Otimização do Meio de Cultura para a Produção de Quitosanase … · 2017. 11. 2. ·...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TESE DE DOUTORADO

Otimização do Meio de Cultura para a Produção de Quitosanase por Metarhizium anisopliae em

Cultivo Descontínuo Submerso

Raimundo Cosme da Silva Filho

Natal/RN

Abril/2013


Otimização do Meio de Cultura para a Produção de Quitosanase por Metarhizium anisopliae em Cultivo

Descontínuo Submerso

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia Química, sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e a coorientação da Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo.

Natal/RN

Abril/2013

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / PPGEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolas Sólimo”.

Silva Filho, Raimundo Cosme da. Otimização do meio de cultura para a produção de quitosanase por Metarhizium

anisopliae em cultivo descontínuo submerso / Raimundo Cosme da Silva Filho. - Natal, 2013. 98 f.: il.

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos. Co-orientador: Gorete Ribeiro de Macedo. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.

1. Quitosana - Tese. 2. Quitina - Tese. 3. Quitosanase – Tese. 4. Metarhizium

anisopliae - Tese. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSEQ CDU 547.458 (043.2)

Ao meu pai, minha mãe e minha

família, em especial aos meus

irmãos e sobrinhos

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida e por me ceder à

oportunidade de iniciar e concluir este trabalho.

A minha mãe Cândida Inocência da Silva que esteve comigo em todos os momentos da

minha vida me educando, me amando e sempre me dando muito carinho.

Ao meu pai Raimundo Cosme da Silva, que não está mais aqui para ver este trabalho,

mas que foi a pessoa que mais me apoiou e me incentivou, em todos os momentos da minha vida,

para que eu pudesse chegar o mais longe possível na minha carreira acadêmica. Pai muito

obrigado por toda atenção, educação, amor e carinho que recebi durante toda a minha vida.

Aos meus irmãos e familiares que sempre estiveram comigo dividindo momentos de

grande alegria e às vezes de tristeza, mas sempre nos mantendo unidos para superarmos todos os

obstáculos.

A minha namorada Rochelly Caroliny por todo amor e carinho que me deu e que me

entendeu nos momentos que estive ausente para a conclusão deste trabalho.

Ao meu orientador Professor Doutor Everaldo Silvino dos Santos por confiar em mim e

me aceitar como orientando além de toda a amizade, orientação e dedicação em todas as etapas de

desenvolvimento e conclusão deste trabalho.

À Professora Doutora Gorete Ribeiro de Macedo, “pessoa que admiro muito como

profissional e principalmente, como pessoa, um exemplo a ser seguido”, pelos conselhos e críticas

quando necessários ao desenvolvimento deste trabalho. Professora a senhora é considerada uma

mãe para de todos os alunos que tiveram a honra de conhecê-la e trabalhar com a senhora.

Aos meus amigos Engenheiros Químicos, Ana Carmen, Ana Katerine, Andréa Farias,

Anita Lima, Sirtys Lessa, Alexandre, Sérgio, Márcio Bezerra e ao Biólogo Daniel Souza, que

sempre me ouviram e que me ajudaram de alguma forma nesse trabalho.

A Eusamar Coelho de Lima, Mazinha, secretária do PPGEQ, pelo apoio, pela paciência e

orientação nas questões burocráticas do processo.

A Carlos e Jardelson, pela grande colaboração e dedicação nos experimentos do

laboratório.

A Sérgio Santana pela grande colaboração e dedicação, o qual não poupou esforços nem

tempo em me ajudar na realização dos experimentos em laboratório.

Ao meu amigo Ubiratan Nazaré por me ajudar na organização do texto e na tradução para

o Abstract.

Finalizando, agradeço ao Laboratório de Engenharia Bioquímica da UFRN por ter cedido

toda a sua estrutura para realização dos experimentos e ao Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química, assim como a todos os professores do Departamento de Engenharia Química

da UFRN que trabalham em pró de uma educação digna e ensino de qualidade para todos os

alunos.

SILVA FILHO, Raimundo Cosme da – Otimização do Meio de Cultura para a Produção de Quitosanase por Metarhizium anisopliae em Cultivo Descontínuo Submerso. Tese de Doutorado. UFRN - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Pesquisa e Desenvolvimento de Tecnologias Regionais – Subárea: Engenharia de Processos – Alimentos e Biotecnologia, Natal/RN, Brasil.

Orientação: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Coorientação: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo ___________________________________________________________________________

RESUMO: No presente trabalho utilizou-se um Planejamento Plackett & Burman, com 8 fatores e 12 ensaios em 2 níveis e mais 3 repetições na condição do ponto central, para se investigar a influência das concentrações de quitosana, peptona, extrato de levedura, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O e FeSO4 na produção da enzima quitosanase por Metarhizium

anisopliae. Os ensaios para produção da enzima foram realizados em cultivo descontínuo submerso. Os resultados para o Planejamento Plackett & Burman mostraram que a atividade quitosanolítica foi favorecida pelo aumento da concentração de substrato (quitosana) e de sulfato ferroso (FeSO4), enquanto que o aumento da concentração dos outros fatores não contribuiu de forma significativa para a atividade quitosanolítica. A otimização do meio de cultura para a produção da enzima foi realizado por meio de um Planejamento Composto Central, com os dois fatores que mais influenciaram a atividade quitosanolítica (quitosana e FeSO4), conforme Planejamento Plackett & Burman, mantendo-se os outros nutrientes em seus valores mínimos. Nesse planejamento, para o fator FeSO4, tomou-se o limite inferior (-1) como sendo o limite superior do Planejamento Plackett & Burman. Os resultados mostraram que a produção da enzima foi favorecida pelo aumento da concentração quitosana e pela diminuição da concentração de FeSO4. A produção máxima de atividade quitosanolítica foi da ordem de 70,0 U/L e foi atingida em apenas 18 h de fermentação, resultado esse vinte e oito vezes maior aos obtidos anteriormente para o mesmo microrganismo que foi 2,5 U/L em 48h.

Palavras-chave: quitosana; quitosanase; Metarhizium anisopliae; Plackett & Burman.

ABSTRACT

In this work a Plackett-Burman Design with 8 factors and 12 trials in 2 levels with 3 repetitions at the center point was used in order to investigate the influence of the concentration of chitosan, peptone, yeast extract, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O and FeSO4 on chitosanase production by Metarhizium anisopliae. Runs were carried out using submerged discontinuous cultivation for enzyme production. The results of the Plackett & Burman Design showed that only two factors, chitosan concentration as well as FeSO4 had influence on chitosanolytic activity, while the increase in concentration of other factors not contributed significantly to the quitosanolítica activity. Cultivation medium optimization for enzyme production was carried out using a Composite Central Design, with the most important factors for chitosanolytic activity (chitosan and FeSO4), in accordance with Plackett & Burman Design, and keeping the other nutrients in their minimum values. On this other design, it was taken the highest limit in Plackett & Burman Design as the lowest limit (-1) to FeSO4 factor. The results showed that the enzyme production was favoured by increasing the chitosan concentration and by decreasing FeSO4. Maximum production for chitosanolytic activity was about 70.0 U/L and was reached in only 18 h of fermentation, a result about twenty-eight times greater than a former study using the same microorganism (about 2.5 U/L at 48 h).

Key-words: Chitosan; Chitosanase; Metarhizium anisopliae; Plackett & Burman

Sumário LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

NOMENCLATURA

INTRODUÇÃO...............................................................................................................................15

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................................................18

2.1. Enzimas................................................................................................................................18

2.1.1. Quitosana e seus derivados........................................................................................19

2.1.2. Quitosanases...............................................................................................................24

2.2. Fungos..................................................................................................................................29

2.2.1. Características gerais..................................................................................................29

2.2.2. Reprodução dos Fungos.............................................................................................32

2.2.3. Metabolismo de fungos..............................................................................................33

2.2.4. Nutrição de fungos.....................................................................................................34

2.2.5. O Fungo Metarhizium anisopliae ..............................................................................36

2.3. Fermentação.........................................................................................................................40

2.3.1. Preparo do inóculo......................................................................................................41

2.3.2. Produção de enzimas em cultivo submerso descontínuo...........................................42

2.4. Planejamento experimental..................................................................................................42

2.4.1. Planejamento fatorial..................................................................................................43

2.4.2. Planejamento Plackett & Burman..............................................................................43

2.4.3. Aplicações do Planejamento Plackett & Burman.......................................................44

METODOLOGIA EXPERIMENTAL.............................................................................................50

3.1. Quitosana..............................................................................................................................50

3.2. Microrganismo.....................................................................................................................50

3.2.1. Escolha da cepa produtora de quitosanase.................................................................50

3.2.2. Manutenção da cepa...................................................................................................50

3.3. Produção de enzima.............................................................................................................51

3.4. Determinação da Proteína Total...........................................................................................51

3.5. Determinação da Atividade Quitosanolítica e Atividade Específica...................................51

3.6. Planejamento Experimental.................................................................................................52

3.6.1. Planejamento de seleção de fatores Plackett Burman................................................52

3.6.2. Planejamento Composto Central para Otimização do meio de cultura para a

Produção da Enzima em Cultivo Submerso.....................................................................................53

3.7. Perfil Cinético durante o Cultivo.........................................................................................56

RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................................................58

4.1. Imagem do micélio de Metarhizium anisopliae em meio PDA ..........................................58

4.2. Planejamento Plackett & Burman........................................................................................59

4.2.1. Análise do Plackett & Burman com 8 fatores e 12 ensaios .......................................59

4.2.2. Análise do Plackett & Burman com 12 ensaios e mais 3 repetições na condição do

ponto central ....................................................................................................................................61

4.3. Planejamento Composto Central para Produção de Quitosanase por Metarhizium

anisopliae em Cultivo Descontínuo Submerso................................................................................64

4.4. Perfil Cinético – Melhor Condição......................................................................................69

CONCLUSÃO.................................................................................................................................75

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................78

APÊNDICE I...................................................................................................................................93

Metodologia para Repique da Cepa ................................................................................................93

APÊNDICE II.................................................................................................................................94

Montagem da Curva de Calibração Usando o Método DNS..........................................................94

APÊNDICE III................................................................................................................................96

Método de Determinação de Proteína Utilizando o Corante Comassie Brilhante Blue G 250

(Método modificado de Sedmak e Grossberg)................................................................................96

Lista de Figuras

Figura 1 – Estrutura da quitosana..................................................................................................20

Figura 2 – Estrutura da glicosamina..............................................................................................23

Figura 3 – Estrutura do sulfato de glicosamina.............................................................................23

Figura 4 – Representação da estrutura geral de uma célula de fungo..........................................30

Figura 5 – Estrutura das Hifas: a) septadas e b) asseptadas...........................................................31

Figura 6 – Conídios de Aspergillus e Penicillium.........................................................................33

Figura 7 – Imagem do MEV do micélio de Metarhizium anisopliae em meio PDA ...................58

Figura 8 – Gráfico de Pareto do planejamento Plackett & Burman mostrando a influência dos

fatores estudados............................................................................................................................60

Figura 9 – Gráfico de Pareto do planejamento Plackett & Burman com triplicata no ponto central

mostrando a influência dos fatores estudados................................................................................63

Figura 10 – Gráfico de Pareto do planejamento Composto Central mostrando a influência dos


Figura 11 – Valores preditos em função dos valores observados..................................................68

Figura 12 – Atividade quitosanolítica em função da concentração de quitosana e da concentração

de FeSO4 para os fatores não significativos no ponto central .......................................................68

Figura 13 – Concentração de proteínas totais em função do tempo de cultivo na produção de

quitosanase por Metarhizium anisopliae em meio de cultivo contendo 0,2% de quitosana ........70

Figura 14 – Perfil da atividade quitosanolítica em função do tempo de fermentação com o

Metarhizium anisopliae cultivado em meio contendo 0,2% de quitosana....................................70

Figura 15 – Perfil da atividade específica da quitosanase em função do tempo de fermentação

com o Metarhizium anisopliae cultivado em meio contendo 0,2% de

quitosana........................................................................................................................................71

Figura 16 – Perfil de açúcares redutores por Metarhizium anisopliae em meio de cultivo

contendo 0,2% de quitosana..........................................................................................................72

Figura 17 – Curva padrão de glicosamina ....................................................................................95

Figura 18 – Curva Padrão de BSA ................................................................................................98

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Comparação das enzimas com os catalisadores químicos..............................................19

Tabela 2 – Fontes naturais de quitina e quitosana ...........................................................................20

Tabela 3 – Níveis para os fatores e seus valores codificados...........................................................53

Tabela 4 – Matriz do planejamento Plackett & Burman com 8 fatores e 12 ensaios e mais 3

repetições na condição do ponto central .........................................................................................53

Tabela 5 – Matriz do planejamento Composto Central...................................................................54

Tabela 6 – Níveis para os fatores e seus valores codificados para o cultivo submerso –

Planejamento Composto Central......................................................................................................55

Tabela 7 – Matriz do planejamento Plackett & Burman com 8 fatores e 12 ensaios.......................59

Tabela 8 – Efeitos Estimados do planejamento Plackett & Burman...............................................60


Tabela 10 – Efeitos Estimados do planejamento Plackett & Burman com triplicata no ponto

central...............................................................................................................................................62

Tabela 11 – Matriz do planejamento Composto Central com os respectivos resultados da atividade

enzimática........................................................................................................................................65

Tabela 12 – Efeitos Estimados do planejamento Composto Central...............................................65

Tabela 13 – Resumo da ANOVA....................................................................................................66

Tabela 14 – Dados para construção da curva de calibração usando o Método DNS ......................94

Tabela 15 – Medidas de absorbância a 600 nm para construção da curva de calibração................94

Tabela 16 – Dados para construção da curva padrão de BSA ........................................................97

NOMENCLATURA

A – Atividade quitosanolítica (U/L)

AE – Atividade específica (U/mg)

ANN-GA – algoritmo genético de rede neural artificial

ANOVA – Análise de variância (Analysis of Variance)

BSA – Albumina de soro bovino (Bovine Sereum Albumin)

CCD – Planejamento Composto Central

CDA – Chitosan Dector Agar

Cs – Concentração de substrato (%)

CP – Concentração de KCl (%)

Da – Dalton

DEQ – Departamento de Engenharia Química

DNS – Ácido Dinitrosalissílico

E – Enzima

Ea – Energia de ativação

EC – Comissão para nomenclatura e classificação de enzimas

EL – Concentração de Extrato de Levedura (%)

FP – Concentração de K2HPO4 (%)

NS – Concentração de NaNO3 (%)

GDA – Grânulos dispersíveis em água

k – Número de fatores, variáveis

LEB – Laboratório de Engenharia Bioquímica

mRNA – RNA mensageiro

n – Número de níveis de um determinado fator

N – Número de ensaios de um planejamento

P – Pressão

PP – Concentração de Peptona (%)

PDA – Batata Dextrose Agar

pH – Potencial hidrogeniônico

Q – Concentração de Quitosana (%)

Qm – Quadrado médio

r – Agitação (rpm)

R2 – Coeficiente de determinação

RA – Razão de aeração

rpm – Rotações por minuto

RSM – Metodologia de superfície de resposta

S – Molécula de substrato

SF – Concentração de FeSO4 (%)

SM – Concentração de MgSO4.7H2O (%)

SQ – Soma de quadrados

SSF – Fermentação de estado sólido

T – Temperatura

TMC – Temperatura de cultivo

V11,V12,V13 – Variáveis inertes para cálculo do erro

VHG – Fermentação de alta densidade

WP – Pó molhável

X – Concentração celular

Xi – variável independente

Xj – variável independente

xi – Fator independente real

x0 – Valor de xi no ponto central

∆xi – Variação de valor

Y – Resposta do modelo de primeira ordem

Yp – Resposta do modelo polinomial de segunda ordem

β0 – Interseção dos modelos de primeira ou segunda ordem

βi – Coeficiente linear dos modelos de primeira ou segunda ordem

βii – Coeficiente quadrático

βij – Coeficiente de interação

Capítulo 1 Introdução


______________________________________________________________________Raimundo Cosme da Silva Filho – Tese de Doutorado – UFRN – PPGEQ

15

1. Introdução As quitosanases foram descobertas simultaneamente há quase quarenta anos por

Monaghan et al. (1973), como pelo grupo de Ramirez-León & Ruiz-Herrera (1972), e

são enzimas obtidas a partir do metabolismo de bactérias, fungos e extraídas de plantas.

Desde então, vários estudos vêm apresentando a obtenção de quitosanase deste

microrganismos, na forma intracelular ou extracelular (Osswald et al., 1994;

Somashekar & Joseph, 1996), como a do presente estudo. A quitosanase (EC 3.2.1.132)

representa uma classe de enzimas hidrolíticas que catalisam a hidrólise de ligação β-

(1→ 4) glicosídica da quitosana, gerando oligômeros chamados quito-oligossacarídeos

(Reddy et al., 2008).

A quitosana é um biopolímero hidrofílico obtido a partir da quitina, um

polissacarídeo abundante na natureza. Na literatura, é considerado quitosana o produto

da desacetilação da quitina para um grau de desacetilação superior a 75% e solúveis em

ácidos como o acético e o fórmico. A quitosana é conhecida por exibir uma ampla

variedade de atividade fisiológica como atividade antitumoral, mas o peso molecular e a

insolubilidade em água da quitosana são desvantagens para várias aplicações.

Atualmente, há interesse nas quitosanas quando as mesmas são convertidas em quito-

oligossacarídeos porque eles não apenas são solúveis em água e possuem baixo peso

molecular, mas também têm atividades biológicas bem notáveis, como atividade

anticancerígena atóxica e biocompatível, incluindo efeito antimetastático, atividade anti-

HIV, hepatoprotetora, antioxidante, hipocolesterolêmica, antimicrobiana,

imunoestimulate, antitumoral, anti-inflamatória e atividade aceleradora da absorção de

cálcio e ferro. No entanto, estes quito-oligossacarídeos são obtidos tradicionalmente na

indústria por reação de hidrólise usando ácidos, que apresenta muitos problemas como

dificuldade em controlar a hidrólise, produzindo uma grande quantidade de

oligossacarídeos de cadeia pequena e oligossacarídeos de baixo rendimento, alto custo

de separação e, também, poluição ambiental, uma vez que utiliza um ácido como

catalisador. Como alternativa, com suas vantagens em termos de compatibilidade

ambiental, baixo custo e reprodutibilidade, a obtenção destes quito-oligossacarídeos por

hidrólise com quitosanase se tornou cada vez mais popular nos últimos anos (Azevedo

et al., 2007).



16

Devido a todos estes aspectos positivos é que, em geral, as enzimas vêm sendo

estudadas em diferentes aplicações, mostrando que esta é uma tendência na indústria.

No presente trabalho, foi desenvolvido um processo fermentativo visando a

otimização do meio de cultura para a produção da enzima quitosanase em cultivo

descontínuo submerso, por Metarhizium anisopliae, capaz de sintetizar oligômeros com

aplicações na indústria farmacêutica e de química fina, partindo de quitosana como

única fonte de carbono.

Nesse caso, avaliou-se, através de um planejamento Plackett & Burman (método

de delineamento de seleção de fatores) e de um planejamento Composto Central as

melhores condições para a produção da enzima. A técnica do planejamento

experimental Plackett & Burman para realizar triagem de fatores na otimização de um

determinado processo foi utilizada neste trabalho para identificar quais os fatores que

influenciam de forma significativa na produção da enzima quitosanase. A influência

destes fatores (concentração de quitosana e concentração de FeSO4) foi então

investigada pelo planejamento Composto Central com 22 experimentos na parte fatorial,

repetição em triplicata no ponto central e quatro experimentos na parte axial. A

repetição do ponto central permite também a determinação do erro puro e da

repetibilidade do processo, sendo uma forma de identificar melhor se o processo está

sob controle.

Do ponto de vista industrial é de relevante importância a realização de estudos

para a otimização da produção da quitosanase de forma contínua ou em grandes

bateladas.

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica



18

2. Revisão Bibliográfica 2.1. Enzimas

As enzimas são catalisadores biológicos constituídos por longas cadeias de

aminoácidos que atuam em substratos reduzindo a energia de ativação, acelerando assim

a velocidade da reação, e transformando-os em produtos. Sua atuação catalítica visa

facilitar a atividade das células através da quebra de moléculas ou junção das mesmas

para formação de novos produtos. Podem apresentar alto grau de especificidade relativa

a apenas um substrato ou a vários substratos ao mesmo tempo, como a certos tipos de

ligações glicosídicas α-1,4 das moléculas de amido, ou para determinado tipo particular

de isômero óptico como ocorre na oxidação da β-D-glicose pela glicose oxidase (Furigo

Junior & Pereira, 2001).

Enzimas são proteínas que apresentam em sua estrutura um centro ativo

(apoenzima) e, em alguns casos, um grupo prostético denominado cofator (coenzima ou

íon metálico ativo) e sua atividade depende de alguns fatores como estrutura da

proteína, número de cadeias peptídicas, arranjo dessas cadeias na molécula, natureza do

substrato e natureza do grupo prostético (Politzer & Bon, 2006).

Todos os organismos vivos produzem, em pequena ou grande quantidade, certa

variedade de enzimas, sejam elas intra ou extracelulares. As enzimas extracelulares são

excretadas para o meio externo e podem decompor compostos insolúveis como

celulose, quitina e quitosana.

Algumas destas enzimas podem ser usadas tanto nas indústrias de detergentes,

têxteis e farmacêuticas, como também de alimentos, de bebidas, etc., sendo utilizadas

em processos biotecnológicos industriais em substituição aos processos químicos que

muitas vezes causam grandes prejuízos ao meio ambiente. A produção comercial das

enzimas pode ser realizada através do cultivo de microrganismos como fungos e

bactérias.

Na Tabela 1 mostra-se uma comparação das enzimas com os catalisadores

químicos, levando-se em conta algumas das características dos dois catalisadores.

Destaca-se que alguns parâmetros da Tabela 1 demonstram a maior importância das

enzimas, quando comparadas com os catalisadores químicos, principalmente a

especificidade ao substrato, as condições de reação, o consumo de energia e a



19

velocidade de reação, como desvantagem cita-se o custo de obtenção (isolamento e

purificação).

Tabela 1 – Comparação das enzimas com os catalisadores químicos (Adaptado de

Furigo Junior & Pereira, 2001).

Característica Enzimas Catalisadores Químicos

Especificidade ao substrato Alta Baixa

Natureza da estrutura Complexa Simples

Sensibilidade à T e pH Alta Baixa

Condições de reação (T, P e pH) Suaves Drástica (geralmente)

Custo de obtenção (isolamento e purificação) Alto Moderado

Natureza do processo Batelada Contínuo

Consumo de energia Baixo Alto

Formação de subprodutos Baixa Alto

Separação catalisador/produtos Difícil/cara Simples

Atividade catalítica (temperatura ambiente) Alta Baixa

Presença de cofatores Sim Não

Estabilidade do preparado Baixa Alta

Energia de Ativação Baixa Alta

Velocidade de reação Alta Baixa

2.1.1. Quitosana e seus derivados

A quitosana e seus derivados apresentam grande importância devido ao

conhecimento de suas funcionalidades biológicas, médicas, tecnológicas, etc

(Shimosaka et al, 1993; Shimosaka et al, 1995; Mitsutomi et al., 1995). A quitosana é

obtida da quitina, polissacarídeo abundante na natureza, extraído principalmente das

carapaças de caranguejos, lagosta e camarões. A quitosana é um polímero natural,

biodegradável, não tóxico e de alta massa molecular obtido a partir de animais

marinhos, insetos e microrganismos (Tabela 2).



20

Tabela 2 – Fontes naturais de quitina e quitosana. (Adaptado de Polymar, 2003).

Animais

Marinhos

Insetos Aracnídeos Microrganismos

Anelídios Formigas Escorpiões Leveduras

Moluscos Besouros Aranhas Fungos

Lagosta Esporos

Camarão

Caranguejo

Krill

A Figura 1 abaixo mostra a estrutura química da quitosana

Figura 1 – Estrutura da quitosana (Fonte: Polymar, 2003)

Quitosana totalmente desacetilada não existe na natureza. Graus de acetilação

(GA) nferior a 50% a torna mais solúvel em soluções ácidas (Muzzarelli, 1993;

Muzzarelli et al., 1994; Dung et al., 1994; Stoyachenko et al.,1994). Pelletier &

Sygusch (1990) enfatizaram que grande parte dos resíduos sólidos da indústria

pesqueira, principalmente da carcinicultura, é jogada ao mar ocasionando degradação

ambiental. Logo, a utilização desses resíduos como matéria-prima para formação de

novos produtos, não só reduz de forma drástica o impacto ambiental, mas também daria

maior valor agregado à indústria pesqueira.

A demanda cada vez maior de consumidores por alimentos mais saudáveis, sem

conservantes químicos, tem motivado pesquisas à descoberta de novos agentes

antimicrobianos naturais. Sendo assim, a atividade antimicrobiana incomum da



21

quitosana e seus derivados contra microrganismos, tais como bactérias, bolores e

leveduras tem tido maior atenção ultimamente.

Devido à interação entre a quitosana, que é positivamente carregada, e as

membranas celulares dos microrganismos, negativamente carregadas, ocorre a formação

de verdadeiros poros na membrana, que são canais de vazamento de conteúdo protéico e

outros componentes intracelulares. A quitosana tem também a propriedade de agir como

agente quelante que se liga de forma seletiva a traços de metais, inibindo, assim, a

produção de toxinas e o crescimento microbiano. Ainda é capaz de ativar mecanismos

de defesa em tecidos hospedeiros, atuando como agente sequestrante de água e inibindo

várias enzimas. A ligação da quitosana com DNA e a inibição da síntese do mRNA

ocorre via penetração da quitosana no núcleo dos microrganismos e interferência na

síntese do mRNA e proteínas, (Craveiro et al., 2004).

Em um estudo clínico conduzido por Giustina & Ventura (1995) com 100

pessoas com sobrepeso de 10 a 25%, ao final de 4 semanas as pessoas que receberam

quitosana demonstraram perda de peso significativa (7,3 Kg contra 3,0 Kg nos grupos

controle). As pessoas que tomaram quitosana também demonstraram redução na pressão

sanguínea sistólica (de 145 para 135 mm Hg) e diastólica (92.6 para 84.2 mm Hg),

assim como uma redução na taxa respiratória (27.6/min a 21.2/min).

Kondo & Osada (1996) pesquisaram a influência da quitina e da quitosana na

biodisponibilidade do zinco em ratos alimentados com uma dieta com suplementos de

5% ou sem fibra dietética (quitina, quitosana, celulose, pectina e agar-agar) durante 31

dias. Observaram que os ratos alimentados com dietas contendo 5% de fibras, exceto

quitosana, o consumo de alimento foi maior do que o controle. O ganho de peso em

todos os grupos alimentados com fibra foi maior do que o controle, exceto para o grupo

suplementado com quitosana (5%) onde a ingestão de alimento e o ganho de peso foram

menores do que os grupos controle e das demais fibras.

Segundo Craveiro et al. (2004), derivados da quitosana obtidos pela reação com

ácidos carboxílicos, podem promover ao polímero uma solubilidade especial em água.

Esses compostos possuem estrutura química semelhante ao ácido hialurônico e

fornecem uma excelente compatibilidade com o tecido epitelial. As soluções obtidas

com esses derivados podem ser facilmente incorporadas a formulações cosméticas,

mostrando melhor compatibilidade com surfactantes iônicos e emulsificantes,

apresentando estabilidade em uma larga faixa de pH.



22

Han et al. (1999) examinaram os efeitos da quitosana sobre a atividade da lipase

pancreática in vitro e sobre o grau de armazenamento de gorduras induzido em ratos

pela administração oral de uma dieta rica em gorduras por nove semanas. Como

resultado, observou-se que os animais alimentados com quitosana, reduziram o peso

corporal, a hiperlipidemia e a gordura hepática. Como conclusão, os autores propõem

que os efeitos anti-obesidade da quitosana em ratos alimentados com alto teor de

gordura se devem parcialmente a inibição da absorção intestinal das gorduras dietéticas.

Em outro ensaio, Zahorska-Markiewicz et al. (2002) realizaram um estudo para

avaliar o efeito da quitosana no tratamento da obesidade. Segundo os autores do estudo,

a quitosana pode ser usada como um valioso e seguro coadjuvante em tratamentos para

a obesidade em longo prazo. A quitosana parece acentuar a redução da pressão arterial,

juntamente com a perda de peso.

Assis (2010) estudou a produção e caracterização de quitooligossacarídeos

produzidos pelo fungo Metarhizium anisopliae e avaliação da citotoxicidade em células

tumorais. A hidrólise da quitosana foi realizada em tempos de 10 a 60 min para a

produção de quitooligossacarídeos. A avaliação da citotoxicidade dos oligômeros de

quitosana foi realizada em células tumorais (HepG2 e HeLa) e não tumoral (3T3). A

produção de oligômeros de quitosana teve maiores rendimentos durante 10 minutos de

hidrólise, os pentâmeros apresentaram concentração de 0,15 mg/mL, no entanto os

hexâmeros, que apresentam maior interesse por causa de suas propriedades biológicas,

só foram detectados com 30 minutos de hidrólise com uma concentração de 0,004

mg/mL.

Ghorbel-Bellaaj et al. (2010) estudaram a otimização da extração de quitina a

partir de fermentação de resíduos de camarão por Pseudomonas aeruginosa A2

utilizando o planejamento Plackett-Burmam e a metodologia de superfície de resposta.

Os resultados mostraram que a eficiência máxima de extração da quitina foi conseguida

nas seguintes condições: concentração de casca de camarão 50g/L, glicose 50g/L, tempo

de incubação de 5 dias e inoculo como 0,05 OD (densidade óptica).

A glicosamina, unidade monomérica básica da quitosana, possui atividade

antiinflamatória e tem grande importância na construção e manutenção da cartilagem,

no tratamento de enfermidades como: febre reumática, artrose e principalmente a artrite

e osteoartrite na forma aguda ou crônica (Polymar, 2003). A Figura 2 apresenta a

estrutura química da glicosamina.



23

Figura 2 – Estrutura da glicosamina (Fonte: Polymar, 2003)

O sulfato de glicosamina é um derivado da quitosana sendo utilizado no

tratamento da osteoartrite sintomática dos joelhos, quadris, coluna, mãos e outras

regiões (Craveiro et al., 2004). O sulfato de glicosamina estimula a síntese de

proteoglicanos necessários para o bom funcionamento das articulações, estimula a

regeneração das cartilagens e ainda incorpora enxofre ao tecido cartilaginoso. Estudos

de longa duração, acima de 3 anos, mostram que o sulfatos de glicosamina evita a

progressão de danos estruturais nas articulações e induz melhora significativa nas dores

e funções físicas (Craveiro et al., 2004). A Figura 3 apresenta a estrutura química do

sulfato de glicosamina.

Figura 3 – Estrutura do sulfato de glicosamina (Fonte: Polymar, 2003)



24

2.1.2. Quitosanases

Dependendo do tipo de quitosanase obtida, ocorrem diferentes mecanismos de

hidrólise da quitosana, isso devido a diferentes microrganismos produzirem enzimas

com diferenças nas suas estruturas (Kurita et al., 1977; Seino et al., 1991).

Quitosanases (EC 3.2.1.132) são enzimas que catalisam a reação de hidrólise de

quitosana em oligossacarídeos. As enzimas quitosanases são produzidas por vários

microrganismos, bactérias, actinomicetos e fungos, e até por algumas plantas. Estas

enzimas agem em polímeros com grau de acetilação de 30% a 60%. Os monômeros

resultantes da hidrólise da quitosana por estas enzimas são melhores digeridos, ao serem

ingeridos, como é o caso da glicosamina. Estudos efetuados até o presente momento

classificam as quitosanases em cinco famílias: 5, 8, 46, 75, 80, sendo que a família 46 é

a mais estudada. As quitosanases tem grande aplicação na geração de oligômeros de

quitosana (Somashekar & Joseph, 1996; Chen et al., 2005).

Nogawa et al. (1998) estudaram a produção, purificação e caracterização total de

uma quitosanase produzida pelo fungo Trichoderma reseei PC-3-7. Estes pesquisadores

inocularam 106 conídios em 100 mL de um meio basal contendo 0,3% de N-

acetilglicosamina em incubator rotativo com agitação de 220 rpm a 28oC. Destaca-se

que o fungo não produziu quitosanase em meio contendo quitosana ou quitina.

Entretanto, o microrganismo produziu quitosanase em meio contendo glicosamina e N-

acetilglicosamina, sendo que para este último obteve-se uma atividade específica

máxima de 1,5 U/mg após 72 horas de incubação. É importante ressaltar que uma

agitação vigorosa favoreceu a produção da enzima. Esse artigo ilustra a presença de

exo-β-D-glicosaminidase e exo-β-D-N-acetilglicosaminidase.

Piza et al. (1999) estudaram a produção, purificação e caracterização parcial de

uma quitosanase produzida por Bacillus cereus. Nesse caso, investigou-se através de um

planejamento fatorial fracionário a influência dos fatores: concentração de sulfato de

amônio (0,4; 2,2 e 4,0%), razão de aeração (2; 6 e 7), tempo de fermentação (16; 24 e

32 horas), pH (5; 6 e 6,5) e concentração de quitosana (1,0; 1,5 e 2,0%). Os resultados

mostraram que os fatores mais significativos para esse planejamento foram a

concentração de sulfato de amônio, a aeração, o pH e a interação entre sulfato de

amônio e a aeração.

Cheng & Li (2000) estudaram a preparação de oligossacarídeos utilizando

quitosanase produzida por Aspergillus sp e constataram que a enzima foi largamente



25

induzida em meio contendo quitosana como única fonte de carbono e também na

presença de quitina coloidal. A indução da enzima foi realizada em temperaturas

variando na faixa de 28 a 30ºC, pois essa espécie não cresceu bem em temperaturas

superiores a 37ºC.

Zhang et al. (2000) estudaram a produção, purificação e caracterização de

quitosanase e Exo-β-D-Glucosaminidase por Aspergillus oryzae IAM2660. Os

microrganismos utilizados neste estudo foram mantidos em placas de Petri contendo

agar para contagem em placas (PDA). Destaca-se que para produzir a enzima, conídios

foram retirados das placas e inoculados em meio Czapeq-dox com os seguintes

componentes: 1,0g K2HPO4, 0,5g KCl, 2,0g NaNO3, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,02g

FeSO4.7H2O, 20g de sacarose e 1,0L de água deionizada, com pH do meio igual a 5,5.

Foi adicionado ao meio 0,5 g de peptona e 0,5g de extrato de levedura com

concentração de esporos da ordem de 1,0x106 esporos.mL-1. Após a incubação, feita em

incubador rotativo a 26ºC por um período de 60h, micélios foram coletados e após

filtração e secagem a 80ºC foram utilizados para ensaio de quitosanase.

Kuroiwa et al. (2002) estudaram os fatores que afetam a composição de

oligossacarídeos produzidos através da hidrólise de quitosana por quitosanase originária

de Bacillus pumilus BN-262. Neste experimento foi utilizado quitosana 100%

desacetilada dissolvida em ácido acético 1M. O pH do meio foi ajustado em 5,6. Neste

estudo a quitosanase foi imobilizada em agar e Sepharose. Os resultados mostraram que

a concentração de enzima, a temperatura, a velocidade de agitação, e concentração de

substrato influenciaram de forma significativa na composição dos oligossacarídeos

produzidos.

Ichikawa et al. (2002) estudaram a imobilização e estabilização da ligação

multiponto da quitosanase tendo agar como suporte e concluíram que a imobilização

aumentou a termoestabilidade da quitosanase. Os oligossacarídeos de quitosana foram

continuamente produzidos usando um reator coluna contendo quitosanase imobilizada.

A percentagem de quitosana imobilizada após 28 dias de reação foi de 44%.

Hung et al. (2002) estudaram a purificação, através de troca iônica, e

caracterização da hidrólise sobre ação da quitinase e quitosanase purificadas do meio

contendo Bromelina comercial. Destaca-se que a quitinase purificada apresentou pH,

temperatura e Km ótimo para ação catalítica em meio contendo quitina de 4,0, 60ºC e



26

0,2mg.mL-1, respectivamente. Enquanto que quitosanase apresentou o pH, temperatura e

Km ótimo de 3,0, 50ºC e 0,88mg.mL-1, respectivamente.

Zhu et al. (2003) estudaram as melhores condições fermentativas e propriedades

de uma quitosanase produzida por Acinetobacter sp. C-17. A espécie de bactéria

utilizada neste ensaio foi isolada do solo e identificada como sendo Acinetobacter sp C-

17 e capaz de produzir quitosanase. O microrganismo foi mantido em placas contendo o

meio agar com os seguintes componentes: 0,5 % de quitosana, 0,2 % K2HPO4, 0,1 %

KH2PO4, 0,07 % MgSO4, 0,05 % NaCl, 0,05 % KCl, 0,01 % CaCl2, 0,05 % de extrato

de levedura e 2 % agar, o pH do meio de manutenção foi mantido em 7,2 e a

temperatura foi mantida em 30ºC durante 3 a 5 dias, para identificar a ação da enzima

quitosanase. A ação da quitosanase foi identificada através da observação de uma

colônia de microrganismo existente na placa. A bactéria foi então isolada da placa e

colocada em fermentador rotativo a 200 rpm durante 72h em meio contendo: 0,07 %

K2HPO4, 0,03 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4, 0,03 % peptona, 0,03 % de extrato de

levedura e 1,0 % de quitosana. O pH foi de 7,0 e a temperatura 30ºC. Como fontes de

carbono foram utilizadas além de 1,0 % de quitosana, 1,0 % de quitina e 1,0 % de

glicose. Os resultados mostraram que as melhores condições para produção da

quitosanase foram alcançadas quando se utilizou 1,0 % de solução de quitosana a 30ºC,

pH 7,0 durante 24 horas de incubação.

Liu et al. (2003) estudaram a produção de quitinase por Verticillium lecanii

F091 usando fermentação submersa, a atividade de quitinase foi de 9,95 mU/mL em um

meio de cultura otimizado, com um volume de cultura de 200 mL, agitação de 150 rpm

e temperatura de 24ºC cultivado em incubador rotativo e concluíram que a taxa de

agitação e o pH foram os fatores mais significativos para a produção de quitinase, no

entanto, as taxas de agitação e aeração poderiam modificar a concentração de oxigênio

dissolvido afetando diretamente no crescimento do Verticillium lecanii e na produção

de quitinase.

Donzelli et al. (2003) estudaram a hidrólise enzimática avançada de quitina de

casca de caranguejo langostino com misturas de enzimas de bactérias e fungos e

concluiram que a combinação de enzimas de Trichoderma atroviride e Serratia

marcescens foram capazes de degradar completamente altas concentrações de quitina

(100g/mL) a partir de carapaças de caranguejo langostino convertendo a N-

Acetilglicosamina (78%), glucosamina (2%) e quitobiose (10%). Enzimas de fonte



27

procariótica apresentaram atividades menores que as enzimas de T. atroviride, para

catalisar a reação com quitosana.

Jo et al. (2003) estudaram a caracterização e a avaliação cinética de quitosanase

produzida por Bacillus sp. Destaca-se que na produção da enzima utilizada neste ensaio

o meio continha 0,5% de concentração de quitosana, 1% de triptona e 1% de NaCl, o

pH do meio foi ajustado em 5,5 e a temperatura foi mantida em 37ºC com agitação de

180 rpm em incubador rotativo.

Fu et al (2003) estudaram a caracterização de três iso-enzimas de quitosanase

isolada de pepsina comercial e denominado como PSC-I, PSC-II, PSC-III,

respectivamente, em relação a hidrólise enzimática da quitosana, o meio ótimo para a

produção destas iso-enzimas continha as seguintes características: pH 5,0; 5,0 e 4,0 e

temperaturas de 40ºC, 40ºC e 30ºC, o valor de Km foi de 5,2, 4,0 e 5,6 mg.mL-1,

respectivamente. As massas moleculares das três iso-enzimas foram de 40 kDa. Os

resultados mostraram que as três iso-enzimas apresentaram atividade em meio contendo

quitosana, produzindo oligômeros da ordem de 68 – 88% desacetilada.

Choi et al. (2004) estudaram a produção, purificação e caracterização total de

uma quitosanase produzida por Bacillus sp KCTC 0377BP. Nesse caso, com relação à

produção da enzima foi possível obter um aumento de 1,2 U/ml em incubator rotativo

para 100,0 U/ml em fermentador piloto de 500 L, utilizando uma concentração de

substrato de 0,5% de quitosana e como fonte de nitrogênio polipeptona (2,5%) em pH

igual a 6,8, com 100 rpm de 100,0 rpm a 30oC.

Shimosaka et al. (2003) estudaram a produção, purificação e caracterização total

de duas quitosanases produzida por Acinetobacter sp CHB101. Nesse caso, com relação

à produção da enzima os pesquisadores usaram dois meios, um contendo glicose e outro

contendo quitosana. Com relação à cinética, o meio contendo quitosana fornece um

tempo de geração de 280 minutos, enquanto que no meio contendo glicose a taxa de

crescimento foi mais elevada e o tempo de geração foi de apenas 110 minutos. Os

autores observaram que após os dois primeiros dias de cultivo a atividade

quitosanolítica permaneceu baixa (na ordem 0,10 a 0,20 U/mL). Durante a fase de

crescimento exponencial o valor da atividade permaneceu com valor inferior a 0,01

U/mL, começando a aumentar ao atingir a fase estacionária, indicando assim que a

produção da enzima é não associada ao crescimento.



28

Kim et al. (2004) estudaram a produção, purificação e caracterização de uma

quitosanase produzida pelo Bacillus sp e identificado pelo número 1299. Destaca-se que

na produção da enzima quitosanase foi utilizado um meio contendo os seguintes

componentes: 0,5 % de quitosana, 0,42 % (NH4)2SO4, 0,2 % K2HPO4, 0,02 % uréia,

0,03 % CaCl2.2H2O, 0,03% MgSO4.7H2O, 0,1% peptona, 0,2% Tween 80, 0,2 % da

solução (0,5% FeSO4.7H2O, 0,16% MnSO4.H2O, 0,14% ZnSO4.7H2O, 0,2% CoCl2) e

1,7% agar. O pH do meio para este ensaio foi mantido em 7,0. Este microrganismo foi

escolhido por ser grande produtor de quitosanase.

Chen et al. (2005) estudaram a purificação e a caracterização de dois tipos de

quitosanase produzidas por Aspergillus sp. CJ22-326 em cultivo submerso. Na

produção da enzima foi utilizado um meio de cultivo contendo 1,0% de quitosana, 2,0%

de gérmen de trigo, 0,2% de sulfato de amônio, 0,2 % de fosfato de potássio e 0,05% de

sulfato de magnésio por litro de solução em pH 5,6. O cultivo foi realizado em frasco de

500 mL contendo 150 mL de meio de cultura a 30ºC por 96 horas com uma agitação de

150 rpm. Os autores apresentam um gel de eletroforese com as duas enzimas purificadas

com massa molar de 29 kDa e 109 kDa.

Silva Filho et al. (2005) estudaram, através de planejamento fatorial 24 com

repetição em triplicata no ponto central, a produção de quitosanase por Aspergillus

ochraceus em cultivo descontínuo submerso. Os resultados mostraram que foi possível

produzir quitosanase com atividade na ordem de aproximadamente 5,9 U/mL utilizando

Aspergillus ochraceus e que a atividade foi favorecida pelo aumento da agitação (r), da

razão de aeração (RA) e da concentração de substrato (Cs), enquanto que o aumento da

temperatura de cultivo (TMC) não favoreceu a resposta (atividade quitosanolítica).

Pode-se classificar as quitosanases em endoquitosanases e exoquitosanases. As

primeiras diferenciam-se por catalisar a hidrólise aleatoriamente, no interior do

biopolímero, gerando diversos tamanhos de oligossacarídeos. As exoquitosanases são

capazes de hidrolisar as terminações não redutoras, produzindo assim unidades

redutoras (Peter, 2005).

Palma-Guerrero et al. (2008) estudaram o biocontrole de fungos patogênicos e

demonstraram a lise da membrana plasmática e a inibição da germinação de esporos de

fungos. Eles observaram que os fungos entomopatogênicos e nematófagos foram menos

inibidos pela quitosana que os fitopatogênicos e micoparasíticos provavelmente porque

apresentam a enzima quitosanase que degrada a quitosana. Mesmo assim, a quitosana



29

pode ajudar a desenvolver novas estratégias para o biocontrole em geral de fungos

patogênicos, evitando o uso de fungicidas que prejudicam o meio ambiente e a saúde

humana.

Pagnoncelli (2008) estudou a produção de quitooligossacarídeos com

propriedades nutracêuticas a partir da quitosana por hidrólise enzimática, utilizando

processo fermentativo simultâneo. Duas cepas produtoras de quitosanaes foram

selecionadas, Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis, e avaliadas quanto

ao comportamento em meio de cultivo contendo açúcares simples e em relação às

variações de pH do meio. Os quitooligossacarídeos produzidos a partir do complexo

enzimático da primeira cepa apresentaram maior pico após 9h de hidrólise, enquanto

para a segunda cepa avaliada, após 20min, observou-se quitooligossacarídeos com grau

de polimerização entre 3 e 6 unidades.

2.2. Fungos

2.2.1. Características gerais

Desde o final dos anos 60 que os fungos deixaram de pertencer ao reino das

plantas e passaram a ter um reino próprio chamado de Reino Fungi. Foi a partir de

estudos morfológicos, bioquímicos e citológicos onde se concluiu que eles são tão

diferentes dos vegetais como dos animais. Distinguem-se de outros organismos

eucariotas por serem seres quimiorganoheterotróficos e, ainda, por apresentarem parede

celular rígida que é composta por quitina e glucano e uma membrana celular em que o

ergosterol substitui o colesterol (Trabulsi & Toledo, 1996; Murray et al., 2005).

Fazem parte do Reino Fungi cerca de 100 mil espécies, desde grandes como

os cogumelos, até microscópicas como os bolores e leveduras. Ainda hoje é utilizada

essa classificação, mas os avanços da biologia molecular e estudos bioquímicos levaram

a outras propostas de classificação em que os fungos e organismos afins foram incluídos

em três diferentes reinos: Protozoa, Chromista e Fungi (Kirk et al., 2008).

Abaixo, são apresentadas características que diferenciam os fungos das plantas:

• são incapazes de sintetizar clorofila, como também não apresentar celulose em

sua parede celular, com exceções como fungos aquáticos;

• apresentam algumas características de células animais (capacidade de depositar

glicogênio e a presença de substâncias quitinosas, em sua parede celular);



30

• podem ser eucarióticos (as leveduras), ou multinucleados (os bolores), e

apresentar retículo endoplasmático rugoso e mitocôndrias em seu citoplasma;

• são heterotróficos, alimentam-se de matéria orgânica viva (fungos parasitários),

ou morta (fungos saprofíticos);

Os fungos são amplamente encontrados na natureza, crescem rapidamente no

solo, na água, na atmosfera, bem como nos animais, nos vegetais, resíduos orgânicos e

desempenham um papel importante na vida do homem, quer de uma maneira benéfica,

quer de um modo prejudicial. Os fungos são um dos principais microrganismos

responsáveis pela decomposição da matéria orgânica, interferindo no ciclo do carbono,

do nitrogênio e de outros nutrientes da biosfera. São capazes de deteriorarem produtos e

bens de consumo, tais como alimentos, tecidos, papel, madeira. Os alimentos

armazenados representam um vasto meio para a proliferação dos fungos, principalmente

quando não são consideradas as condições básicas de armazenamento correto (Trabulsi

& Toledo, 1996).

Estão presentes funcionalmente em vários processos industriais, tais como, de

fabricação de pão, cervejas, vinhos e determinados tipos de queijos, sendo também

utilizados na produção comercial de muitos ácidos orgânicos, de alguns fármacos, como

a ergometrina e a cortisona, na obtenção de diferentes antibióticos, como a penicilina, e

de substâncias imunossupressoras, como a ciclosporina (Esteves et al., 1990). A Figura

4 ilustra a estrutura geral de uma célula de fungo.

Figura 4 – Representação da estrutura geral de uma célula de fungo.



31

Os fungos podem se desenvolver em meios de cultivo especiais formando

colônias de dois tipos, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciam pela

macromorfologia e micromorfologia. O primeiro tipo apresenta, em geral, característica

de consistência cremosa de cor branca a creme, brilhantes ou opacas, podendo

apresentar às vezes coloração escura ou alaranjada, e são formados por microrganismos

unicelulares que apresentam as funções vegetativas e reprodutivas. As filamentosas

apresentam características granulares, cotonosas, aveludadas ou pulverulentas, são

multinucleadas e apresentam-se em forma de tubos denominadas de hifas. Essas hifas

podem ser não septadas (cenocíticas) ou septadas (tabicadas). O conjunto de hifas é

denominado micélio.

As hifas asseptadas têm aparência anastomosada (concisa), formada por um

citoplasma estendido e polinucleado, enquanto que as hifas septadas contêm células

individualizadas, cada uma contendo o seu núcleo. Na Figura 5 são mostradas as

estruturas das hifas septadas e não septadas.

Figura 5 – Estrutura das Hifas: a) septadas e b) asseptadas. (Adaptado de Guia.Bio,

2012)

O micélio que se desenvolve no interior do substrato e que é responsável pela

sustentação e absorção de nutrientes é denominado micélio vegetativo. O micélio que

cresce na superfície do meio de cultura é denominado micélio aéreo. Este pode ser

denominado também de micélio reprodutivo, quando o mesmo se diferencia para

sustentar os corpos de frutificação ou propágulos (Putzke & Putzke, 1998). Os

propágulos classificam-se de acordo com a origem em externos e internos, sexuados e

assexuados.



32

2.2.2. Reprodução dos Fungos

A reprodução dos fungos ocorre em ciclos assexuais, sexuais e parassexuais. Em

fungos, a reprodução assexuada é observada com mais freqüência do que a reprodução

sexuada. A reprodução assexuada é normalmente a reprodução mais importante para a

propagação da espécie, feita através de fragmentação de artroconídios, fissão de células

somáticas, brotamento ou gemulação do blastoconídios-mãe e produção de conídios. A

reprodução sexuada envolve a união de duas células ou de dois órgãos sexuais

sexualmente compatíveis. A reprodução sexuada culmina na produção de basidiósporos,

no caso de basidiomicetos. A reprodução parassexuada ocorre com a fusão de hifas e

formação de um heterocário, que consiste na existência de núcleos haplóides

geneticamente distintos num mesmo citoplasma, os quais, após a fusão, originam

núcleos diplóides heterozigotos sujeitos a sucessivas divisões mitóticas. Apesar da

raridade dessas, a reprodução parassexual é de grande importância na evolução de

alguns fungos (Pelczar et al., 1996).

A reprodução assexuada é feita por conídios, esporos assexuados formados no

ápice de hifas modificadas, os conidióforos. Os conidióforos não possuem esporângios

de forma que os conídios ficam expostos. Na reprodução sexuada, com o encontro de

duas hifas haplóides distintas, ocorre a plasmogamia e um novo conjunto de hifas

dicarióticas é formado.

Os conídios podem ter formas esféricas, fusiformes, cilíndricas, piriformes, entre

outras. Apresentam-se como hialinos ou pigmentados, podem estar isolados ou

agrupados, a parede celular pode ser lisa ou rugosa e podem ser formados por apenas

uma célula ou apresentarem septos em mais de um plano.

Os conídios também podem originar-se em qualquer parte do micélio vegetativo

e são denominados conídios sésseis como é o caso do Trichophyton rubrum.

Alguns fungos patogênicos são identificados a partir de estruturas formadas pela

célula conidiogênica e o conidióforo. Essas estruturas são denominadas: aparelho de

frutificação ou conidiação. Os conídios podem formar cadeias sobre fiálides em volta de

uma vesícula, dilatando a extremidade do conidióforo. Essas estruturas ocorrem em

Aspergillus, apresentando-se em forma de cabeça ao redor de uma vesícula, e em

Penicillium agrupados em forma de pincel, como é ilustrada na Figura 6.



33

Figura 6 – Conídios de Aspergillus e Penicillium

2.2.3. Metabolismo de fungos

Os fungos são seres aeróbicos e heterotróficos, podendo se desenvolver em

ambientes com baixa quantidade de oxigênio, como ocorre no crescimento vegetativo e

na reprodução assexuada, como também em ambientes com grande quantidade de

oxigênio como é o caso da reprodução sexuada.

Os fungos são capazes de produzir certas enzimas como lipases, invertases,

lactases, quitosanases, proteases, amilases, etc., que fazem a hidrólise do substrato

facilitando o mecanismo de transporte ativo e passivo. Esses substratos induzem a

formação de enzimas degradativas. Algumas espécies de fungos desenvolvem-se em

meios que apresentam amônia ou nitrilos como única fonte de nitrogênio. As melhores

fontes orgânicas para o seu desenvolvimento são carboidratos, como a D-glicose, e

alguns sais minerais como sulfatos e fosfatos.

A água é uma necessidade de todos os seres vivos, não sendo diferente para os

fungos que precisam de água para o seu desenvolvimento. Certos fungos apresentam

características halofílicas podendo crescer nos ambientes com grandes concentrações de

sal.

A razão de não existirem ambientes livres de espécies fúngicas deve-se ao facto

destes microrganismos conseguirem sobreviver em situações extremas como, por

exemplo, temperaturas que variam entre os - 5 e os 60 ºC, com pH de 1 a 9 e com baixas



34

concentrações de oxigênio, apesar de cada espécie possuir condições ideais para o seu

desenvolvimento (Chao et al., 2002).

Devido a grande faixa de temperatura ótima para o seu crescimento, os fungos

apresentam espécies psicrófilas, mesófilas e termófilas. Para a maior parte das espécies

fúngicas, a temperatura de desenvolvimento situa-se entre os 20 e 24 ºC e não crescem

acima dos 29 ºC. Em relação à umidade relativa, necessitam de pelo menos 50 %, mas

geralmente necessitam de mais de 65 % (Colakoglu, 2001).

O pH ideal para o desenvolvimento dos fungos varia na faixa entre 5 e 7.

Destaca-se, entretanto, que a maioria dos fungos suportam grandes variações de pH

como ocorre com os fungos filamentosos que podem crescer em pH variando entre 1,5 e

11. Por outro lado, as leveduras não suportam pH alcalino.

Os fungos crescem lentamente, se comparados com as bactérias, em meio de

incubação para o seu desenvolvimento. Para evitar contaminação por bactérias, que

podem se sobrepor ou inibir o seu crescimento, pode-se introduzir no meio de cultura

um antibacteriano de largo espectro como o cloranfenicol.

Algumas espécies de fungos se desenvolvem na presença de luz, outras são

inibidas e algumas podem crescer tanto na presença quanto na ausência deste agente. No

entanto a irradiação solar, em geral, é prejudicial ao seu desenvolvimento, por causa da

radiação ultravioleta.

2.2.4. Nutrição de fungos

Quanto ao aspecto da nutrição, os fungos são heterótrofos, ou seja, incapazes de

produzir seu próprio alimento. Entretanto, a forma de assimilar matéria orgânica é

diferente daquela utilizada pela maioria dos animais, que são heterótrofos por ingestão.

Nos fungos, a digestão é extracorpórea, ou seja, é realizada fora do corpo. O fungo

lança no ambiente, enzimas que degradam as moléculas orgânicas complexas e, depois,

absorve moléculas menores, mais simples. Por essa razão, são designados heterótrofos

por absorção. É devido a este processo que os fungos podem crescer dentro ou sobre os

alimentos. Desenvolve-se geralmente em meios contendo um pH baixo, uma fonte de

carbono, uma fonte de nitrogênio orgânico ou inorgânico e alguns minerais. Alguns

necessitam de vitaminas. Quanto aos modos de vida, os fungos podem ser

decompositores, parasitas, mutualísticos e predadores (Raven, 2001).



35

Os fungos decompositores, saprófagos (do grego, saprós, “podre”, e phagos,

“comedor”), juntamente com as bactérias, são os principais decompositores da biosfera,

participando intensamente do processo de degradação da matéria orgânica morta, o que

promove a reciclagem dos elementos químicos constituintes dos seres vivos. A maioria

deles vive no solo, obtendo nutrientes de seres mortos. Em florestas, onde a matéria

orgânica vegetal é abundante, os micélios dos fungos decompositores absorvem os

nutrientes de folhas e galhos caídos, decompondo-os. Os fungos decompositores

também são responsáveis pelo apodrecimento de alimentos e de outros materiais, como

a madeira.

Os fungos parasitas vivem à custa de outros organismos vivos, prejudicando-os.

Ao parasitar o corpo de um ser vivo, animal ou vegetal, o fungo pode até provocar sua

morte. Várias doenças são causadas por fungos parasitas. Nas plantas, cita-se a

ferrugem do café, que, no Brasil, é motivo de grande preocupação por parte dos

cafeicultores, devido aos prejuízos que acarreta. As micoses que atacam a pele de seres

humanos e animais são provocadas por fungos.

Existem fungos que se associam a outros organismos, estabelecendo uma relação

em que há benefício mútuo para os indivíduos envolvidos. Esses fungos são

denominados mutualísticos. A maioria vive associada a seres fotossintetizantes, como

as plantas, cedendo-lhes parte da água e dos nutrientes que as hifas absorvem do solo.

As plantas, por sua vez, cedem ao fungo certos açúcares e aminoácidos. Duas

associações mutualísticas formam estruturas bem características: as micorrizas,

associação que envolve fungos e raízes de plantas, e os líquens, formados por fungos e

algumas variedades de algas e cianobactérias.

Certos fungos atuam como predadores. Na maioria dos casos, as hifas secretam

substâncias aderentes que aprisionam os organismos que tocam os fungos. Dessa

maneira, as hifas penetram o corpo da presa, crescem e se ramificam, espalhando-se no

interior do organismo e absorvendo seus nutrientes, causando-lhe a morte. O gênero

Arthrobotrys apresenta uma forma mais elaborada de predação. O fungo vive no solo e

captura nematódeos microscópicos que habitam o mesmo ambiente. As hifas

apresentam pequenos anéis que se estreitam quando a presa passa por eles. As hifas do

fungo logo invadem o corpo do nematódeo, digerindo-o.



36

2.2.5. O fungo Metarhizium anisopliae

Existem três espécies de fungos do gênero Metarhizium, divididas em dez

variedades: M. anisopliae, variedades anisopliae, majus, lepidiotum e acridum; M.

flavoviride, variedades tipo E, flavoviride, minus, novazealandicum e pemphigum; e M.

album (Driver et al. 2000). E, mais recentemente, foi descrita na China uma nova

variedade de M. anisopliae, dcjhyium (Dong et al. 2009).

Data de 1879 quando o russo Ilya Metchnikoff aplicou o fungo para combater

larvas de um curculionídeo, praga de beterraba, e foi classificado como Metarhizium

anisopliae por Sorokin em 1883. É um fungicida natural para mais de 300 espécies de

insetos, especialmente pragas da agricultura e pecuária. No Brasil, o fungo Metarhizium

anisopliae teve a sua aplicação com sucesso pela primeira vez em 1965, no controle da

cigarrinha-da-cana Mahanarva posticata (Alves, 1998).

O fungo Metarhizium anisopliae é um importante agente entomopatogênico

utilizado no controle de pragas, como cupins, gafanhotos, cigarrinhas e besouros, sendo

amplamente estudado em todo o mundo. Existe amplamente na natureza e é facilmente

encontrado no solo, onde sobrevive por longos períodos e seu desenvolvimento se dá

geralmente entre 15 e 32 °C, sendo ideal entre 24 e 30 °C e com pH ótimo igual a 6,9.

Apresenta micélio hialino e septado, com conidióforos característicos, sobre os quais

surgem conídios cilíndricos organizados em colunas. Este fungo ao atacar os insetos

provoca rigidez e os recobre por uma camada pulverulenta de conídios, resultando em

colorações que variam do verde claro ao escuro, cinza ou branco com pontos verdes

(Tinline, 1971; Alves, 1998, Driver et al. 2000; Arruda, 2005).

Quanto a sua morfologia, apresenta-se como um fungo filamentoso, com corpo

de frutificação equivalente a um esporodóquio agregado a hifas intimamente

entrelaçadas, com massa compactada de conidióforos característicos, simples ou

ramificados, formando células esporogênicas denominadas fiálides, resultando nos

fialosporos (Wang et al., 2002).

O Metarhizium anisopliae é um fungo de cultivo simples, sendo necessário

quase que exclusivamente o nutriente a base de amido. Um dos fungos mais estudados

em programas de manejo de pragas já que apresenta grande potencialidade

entomopatogênica (Onofre et al., 2002). O Metarhizium anisopliae é um microrganismo

pouco exigente, pois pode se desenvolver em diversos meios de cultura como: amido,

glicose, glicerina, levulose, maltose, sacarose e quitina (Jabor et al., 2003).



37

Em geral, os fungos produzem enzimas que convertem os tecidos dos insetos em

nutrientes. Porém, a cutícula esclerotizada dos insetos não é bem utilizada pelos fungos,

excetos pelos entomopatogênicos que desenvolveram enzimas eficientes para degradar

essa camada protetora. Destaca-se a enzima Pr1, produzida por Metarhizium anisopliae,

que tem um poder de degradação bem superior a qualquer outra enzima sintetizada por

esse grupo de fungos (Dias, 2005). Desta forma, o Metarhizium anisopliae (fungo

entomopatogênico) ao atacar a célula dos insetos, produz grande quantidade de enzimas

que degradam a membrana citoplasmática e inativa a célula e, consequentemente, mata

o inseto, logo é evidente a relação entre o controle de pragas e produção de enzimas.

No momento, sobre a comercialização de fungos entomopatogênicos no Brasil,

em sua maioria, são formulados em grânulos, compostas do fungo mais o substrato

(arroz + fungo), como também na forma de pó molhável (WP), resultado da moagem do

fungo com o substrato. Esses produtos representam 90% e 8,5%, respectivamente, da

produção de fungos no Brasil, e sendo suas concentrações finais ficam em torno de

5x108 conídios/g para Metarhizium anisopliae e 1x109 conídios/g para Beauveria

bassiana (Alves et al., 2008).

Segundo Batista Filho et al. (2002), Garcia et al. (2005) e Mello et al. (2006), o

Metarhizium anisopliae tem sido bastante utilizado para o controle de diferentes pragas

no Brasil, como a broca da bananeira, pragas de grãos armazenados, carrapatos, cupim

de montículo em pastagens, larvas de escarabeídeos que atacam a cana de açúcar e

cigarrinha da cana-de-açúcar.

É comum a ocorrência natural do fungo Metarhizium anisopliae atacando

cigarrinha-das-raízes de canaviais pelo país, o que incentiva a utilização dele como

agente de controle biológico em áreas infestadas por esse tipo de praga. A aplicação de

recursos no uso de programa de manejo integrado da cigarrinha tem sido reforçado por

razões ambientais e econômicas (Dinardo-Miranda, 2001).

Faria & Magalhães (2001) fizeram uma avaliação do uso de fungos

entomopatogênicos no Brasil, na qual observaram que a qualidade dos micoinseticidas

disponíveis no Brasil poderia ser incrementada de forma considerável quanto a sua

formulação, ou seja, antes da venda, poderiam realizar melhorias no tratamento

posterior, adição de substâncias que lhes assegurem melhorias na eficiência de controle,

capacidade de armazenamento ou praticidade de manuseio, ou de qualquer outro critério

que resulte em vantagem em relação ao produto bruto. Ressaltaram a pouca praticidade



38

em alguns casos, como exigência de lavagem, e em outros podendo causar o

entupimento de bicos dos pulverizadores devido à elevada proporção de inertes,

principalmente quando são empregados baixos volumes de aplicação. Outro problema

evidenciado com os inseticidas nacionais diz respeito à pequena sobrevida, devendo a

ser usados em, no máximo, 30 dias depois de produzidos, quando armazenados à

temperatura ambiente e em local sombreado, fazendo as vendas ocorrerem quase que,

exclusivamente, sob encomenda. Comparativamente, os bons inseticidas sob

comercialização em outros países apresentam maior concentração de ingrediente ativo,

maior sobrevida (alguns produtos podem ser armazenados por mais de 8 meses à

temperatura ambiente) e praticidade (são formulados na forma de GDA (grânulos

dispersíveis em água) ou de óleos emulsionáveis, por exemplo, podendo ser adicionados

diretamente ao tanque do pulverizador.

Rangel et al. (2007), instalaram uma Unidade de Observação para o controle

microbiano das cigarrinhas das pastagens Distrito de Itahum, em Dourados/MS, devido

as necessidades de agricultores familiares de produção de leite. As aplicações do fungo

Metarhizium anisopliae foram realizadas por pulverização com equipamento de tração

animal. As condições do ambiente de estudo foram favoráveis ao desenvolvimento da

população das cigarrinhas e à incidência do fungo. Como resultados, observaram que os

níveis de espumas, ninfas e adultos reduziram significativamente após as aplicações,

levando os Agricultores Familiares a total satisfação com os ganhos na produção de

todos os envolvidos.

Segundo Vieira et al. (2007), o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

var. acridum tem sido utilizado no controle de pragas, e assim, visando este fim,

analisaram em laboratório a esporulação, a germinação dos conídios e as características

morfológicas peculiares desse fungo em diferentes temperaturas. Esperou-se o

desenvolvimento das colônias em períodos de 1 a 15 dias. Foi observado que

temperaturas de 25, 28 e 30 ºC proporcionaram maiores taxas de esporulação e elevadas

porcentagens de germinação dos conídios. A 25, 28 e 30 ºC observou-se um

desenvolvimento mais rápido das microestruturas somáticas e reprodutivas (hifas,

anastomoses, apressórios, conidióforos e conídios elipsóides). Nas temperaturas

extremas de 40 e 45 ºC não foi detectado esporulação, germinação, nem

desenvolvimento de nenhuma microestrutura.



39

Lopes et al. (2007) avaliaram o efeito de formulações de Beauveria bassiana e

Metarhizium anisopliae sobre ninfas de Amblyomma cajennense (transmissor da febre

maculosa ao homem) em laboratório. Ninfas não alimentadas foram pulverizadas com

suspensões contendo 2x107 e 4x107 conídios/mL de B. bassiana, e 1x107, 1,5x107,

2x107, 3x107 e 5x107 conídios/mL de M. anisopliae. A mortalidade de ninfas,

decorridos três dias da aplicação, foi significativa nas concentrações de 3x107 e 5x107

conídios/mL de M. anisopliae, com 57,1 e 56,2 %, respectivamente. Após seis dias a

mortalidade foi de 100 % nessas duas concentrações. A mortalidade foi

significativamente maior que a observada para B. bassiana em concentrações

semelhantes.

Guirado et al. (2009) realizaram estudos para controlar cupins de montículo em

área de pastagem, utilizando fungos entomopatogênicos Metarhizium anisopliae e

Beauveria bassiana em diferentes doses e formulações. A avaliação foi realizada após

30 dias da aplicação dos produtos. Os melhores resultados em ordem decrescente de

eficiência foram: M. anisopliae 30 mL + 1000 mL de água com 100 % de eficiência; B.

bassiana 10g + M. anisopliae 20 mL + 1000 mL de água com 85,71 % de eficiência; M.

anisopliae 20 mL + 1000 mL de água com 71,42 % de eficiência. Os demais

tratamentos não diferiram da testemunha.

Loureiro et al. (2012) compararam a eficiência de isolados de Metarhizium

anisopliae em controlar populações naturais de Mahanarva fimbriolata (cigarrinha-da-

raiz) em cultivos comerciais de cana-de-açúcar colhida mecanicamente. Foram

aplicados os isolados IBCB 348, IBCB 408, IBCB 410 e IBCB 425 do fungo em

concentração de 1,5×1012 conídios/ha. Aplicou-se o planejamento experimental em

blocos casualizados com 5 tratamentos e 4 repetições, sendo cada repetição composta

por 7 linhas de 100 m de comprimento e espaçamento de 1,5 m. Após 30 dias de

pulverização foi observado para os isolados IBCB 408 e IBCB 425 uma eficiência de

controle de ninfas de 63 e 62%, respectivamente, já no caso dos adultos chegou a 100%.

Após 60 dias o isolado IBCB 425 foi o mais eficiente para controlar as ninfas com

48,4%.

Assis et al. (2012) estudaram a citotoxidade de quitoolissacarídeos (QOS) e

oligômeros A, B e C (soluções compostas por diferentes quantidades de QOS)

produzidos por hidrólise enzimática pelo fungo Metarhrizium anisopliae. Foi analisado

o efeito de antiproliferativo destas moléculas em células tumorais (HepG2 e HeLa) e



40

também em célula normal (3T3). A atividade antioxidante foi analisada em vários

experimentos in vitro. A glicosamina apresentou maior toxicidade (cerca de 92%) para

todas as células estudadas. No entanto, os oligômeros obtidos após hidrólise não

demonstraram efeito tóxico sobre a célula normal (3T3). Além disso, mostraram que

uma pequena quantidade de outros COS pode diminuir o efeito citotóxico da

glicosamina contra células 3T3, indicando que glicosamina poderia ser usada como uma

droga antitumoral na presença de outros COS.

2.3. Fermentação

Os processos fermentativos são caracterizados por processos nos quais

microrganismos realizam a conversão catalítica de uma dada substância num

determinado produto. Estes processos podem ser classificados como processos

descontínuos, contínuos e descontínuos alimentados. A classificação destes processos

está diretamente ligada à forma de como o substrato é adicionado e como o produto é

retirado. No processo de fermentação descontínuo o substrato é colocado no

fermentador, em seguida é inoculado e após o término do processo o produto é retirado.

No processo contínuo, o substrato é colocado num reator com vazão constante e o meio

fermentado é retirado com a mesma vazão de entrada do reator (Faccioti, 2001). Nos

processo descontínuos alimentados à adição de substrato e a retirada do mesmo deve

ocorrer de forma intermitente (Carvalho & Sato, 2001).

De certa forma, os processos fermentativos representam um elo entre as antigas

artes de elaboração de alimentos, como queijos e vinho, a partir de uma flora

microbiana natural, com a moderna indústria de fermentação de alimentos, onde são

utilisados cultivos puros e equipamentos sofisticados para o controle do processo

(Assis, 2010).

Atualmente, a maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de

vidro ou de aço de até 20 litros. Os agentes biológicos se encontram submersos no meio de

cultivo que ocupa, aproximadamente, 75% da cuba. As vezes é necessário injetar ar, e em muitas

fermentações se forma espuma. O desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do

processo, respondendo eventualmente a diversos imperativos, tais como a esterilização do

sistema, a aeração e homogeneização do meio, o acréscimo de nutrientes e de aditivos

antiespuma, a manutenção do pH, etc. Os modelos de fermentadores mais utilizados com

microrganismos contam com aeração e agitação mecânica. Esta facilita a distribuição dos



41

nutrientes na cuba, mas gera calor que deve ser eliminado mediante a circulação de água

fria. Em outros tipos de biorreatores, em coluna ou torre, a homogeneização depende da injeção de

ar. Os sistemas submersos são apropriados para o cultivo de microrganismos livres, mas resultam

pouco econômicos quando se trabalha com células ou enzimas caras. A imobilização em

fermentadores menores, seja por adesão a um suporte inerte, seja por inclusão dentro de um

polímero que permita o contato com o meio de cultura, além de simplificar a purificação do

produto permite a reutilização das células ou das enzimas, que permanecem dentro do

biorreator (Malajovich, 2009).

As enzimas são produtos de alto valor agregado, amplamente empregadas em

uma gama de indústrias, e entre as fontes para sua obtenção, destacam-se as de origem

microbiana, principalmente, devido a elevada seletividades dos substratos utilizados e

produtos formados. A principal forma de obtenção de enzimas, em escala industrial, é a

fermentação submersa, por esta apresentar vantagens em relação a fermentação

semisólida, como: maior controle do processo fermentativo e consequente reprodução

da cinética microbiana, além de maiores rendimentos (Wanderley, 2011).

2.3.1. Preparo do inóculo

Denomina-se inóculo um volume de suspensão de microrganismo de

concentração adequada, capaz de garantir, em condições econômicas, a fermentação de

uma dada quantidade de meio. O volume do inóculo, assim como sua concentração de

células, vai depender tanto do processo de fermentação c omo da quantidade de meio a

ser fermentado (Carvalho & Sato, 2001).

A partir de uma cultura pura, inocula-se um volume relativamente pequeno de

meio nutriente, que vai depender do tipo de microrganismo cultivado (pois cada espécie

microbiana possui velocidades diferentes de crescimento), sendo, em seguida, incubado

em condições favoráveis ao desenvolvimento do microrganismo. A suspensão obtida é

transferida para um frasco maior em agitador rotativo ou recíproco (shakers), que por

sua vez é adequadamente incubado, e a seguir, transferido para um frasco contendo um

volume ainda maior deste meio, até se conseguir alguns litros de suspensão microbiana.

Os cuidados com assepsia, volumes de meio utilizado, numero de transferência bem

como as condições de incubação, podem variar de acordo com o tipo de processo de

fermentação que se deseja realizar.



42

2.3.2. Produção de enzimas em cultivo submerso descontínuo

A produção de enzimas, usando processos fermentativos, é constituída

basicamente por duas etapas: a primeira caracteriza-se pela preparação do inóculo e a

segunda, pela fermentação do substrato (Carvalho & Sato, 2001). A finalidade da

primeira etapa é o preparo do microrganismo em condições adequadas para que possa

ocorrer o desenvolvimento da segunda etapa. Diferentemente do cultivo em estado

sólido, no cultivo submerso os microrganismos encontram-se em um meio com elevada

atividade de água.

2.4. Planejamento experimental

Um bom planejamento tem como fundamental projetar um experimento de

forma que ele seja capaz de fornecer exatamente o tipo de informação que procuramos.

Para isso é necessário saber, em primeiro lugar, o que é mesmo que se deseja procurar.

Planejamento experimental, ou delineamento experimental, é um conjunto de

ensaios estabelecido com critérios científicos e estatísticos, objetivando determinar a

influência de diversas variáveis nos resultados de um dado sistema ou processo (Barros

Neto et al., 2001; Rodrigues & Iemma, 2005). De acordo com o propósito dos ensaios,

esse objetivo maior pode ser mais detalhado em:

– determinar quais variáveis são mais influentes nos resultados;

– atribuir valores às variáveis influentes de modo a otimizar os resultados;

– atribuir valores às variáveis influentes de modo a minimizar a variabilidade dos

resultados;

– atribuir valores às variáveis influentes de modo a minimizar a influência de variáveis

incontroláveis.

O planejamento experimental, baseado nos fundamentos estatísticos é, sem

dúvida alguma, uma ferramenta poderosa para se chegar às condições otimizadas de um

processo, desenvolvimento da formulação de produtos dentro das especificações

desejadas ou simplesmente para avaliar os efeitos ou impactos que os fatores (variáveis

independentes) têm nas respostas (variáveis dependentes) desejadas (Barros Neto et al.,

2001; Rodrigues & Iemma, 2005). Da utilização das técnicas estatísticas de

planejamento experimental, é possível chegar benefícios importantes, como:



43

– reduzir o número de ensaios sem prejuízo da qualidade da informação;

– estudar simultaneamente diversas variáveis, separando seus efeitos;

– determinar a confiabilidade dos resultados;

– realizar a pesquisa em etapas, num processo iterativo de acréscimo de novos ensaios;

– selecionar as variáveis que influem num processo com número reduzido de ensaios;

– representar o processo estudado através de expressões matemáticas;

– elaborar conclusões a partir de resultados qualitativos.

2.4.1. Planejamento fatorial

Em um planejamento fatorial é investigado as combinações de níveis de estudo

de cada fator. Para tanto, inicialmente, é necessário especificar esses níveis em cada

fator, quer dizer, os valores dos fatores que serão utilizados nos experimentos. Um

ensaio experimental é definido como um experimento constituído de um conjunto de

níveis definido. Geralmente, quando se tem n1 níveis de um determinado fator 1, n2 do

fator 2, ..., e nk do fator k, o planejamento será descrito por um fatorial n1 x n2 x ... x nk,

que corresponde ao número mínimo de experimentos para se ter um planejamento

fatorial completo.

É necessário fazer cada fator variar e observar o resultado dessa variação para se

estudar o efeito sobre a resposta. Assim, os ensaios precisam ter um mínimo de dois

níveis por fator para a realização desses ensaios. Para k fatores, ou seja, k variáveis de

controle, o planejamento de dois níveis precisará de 2 x 2 x ... x 2 = 2k, para o número

de ensaios diferentes, sendo conhecido como planejamento fatorial 2k.

Para o planejamento fatorial, são especificados os valores dos fatores em cada

experimento, e estes são classificados em níveis, variando-se, por exemplo, de -1

(mínimo) a +1 (máximo). A partir de uma matriz serão apresentadas todas as

combinações entre o número de fatores e de níveis nos experimentos a serem realizados

(Barros Neto et al., 2001; Rodrigues & Iemma, 2005).

2.4.2. Planejamento Plackett & Burman

A maioria dos planejamentos do tipo “Screening” (Delineamentos de Seleção de

fatores) foi descrito originalmente por Plackett & Burman em 1946. Os planejamentos

experimentais de Plackett & Burman são eficientes em situações que envolvem uma



44

grande quantidade de variáveis a serem exploradas em um processo de otimização de

fatores (Reddy et al., 2008).

As matrizes Plackett & Burman consistem de planejamentos fatoriais de dois

níveis para estudar k = N – 1 variáveis em N ensaios. São construídas para ensaios

múltiplos de 4, sendo essas matrizes para ensaios de 8, 12, 16,..., 100. Cada variável

independente em uma matriz assume uma configuração de dois níveis, o inferior (-1) e o

superior (+1), para o nível intermediário é estabelecido (0). Para cada vez que a variável

aparece no nível inferior, terá o par equivalente no nível superior (Rodrigues & Iemma,

2005).

Para evitar dúvidas nos resultados dos efeitos de algum fator no planejamento de

Plackett & Burman, o número de ensaios a ser realizado deve ser no mínimo o número

de variáveis mais 4. No caso de um fatorial completo o número de ensaios a ser

realizado é bem maior (Rodrigues & Iemma, 2005).

Mesmo já determinado o planejamento Plackett & Burman, torna-se importante

à realização de experimentos relativos aos pontos centrais de modo a se avaliar melhor

as possíveis interferências analíticas que podem ocorrer durante os diferentes

experimentos. A repetição do ponto central permite também a determinação do erro

puro e da repetibilidade do processo. Na prática, esta é uma ferramenta que permite

identificar melhor se o processo em estudo está sob controle (Rodrigues & Iemma,

2005).

É possível que no planejamento Plackett & Burman não tenha sido considerado

a codificação do ponto central (0) para repetição, pois, matematicamente, a estimativa

do valor desse efeito codificado (zero) vezes, teria como resposta zero. Porém, no

resultado prático do experimento, consegue-se informações valiosas com essas

repetições no ponto central (Rodrigues & Iemma, 2005).

2.4.3. Aplicações do Planejamento Plackett & Burman

Ghanem et al. (2000) produziram xilanase por Aspergillus terreus cultivadas

sobre palha de trigo finamente moída em fermentação de estado sólido. A composição

ideal do meio foi estabelecida aplicando-se o planejamento experimental de Plackett &

Burman. A melhor atividade enzimática foi obtida em um meio contendo 10 g/L de



45

palha de trigo por frasco umedecido com uma solução concentrada de sal com teor de

água inicial de 75 % e incubadas durante 4 dias a 30 °C. Observou-se que íons

metálicos como Hg2+, Cu2+, Co2+, Fe3+ e Pb2+ inibiram fortemente a xilanase, enquanto

que Ca2+ ativou a enzima.

Mu et al. (2005) estudaram as otimização de meio de fermentação para a reação

de estereoinversão por Candida parapsilosis CCTCC M203011 utilizando o

planejamento Plackett & Burman. Os resultados mostraram que dentre os fatores

estudados, os fatores mais significativos foram: a Concentração de MgSO4, ZnSO4 e

KH2PO4 e que após a utilização da metodologia de superfície de resposta foi constatado

que o ponto ótimo para a otimização foi conseguido com as concentrações dos fatores

MgSO4, ZnSO4 e KH2PO4 nos valores em: 1,17 g/L, 0,10 g/L e 9,41 g/L,

respectivamente, elevando a taxa de conversão enantiosseletiva de 75,2 % para 96 %.

Naveena et al. (2005) empregaram o planejamento Plackett & Burman para a

seleção de 15 parâmetros para produção de ácido láctico L(+) de farelo de trigo,

substrato de baixo custo e suporte sólido, por Lactobacillus amylophilus GV6 em

fermentação de estado sólido (SSF). Onze nutrientes pertencentes a duas categorias,

fontes de nitrogênio e fontes de sal, junto com três parâmetros físicos e um tampão

foram os parâmetros considerados. Os autores verificaram influência na produtividade

devido às fontes de nitrogênio, peptona, extrato de levedura e tri-citrato de amônio,

juntamente com o NaH2PO4.2H2O e Tween 80, que podem ainda serem otimizados para

o aumento na produção de ácido lático. Esses pesquisadores ainda chamam atenção para

o uso escasso deste planejamento em fermentação em estado sólido e que o mesmo

ainda não havia sido considerado anteriormente para a conversão direta de amido em

ácido láctico L (+) usando um sistema bacteriano.

Khosravi-Darani et al. (2008) estudaram a aplicação de Plackett & Burman na

análise dos fatores significativos para a produção de ácido cítrico por Aspergillus niger

ATCC 9142 utilizando palha de trigo como substrato. Os resultados mostraram que a

produção, com a palha de trigo pré-tratada com HCl, NaOH e Uréia, foi mais eficiente e

que os fatores mais significativos na produção foram: Solvente, Teor de Umidade,

Temperatura, Tempo de Incubação, Concentração Inicial de Açúcar e Concentração de

Metanol.

Ji et al. (2009) estudaram o desenvolvimento de um meio de cultura econômico

para a produção do 2,3-butanodiol através da fermentação da glicose e xilose por



46

Klebsiella oxytoca utilizando o planejamento Plackett & Burman. Os resultados

mostraram que a uréia e a maceração de milho foram os fatores mais significativos para

a produção do 2,3-butanodiol e que através de planejamento experimental com repetição

em triplicata no ponto central para determinar os níveis ótimos de produção. Os autores

constaram que o rendimento atingido foi 85,6% do valor teórico.

Paula & Arruda. (2009) observaram a necessidade da busca por alternativas mais

eficientes ao método termomecânico utilizado para a degradação de milhões de

toneladas de penas de aves provenientes de frigoríficos e aviários, cuja rígida estrutura é

composta por mais de 90 % de queratina. Para esse fim, utilizaram de comunidades

microbianas para a finalidade proposta, testando o planejamento experimental Plackett

& Burman para verificar a influência de diferentes microrganismos simultaneamente,

com um número reduzido de experimentos. Testaram 32 bactérias isoladas, inoculadas

em meio contendo somente uma pena como única fonte de carbono, durante sete dias,

de onde foi selecionado as cepas para os consórcios microbianos. Experimentos unindo

as cepas NP5, FCA7, NP4 e S14 demonstraram diferentes atividades queratinolíticas,

aumentando o nível de degradação, até 87,8%, comparada com as cepas

individualmente, variando entre 26,4% e 78,0%.

Rajendran & Thangavelu (2009) obtiveram valores máximos da atividade de

produção de lipase em 3,98 U/mL e concentração de massa celular em 5,62 g.L-1 com R.

arrhizus em cultivo submerso descontínuo otimizado pelo planejamento Plackett &

Burman. As variáveis mais importantes que afetaram a produção da lipase foram azeite

de oliva, peptona, KH2PO4, CaCl2.2H2O e MgSO4.7H2O.

Li et al. (2010) estudaram a otimização de meio de cultura para a produção de

Streptolydigin (um antibiótico) por Streptomyces lydicus AS 4,2501 utilizando Plackett

& Burman e a metodologia de superfície de resposta. Os resultados mostraram que

dentre os fatores estudados, os fatores mais significativos para a produção de

Streptolydigin e otimização do meio de cultura foram: Concentração de Amido,

Concentração de Peptona e a Concentração de K2HPO4.

Chen et al. (2010) estudaram a otimização de meio de cultura para a produção da

Luciferase – que são enzimas que catalisam reações biológicas transformando energia

química em energia luminosa - por Bacillus Subtilis em fermentação descontínua

utilizando planejamento Plackett & Burmam. Os resultados mostraram que dentre os

componentes estudados, os fatores mais significativos para a produção e otimização do



47

meio de cultura para a produção da Luciferase foram: Concentração de Glicose 1,17 %,

Extrato de Levedura 2,27 % e Glutamato 0,55 %.



utilizando o projeto Plackett & Burman e a metodologia de superfície de resposta. Os

resultados mostraram que a eficiência máxima de extração da quitina foi conseguida nas

seguintes condições: Concentração de casca de camarão (50 g/L), glicose (50 g/L),

tempo de incubação de 5 dias e inoculo com 0,05 de OD (densidade óptica).

Gao et al. (2010) desenvolveram um meio para a fermentação do extrato bruto

de inulina de tubérculos de alcachofra de Jerusalém por Paenibacillus polymyxa ZJ-9

para produzir R,R-2,3-butanodiol (R-R,2,3-BD). Inulina, K2HPO4 e NH4Cl foram os

parâmetros principais na fermentação de acordo com os resultados obtidos com o

planejamento experimental Plackett & Burman. A concentração ideal dos três fatores,

77,14 g/L, 3,09 g/L e 0,93 g/L, respectivamente, foi obtida pelo planejamento Box-

Behnken e pela superfície de resposta. Sob as condições ideais, a concentração do R-

R,2,3-BD obtida foi 36,92 g/L, em mais de 98 % de pureza óptica. Comparado com

outras fontes de carbono investigadas, a fermentação do extrato bruto de inulina obteve

o maior rendimento de R-R,2,3-BD.

Uma metodologia de superfície de resposta foi empregada com sucesso para

otimizar um meio de fermentação chamada VHG (Very High Gravity), referência à alta

concentração de açúcares e densidade dos mostos, baseado na água maceração de milho

CSL (Corn Steep Liquor) e outros nutrientes de baixo custo para a produção eficiente de

etanol a partir de glicose por S. cerevisiae. Usando a composição média otimizada (g/L:

CSL 44,3; uréia 2,3; MgSO4.7H2O 3,8; CuSO4.5H2O 0,03), a levedura industrial PE-2

foi capaz de fermentar até 330 g/L de glicose e produzir 18,6 % (v/v) de etanol, com

uma produção descontínua de 2,4 g/L/h e um rendimento em etanol de 93 % (Pereira et

al., 2010).

O planejamento Plackett & Burman juntamente com o Planejamento Composto

Central (CCD) foram aplicados para otimizar o meio de cultura para produção de etanol

por Clostridium autoethanogenum com monóxido de carbono (CO) como fonte única de

carbono e um meio contendo (g/L): 1,0 de NaCl, 0,1 de KH2PO4, 0,02 de CaCl2, 0,15 de

extrato de levedura, 0,116 de MgSO4, 1,694 de NH4Cl e pH 4,74. O rendimento ótimo

de etanol previsto pela metodologia de superfície de resposta (RSM) e um algoritmo



48

genético de rede neural artificial (ANN-GA) foram 247,48 e 261,48 mg/L,

respectivamente. Valores semelhantes aos obtidos experimentalmente sob as condições

ideais sugeridas pelos métodos estatísticos (254,26 e 259,64 mg/L). A adequação do

modelo ANN-GA foi maior do que o modelo RSM. Os rendimentos obtidos foram

substancialmente superiores aos relatados anteriormente (60-70 mg/L) com essa cultura

(Guo et al., 2010).

Rigueira (2010) avaliou a influência das variáveis do procedimento de extração

na porcentagem de recuperação das aminas encontradas no leite cru utilizando um

planejamento para “screening” do tipo Plackett & Burman, para os ácidos

tricloroacético (TCA) e sulfosalicílico (ASS).

Quines (2010) estudou a necessidade ou não de se fazer um pré-tratamento da

biomassa antes da extração. Um planejamento experimental Plackett & Burman de doze

ensaios mais três pontos centrais foi utilizado para selecionar as variáveis mais

significativas na extração de Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) por 1,2-carbonato de

propileno. Foram realizados dois testes de recuperação do solvente 1,2-carbonato de

propileno, após a extração, sendo um com aplicação de aquecimento e o outro com

aquecimento e vácuo. Os resultados mostraram que o pré-tratamento térmico levou a

uma maior porcentagem de recuperação e de pureza do polímero.

Capítulo 3 Metodologia Experimental


______________________________________________________________________ Raimundo Cosme da Silva Filho – Tese de Doutorado – UFRN – PPGEQ

50

3. Metodologia Experimental

O presente capítulo apresenta os matérias e métodos utilizados na produção de

quitosanase por Metarhizium anisopliae em cultivo descontínuo submerso.

3.1. Quitosana

Neste trabalho utilizou-se uma quitosana (Lote 067) obtida junto a POLYMAR/CE,

com no mínimo 80% de desacetilação. Esse substrato foi utilizado como fonte de carbono e

energia tanto no estudo cinético como nos ensaios do planejamento de seleção de fatores

Plackett & Burman e Planejamento Composto Central, para a produção de quitosanase pelo

Metarhizium anisopliae, por fermentação submersa.

3.2. Microrganismo

O fungo Metarhizium anisopliae estirpe (CG374), utilizado neste estudo, foi cedido

pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília / DF-Brasil) e foi mantido em

placas de Petri contendo o meio Batata Dextrose Agar (PDA). As placas foram incubadas em

estufa a 25 ºC. O pH do meio de manutenção foi mantido entre 6,0 e 6,5.

3.2.1. Escolha da cepa produtora de quitosanase

A escolha do microrganismo Metarhizium anisopliae foi feita com base na capacidade

de crescer em meio contendo quitosana como única fonte de carbono, além de apresentar

grande tolerância a pH variando a uma taxa de 2,0 a 8,5, sendo 6,9 a melhor condição para o

crescimento vegetativo e esporução, de acordo com Assis (2010).

3.2.2. Manutenção da cepa

A manutenção da cultura foi realizada em placas petri contendo o meio Batata

Dextrose Agar (PDA). A renovação das células foi realizada a cada trinta dias através de

subcultivos das células no meio PDA.



51

3.3. Produção de enzima

No preparo do inóculo, utilizou-se 7 placas cultivadas e mantidas, com o fungo

Metarhizium anisopliae, em meio PDA a 25 ºC durante 5 dias em estufa. O meio de cultura

para a produção da enzima quitosanase apresentou os seguintes componentes: quitosana;

peptona; extrato de levedura; NaNO3; K2HPO4; KCl; MgSO4.7H2O e FeSO4, com

concentrações de acordo as matrizes dos planejamentos: Plackett & Burman e composto

central. Para a produção da enzima no cultivo, a biomassa foi transferida através de água

estéril, para um Béquer de 500 mL que, em seguida, foi colocado em Erlenmeyers de 250 mL

na proporção de 20 mL de biomassa para 180 mL do meio de cultura. Os Erlenmeyers

cultivados foram então incubados em incubador rotativo a 25 ºC e 150 rpm durante 24 h.

Alíquotas foram retiradas e centrifugadas a 8000xg por 5 min, a cada 6 horas, para se

determinar a atividade quitosanolítica, teores de açúcares redutores e de proteína total.

Ressalta-se que todos os experimentos foram feitos em triplicata.

3.4. Determinação da Proteína Total

A determinação da proteína total foi efetuada de acordo com o método modificado de

Sedmak & Grossberg (1977), que se baseia na diminuição da absorbância do corante azul de

Coomassie, devido à ligação proteína-corante, a 595 nm, comparado a absorção máxima a

465 nm, conforme Santos (2001). Nesse caso, após centrifugação para retirada da biomassa,

transferia-se para um eppendorf 1,5 mL de amostra (caldo fermentativo) e adicionava-se 1,5

mL de solução azul de Coomassie. Deixava-se a solução em repouso por 5 minutos,

transferindo-se em seguida para um cubeta de quartzo e efetuando-se as leituras de

absorbância nos comprimentos de ondas 465 nm e 595 nm, respectivamente. O

espectrofotômetro (Thermo Spectronic modelo Genesys 10UV) foi zerado com água

destilada. O conteúdo protéico foi obtido a partir de uma curva padrão na qual graficava-se a

relação de absorbância A595/A465 para diferentes concentrações de Albumina de Soro

Bovino (Fração V – Lote 110881/Sigma Aldrich-Ohio-USA).

3.5. Determinação da Atividade Quitosanolítica e da Atividade Específica

A atividade quitosanolítica foi obtida monitorando-se o aumento dos açúcares

redutores totais, utilizando-se o método DNS a partir de uma curva padrão de glicosamina.

Para a determinação da atividade quitosanolítica adicionaram-se, aos tubos de ensaios 500 µL



52

de substrato (solução 0,2 % de quitosana solubilizada em ácido clorídrico 1N) e 500 µL de

caldo bruto (contendo enzima), controlando-se o pH entre 6,0 e 6,5 e incubando-se o sistema

em um banho termostatizado com temperaturas da ordem de 55 ºC. Após o tempo de

incubação de 30 minutos no banho foi adicionado aos tubos de ensaio 2,5 mL de DNS,

aquecendo-se à ebulição em banho-maria por 10 minutos, resfriando-se, em seguida, em

banho de gelo. Após essa etapa, o sistema foi centrifugado e com o sobrenadante efetuou-se a

leitura no espectrofotômetro a 600 nm. Destaca-se, que antes da leitura da amostra zerava-se o

equipamento (branco do espectro) com 1,0 mL de água destilada acrescidos de 2,5 mL de

DNS e realizava-se o branco da enzima que consistia da adição de 500 µL de solução de

quitosana, completando-se até um 1,0 mL com água destilada. Uma unidade de atividade

quitosanolítica (A) foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1

µmol.min-1 de glicosamina por mL de extrato enzimático, nas condições de temperatura e pH

citadas, sendo o resultado expresso em (U.mL-1). A Atividade específica foi determinada pela

divisão entre a atividade da enzima (U.mL-1) e a concentração de proteína total (µg.mL-1),

sendo expressa em (U. µg-1).


3.6.1. Planejamento de seleção de fatores Plackett & Burman

O planejamento experimental Plackett & Burman é uma técnica muito usada, para se

realizar triagem de fatores na otimização num determinado processo (Reddy et al., 2008), e

foi utilizado neste trabalho para identificar os fatores que influenciam de forma significativa

na produção da enzima quitosanase.

A Tabela 3 ilustra os níveis de cada variável (fator) utilizada no planejamento Plackett

& Burman, sendo: Concentração de Quitosana (Q), Peptona (PP), Extrato de Levedura (EL),

NaNO3 (NS), K2HPO4 (FP), KCl (CP), MgSO4.7H2O (SM), FeSO4 (SF). Já a Tabela 4 mostra

a matriz do planejamento Plackett & Burman com 8 fatores e 12 ensaios e mais 3 repetições

na condição do ponto central.



53

Tabela 3 – Níveis para os fatores e seus valores codificados.

Nível Q

(%)

PP

(%)

EL

(%)

NS

(%)

FP

(%)

CP

(%)

SM

(%)

SF

(%)

-1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0005

0 0,2 0,5 0,3 0,2 0,10 0,050 0,050 0,0010

1 0,3 0,8 0,4 0,3 0,15 0,075 0,075 0,0015


repetições na condição do ponto central.

Ensaio Q PP EL NS FP CP SM SF V11 V12 V13

1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 -1

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Sendo: V11,V12,V13 = Variáveis inertes para cálculo do erro.

3.6.2. Planejamento Composto Central para a Otimização do Meio de Cultura para a

Produção da Enzima em Cultivo Submerso

Um dos problemas mais comuns para quem realiza experimentos é determinar a

influência de uma ou mais variáveis sobre outra variável de interesse (Lobato, 2003). Este



54

problema pode ser minimizado utilizando-se um planejamento experimental de modo a se

obter uma função, ou uma aproximação satisfatória para a mesma, de forma que se operando

sobre as variáveis de entrada produza-se como saída a resposta ou as respostas observadas

(Barros Neto, 2001; Silva, 2004).

Em um planejamento, inicialmente, deve-se definir os fatores e as respostas de

interesse. Tendo-se identificado os fatores e respostas define-se o objetivo que se pretende

alcançar com os experimentos para que se possa escolher o planejamento mais apropriado.

(Silva, 2004).

No presente trabalho foi utilizado um Planejamento Composto Central (CCD) com 22

experimentos na parte fatorial, repetição em triplicata no ponto central e quatro experimentos

na parte axial (planejamento do tipo estrela), para se investigar a influência dos fatores:

concentração de quitosana e concentração de FeSO4 que foram os dois fatores que

influenciaram a produção de quitosanase, conforme o planejamento Plackett & Burman de 12

ensaios e mais 3 repetições na condição do ponto central. Estes dois fatores foram estudados

em cinco diferentes níveis (-1,41; -1; 0; 1; 1,41) e um conjunto de 11 experimentos foi

realizado, conforme Tabela 5.

Tabela 5 – Matriz do planejamento Composto Central.

Ensaio Q SF

1 -1 -1

2 -1 1

3 1 -1

4 1 1

5 -1,41 0

6 1,41 0

7 0 -1,41

8 0 1,41

9 0 0

10 0 0

11 0 0

Os outros fatores foram mantidos nos níveis mais baixos (para evitar custos). Uma que

não influenciaram de forma significativa na produção da enzima quitosanase.



55

A codificação dos fatores foi realizada de acordo com a seguinte equação (Ji et al.,

2009):

Xi = (xi – x0)/∆xi , i = 1, 2, 3, ..., k (2)

Onde Xi é o fator independente codificado, xi é o fator independente real, x0 é o valor de xi no

ponto central e ∆xi é a variação de valor. O comportamento do sistema foi explicado pela

seguinte equação polinomial de segunda ordem:

Yp = β0 + ∑ βiXi + ∑ βiiXi2 + ∑ βijXiXj, i, j = 1, 2, 3,..., k (3)

Onde Yp foi a resposta esperada, β0 foi a interseção, Xi e Xj

foram os fatores independentes codificados, βi foi o coeficiente linear, βii

foi o coeficiente quadrático e βij foi o coeficiente de interação. Destaca-se que os outros

fatores não significativos foram mantidos no nível mais baixo (-1).

A Tabela 6 apresenta os níveis para os fatores e seus valores codificados, para o

Planejamento Composto Central, com triplicata no ponto central.


Planejamento Composto Central.

Nível Q

(%)

PP

(%)

EL

(%)

NS

(%)

FP

(%)

CP

(%)

SM

(%)

SF

(%)

-1,41 0,218 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0009

-1 0,3 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0015

0 0,5 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0030

1 0,7 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0045

1,41 0,782 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0051

Na análise do planejamento de seleção de fatores Plackett & Burman e do

planejamento experimental fatorial foi utilizado um pacote computacional STATISTICA for

Windows versão 7.0.



56

3.7. Perfil cinético durante o cultivo

Um perfil cinético na melhor condição de cultivo, conforme planejamento

apresentado, foi realizado em frascos Erlenmyer de 250 mL contendo 200 mL de meio de

cultivo contendo os seguintes componentes, em 1 Litro: 2,0g de quitosana; 5,0g de peptona;

3,0g de extrato de levedura; 2,0g de NaNO3; 1,0g de K2HPO4; 0,5g de KCl; 0,5g de

MgSO4.7H2O; 0,01g de FeSO4, que foram inoculadas com 10% (vol/vol) de inóculo contendo

o fungo Metarhizium anisopliae e cultivadas em incubador rotativo durante 5 dias a 150 rpm

e 25 ºC. Alíquotas foram retiradas a cada seis horas e analisadas quanto à proteína total no

sobredanante, atividade enzimática, atividade específica e açúcares redutores. Os ensaios

foram realizados em triplicata (Silva Filho, 2005).

Capítulo 4 Resultados e

Discussão

Capítulo 4 Resultados e discussão


58

4. Resultados e discussão

Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados obtidos no presente

trabalho. Inicialmente, é apresentada imagem do MEV do Metarhizium anisopliae

mantidos em meio PDA. Em seguida, apresenta-se e discute-se os resultados da avaliação

dos fatores significativos, que podem influenciar na produção da quitosanase, no

planejamento de seleção de fatores, conforme planejamento Plackett & Burman bem como

são apresentados e discutidos os resultados obtidos para o planejamento composto central.

Por último, apresenta-se o perfil cinético, na melhor condição, para a produção de

quitosanase em cultivo submerso descontínuo usando o fungo Metarhizium anisopliae.

4.1. Imagem do micélio de Metarhizium anisopliae em meio PDA.

A Figura 7 ilustra a imagem da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) do micélio de Metarhizium anisopliae mantido em meio PDA.

Figura 7. Imagem do MEV do micélio de Metarhizium anisopliae em meio PDA.

Observa-se na Figura 7, quanto à morfologia que o Metarhizium anisopliae, apresenta-

se como um fungo filamentoso com as hifas intimamente entrelaçadas conforme citado por

Wang et al. 2002.



59

4.2. Planejamento Plackett & Burman

4.2.1 Análise do Plackett & Burman com 8 fatores e 12 ensaios

Um planejamento de Seleção de Fatores Plackett & Burman com 8 fatores e 12

ensaios em 2 níveis, foi utilizado para avaliar a influência dos fatores: Concentração de

Quitosana (Q), Peptona (PP), Extrato de Levedura (EL), NaNO3 (NS), K2HPO4 (FP), KCl

(CP), MgSO4.7H2O (SM), FeSO4 (SF) na produção da enzima quitosanase por Metarhizium

anisopliae em cultivo descontínuo submerso. Ressalta-se que os experimentos foram

realizados aleatoriamente.

A Tabela 7 apresenta a matriz do modelo Plackett & Burman e os respectivos valores

obtidos para a variável resposta (Atividade Quitosanalítica).

Tabela 7 – Matriz do planejamento Plackett & Burman com 8 fatores e 12 ensaios.

Ensaio Q PP EL NS FP CP SM SF A (U/mL)

1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 0,0195

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 0,0202

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 0,0109

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 0,0121

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 0,0136

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 0,0156

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 0,0109

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 0,0103

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 0,0099

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 0,0117

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 0,0094

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0,0085

A Tabela 8 apresenta os efeitos estimados para o planejamento Plackett & Burman.

Observa-se na Tabela 8 que o valor do coeficiente de determinação R2 foi de

aproximadamente 90%, indicando que um modelo linear poderia representar bem a relação

entre o fator significativo, concentração de quitosana (1), e a resposta.



60

Tabela 8 – Efeitos Estimados do planejamento Plackett & Burman.

Efeitos Estimados; R2=0,8996; Ajuste:0,63178 MS Erro Residual =0,0000054

Desvio Padrão t(3) p

Lim. Conf. Lim. Conf.

Efeito Erro Residual

-95,% +95

Média/Interação 0,0127 0,0007 18,903 0,0003 0,0105 0,0149 (1) Quitosana 0,0055 0,0013 4,0628 0,0268 0,0011 0,0098

(2) Peptona 0,0015 0,0013 1,1080 0,3486 -0,0028 0,0058 (3) Ext. de leved. 0,0009 0,0013 0,7387 0,5136 -0,0033 0,0053

(4) NaNO3 0,0002 0,0013 0,1758 0,8715 -0,0040 0,0045 (5) K2HPO4 -0,0014 0,0013 -1,0552 0,3687 -0,0057 0,0028

(6) KCl -0,0022 0,0013 -1,6708 0,1933 -0,0065 0,0020 (7) MgSO4.7H2O -0,0003 0,0013 -0,2286 0,8338 -0,0046 0,0039

(8) FeSO4 0,0029 0,0013 2,1457 0,1211 -0,0014 0,0071

A Figura 8 mostra o gráfico de Pareto, uma das formas de se avaliar visualmente a

influência dos fatores estudados na resposta. A magnitude dos efeitos é representada pelas

colunas enquanto que a linha transversal às colunas representa a magnitude dos efeitos com

significado estatístico para p=0,05, ou seja, os fatores que são estatisticamente significativos

ao nível de 95% de confiança.

Figura 8. Gráfico de Pareto do planejamento Plackett & Burman mostrando a influência dos

fatores estudados.



61

Analisando-se o gráfico de Pareto (Figura 8) observa-se que o fator concentração de

quitosana (1) foi o único fator que influenciou de forma mais significativa na atividade

enzimática atingindo efeitos estimados de aproximadamente 4,06. O sinal positivo indica que

o aumento da concentração de quitosana aumentará à atividade enzimática. Por outro lado, os

outros fatores parecem desprezíveis estatisticamente conforme o gráfico de Pareto.

4.2.2 Análise do Plackett & Burman com 12 Ensaios e mais 3 Repetições na condição do

ponto central.


ensaios em 2 níveis com repetição em triplicata no ponto central, foi utilizado para se avaliar a

influência dos mesmos fatores descritos na Seção 4.2.1 para a produção da enzima

quitosanase por Metarhizium anisopliae em cultivo descontínuo submerso. Ressalta-se que os

experimentos foram realizados aleatoriamente. A Tabela 9 apresenta a matriz do modelo

Plackett & Burman e os respectivos valores obtidos para a variável resposta (Atividade

Quitosanalítica).


Ensaio Q PP EL NS FP CP SM SF V11 V12 V13 A (U/mL)

1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 0,0195

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 0,0202

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 0,0109

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 0,0121

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0,0136

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 0,0156

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0,0109

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1 0,0103

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1 0,0099

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 0,0117

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 -1 0,0094

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 0,0085

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0704

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0688

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0710



62

A Tabela 10 a seguir apresenta os efeitos estimados para planejamento Plackett &

Burman com 3 repetições na condição do poto central. Observa-se na Tabela 10 que o valor

do coeficiente de determinação R2 foi de aproximadamente 2,0%, indicando que um modelo

linear não poderia representar a relação entre os fatores significativos concentração de

quitosana (1), concentração de FeSO4 (8) e a resposta.


central.

Efeitos Estimados; R2=0,01811; Ajuste:0,0 MS Erro Puro =0,0000012

Desvio Padrão t(2) P

Lim. Conf. Lim. Conf. Efeito Erro Puro -95,% +95



(4) NaNO3 0,0002 0,0006 0,3742 0,7442 -0,0024 0,0029 (5) K2HPO4 -0,0014 0,0006 -2,2450 0,1538 -0,0041 0,0013

(6) KCl -0,0022 0,0006 -3,5546 0,0708 -0,0049 0,0005 (7) MgSO4.7H2O -0,0003 0,0006 -0,4864 0,6747 -0,0030 0,0024

(8) FeSO4 0,0029 0,0006 4,5648 0,0448 0,0002 0,0056

A Figura 9 ilustra o gráfico de Pareto para o planejamento Plackett & Burman, com

repetição em triplicata no ponto central, uma das formas de se avaliar visualmente a influência

dos fatores estudados na resposta, onde é mostrado a magnitude dos efeitos para 95 % de

confiança.



63

Figura 9. Gráfico de Pareto do planejamento Plackett & Burman com triplicata no ponto

central mostrando a influência dos fatores estudados.

Analisando-se o gráfico de Pareto, observa-se que os fatores concentração de

quitosana (1) e concentração de FeSO4 (8) foram os fatores que influenciaram de forma mais

significativa na atividade enzimática atingindo efeitos estimados de aproximadamente 8,84 e

4,67, respectivamente. O sinal positivo indica que o aumento das concentrações de quitosana

e de FeSO4 aumentará à atividade enzimática. Por outro lado, os outros fatores parecem

desprezíveis estatisticamente conforme o gráfico de Pareto.

Este comportamento do FeSO4 está de acordo com o observado por Hagag et al.

(2012) que utilizando o Aspergillus fumigatus na produção de protease mostraram que um

fator de transcrição PrtT regula positivamente o controle da produção de protease, da

assimilação de Ferro e da síntese de ergosterol e que a produção de protease foi favorecida

pelo aumento da concentração de ferro.

Rajendran & Thangavelu (2009) utilizaram um planejamento Plackett & Burman para

identificar quais os fatores significativos na produção de lipase por Rhizopus arrhizus MTCC

2233 e observaram o efeito significativo médio do FeSO4, apresentando um nível de

confiança para esse fator de 48,92% (para um máximo de 98,7 % de MgSO4), com uma

produção de lipase da ordem de 2,98 U/mL em 84 horas de fermentação e que ocorreu uma

produção considerável de protease no meio de cultivo da ordem de 1,92 U/mL em 96 horas de

cultivo.



64

Mu et al. (2005) também observaram um efeito positivo do FeSO4, da ordem de 1,48

para um fator máximo encontrado de 3,11 de MgSO4, no aumento da atividade da

estereoinversão de S-fenil-1,2-etanodiol por Candida parapsilosis CCTCC M203011 na

otimização da fermentação utilizando um planejamento Plackett & Burman.

Dessa forma, observa-se que o FeSO4 é importante uma que vez o mesmo está

diretamente associado a síntese de proteases (principalmente metalloproteases), conforme

citado por Hagag et al. (2012).

4.3. Planejamento Composto Central para Produção de Quitosanase por

Metarhizium anisopliae em Cultivo Descontínuo Submerso

Um planejamento experimentos 22 com repetição em triplicata no ponto central e mais

quatro ensaios axiais, foram utilizados para se chegar a uma combinação ideal de quitosana e

FeSO4 na produção da enzima quitosanase (Tabela 11). A partir do modelo Plackett &

Burman (Tabela 12), que mostrou que o aumento das concentrações de quitosana e FeSO4,

favoreceram a produção de quitosanase, os valores utilizados neste modelo para estes

componentes nos níveis mais altos, serão considerados como os níveis mais baixos no

planejamento experimental do composto central. Os outros fatores foram fixados em todos os

ensaios em seus níveis mais baixos para a redução de custos (Tabela 11).



65

Tabela 11 – Matriz do planejamento Composto Central com os respectivos resultados da

atividade enzimática.

Ensaio Q SF A (U/mL)

1 -1 -1 0,0195

2 -1 1 0,0202

3 1 -1 0,0109

4 1 1 0,0121

5 -1,41 0 0,0136

6 1,41 0 0,0156

7 0 -1,41 0,0108

8 0 1,41 0,0103

9 0 0 0,0099

10 0 0 0,0116

11 0 0 0,0094

A Tabela 12 apresenta os efeitos estimados para o planejamento composto central.

Tabela 12 – Efeitos Estimados do planejamento Composto Central.




Média/Interação 0,0103 0,0006 15,305 0,0042 0,0074 0,0132 (1) Quitosana (L) 0,0011 0,0008 1,4316 0,2885 -0,0023 0,0047

Quitosana (Q) 0,0058 0,0009 5,9637 0,0269 0,0016 0,0101 (2) FeSO4 (L) -0,0043 0,0008 -5,3037 0,0337 -0,0079 -0,0008 (2) FeSO4 (Q) 0,0018 0,0009 1,8366 0,2076 -0,0024 0,0060

1L x 2L 0,0001 0,0011 0,1520 0,8931 -0,0048 0,0052


aproximadamente 63%, indicando que um modelo linear representaria bem a relação entre os

fatores significativos concentração de quitosana (1), concentração de FeSO4 (8) e a resposta.



66

A Tabela 13 mostra um resumo da ANOVA para o planejamento composto central

com repetição em triplicata no ponto central.

Tabela 13 – Resumo da ANOVA.

Fonte de

Variação

Soma dos

Quadrados

Grau de

Liberdade

Quadrado

Médio

Fcalculado Ftabelado

Regressão

Resíduos

0,000086 2 0,000043 6,14 4,46

0,000056 8 0,000007

Falta de

Ajuste

Erro puro

0,000053 6 0,000009 6 19,33

0,000003

2

0,0000015

Total 0,000142 10

De acordo com a Tabela 13, partindo-se dos efeitos significativos propõe-se o

modelo:

� = 0,010316 + 0,002942� � − 0,002193�� (8)

% de variação explicável: 60,5

% máxima de variação explicável: 97,9

A análise da ANOVA mostra que o modelo proposto possui significância estatística, ao

nível de 95% de confiança, uma vez que o valor de F (calculado) é maior que F (tabelado),

entretanto a ANOVA mostra também que o modelo proposto pode ser útil para se fazer

previsões, uma vez que a relação entre F (calculado) e F (tabelado) para a falta de ajuste e o

erro puro é menor que 1. O coeficiente de determinação R2 foi de aproximadamente 63%,

indicando que o modelo consegue explicar 63% da variação total em torno da média.

Os cálculos para variação explicável e para máxima variação explicável são dados pelas

Equações (9) e (10):

% de variação explicável = (SQ da regressão) / (SQ Total) (9)

% máxima de variação explicável = (SQ Total – SQ Erro puro) / (SQ Total) (10)

Sendo:

SQ – Soma dos quadrados.



67

A Figura 10 mostra o gráfico de Pareto para o planejamento Composto Central

utilizando erro puro. A magnitude dos efeitos é representada pelas colunas. Já a linha

transversal às colunas representa a magnitude dos efeitos com significado estatístico para 95%

de confiança.

Figura 10 – Gráfico de Pareto do planejamento Composto Central mostrando a influência dos fatores estudados.

Analisando-se o gráfico de Pareto (Figura 10) observa-se que os fatores concentração

de quitosana (1) e concentração de FeSO4 (8) foram os fatores que influenciaram de forma

mais significativa na atividade enzimática atingindo efeitos estimados de aproximadamente

5,96 e - 5,30, respectivamente. O sinal positivo indica que o aumento das concentrações de

quitosana aumentará à atividade enzimática. O sinal negativo indica que o decréscimo da

concentração de FeSO4 aumentará à atividade enzimática. Por outro lado, os outros fatores

parecem desprezíveis estatisticamente no gráfico de Pareto.

A avaliação do modelo também pode ser feita através da observação do gráfico dos

valores preditos em função os valores observados que são mostrados na Figura 11. Os valores

preditos pelo modelo são representados pela reta, enquanto que os valores observados

representam-se pelos pontos.



68

Figura 11 – Valores preditos em função dos valores observados.

Observa-se que alguns valores preditos apresentam um afastamento dos valores

observados. A Figura 12 ilustra a superfície de resposta da atividade quitosanolítica em

função dos dois fatores significativos, concentração de quitosana e concentração de FeSO4.

Figura 12. Atividade quitosanolítica em função da concentração de quitosana e da

concentração de FeSO4 para os fatores não significativos no ponto central.

Observa-se a existência de um ponto de mínimo, ocorrendo para concentração de

quitosana no ponto central (0) e para maiores concentrações de FeSO4 igual a (1,5). Essa



69

região deve ser evitada uma vez que a atividade quitosanolítica atinge níveis tão reduzidos

quanto 0,0094 U.mL-1. Destaca-se que nesse planejamento o maior nível da concentração de

FeSO4 (α=+1,41) equivale a 0,0051% (Tabela 6) que é aproximadamente cinco vezes maior

que o nível desse fator no ponto central do planejamento Plackett & Burman (0,001%),

conforme Tabela 3. Dessa forma, ao se utilizar o nível mínimo da concentração de FeSO4 no

Planejamento Composto Central (α=-1,41), que equivale a aproximadamente 0,001%,

aproxima-se do ponto central do do planejamento Plackett & Burman (0,001%), condição

essa que apresenta os melhores resultados de atividade quitosanolítica usando quitosana como

fonte de carbono e energia e fungo Metarhizium anisopliae.

4.4. Perfil Cinético – Melhor Condição

A seguir, apresenta-se um perfil cinético, na melhor condição, para produção da

quitosanase usando o fungo Metarhizium anisopliae, em que foram monitorados durante 24

horas os seguintes parâmetros: Concentração de proteínas totais (µg/mL), atividade

quitosanolítica (U/mL), atividade específica (U/µg) e açúcares redutores (mg/mL), ilustradas

nas Figuras 13, 14, 15 e 16, respectivamente.

Com relação à proteína extracelular, observa-se na Figura 13 que, inicialmente, ocorre

um aumento da mesma para o seu nível máximo (6,2 µg/mL), durante as 6 primeiras horas de

cultivo, seguido de uma redução para 5,7 µg/mL em 18 horas de cultivo, possivelmente

devido à presença de proteases no meio. Observa-se que a partir de então ocorre uma redução

e aumento da proteína total, em uma quantidade inferior, sugerindo um mecanismo de

controle.



70

0 4 8 12 16 20 245,0

5,2

5,4

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

Pro

tein

a (

µg

/mL

)

Tempo (h)


quitosanase por Metarhizium anisopliae em meio de cultivo contendo 0,2% de quitosana.

Com relação à atividade quitosanolítica, conforme Figura 14, a atividade máxima

ocorreu em 18 horas de produção em que se obteve aproximadamente 70,0 U/L, o que foi 28

vezes maior que o valor (2,5 U/L em 48 horas) relatado por Assis (2010) para o mesmo fungo,

e em apenas um terço do tempo de produção.

0 4 8 12 16 20 240,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

Ativid

ade

(U

/mL

)

Tempo (h)

Figura 14. Perfil da atividade quitosanolítica em função do tempo de fermentação com o

Metarhizium anisopliae cultivado em meio contendo 0,2% de quitosana.



71

Além disso, destaca-se o considerável aumento da produção de quitosanase a partir das

12 horas até 18 horas de cultivo onde atingiu o pico máximo de produção (70,0 U/L). Após o

pico em 18 horas, a produção começa a cair rapidamente, comportamento esse observado

durante todos os ensaios cinéticos. Destaca-se que é importante do ponto de vista industrial

manter a produção em alto nível por muitas horas, onde se espera uma produção contínua ou

em grandes bateladas.

Ak et al. (1998) utilizaram o fungo Penicillium spinulosum para produzir a quitosanase

usando um meio de cultura contendo 0,1% de K2HPO4; 0,05 % de MgSO4.7H2O; 0,05% de

KCl; 0,001 % de FeSO4, 0,5% NH4NO3 e como fonte de carbono e energia, os autores

usaram quitosana e parede de Rhizopus. A produção foi realizada em cultivo submerso a 28

oC. Os autores apresentam atividade quitosanolítica máxima de aproximadamente 47,0 U/mL,

ao se utilizar a parede do fungo como fonte de carbono e energia, e 30,0 U/mL ao se utilizar

quitosana como fonte de carbono e energia. Destaca-se que essas atividades ocorreram após 4

dias de cultivo. Os perfís com o tempo da atividade quitosanolítica e da atividade específica

apresentaram tendência de crescimento, com o pico máximo em 4 dias, seguindo com uma

tendência de queda da atividade. Neste tempo, a atividade específica máxima da quitosanase

foi de aproximadamente 60,0 U/mg de proteína. Essas tendências também foram observadas

nos resultados apresentados nos perfís de atividade das Figuras 14 e 15.

0 4 8 12 16 20 24

-0,010

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

Ativid

ad

e E

spe

cific

a (

U/µ

g)

Tempo (h)

Figura 15. Perfil da atividade específica da quitosanase em função do tempo de fermentação

com o Metarhizium anisopliae cultivado em meio contendo 0,2% de quitosana.



72

Observa-se na Figura 15 que a atividade específica máxima da quitosanase segue a

mesma tendência da atividade quitosanolítica apresentada na Figura 14, alcançando uma

produção máxima de aproximadamente 12,4 U/µg, em 18 horas de cultivo.

O perfil para os açúcares redutores durante o cultivo de Metarhizium anisopliae

cultivado em meio contendo 0,2% de quitosana é ilustrado na Figura 16.

0 4 8 12 16 20 240,004

0,008

0,012

0,016

0,020

0,024

0,028

Acuca

res R

ed

uto

res (

mg/m

L)

Tempo (h)

Figura 16. Perfil de açúcares redutores por Metarhizium anisopliae em meio de cultivo

contendo 0,2% de quitosana.

Observa-se, na Figura 16, que taxa máxima de redução dos açúcares redutores

(aproximadamente 0,021 mg/mL) ocorre logo após a produção máxima da enzima, em 18

horas de cultivo, conforme Figura 14. A quantidade de açúcares redutores foi a

aproximadamente 0,012 mg/mL após 24 h de cultivo. O fungo excreta para o meio enzimas

com atividade quitosanolítica, essas enzimas hidrolisam a quitosana aumentando a quantidade

de açúcares redutores para o meio, sendo que esses açúcares também são consumidos pelo

fungo durante seu crescimento.

Foi demonstrado por Assis (2010) que os açúcares redutores produzidos através da

quitossana, ocasionada pelas enzimas quitossanases metabolizadas por Metarhizium

anisopliae, com quitosana como sua única fonte de carbono e energia, atingiu um pico de 0,53

mg/mL em 48 horas. Apresentaram como quitooligossacarídeos, constituídos principalmente

por dímeros e pentâmeros, formados pela hidrólise enzimática de quitosanase em quantidades

maiores do que o consumido pelos microrganismos. Mostraram, também, que essa produção



73

segue a mesma tendência da sua atividade enzimática, corroborando com os resultados

apresentados no presente trabalho.

Os resultados do presente trabalho mostram a relevância de se adotar novas condições

para a produção de quitosanase, com suas vantagens em termos de compatibilidade ambiental,

baixo custo e reprodutibilidade com a possibilidade também de se obter quitooligossacarídeo

com atividades biológicas. Esta pesquisa, portanto, sugere base para novos estudos que

permitam alcançar rapidamente a produção de quitosanase e quitooligossacarídeo com todos

os seus benefícios.

Capítulo 5 Conclusão



75

5. Conclusão

Após o desenvolvimento desse trabalho conclui-se:

- Com relação ao Planejamento de Seleção de Fatores Plackett & Burman:

Os resultados das análises do Planejamento de Seleção de Fatores Plackett &

Burman com 8 fatores e 12 ensaios em 2 níveis, mais 3 repetições no ponto central, para

se investigar a influência dos fatores: Concentração de Quitosana, Peptona, Extrato de

Levedura, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O, FeSO4 na produção da enzima

quitosanase por Metarhizium anisopliae, mostraram que a atividade foi favorecida pelo

aumento da concentração de substrato (quitosana) e sulfato ferroso (FeSO4), enquanto

que o aumento da concentração dos outros fatores não contribuíram de forma

significativa para a resposta (atividade quitosanolítica). Os fatores concentração de

quitosana (1) e concentração de FeSO4 (8) atingiram efeitos estimados de

aproximadamente 8,84 e 4,67, respectivamente. O sinal positivo indica que o aumento

das concentrações de quitosana e de FeSO4 aumentará a atividade enzimática. Conforme

visto na literatura, observa-se importância do FeSO4, já que o mesmo está diretamente

associado a síntese de proteases (principalmente metalloproteases),

- Com relação ao Planejamento Composto Central:

A análise do planejamento composto central para avaliar a influência dos

fatores, concentração de substrato (quitosana) e concentração de FeSO4, na produção da

enzima quitosanase por Metarhizium anisopliae (a partir do planejamento Plackett &

Burman) mostrou que os fatores concentração de quitosana e concentração de FeSO4

foram os fatores que influenciaram de forma mais significativa na atividade enzimática

atingindo efeitos estimados de aproximadamente 5,96 e - 5,30, respectivamente. O sinal

positivo indica que o aumento das concentrações de quitosana aumentará a atividade

enzimática. O sinal negativo indica que o decréscimo da concentração de FeSO4

aumentará a atividade enzimática. Observa-se a existência de um ponto de mínimo,

ocorrendo para concentração de quitosana (X1) no ponto central (0) e para maiores



76

concentrações de FeSO4 (X2) igual a (1,5) com a atividade quitosanolítica de 0,0094

U.mL-1.

- Com relação ao cultivo na melhor condição:

O cultivo na melhor condição mostrou uma produção máxima de quitosanase em

18 horas de cultivo, com a atividade enzimática de 70,0 U/L, o que foi 28 vezes maior

que o valor (2,5 U/L em 48 horas) relatado na literatura (Assis, 2010) para o mesmo

fungo e em apenas um terço do tempo de produção.

Além disso, observou-se que um elevado incremento na produção de

quitosanase a partir das 12 horas de cultivo, antes de se atingir a atividade

quitosanolítica máxima, 18 horas de cultivo. Essa produção em alto nível por muitas

horas é importante do ponto de vista industrial, onde se espera uma produção contínua

ou em grandes bateladas. Observou-se também que a atividade específica máxima da

quitosanase segue a mesma tendência da atividade quitosanolítica, alcançando uma


- Com relação aos açúcares redutores:

Foi observado que os açúcares redutores seguem a mesma tendência da atividade

enzimática, com uma produção máxima de cerca de 0,21 mg/mL em 18 horas de

cultivo, produção essa que coincinde com o máximo pico de atividade enzimática.

Estes resultados mostram a relevância de se adotar novas condições para a

produção de quitosanase, com suas vantagens em termos de compatibilidade ambiental,

baixo custo e reprodutibilidade com a possibilidade também de se obter

quitooligossacarídeo com atividades biológicas. Esta pesquisa, portanto, sugere base

para novos estudos que permitam alcançar rapidamente a produção de quitosanase e

quitooligossacarídeo com todos os seus benefícios.

Referências Bibliográficas



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Apêndice


92

APÊNDICE

Apêndice


93

APÊNDICE I

Metodologia para repique da cepa

Em Erlenmeyer de 1000 mL colocava-se 500 mL do meio de manutenção

PDA. Este Erlenmeyer, com o meio de manutenção, era autoclavado junto com placas

de Petri a 1,5 kgf/cm2 por 15 minutos, em seguida, era levado para uma câmara de fluxo

laminar e transferido para as placas de Petri já autoclavadas, onde eram mantidas numa

estufa a 27 ºC durante 24 h. Após este período, as placas de Petri eram levadas a câmara

de fluxo laminar, utilizando bico de Bunsen para esterilizar a alça de platina. Procedia-

se o repique utilizando uma placa de Petri contendo a cepa pura. Cada placa de Petri

contendo a cepa pura era transferida para duas placas de Petri contendo o meio de

manutenção. As placas eram mantidas na estufa a 27 ºC durante 30 dias onde após esse

período, repetia-se este procedimento.

Apêndice


94

APÊNDICE II

Montagem da Curva de Calibração Usando o Método DNS

Soluções:

Glicosamina = 0,01 mol/mL (10000,0 µmol/mL)

Tabela 14. Dados para construção da curva de calibração usando o Método DNS.

Tubo de

Ensaio

Solução de

glicosamina (mL)

Água Destilada

(mL)

DNS (mL)

Volume Total

Massa (µµµµmol)

1 0 1,0 1,5 2,5 0

2 0,2 0,8 1,5 2,5 0,2

3 0,4 0,6 1,5 2,5 0,4

4 0,6 0,4 1,5 2,5 0,6

5 0,8 0,2 1,5 2,5 0,8

6 1,0 0 1,5 2,5 1,0

Tabela 15 - Medidas de absorbância a 600nm

Dados adicionais:

Peso Molecular D-Glicosamina = 215,64 (recipiente SIGMA)

Conc. Sol. D-Glicosamina = 0,05 g/50 mL

Massa calc.(µmol) = conc. Sol. D-Glic. x Vol. Utiliz. D-Glics. =

= 0,05 x 1000 x Vol.util./50*215,64

Tempo atividade enzimática = 30 min

1 U/mL = 1 µmol/(min.mL)

Vol. Total (Glicosamina+caldo) = 1 mL

Medições Adsorbância a 600 nm Vol. Utiliz. Massa Massa Atividade

II III Média(Abs)(mL) calc. (mg) calc. (µg) Enzim. (U/mL)

0 0 0 0 0 0 0

0,133 0,128 0,1307 0,2 0,2 200 0,0309

0,279 0,277 0,2787 0,4 0,4 400 0,0618

0,433 0,428 0,4297 0,6 0,6 600 0,0927

0,587 0,583 0,5797 0,8 0,8 800 0,1237

0,727 0,716 0,7157 1 1 1000 0,1546

Apêndice


95

Figura 17 – Curva padrão de glicosamina.

y = 1900ralx + 1900ral

R² = 1900ral

00,000

00,020

00,040

00,060

00,080

00,100

00,120

00,140

00,160

00,180

00,000 00,100 00,200 00,300 00,400 00,500 00,600 00,700 00,800

Ati

v.

En

zim

áti

ca (

U/m

L)

Absorbância (Abs) a 600 nm

Curva-Padrão D-Glicosamina

Apêndice


96

APÊNDICE III

Método de Determinação de Proteína Utilizando o Corante Comassie

Brilhante Blue G 250 (Método modificado de Sedmak e Grossberg)

Micrométodo

Preparar uma solução 0,06% de Comassie Blue G250 em 1,5 % HCl (w/V). Filtrar e

papel de filtro Whatman nº1.

Curva Padrão (1 a 20 µµµµg)

a) Preparar soluções estoque de BSA de 10 a 200 µg/mL.

b) Colocar em tubos de ensaio 100 µL da solução estoque, 1400 µL de água e

1500µL do Comassie e agitar.

c) Preparar um tubo contendo 1500 µL de água e 1500 µL do corante que

corresponde ao zero de proteína.

d) Após 5 minutos (padronizar o tempo) fazer as leituras das absorbâncias.

e) As leituras das amostras devem ser feitas em dois comprimentos de onda 595 e

465 contra a água.

f) Plotar a razão das absorbâncias a 595/465 como uma função da massa de BSA e

calcular o melhor ajuste linear dos dados.

Apêndice


97

Micrométodo (1 a 20 µµµµg de BSA)

Solução Estoque de BSA = 0,2 mg/mL

Tabela 16. Dados para construção da curva padrão de BSA.

Tubo de

Ensaio

H2O (µµµµL)

BSA (µµµµg)

Coomassie (µµµµL)

BSA (µµµµg)

1 1500 0 1500 0

2 1490 10 1500 2

3 1480 20 1500 4

4 1470 30 1500 6

5 1460 40 1500 8

6 1450 50 1500 10

7 1440 60 1500 12

8 1430 70 1500 14

9 1420 80 1500 16

10 1410 90 1500 18

11 1400 100 1500 20

Dados adicionais:

Concentração Sol. Estoque

BSA = 0,2 mg/mL = 0,2 µg/µL

Vol. total sol. = vol. H2O + vol. BSA + vol.

Coomassie = 3000 µL = 3 mL

Concentração Sol. BSA (mg/mL) = (massa BSA mg) / 3 mL

.

Apêndice


98

Figura 18 – Curva Padrão de BSA

y = 1900ralx - 1900ral

R² = 1900ral

000,000

001,000

002,000

003,000

004,000

005,000

006,000

007,000

000,400 000,500 000,600 000,700 000,800 000,900 001,000 001,100

µg

BS

A

Razão Absorbâncias (595nm/465nm)

Curva-Padrão BSA



TESE DE DOUTORADO




Natal/RN

Abril/2013





Natal/RN

Abril/2013

ABSTRACT





irmãos e sobrinhos

AGRADECIMENTOS











obstáculos.
















laboratório.




o Abstract.





alunos.


LISTA DE TABELAS

NOMENCLATURA

INTRODUÇÃO...............................................................................................................................15


2.1. Enzimas................................................................................................................................18


2.1.2. Quitosanases...............................................................................................................24

2.2. Fungos..................................................................................................................................29






2.3. Fermentação.........................................................................................................................40








3.1. Quitosana..............................................................................................................................50

3.2. Microrganismo.....................................................................................................................50
















ponto central ....................................................................................................................................61




CONCLUSÃO.................................................................................................................................75


APÊNDICE I...................................................................................................................................93


APÊNDICE II.................................................................................................................................94


APÊNDICE III................................................................................................................................96



Lista de Figuras























quitosana........................................................................................................................................71





Lista de Tabelas













central...............................................................................................................................................62


enzimática........................................................................................................................................65






NOMENCLATURA










Da – Dalton



E – Enzima












P – Pressão
















T – Temperatura



















15






























et al., 2007).



16



















sob controle.



bateladas.



18

























bactérias.








19


purificação).




























20


Animais

Marinhos




Lagosta Esporos

Camarão

Caranguejo

Krill
















21




































22






















mg/mL.














23














24

2.1.2. Quitosanases



































25




superiores a 37ºC.



















produzidos.












26



























de quitinase.









27



































28




































29



humana.










2.2. Fungos





















30














& Toledo, 1996).










31
















2012)







assexuados.



32


































33

















sal.






34


































35









a madeira.

























36




































37




































38



































39










semelhantes.



















48,4%.







40








2.3. Fermentação
















(Assis, 2010).











41


































42








atividade de água.













resultados;


incontroláveis.










43
















fatorial completo.

















44









2005).











2005).













45































Metanol.





46




































47



























al., 2010).









48






(Guo et al., 2010).















50




3.1. Quitosana






3.2. Microrganismo
















51

































52





























53


Nível Q

(%)

PP

(%)

EL

(%)

NS

(%)

FP

(%)

CP

(%)

SM

(%)

SF

(%)

-1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0005

0 0,2 0,5 0,3 0,2 0,10 0,050 0,050 0,0010

1 0,3 0,8 0,4 0,3 0,15 0,075 0,075 0,0015




1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 -1

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0








54








(Silva, 2004).










Ensaio Q SF

1 -1 -1

2 -1 1

3 1 -1

4 1 1

5 -1,41 0

6 1,41 0

7 0 -1,41

8 0 1,41

9 0 0

10 0 0

11 0 0





55


2009):

Xi = (xi – x0)/∆xi , i = 1, 2, 3, ..., k (2)













Nível Q

(%)

PP

(%)

EL

(%)

NS

(%)

FP

(%)

CP

(%)

SM

(%)

SF

(%)

-1,41 0,218 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0009

-1 0,3 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0015

0 0,5 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0030

1 0,7 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0045

1,41 0,782 0,2 0,2 0,1 0,05 0,025 0,025 0,0051






56












Discussão



58















Wang et al. 2002.



59













1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 0,0195

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 0,0202

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 0,0109

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 0,0121

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 0,0136

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 0,0156

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 0,0109

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 0,0103

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 0,0099

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 0,0117

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 0,0094

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0,0085







60






-95,% +95



(4) NaNO3 0,0002 0,0013 0,1758 0,8715 -0,0040 0,0045 (5) K2HPO4 -0,0014 0,0013 -1,0552 0,3687 -0,0057 0,0028

(6) KCl -0,0022 0,0013 -1,6708 0,1933 -0,0065 0,0020 (7) MgSO4.7H2O -0,0003 0,0013 -0,2286 0,8338 -0,0046 0,0039

(8) FeSO4 0,0029 0,0013 2,1457 0,1211 -0,0014 0,0071







fatores estudados.



61







ponto central.







Quitosanalítica).



1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 -1 0,0195

2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 0,0202

3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 0,0109

4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 0,0121

5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0,0136

6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 0,0156

7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0,0109

8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1 0,0103

9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1 0,0099

10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 0,0117

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 -1 0,0094

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 0,0085

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0704

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0688

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0710



62







central.






(4) NaNO3 0,0002 0,0006 0,3742 0,7442 -0,0024 0,0029 (5) K2HPO4 -0,0014 0,0006 -2,2450 0,1538 -0,0041 0,0013

(6) KCl -0,0022 0,0006 -3,5546 0,0708 -0,0049 0,0005 (7) MgSO4.7H2O -0,0003 0,0006 -0,4864 0,6747 -0,0030 0,0024

(8) FeSO4 0,0029 0,0006 4,5648 0,0448 0,0002 0,0056




confiança.



63




















cultivo.



64




















65




1 -1 -1 0,0195

2 -1 1 0,0202

3 1 -1 0,0109

4 1 1 0,0121

5 -1,41 0 0,0136

6 1,41 0 0,0156

7 0 -1,41 0,0108

8 0 1,41 0,0103

9 0 0 0,0099

10 0 0 0,0116

11 0 0 0,0094








1L x 2L 0,0001 0,0011 0,1520 0,8931 -0,0048 0,0052






66




Fonte de

Variação

Soma dos

Quadrados

Grau de

Liberdade

Quadrado

Médio


Regressão

Resíduos

0,000086 2 0,000043 6,14 4,46

0,000056 8 0,000007

Falta de

Ajuste

Erro puro

0,000053 6 0,000009 6 19,33

0,000003

2

0,0000015

Total 0,000142 10


modelo:

� = 0,010316 + 0,002942� � − 0,002193�� (8)













Sendo:




67




de confiança.















68











69





















controle.



70

0 4 8 12 16 20 245,0

5,2

5,4

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

Pro

tein

a (

µg

/mL

)

Tempo (h)







0 4 8 12 16 20 240,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

Ativid

ade

(U

/mL

)

Tempo (h)





71



















0 4 8 12 16 20 24

-0,010

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

Ativid

ad

e E

spe

cific

a (

U/µ

g)

Tempo (h)





72






0 4 8 12 16 20 240,004

0,008

0,012

0,016

0,020

0,024

0,028

Acuca

res R

ed

uto

res (

mg/m

L)

Tempo (h)


















73











75

5. Conclusão





























76


U.mL-1.

























78









37.


















79






401p.










p.777-782, 2002.



p.315-322, 2005.






2000.



80
















p.145-149, 200.









Research, v.104, n.2, p.134-150, 2000.



81



v.24, p.209-214, 1994.



















7082, 2010.





2005.



82




v.73, p.113-121, 2000.





v.48, p.596–602, 2010.



















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J. Agric. Food Chem., 50, 4666-4673, 2002.




p.201-206, 2002.








v.100, p.5214–5218, 2009.



v.67, n.9, 1875 – 1882, 2003.









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368, 2005.







2012.




v.178, p.3197-3202, 1977.







2010.



Technology, v.33, p.410-415, 2003.



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Natal.




Veterinária, v.16, n.1, p.27-31, 2007.





p. 47-53, 2012.




São Paulo, v.15, p.157-162, 2006.













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v.96, p.485-490, 2005.




p.890-895, 1998.














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Alegre.





56, n.4, p.844-848, 1990.




Technology, v.101, p.7856-7863, 2010.



Wileyvch, v.1, p.115-208, 2005.






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EDUNISC, 1998.















2007.







89


2249, 2008.








Editora, 2005.



p.152, 2001.





2423, 1991.







1995.



90
















v.24, p.47-54, 1994.


713-721, 1971.


1996.







91












Biochem., v.64, n.9, 1896-1902, 2000.



Apêndice


92

APÊNDICE

Apêndice


93

APÊNDICE I












Apêndice


94

APÊNDICE II


Soluções:



Tubo de

Ensaio

Solução de

glicosamina (mL)

Água Destilada

(mL)

DNS (mL)

Volume Total

Massa (µµµµmol)

1 0 1,0 1,5 2,5 0

2 0,2 0,8 1,5 2,5 0,2

3 0,4 0,6 1,5 2,5 0,4

4 0,6 0,4 1,5 2,5 0,6

5 0,8 0,2 1,5 2,5 0,8

6 1,0 0 1,5 2,5 1,0


Dados adicionais:




= 0,05 x 1000 x Vol.util./50*215,64






0 0 0 0 0 0 0

0,133 0,128 0,1307 0,2 0,2 200 0,0309

0,279 0,277 0,2787 0,4 0,4 400 0,0618

0,433 0,428 0,4297 0,6 0,6 600 0,0927

0,587 0,583 0,5797 0,8 0,8 800 0,1237

0,727 0,716 0,7157 1 1 1000 0,1546

Apêndice


95


y = 1900ralx + 1900ral

R² = 1900ral

00,000

00,020

00,040

00,060

00,080

00,100

00,120

00,140

00,160

00,180

00,000 00,100 00,200 00,300 00,400 00,500 00,600 00,700 00,800

Ati

v.

En

zim

áti

ca (

U/m

L)



Apêndice


96

APÊNDICE III



Micrométodo











465 contra a água.



Apêndice


97




Tubo de

Ensaio

H2O (µµµµL)

BSA (µµµµg)


BSA (µµµµg)

1 1500 0 1500 0

2 1490 10 1500 2

3 1480 20 1500 4

4 1470 30 1500 6

5 1460 40 1500 8

6 1450 50 1500 10

7 1440 60 1500 12

8 1430 70 1500 14

9 1420 80 1500 16

10 1410 90 1500 18

11 1400 100 1500 20

Dados adicionais:






.

Apêndice


98


y = 1900ralx - 1900ral

R² = 1900ral

000,000

001,000

002,000

003,000

004,000

005,000

006,000

007,000

000,400 000,500 000,600 000,700 000,800 000,900 001,000 001,100

µg

BS

A


Curva-Padrão BSA