elementos transponíveis) -SINE (Elementos Nucleares Intercalares Curtos)SINE (Elementos Nucleares Intercalares Curtos)-LINE (LINE (Elementos Nucleares Intercalares Longos)Elementos Nucleares Intercalares Longos)

(1.701 g-cm-3)

(1,690 g-cm-3)

Localização cromossômica das principais classes de DNA repetitivo

MINISSATÉLITES (VNTR): unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), resultam de inserção em tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) → sítio p/ recombinação homóloga.

Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNAhttp://www.fathom.com/course/21701758/

session1.html

MICROSSATÉLITES (STR):

•unidades repetidas de 2-4 pb, como:

CACA...CA;

CAACAA...CAA;

AAATAAAT...AAAT.

• Existem 6,5x105 microssatélites no genoma humano.

•Lócus de microssatélite é multi-alélico: cada pessoa deve ser heterozigota em mais de 70%

•Espalhados por todo o genoma

http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

10

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SEQUÊNCIAS REPETIDAS DISPERSASElementos de transposição: Retrotransposons

• SINE: (Short Interspersed Nuclear Elements) família de repetições Alu

• Família Alu: ~300 pb (ricas em GC)→ ~1 milhão membros no genoma (10% DNA total)→ originada por retrotransposição → localização preferencial em bandas G- (eucromatina – entre genes e dentro de íntrons) → promotora de recombinação desigual (duplicação gênica).

• LINE: (Long Interspersed Nuclear Elements) elementos LINE-1 ou L1

• Família L1: seq. Longas (6 a 8 Kb) → ~850 mil cópias (20% genoma) - move-se com um retrotransposon (transcriptase reversa)

• Alu e LINE1: encontradas em introns e seq. não traduzidas (presentes nos transcritos primários do gene) – Ex.: gene Rb

DNA Repetitivo e Doenças: inserção de elementos L1 ou Alu

• Alu e L1: causa de mutações em doenças hereditárias → retrotransposição → geram cópias que se integram em outras partes do genoma → inativação insercional de um gene

• Inserção de Alu e L1: • Hemofilia A: seq. L1 inserida no gene do fator

VIII → inativação do gene• Neurofibromatose tipo 1: inserção Alu

BENEFÍCIOS X DILEMAS

•Uso indiscriminado de testes genéticos para doenças multifatoriais (SNPs)

•Implicações: validade analítica, validade clínica e utilidade clínica

•Baixo nível de validade clínica: riscos psicológicos e de saúde, discriminação social e estigmatização

DESAFIO

Se o laboratório de Biologia Molecular do IBILCE realizasse testes genéticos para risco de doenças como:

D. Alzheimer

Doença cardiovascular

Diabetes

Depressão

Alcoolismo

Câncer de mama

QUEM FARIA O TESTE??? POR QUE???

Acessar o site www.ncbi.nlm.nih.gov;No quadro “All databases” selecionar “Gene”, colocar símbolo

do gene de interesse. Ex: HBB (hemoglobina, beta) e clicar em Search;

Na tabela que irá aparecer, clicar no primeiro símbolo (HBB) (hemoglobina, beta, Homo sapiens);

Na página seguinte contendo as informações do gene HBB hemoglobina, beta (Homo sapiens), localizar Genomic regions, transcripts, and products e selecionar GenBank em Go to nucleotide:

Aparecerá todas as informações do gene HBB- com a barra de rolagem da página, localizar as seguintes

informações: Gene (1...1686): tamanho do gene em pb- mRNA join (1...142, 273...495, 1346...1686)- CDS (sequência codificadora) join (51...142, 273...495,

1346...1474)

- no final da página está a sequência completa do gene com os números da posição de cada base

Copiar a sequência e colar no WORD. localizar e marcar com cores diferentes o exon 1 (posição 51

até 142), o exon 2 (posição 273 até 495) e o exon 3 (posição 1346 até 1474)

Marcar também o códon de início da transcrição (ATG) e o stop códon (TAA);

 Em seguida, juntar os três exons marcados, deletar os números que ficam no meio da sequência e verificar a quantidade de nucleotídeos (= 444 nt). Esses 444 nt correspondem à sequência consenso e ela é obtida voltando na página das informações do gene e clicando conforme indicado abaixo:

2.  Identifique os modelos de DNA abaixo: A-DNA, B-DNA e Z-DNA . Caracterize e diferencie cada tipo.

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3.      Conceitue o evento abaixo que ocorre durante o processamento do RNAm originando proteínas diferentes. Descreva 3 mecanismos para sua origem ou formação.