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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA Universidade Federal do Amazonas - UFAM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA Filogeografia e genética de populações de jacaré-paguá (Paleosuchus palpebrosus) ao longo do rio Madeira e bacia do rio Paraguai (Pantanal) FÁBIO DE LIMA MUNIZ Manaus – AM 2012
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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
Universidade Federal do Amazonas - UFAM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA
Filogeografia e genética de populações de jacaré-paguá
(Paleosuchus palpebrosus) ao longo do rio Madeira e bacia do rio
Paraguai (Pantanal)
FÁBIO DE LIMA MUNIZ
Manaus – AM
2012
FÁBIO DE LIMA MUNIZ
Filogeografia e genética de populações de jacaré-paguá
(Paleosuchus palpebrosus) ao longo do rio Madeira e bacia do rio
Paraguai (Pantanal)
ORIENTADORA: Dra. IZENI PIRES FARIAS
CO-ORIENTADORA: Dra. ZILCA CAMPOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
Fonte Financiadora: CNPq/CT-Amazônia 575603/2008-9
Apoio: Laboratório de Evolução e Genética Animal – LEGAL
MANAUS – AM
2012
II
FICHA CATALOGRÁFICA
Sinopse: Para o estudo da filogeografia e genética de populações de Paleosuchus
palpebrosus foi utilizado o gene mitocondrial Citocromo b para as amostras
populacionais da bacia Amazônica brasileira, boliviana e do Pantanal. Um cenário de
panmixia foi observado dentro das bacias, assim como uma forte estruturação
genética entre elas, em decorrência a barreiras geomorfológicas. As corredeiras
presentes no rio Madeira restringem, mas não impedem o fluxo gênico entre as
amostras populacionais dentro da bacia Amazônica Brasileira.
Palavras-chave: jacaré-paguá, estruturação genética, fluxo gênico, diversidade
genética
M966 Muniz, Fábio de Lima Filogeografia e genética de populações de jacaré-paguá (Paleossuchus palpebrosus) ao longo do rio Madeira e bacia do rio Paraguai (Pantanal) / Fábio de Lima Muniz.--- Manaus : [s.n.],2012. ix, 30 f. : il. color. Dissertação (mestrado) --- INPA, Manaus, 2012 Orientador : Izeni Pires Farias Coorientador : Zilca Campos Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
1. Jacaré-paguá. 2. Filogeografia. 3. Genética de populações. 4. Variabilidade genética. I. Título.
CDD 19. ed. 597.980415
III
À minha querida família de nascença. Nada seria possível sem a base sólida de amor e dedicação que recebi e continuo recebendo daqueles a quem Deus me confiou.
À família do coração. Muitos chegaram pra ficar e construíram laços de verdadeira amizade e amor. Estamos unidos pelos laços do espírito nessa jornada chamada vida.
Enfim, a todas as famílias de minha vida.
OFEREÇO
À minha prima do coração Pâmela Marins Moreira. Envio meus melhores sentimentos e
homenagem para que você melhore e se torne uma linda borboleta
DEDICO
IV
“Quando a lagarta achou que tudo havia acabado ela se transformou em borboleta.”
Lamartine
V
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, sempre simples e sincera, agradeço pelo grande incentivo aos meus estudos e todo esforço para me dar o que eu realmente precisava. Te amo mãe!
Ao meu querido pai, a meu avô e a minha avó pelo grande amor e suporte moral necessários para que eu me tornasse uma pessoa de bem.
Ao meu irmão, e segundo pai, e a minha irmãzinha, obrigado por serem “irmãos-amigos” como não se vê em qualquer lugar.
Aos meus tios e tias queridos que me deram suporte e exemplo para vencer as dificuldades da vida.
À orientadora que todos queriam ter, professora Izeni Pires Farias. Seu exemplo, dedicação e amor àquilo que faz representa um espelho daquilo que eu gostaria de ter, pelo menos um pouco, quando eu “crescer”.
À co-orientadora e amiga Zilca Campos. Cresci muito com o seu convívio, tanto em conhecimentos acadêmicos quanto na vida. A sintonia foi forte. Pode contar comigo para novas aventuras pela Amazônia e por que não pelo mundo (hehehhe).
Ao professor Tomas Hrbek, por compartilhar humildemente seus enormes conhecimentos, pela paciência e pela disponibilidade. Obrigado por ser um bom e verdadeiro orientador, mesmo sem ter a obrigação disso.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva e ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela oportunidade de aprendizado e aperfeiçoamento que me ofereceram.
A todos os colegas que pertencem ou que pertenceram ao laboratório de Evolução e Genética Animal – LEGAL, por compartilhar alegrias, euforias, nervosismos e até mesmo dificuldades. Obrigado pela ajuda de muitos, em especial àqueles que revisaram minha dissertação: Deyla, Jhenifer, Julia e Juliana; aos que estavam sempre dispostos a ajudar tirando dúvidas ou mesmo se esforçando junto comigo para resolver os problemas de análises e escrita: Concy, Gabi, Mário, Naty, Olavo e Wal.
Muitos já não estão presentes no LEGAL, mas contribuíram grandemente em minha formação e consequentemente nesse trabalho (Áureo, Dani Tófoli, Ed, Rafa, Will e outros).
Ao tio Edinilson e à tia Rosa (sogro e sogra) pela revisão do texto e apoio, dispensando um tempo valioso apenas para me ajudar. Muito obrigado!
Aos colegas e ajudantes em campo: Ari, Augusto (Adorfo), Daniel, Dênis, Deyla, Seu Manoel, Pedro, Valéria (Val).
VI
Ao CNPq e CT-Amazônia pelo financiamento do projeto intitulado “Rio Madeira: sua contribuição nos mecanismos de diversificação da fauna na Amazônia” (CNPq/CT-Amazônia 575603/2008-9) que subsidiou esse trabalho.
À Universidade Federal do Amazonas, pelo apoio logístico através do Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL) e à FAPEAM pelo financiamento das bolsas de estudo.
Aos grandes amigos pessoais, da casa espírita e do grupo Sal e Luz: Tailah, Augusto (Tinho), Larissa (Lari), João Pedro (JP), Paola, Rony, Sissi, Fernando, Rose, Jéssica, Alexandre, Gilson, dona Francisca, seu Moacir, seu Walter, Rosalina, Robertinho, Miguel, Targlane, Salazar, Teca, Raimunda, Ermelinda, Rosa (tia), Rosa Paes, Manoel, Sônia, Marcos, André Carrera, Daniel, Fred, Elias, Carol, João Nogueira, Allan Kardec. Perdoem-me se esqueci alguém.
À família: Gracilde, Marcio, Aline, Flávio, Gerda, Hadassa, Ermelinda, Zé Muniz, Soraia, Rafael, Pedrinho, Rai, Jéssica, Suzana, Cláudia, Vivi, tio Fernando, tia Rose, tio Fábio, Neide, Ciro, Cícero, Israel, Lidiane, Laiane, Lucas, Liliane, Leandrinho, Ana Paula, Larissa.
À família do Rio de Janeiro: Tailah, Rosa, Edinilson, Matheus, Pâmela (Pam), Paulinho (meu bem), Gilberto (iow man), tia Céia, tia Preta, Fernando, tia Lila, tio Marquinho, Rômulo, tia Lora, Sicínio, Dudu (tio?), Gilda (vovó), tio Mazinho, tia Rosa, Lucas, Lana, tia Mana, Tiago, vovô Nilson.
Por fim, agradeço a Deus pela vida.
VII
RESUMO
Paleosuchus palpebrosus é um crocodiliano da subfamília Caimaninae que se distribui amplamente na região Neotropical. Possui comportamento relacionado à terra firme, e na Amazônia, concentra-se preferencialmente em rios de cabeceira, tributários e em florestas alagáveis. No Pantanal, sua ocorrência é restrita à região periférica, próximo a serras, não sendo encontrado na planície alagada do rio Paraguai. Estão geralmente associados à água corrente, fria e limpa. Os conhecimentos sobre Paleosuchus palpebrosus são muito escassos, o que pode dificultar ações para sua conservação. Assim, foram utilizadas sequências do gene mitocondrial Citocromo b para determinar, pela primeira vez, o padrão de distribuição da variabilidade genética da espécie e avaliar barreiras físicas ou históricas ao fluxo gênico entre suas populações, bem como investigar eventos demográficos históricos. Foi sequenciado o Citocromo b de 172 indivíduos de Paleosuchus palpebrosus em localidades ao longo dos rios Madeira, Mamoré e Guaporé, em várias localidades do Pantanal e em uma no rio Solimões, lago Cururu. Utilizou-se diferentes tipos de inferências Bayesianas para investigar o número de populações reais, o tempo de divergência entre as populações, taxas de fluxo gênico e mudanças históricas no tamanho efetivo de cada uma das populações. A estrutura de populações foi obtida por meio da AMOVA e eventos demográficos foram investigados via testes D de Tajima e Fs de Fu. Também se calculou os índices de diversidade genética da espécie. Paleosuchus palpebrosus é composto por populações fortemente estruturadas geneticamente como resultado da baixa ou inexistente taxa de fluxo gênico entre elas. A população de P. palpebrosus do lago Cururu está isolada do Madeira e restrita à região de paleovárzea do rio Solimões. As populações do Madeira e da Bolívia apresentaram fluxo gênico bidirecional, porém assimétrico. As serras que dividem as sub-bacias do Madeira e da Bolívia e as cachoeiras do alto rio Madeira são barreiras que limitam o fluxo gênico entre essas populações. O complexo de serras dos Parecis divide as bacias do rio Amazonas e Paraguai e representa a barreira vicariante que isolou as populações do Pantanal e da Bolívia. A população do Madeira sofreu expansão populacional, provavelmente após a última era glacial, e a diversidade genética em P. palpebrosus foi alta e comparável com a de outros Caimaninae. Deste trabalho, surgem importantes implicações para melhor conhecer a espécie. Os grupos de indivíduos do lago Cururu, Madeira/Bolívia e Pantanal podem ser considerados Unidades Evolutivas Significantes e devem ser tratadas como pertencentes a populações completamente independentes. Os indivíduos da espécie também podem dispersar entre corpos d’água, utilizando a via terrestre e trocando fluxo gênico sem precisar dispersar pela calha do rio principal. Além disso, a caracterização prévia fornece o padrão de fragmentação genética natural, importante para que futuros estudos possam avaliar com mais exatidão os impactos antrópicos gerados sobre essa espécie, como é o caso das hidrelétricas.
Palavras-chaves: filogeografia, estruturação genética, fluxo gênico, diversidade genética, jacaré-paguá
VIII
ABSTRACT
Paleosuchus palpebrosus is a crocodilian of the subfamily Caimaninae that is distributed widely in the Neotropics. It has behavior associated with, and in the Amazon it is concentrated in headwaters of rivers, tributaries and flooded forests. In the Pantanal, its occurrence is restricted to the periphery, near mountains, not being found in the floodplain of the Paraguay River. Paleosuchus palpebrosus is usually associated with clean, cold running water. Scientific knowledge of Paleosuchus palpebrosus is deficient which adversely affects their conservation. Therefore, we used sequences of the mitochondrial cytochrome b gene to investigate, for the first time, the pattern of distribution of genetic variability, evaluating historical and/or physical barriers to gene flow between populations, as well as investigating historical demographic events. We sequenced the complete cytochrome b from 172 individuals of Paleosuchus palpebrosus sampled from localities along the Madeira and Mamore/Guaporé Rivers, in various localities in the Pantanal and one locality on the Solimões River, Cururu lake. We use different types of Bayesian inference to investigate the number of biological populations, the divergence time between populations, rates of gene flow and historical changes in effective size of each population. The population structure was obtained by AMOVA and demographic events were investigated via tests of Tajima's D and Fu's Fs. We also calculated indexes of genetic diversity of the species. Paleosuchus palpebrosus is composed of genetically highly structured populations as a result of no or low rate of gene flow between them. The population of P. palpebrosus Cururu lake is isolated from the Madeira River basin, and restricted to the paleovárzea region of the Solimões. Populations of the Madeira and Bolivia showed bidirectional gene flow, but asymmetrical. The mountains that divide the sub-basins of the Madeira and Bolivia and the rapids of the upper Rio Madeira are barriers that limit gene flow between populations. The complex of Parecis mountains divide the basins of the Amazon and Paraguay and are a likely vicariant barrier that isolated populations of Bolivia and the Pantanal. The population of Madeira suffered population expansion, probably after the last Ice Age, and genetic diversity in P. palpebrosus was high and comparable to other Caimaninae. Important implications arise from this work for the better understand the species. Populations of Cururu lake, Madeira/Bolivia and the Pantanal can be considered Evolutionary Significant Units and should be treated as completely independent populations. Individuals of P. palpebrosus can also disperse between water bodies via land, thus gene flow does not need to occur via the main river channel. In addition, our characterization provides the natural pattern of the distribution of genetic diversity which is important for future studies to assess more accurately human impacts on this species generated, for example, by hydroelectric dams and plants.
Keywords: phylogeography, genetic structure, gene flow, gene diversity, dwarf caiman.
IX
SUMÁRIO LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. X
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. XI
1. INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................................... 1
1.1 Aspectos gerais dos crocodilianos ................................................................................ 1
1.2 História natural dos Paleosuchus ................................................................................. 2
1.2.1 Ameaças ao Jacaré-paguá (P. palpebrosus) ......................................................... 7
1.3 Filogeografia................................................................................................................. 9
1.4 Genética de populações e conservação ..................................................................... 10
1.5 Marcadores moleculares ............................................................................................ 11
1.6 Estudos filogeográficos e populacionais em jacarés ................................................... 13
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 15
2.1 Objetivo geral ............................................................................................................. 15
2.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 15
Capítulo 1 ............................................................................................................................ 17
ABSTRACT ...................................................................................................................... 18
INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 20
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 24
Área de estudo e coleta das amostras .......................................................................... 24
Processamento em laboratório ..................................................................................... 25
Estimativa do número de grupos biológicos .................................................................. 26
Análises Filogeográficas e Populacionais ..................................................................... 27
RESULTADOS ................................................................................................................. 31
DISCUSSÃO .................................................................................................................... 34
Padrões filogeográficos em P. palpebrosus .................................................................. 34
Demografia Histórica e Divergência Genética ............................................................... 40
Implicações para a conservação ................................................................................... 43
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 46
3. CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................................... 63
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 64
X
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1 Tabela 1. Primers utilizados nas PCRs (Reação em Cadeia da Polimerase) e no
sequenciamento do gene mitocondrial, Citocromo b................................................. 52 Tabela 2. Lista de sequências utilizadas nesse artigo e depositadas no Genbank.
Nós mostramos também a espécie, a região e o a referência de cada uma das
sequências................................................................................................................. 53 Tabela 3. Índices de diversidade e teste de neutralidade em cada uma das
populações de Paleosuchus palpebrosus encontrada nesse trabalho e também para
todos os indivíduos amostrados................................................................................. 55 Tabela 4. Comparação entre a diversidade genética encontrada em P. palpebrosus
e em outras espécies de crocodilianos...................................................................... 56
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Indivíduos de Paleosuchus palpebrosus e Paleosuchus trigonatus.......... 03
Figura 2. Mapas de distribuição de P. palpebrosus e P. trigonatus.......................... 05
Figura 3. Mapa ilustrando a bacia de drenagem do Alto Paraguai........................... 06 Figura 4. Ilustração da fita dupla do DNA mitocondrial, com destaque para o gene
Citocromo b................................................................................................................12 CAPÍTULO 1 Figura 1. Mapa de coleta de P. palpebrosus com as coordenadas geográficas de
cada localidade.......................................................................................................... 59
Figura 2. Mapa mostrando as localidades de coleta divididas em quatro populações
que podem ser distinguidas por cores diferentes...................................................... 60
Figura 3. Mapa de localidades e árvore de haplótipos gerada no programa
HAPLOVIEWER......................................................................................................... 61 Figura 4. Árvore filogenética gerada no programa BEAST......................................... 62
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Aspectos gerais dos crocodilianos
Os crocodilianos descendem, assim como as aves, do grupo Archosauria que
habitou o planeta na era Mesozóica, há cerca de 245 milhões de anos (Ma) (Blake,
1982). Estima-se que os crocodilianos modernos (da subordem Eusuchia) tenham
aparecido a partir do Triásico superior, há cerca de 220 Ma sob a forma de
carnívoros terrestres (Martin, 2008), tornando-se posteriormente mais adaptado ao
ambiente aquático que ao terrestre, uma vez que a água tornou-se essencial para
sua reprodução (Lang, 1976; Martin, 2008). Desde sua origem, os crocodilianos
sofreram poucas alterações morfológicas, levando a supor que foram bem
adaptados ao longo de sua evolução (Hickam et al., 2006; Salisbury, 2006). Eles
compõem um grupo homogêneo e pouco diverso dentro dos répteis. De um modo
geral, os crocodilianos são caracterizados pelo grande porte, longa vida reprodutiva,
longo tempo para maturidade e ampla distribuição tropical e subtropical (Ferguson,
1985).
Todas as 23 espécies de crocodilianos viventes (ou 24, dependendo do autor
e da elevação de nível de subespécie em espécie) (Martin, 2008; McAliley et al.,
2006) estão compreendidas na subordem Eusuchia (Taplin, 1984; Benton e Clark
1988; Clark, 1994; Salisbury, 2006). No entanto, isso representa somente uma
pequena fração da diversidade morfológica de crocodiliformes que existiu na era
Mesozóica (Clark, 1994; Brochu, 2003), incluindo outras subordens.
Atualmente, os Eusuchia são compostos por três famílias: Crocodylidae (que
inclui 13 espécies de Crocodylus e uma espécie de Osteolaemus), Alligatoridae (que
inclui duas espécies de Alligator, três de Caiman, uma de Melanosuchus e duas de
Paleosuchus) e Gavialidae (com apenas uma espécie de Gavialis) (Salisbury, 2006).
A posição do falso gavial (Tomistoma schlegelii) ainda está indefinida, flutuando
entre Crocodylidae, indicada por estudos morfológicos (Salisbury e Willis 1996;
Brochu 1997, 1999, 2004), e Gavialidae, indicada por estudos bioquímicos e
moleculares (Densmore e Owen 1989; Gatesy et al. 2003; Harshman et al. 2003).
Os gêneros viventes da família Alligatoridae, exceto Alligator, são incluídos no
grupo dos Caimaninae. Esse grupo é amplamente sustentado por dados
2
morfológicos e moleculares como sendo monofilético (ver Densmore, 1983; Norell,
1988; Brochu, 1999, 2004; Gatesy et al., 2003; Harshman et al., 2003; Aguilera et
al., 2006; Willis et al., 2007; Willis, 2009).
O Brasil possui a maior diversidade de crocodilianos do mundo. O país conta
com seis espécies conhecidas popularmente como jacarés (Carvalho, 1951), sendo
elas: Caiman latirostris (jacaré-do-papo-amarelo), Caiman crocodilus (jacaré-tinga),
Caiman yacare (jacaré-do-pantanal), Melanosuchus niger (jacaré-açú) Paleosuchus
trigonatus (jacaré-coroa) e Paleosuchus palpebrosus (jacaré-paguá).
O jacaré-do-pantanal, até pouco tempo atrás, era tratado como subespécie de
C. crocodilus (C. c. yacare), no entanto, atualmente é classificada em nível de
espécie (C. yacare). Tal classificação é adotada pela autoridade ambiental brasileira
(IBAMA) (Campos et al., 2010).
Das seis espécies que ocorrem no Brasil, somente C. latirostris não é
encontrada na Bacia amazônica e apenas duas, P. palpebrosus e Caiman yacare,
estão presentes no bioma Pantanal. O jacaré-paguá (P. palpebrosus) foi objeto de
nosso estudo nestes dois biomas brasileiros: Amazônia e Pantanal.
1.2 História natural dos Paleosuchus
Paleosuchus significa “crocodilo antigo", uma vez que paleo tem origem no
grego palaios (antigo) e suchus vem de soukhos (crocodilo). É denominado assim,
pois representa um grupo basal dentro dos Caimaninae (Brochu, 2003).
Muitos de seus caracteres morfológicos são modificações das sinapormofias
típicas da família Alligatoridae, ou seja, possuem várias apomorfias que representam
inversões dos caracteres diagnósticos do grupo (Brochu, 1999), tornando as
espécies desse gênero bem distintas das demais.
Apesar da ausência de registros fósseis de Paleosuchus, estima-se que o
tempo de divergência dos caimaninae gire em torno de 58 Ma, o que representa
também o período do surgimento do gênero devido à sua posição filogenética basal
(Brochu, 2003). Análises moleculares, porém, indicam um tempo de divergência
mais recente, entre 37-41 Ma, o que corresponde ao final do Eoceno (Roos et al.,
2007).
3
Roos et al. (2007), atribui a discordância entre dados morfológicos e
moleculares à falta de registros fósseis intermediários. Além disso, relata que
problemas associados à posição filogenética do gênero Gavialis podem ter
contribuído para o aumento dessa incongruência.
Em algum momento do processo evolutivo do gênero ocorreu um evento de
especiação que deu origem às duas espécies viventes do gênero, P. palpebrosus
(jacaré-paguá) e P. trigonatus (jacaré-coroa). Esse momento é estimado por dados
moleculares entre 17 e 19 Ma, muito embora essa estimativa não possa ser
confrontada devido à ausência de registros fósseis (Roos et al., 2007). Apesar do
considerável tempo de divergência, atualmente as espécies são morfologicamente
similares e frequentemente confundidas (Magnusson e Campos, 2010a). As duas
espécies do gênero Paleosuchus podem ser observadas na Figura 1.
Figura 1. (A) Jacaré-paguá (Paleosuchus palpebrosus); (B) jacaré-coroa (Paleosuchus trigonatus). Fotos: Zilca Campos
A
B
4
Os indivíduos das espécies de Paleosuchus são pequenos em relação à
maioria dos outros crocodilianos. P. palpebrosus atinge no máximo 2,1 metros
(Campos et al., 2010) e P. trigonatus atinge um limite de 2,3 metros (Medem, 1981).
Essas espécies estão entre os menores crocodilianos existentes no mundo
juntamente com Osteolemus tetraspis (Grigg e Gans, 1993). Ambos ocorrem em
riachos ou igarapés de terra firme, principalmente P. trigonatus (Magnusson e Lima,
1991), e de um modo geral, estão associados à água corrente, fria e limpa (Medem,
1981; Campos et al., 1995). Paleosuchus palpebrosus, além disso, pode ser
encontrado em ambientes de florestas alagadas nas margens de rios e lagos
(Magnusson, 1985; Da Silveira et al., 1997; Campos e Sanaiotti, 2006), rios de
cabeceira, tributários dos rios principais e próximo a quedas d’água (Magnusson et
al., 1987; Magnusson, 1992; Campos et al., 1995; Campos e Mourão, 2006;
Vasconcelos e Campos 2007). Em contraste a esse padrão, jacarés-paguás também
já foram encontrados em poças de água formadas à beira de estradas (Botero-Arias,
2007), ambientes artificiais criados devido à ação humana.
O jacaré-paguá possui ampla distribuição na América do Sul, compreendendo
boa parte do Brasil e outros nove países: Paraguai, Bolívia, Peru, Equador,
Colômbia, Venezuela, Guiana, Suriname e Guiana Francesa (Magnusson, 1985)
(Figura 2). Por sua vez, o jacaré-coroa possui distribuição menos ampla, sendo
totalmente sobreposta com parte da distribuição do jacaré-paguá, somente na região
amazônica (Figura 2).
Em território nacional, o jacaré-paguá ocorre em quase todas as bacias
hidrográficas (Amazonas, Tocantins, São Francisco, Paraná e Paraguai) (Medem,
1983; Thorbjarnasson, 1992; Ross, 1998), enquanto o jacaré-coroa está restrito à
bacia amazônica.
5
Figura 2. Distribuição de P. palpebrosus (A); Distribuição de P. trigonatus (B). Fonte: Magnusson e Campos (2010a e b)
Na Amazônia, o jacaré-paguá se concentra preferencialmente em rios de
pequeno porte, afluentes e está fortemente relacionado às áreas de florestas
alagáveis (Magnusson, 1985). A ocorrência em simpatria com a espécie irmã,
jacaré-coroa, e certa semelhança na ocupação de nicho gera uma segregação
espacial e seleção de diferentes micro-habitats. Isso é um forte indicativo de que há
competição entre elas, além do que em localidades onde foram observadas ambas
as espécies, uma delas foi encontrada em maior abundância (Ross e Magnusson,
1990).
No Pantanal, ocorre apenas a espécie jacaré-paguá. Em tese, isso permitiu a
ele ocupar todos os habitats disponíveis com condições compatíveis às exigências
da espécie. Entretanto, sua ocorrência na bacia do rio Paraguai é restrita à parte
periférica do Pantanal, em regiões de serra, causando uma separação espacial com
o jacaré-do-pantanal (Campos et al., 1995; Campos e Mourão, 2006). A bacia do rio
Paraguai que forma o Pantanal pode ser observado na figura 3.
6
Figura 3. Bacia do Alto Paraguai. A região clara do mapa representa a planície alagada, e a escura, o planalto no entorno do Pantanal. Fonte: Mourão et al. (2005) modificado de Souza (1998)
O jacaré-paguá já foi observado compartilhando hábitat com o jacaré-tinga,
jacaré-do-pantanal e jacaré-açú, mas com grandes diferenças na ocupação de nicho
(Medem, 1953; Magnusson et al., 1987; Ross e Magnusson, 1990; Campos et al.,
1995; Da Silveira et al., 1997) o que pode ter facilitado a simpatria com ocupação de
diferentes micro-habitats. Para P. palpebrosus, foi relatada uma densidade de 1,58
jacaré/km na paleovárzea do rio Solimões ao sul, na Amazônia (Botero-Arias, 2007)
e uma alta densidade dessa espécie em riachos de cabeceira na extremidade do
Pantanal brasileiro (até oito jacarés/km) (Campos et al., 1995), maior inclusive que a
encontrada por Magnusson e Lima (1991) para P. trigonatus.
Por ser ectotérmico, possuir alta biomassa em comparação a mamíferos de
mesmo porte e estar relacionado a ambientes de terra firme, o P. trigonatus foi
considerado um dos maiores predadores terrestres na Amazônia (Magnusson e
Lima, 1991).
7
A proximidade entre as duas espécies de Paleosuchus pode indicar
comportamentos semelhantes, mas nem tudo pode ser classificado como comum a
ambas. Não obstante haver mais conhecimentos sobre a ecologia e comportamento
referentes ao jacaré-coroa, muitos aspectos da biologia básica das duas espécies
ainda são desconhecidos (Magnusson e Campos, 2010b).
A ausência dessas informações básicas é um dos fatores que eventualmente
afeta a conservação do jacaré-paguá (Magnusson, 1985). Ela é consequência do
comportamento críptico da espécie e área de vida em regiões de difícil acesso, mas
principalmente em decorrência de seu baixo valor econômico, devido ao pequeno
porte e alta ossificação da pele (Rebêlo e Magnusson, 1983; Magnusson e Campos,
2010b). As características citadas tornaram suas populações menos exploradas e,
portanto, menos visadas pelos pesquisadores por não haver apelo conservacionista.
1.2.1 Ameaças ao Jacaré-paguá (P. palpebrosus)
O jacaré-paguá encontra-se listado no apêndice II da Convention on
International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES), que
inclui espécies não necessariamente ameaçadas de extinção, mas em que o
comércio deve ser controlado, a fim de evitar sobrexploração (Ross, 1998). Pela lista
vermelha da International Union for Conservation of Nature (IUCN), essa espécie é
considerada de baixo risco ou menos preocupante por ser localmente abundante,
embora a quantidade de dados disponíveis seja escassa. Seu status de
conservação e o pouco interesse pela comercialização de suas peles e carne,
devido às características anteriormente citadas, aliados à ausência de informações
pode levar a uma falsa impressão de que não existem pressões antrópicas atuando
sobre o jacaré-paguá.
Esse quadro é alterado se for levado em consideração que as principais
ameaças às populações de P. palpebrosus são a perda e a modificação de habitat
(Campos et al., 1995; Magnusson e Campos, 2010a), e que muitos desses danos
são, direta ou indiretamente, causados pela atividade humana. Alguns exemplos são
construção de barragens, caça de subsistência, urbanização e a poluição
(Magnusson e Campos, 2010a).
8
A construção de barragens é prática comum para a geração de energia
elétrica no Brasil. Esses grandes empreendimentos produzem benefícios para a
população humana, mas também ocasionam grandes impactos ambientais.
Transformam o ambiente de água corrente ou rio em água parada ou lago, ou seja,
geram diminuição da correnteza e alteração no fluxo de sedimentos de forma
drástica e efetiva, favorecendo a deposição desses materiais devido ao ambiente
lêntico (Souza, 2000). Além disso, essas intervenções no leito dos rios representam
novas barreiras à migração de várias espécies (Ruban, 1997) e consequentemente
alteram a dinâmica das populações naturais, fragmentando o que antes era
homogêneo e causando a diminuição da biodiversidade local.
A atividade de caça de subsistência diminui as densidades localmente, mas
parece não afetar de maneira drástica as populações como um todo (Magnusson e
Campos, 2010a). A urbanização e a consequente poluição dos rios têm gerado
grandes impactos ambientais, alterando a qualidade das águas (Porcella e
Sorenson, 1980; Morse et al., 2002) e, portanto, a disponibilidade de recursos para a
manutenção da biodiversidade aquática (Morse et al. 2002; Chadwick et al., 2006;
Voelz et al., 2005; Walsh, 2006). A urbanização e a poluição apresentam um
aspecto agravante em relação às barragens, pois, enquanto as barragens causam
efeitos em uma escala local, a urbanização e a poluição são praticadas em escala
mais ampla (Kearns et al., 2005), atuando simultaneamente em grande parte da
área de distribuição de Paleosuchus palpebrosus.
Todos os impactos citados podem ocasionar alterações na qualidade dos
habitats, o que resulta em forte efeito negativo para espécies que requerem
disponibilidade de recursos alimentares por serem animais predadores de topo de
cadeia, como é o caso dos crocodilianos. Além disso, a destruição de habitat e a
fragmentação de populações naturais podem acarretar uma limitação evolutiva para
toda uma espécie (Barret e Kohn, 1991), pois afetam diretamente sua variabilidade
genética.
Informações genéticas básicas de P. palpebrosus, como a filogeografia e a
genética de populações, ainda são muito escassas na literatura (Zucoloto et al.,
2006). Levantadas essas informações genéticas básicas, aliadas a dados
ecológicos, será possível visualizar seu status de conservação. Após conhecer a
condição natural da espécie, em termos genéticos, é possível mensurar a magnitude
dos impactos antrópicos causados ao longo de várias gerações. Para isso, pode-se
9
realizar pesquisas genéticas que forneçam parâmetros evolutivos representativos
dessa condição natural da espécie. Duas abordagens genéticas importantes são a
filogeografia e a genética de populações.
1.3 Filogeografia
A filogeografia é uma subdisciplina da biogeografia que pode ser definida
como o estudo dos princípios e processos que governam a distribuição geográfica
de linhagens genealógicas (Avise, 2000). As bases históricas dessa ciência estão
intimamente ligadas a estudos com o DNA mitocondrial de animais,
aproximadamente 70% dos estudos (Avise, 2000), suprindo uma ponte empírica e
conceitual entre a genética de populações e a biologia filogenética.
Os dois principais aspectos enfatizados em estudos de filogeografia são a
descrição da variação molecular dentro e entre populações e a evolução dos
sistemas gênicos dos organismos (Avise et al., 1986).
Por meio de uma interpretação filogeográfica, é possível obter explicações
para características da história natural de populações (ver Martins et al., 2001). Isso
é feito mediante uma associação entre a distribuição dos haplótipos do DNA
mitocondrial e a área de ocupação dessas populações (Puorto et al., 2001).
Geralmente análises filogeográficas intraespecíficas permitem supor a existência de
barreiras e estruturas geográficas (Eizirik, 2001) que contribuíram para produzir a
distribuição atual da variabilidade genética de uma espécie, levando a um avanço
em nosso conhecimento dos processos biogeográficos históricos.
Para a confirmação de padrões biogeográficos, é importante o estudo em
diversos grupos taxonômicos, uma vez que a barreira afeta várias espécies
independentemente, criando padrões semelhantes na distribuição da variabilidade
genética. Dados relativamente atuais permitem supor que os padrões biogeográficos
na bacia amazônica foram determinados por diferentes eventos de vicariância e
especiação (Haffer, 1969; Cracraft, 1988; Cracraft e Prum, 1988; Bates et al., 1998)
e vêm sendo confirmados em diversos grupos taxonômicos (Cohn-Haft, 2000; Marks
et al., 2002; Aleixo, 2004; Ribas et al., 2005).
Estudos envolvendo diferentes animais amazônicos, como peixes (Lovejoy e
Collette, 2001; Torrente-Vilara, 2009; Farias et al., 2010), botos (Banguera-
10
Hinestroza et al., 2002) e quelônios (Pearse et al., 2006) têm sugerido que as
cachoeiras do alto rio Madeira atuam como barreira ao fluxo gênico entre
populações. Para jacarés, talvez as corredeiras não funcionem como uma barreira
direta à migração de indivíduos entre localidades, no entanto essa região tem sido
relatada como uma zona de hibridização entre C. crocodilus e C. yacare (Hrbek et
al., 2008), podendo existir ou ter existido uma barreira histórica e/ou ecológica nesta
região. Neste estudo, a hipótese de barreira histórica no alto rio Madeira poderá ser
testada também para P. palpebrosus, uma vez que os eventos históricos devem
afetar não somente uma, mas diversas espécies de determinada área geográfica.
Outra abordagem genética importante, que permite entender melhor alguns
processos naturais que ocorrem na espécie, a fim de avaliar seu status de
conservação, é a genética de populações.
1.4 Genética de populações e conservação
Ações para conservação, como planos de translocação e reintrodução de
indivíduos a fim de evitar a depressão por endocruzamento, são mais efetivas
quando consideram o grau de fragmentação e as taxas de fluxo gênico dentro das
populações e entre elas (Frankham et al., 2002). Isso ocorre porque, antes de
manejar, deve-se definir primeiro a unidade de manejo. Caso essa unidade de
manejo seja uma unidade evolutiva significante (UES), que está evoluindo de forma
independente, pode ser considerada uma prioridade para a conservação genética
dentre as populações naturais (Crandall et al., 2000).
Para conservar a diversidade genética de uma espécie, é importante também
conhecer sua história evolutiva recente, com todas as mudanças que atuam sobre a
diversidade genética de maneira integrada, e características demográficas básicas
das populações. Os efeitos das forças evolutivas (mutação, migração, deriva
genética e seleção) dependem dessas características para serem mais ou menos
rápidos e efetivos. Por exemplo, o balanço das forças que mantêm a diversidade
genética difere entre populações grandes e pequenas, as primeiras sofrem mais o
efeito da seleção natural e as segundas mais a deriva genética (Frankham et al.,
2002).
11
Para populações geneticamente estruturadas, espera-se um maior nível de
adaptações locais. Assim, a diversidade genética nessa área precisa ser
preservada, pois as adaptações acumuladas nesses indivíduos são únicas e se
perderiam se tal população viesse a ser extinta (Haig, 1998). Caso a população seja
panmítica e com vasta distribuição, é mais viável concentrar esforços na
conservação de apenas uma área, usando indivíduos para recolonizar outras
quando necessário (Haig, 1998).
Desse modo, o estudo de parâmetros genéticos populacionais e dos
processos que podem estar ocorrendo em populações naturais é importante para
conhecer melhor o status de conservação da espécie e traçar, se necessário, planos
de conservação mais eficientes. Tais estudos são realizados por meio da utilização
de marcadores moleculares neutros, na ausência de seleção natural, de modo que o
conjunto de mutações do gene (marcador molecular) seja um reflexo da história
evolutiva da espécie.
1.5 Marcadores moleculares
Para que sejam acessados os parâmetros genéticos populacionais corretos e
efetivamente úteis à conservação de uma espécie, é necessário que o marcador
molecular escolhido tenha taxa evolutiva adequada (Avise, 2000; Sole-Cava, 2001),
ou seja, no caso de estudos populacionais, a taxa evolutiva do marcador molecular
utilizado deve ser alta para detectar variação em níveis individuais.
Os genes do DNA mitocondrial (DNAmt) são amplamente utilizados como
ferramentas em estudos populacionais, pois possuem características como a
herança uniparental (geralmente materna), ausência de recombinação e altas taxas
evolutivas, quando comparadas às do genoma nuclear (Brown et al., 1982; Meyer,
1993; Li, 1997). Essas taxas de evolução são altas devido à ineficiência de
mecanismos de reparo, à alta exposição a radicais livres no ambiente oxidante da
mitocôndria e à ausência de associação com proteínas histonas, que conferem
compactação e proteção ao DNA (Wilson et al., 1985; Li, 1997; Nedbal e Flynn,
1998).
O DNAmt é uma molécula de DNA circular, disposta em fita dupla, pequena e
presente em múltiplas cópias nas células. Sua organização inclui 13 genes
12
codificadores de proteína, dentre eles o Citocromo b (Cytb), que está presente na
cadeia transportadora de elétrons (Avise, 2004). Ver figura 4.
Devido à ausência de informação de parâmetros genéticos para P.
palpebrosus, neste estudo foi sequenciado o gene Cyt b, do genoma mitocondrial.
Esse gene foi escolhido por possibilitar a realização de estudos de relações
evolutivas entre indivíduos, populações e espécies (Meyer, 1993) e por ter sido
amplamente utilizado em estudos populacionais e filogenéticos (Johns e Avise,
1998), inclusive em crocodilianos (Glenn et al., 2002; Farias et al., 2004;
Vasconcelos et al., 2006; Vasconcelos et al., 2008; Hrbek et al., 2008).
Figura 4. Fita dupla do DNA mitocondrial (DNAmt), com destaque para o gene Citocromo b (Cytb). Fonte: Taylor e Turnbull (2005)
13
1.6 Estudos filogeográficos e populacionais em jacarés
Marcadores moleculares têm sido amplamente empregados para estimar
parâmetros filogeográficos e de genética de populações relevantes para a
conservação de espécies, inclusive em membros da família Aligatoridae, a saber:
Glenn et al. (2002) verificaram baixo polimorfismo do DNAmt em 25 indivíduos
de Alligator mississippiensis, a partir do sequenciamento do Cyt b e da região
controle do DNAmt. Segundo os autores, esse baixo polimorfismo seria resultado de
um gargalo populacional recente que a espécie teria sofrido.
A estrutura genética de populações de M. niger e C. crocodilus foi investigada
por Farias et al. (2004) em quatro localidades da Amazônia brasileira. Para isso, os
autores utilizaram sequências do gene mitocondrial Cytb. Os resultados indicaram a
ocorrência de isolamento por distância em M. niger no bioma Amazônia e sugeriram
que diferentes propriedades físico-químicas das águas (água branca e água preta)
podem contribuir com certa estruturação genética. Neste mesmo trabalho, os
autores encontraram altos níveis de polimorfismo genético em C. crocodilus, com
uma diferenciação significativa entre as populações geograficamente distantes. Além
disso, verificou-se que as três populações estudadas estavam em expansão
populacional. Esse foi o primeiro trabalho a investigar a diversidade genética,
estrutura populacional e outros indicadores genéticos nessas duas espécies. A
amostragem não foi suficiente para explicar com precisão a causa da diferenciação
encontrada.
Vasconcelos et al. (2006) utilizaram um fragmento de 1085 pares de base
(pb) do Cytb para obter dados mais precisos sobre a distribuição espacial da
diversidade genética em C. crocodilus. Eles analisaram 125 indivíduos provenientes
de nove localidades na bacia amazônica. Os autores suportaram com seus
resultados as propostas de Rebêlo e Lugli (2001) e Farias et al. (2004) de panmixia
na bacia amazônica para a espécie e confirmaram altos níveis de diversidade
genética apesar da forte pressão de caça sofrida em um período recente, a partir de
1930. Dessa panmixia, pode-se deduzir ausência de barreira biogegráfica atual para
a espécie na bacia amazônica.
De Thoisy et al. (2006) avaliaram o polimorfismo de microssatélites em sete
populações de M. niger, provenientes da Guiana Francesa, Equador e Brasil, e
obtiveram parâmetros genéticos como diversidade alélica, heterozigosidade e fluxo
14
gênico a fim de contribuir para o melhor conhecimento da dinâmica populacional de
M. niger para fim de conservação. Eles testaram o funcionamento de sete pares de
locos microssatélites originalmente desenvolvidos para C. latirostris (Zucoloto et al.,
2002) e 28 pares de primers desenvolvidos para A. mississipiensis (Glenn et al.,
1998; Davis et al., 2002). Oito locos amplificaram com sucesso e foram polimórficos,
podendo ser utilizados em estudos populacionais.
Em C. latirostris, a estrutura populacional foi estuda por Amavet et al. (2007).
Os autores utilizaram 233 marcadores RAPDs para obter dados preliminares e
avaliar unidades de conservação com vistas a modificar os atuais planos para a
gestão sustentável dessa espécie em Santa-Fé, na Argentina. Eles observaram que
havia um baixo fluxo gênico e que algumas populações encontravam-se
subdivididas.
Vasconcelos et al. (2008) utilizaram 1027 pb do gene Cytb com a finalidade
de avaliar a distribuição da variabilidade genética em M. niger, visando a fornecer
informações para uma melhor formulação de planos de manejo e conservação da
espécie na Amazônia brasileira. Os resultados desse trabalho sugerem que a
espécie ocorre em panmixia na bacia amazônica e que as populações localizadas
fora desse âmbito, na Guiana Francesa (bacia do Orinoco) e Amapá (em rios que
deságuam diretamente no oceano Atlântico), foram geneticamente estruturadas.
Também foram encontrados altos valores de diversidade genética, indicando que M.
niger, a exemplo de C. crocodilus, suportou a forte pressão de caça sofrida a partir
da década de 1930 (Smith, 1980; Medem, 1983).
Hrbek et al. (2008) utilizaram sequências do gene mitocondrial Cytb e dos
genes nucleares RAG 1 e MYC para inferir relações filogenéticas entre C. yacare e
C. crocodilus e outras espécies de jacarés sul americanos. O trabalho incluiu
indivíduos provenientes do alto rio Madeira, em área considerada como zona de
hibridização entre essas duas espécies. Os autores levantaram duas possíveis
hipóteses: houve contato secundário seguido de hibridização ou diferenciação ao
longo de um cline. Além disso, os autores detectaram considerável polimorfismo dos
genes RAG 1e MYC para P. palpebrosus em nível individual, e sugeriram a
possibilidade de utilização desses genes em estudos de genética de populações.
Essa abordagem, utilizando genes nucleares em estudos populacionais, não
foi possível no presente trabalho, uma vez que nenhum dos três genes nucleares
(MYC- myelocitomatosis, DEN- dentina e MOS- c-mos) testados foi suficientemente
15
polimórfico. Para esse teste foram sequenciados cinco indivíduos de cada população
encontrada por meio de análise com o DNAmt, totalizando 20 indivíduos.
Existem poucas informações sobre comportamento, ecologia e genética do
jacaré-paguá, disponíveis na literatura. Sabendo disso, este estudo traz
contribuições no campo da genética e fornece informações importantes para avaliar
o status genético da espécie, a fim de que medidas de conservação sejam eficazes
em prevenir possíveis eventos de erosão genética nas populações naturais. Além
disso, poderemos conhecer os níveis de diversidade e estruturação genéticas,
diagnosticar possíveis populações fragmentadas e a ocorrência de depressão por
endocruzamento nessas populações (Frankham et al., 2002).
No presente trabalho foram testadas as seguintes hipóteses: (1) as
cachoeiras do rio Madeira não representam uma barreira natural para P.
palpebrosus; (2) a distribuição da variabilidade genética nas populações estudadas
não tem sofrido influência de algum evento demográfico histórico; (3) populações de
P. palpebrosus localizadas em diferentes bacias hidrográficas sofrem restrição no
fluxo gênico entre si; (4) existe estruturação genética entre localidades da mesma
bacia hidrográfica, como resultado de isolamento por distância.
Para responder tais hipóteses os objetivos foram traçados como segue.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Determinar padrões de distribuição da variabilidade genética no jacaré-paguá
(P. palpebrosus), utilizando sequências do gene mitocondrial Cytb.
2.2 Objetivos específicos
Testar possíveis barreiras ao fluxo gênico de P. palpebrosus.
Investigar a ocorrência de eventos históricos que contribuíram para formar a
distribuição atual da diversidade genética dentro e entre as bacias do rio Madeira e
do rio Paraguai (Pantanal).
16
Quantificar, por meio de estimadores genéticos, o grau de estruturação genética
de P. palpebrosus do rio Madeira ao Pantanal.
Avaliar a diversidade genética encontrada em P. palpebrosus comparativamente
a outras espécies de crocodilianos.
17
Capítulo 1 _____________________________________________
Muniz, F. L.; Campos, Z.; Hrbek, T.; Farias, I.P.
2012. Desvendando a história evolutiva do críptico
Paleosuchus palpebrosus: da Amazônia ao
Pantanal. A ser submetido para o Journal of
Biogeography.
18
Desvendando a história evolutiva do críptico Paleosuchus palpebrosus: da Amazônia ao Pantanal
Muniz, Fábio1; Campos, Zilca2; Hrbek, Tomas1; Farias, Izeni Pires1
1Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, Brazil
2Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Pantanal, Corumbá, Ms, Brazil
* Correspondence: Izeni Pires Farias
Keywords: Phylogeography, jacaré-paguá, dams, waterfalls, Madeira river, Amazon basin,
ESU, genetic of population; genetic structure, gene flow, gene diversity
Abstract
Aim Paleosuchus palpebrosus é um crocodiliano pequeno que ocorre em rios de
cabeceira e florestas alagáveis. Os conhecimentos sobre a espécie são muito
escassos e isso pode afetar sua conservação. Assim, foram utilizadas sequencias
do gene mitocondrial Citocromo b para determinar padrões de distribuição da
variabilidade genética da espécie e testar se possíveis eventos demográficos
históricos e barreiras físicas ou históricas poderiam ter um papel significante para
restringir o fluxo gênico entre populações.
Location Região Neotropical, incluindo parte da bacia Amazônica e bacia do
Paraguai.
Methods Foi sequenciado o Citocromo b de 172 indivíduos de Paleosuchus
palpebrosus em localidades ao longo dos rios Madeira, Mamoré e Guaporé e no
Pantanal. Utilizou-se diferentes tipos de inferências Bayesianas para investigar o
número de populações reais, o tempo de divergência entre as populações, taxas de
19
fluxo gênico e mudanças históricas no tamanho efetivo de cada uma das
populações. A estrutura de populações foi investigada pela AMOVA e eventos
demográficos foram investigados via testes D de Tajima e Fs de Fu. Também foram
calculados os índices de diversidade genética da espécie.
Results Paleosuchus palpebrosus é composto por populações fortemente
estruturadas geneticamente como resultado da baixa ou inexistente taxa de fluxo
gênico entre elas. A população do lago Cururu está geneticamente isolada do
Madeira e restrita à região de paleovárzea do rio Solimões, enquanto Madeira e
Bolívia apresentaram fluxo gênico bidirecional. As serras que dividem as sub-bacias
do Madeira e da Bolívia e as cachoeiras do alto rio Madeira são barreiras que
provavelmente limitam o fluxo gênico entre essas populações. O complexo de serras
dos Parecis divide as bacias do rio Amazonas e Paraguai e provavelmente
representa uma barreira vicariante que isolou as populações do Pantanal e da
Bolívia. Somente a população do Madeira sofreu expansão populacional,
provavelmente após a última era glacial, e a diversidade genética em P. palpebrosus
foi alta e comparável com a de outros Caimaninae.
Main conclusions As populações do lago Cururu, Madeira/Bolívia e Pantanal
devem ser tratadas como Unidades Evolutivas Significantes. P. palpebrosus também
pode dispersar entre corpos d’água utilizando a via terrestre, trocando fluxo gênico
sem precisar dispersar pela calha do rio principal. Nossa caracterização prévia
fornece o padrão de fragmentação genética natural, importante para futuros estudos
sobre a biologia da espécie e, no caso das populações do rio Madeira, para que seja
possível avaliar os impactos das hidrelétricas sobre essa espécie.
20
INTRODUÇÃO
O Brasil conta com seis espécies e é o país com a maior diversidade de
crocodilianos do mundo. Dessas seis espécies, somente duas podem ser
encontradas na bacia do rio Paraguai, no Pantanal (Caiman yacare e Paleosuchus
palpebrosus). A bacia amazônica, porém, é mais diversa. Possui cinco espécies
simpátricas (Caiman crocodilus, Caiman yacare, Melanosuchus niger, Paleosuchus
trigonatus e Paleosuchus palpebrosus) (King & Burke, 1989).
Paleosuchus palpebrosus é uma espécie Neotropical pertencente à família
Alligatoridae. A espécie possui ampla distribuição na América do Sul,
compreendendo boa parte do Brasil e parte de outros nove países. Em território
brasileiro ocorre em quase todas as bacias hidrográficas, inclusive na bacia do rio
Paraguai e bacia amazônica, além das bacias do Paraná, Tocantins, São Francisco
e Paraíba (Medem, 1983; Thorbjarnasson, 1992; Ross, 1998).
Todas as espécies de crocodilianos que ocorrem em território brasileiro
pertencem à subfamília dos Caimaninae, e são conhecidos popularmente como
jacarés (Carvalho, 1951). Estima-se que o tempo de divergência dos Caimaninae
gire em torno de 58 Ma (milhões de anos), o que representa também o período do
surgimento do gênero Paleosuchus devido à sua posição filogenética basal (Brochu,
2003). Análises moleculares, porém, indicam um tempo de divergência mais recente,
entre 37-41 Ma, o que corresponde ao final do Eoceno (Roos et al., 2007).
Em algum momento do processo evolutivo do gênero, ocorreu um evento de
especiação que deu origem às duas espécies viventes, P. palpebrosus e P.
trigonatus. Esse momento é estimado por dados moleculares entre 17 e 19 Ma,
muito embora a precisão dessa estimativa não possa ser confrontada com registros
fósseis pela ausência deles (Roos et al., 2007). Apesar do considerável tempo de
21
divergência, atualmente as espécies são morfologicamente similares e
frequentemente confundidas (Magnusson & Campos, 2010a).
Ambas as espécies de Paleosuchus são pequenas em relação à maioria dos
outros crocodilianos, P. trigonatus atinge um máximo de 2,3 metros (Medem, 1981)
e P. palpebrosus atinge no máximo 2,1 metros (Campos et al., 2010) de
comprimento total. Ambos ocorrem em riachos ou igarapés de terra firme,
principalmente P. trigonatus (Magnusson & Lima, 1991), e de um modo geral, estão
associados à água corrente, fria e limpa (Medem, 1981; Campos et al., 1995).
Paleosuchus palpebrosus, além disso, pode ser encontrado em ambientes de
florestas alagadas nas margens de rios e lagos (Magnusson, 1985; Da Silveira et al.,
1997; Campos & Sanaiotti, 2006), rios de cabeceira, tributários dos rios principais e
próximo a quedas d’água (Magnusson et al., 1987; Magnusson, 1992; Campos et al.,
1995; Campos & Mourão, 2006; Vasconcelos & Campos, 2007).
Na Amazônia, onde as espécies ocorrem em simpatria, há indícios de
competição com segregação espacial e seleção de diferentes micro-habitats,
principalmente porque em localidades em que foram observadas ambas as espécies
uma das duas sempre foi muito mais abundante (Ross & Magnusson, 1990). No
Pantanal, ocorre apenas P. palpebrosus. Em tese, isso permitiu a ocupação de
todos os habitats disponíveis com condições compatíveis com as exigências da
espécie. Entretanto, sua ocorrência na Bacia do rio Paraguai é restrita à parte
periférica em regiões próximas a serras, causando uma separação espacial com o
Caiman crocodilus que domina amplamente a planície alagada do Pantanal
(Campos et al., 1995; Campos & Mourão, 2006).
O Pantanal está situado na borda inferior do escudo brasileiro e é formado
pelo transbordamento do rio Paraguai, que compõe a bacia do Paraná-Paraguai,
22
formando uma das maiores planícies alagáveis do mundo (Ministério do Meio
Ambiente, 1997). O padrão de drenagem do rio Paraguai representa uma forma
clássica da maioria das bacias alagáveis, onde os tributários se dispõem em forma
de megafan (em forma de leque). A disposição deste megafan é transversal ao rio
principal que corre longitudinalmente, ou seja, paralelo à elevação de terra onde
nascem os tributários (Wilkinson et al., 2010).
É possível que megafans adjacentes, que hoje são separados por elevações
de terra, como é o caso de megafans nos sistemas Amazonas-Orinoco e Amazonas-
Paraguai-Paraná, poderiam ter se conectado no passado. A ocorrência de
populações de uma espécie, ou de espécies irmãs em ambas as bacias
hidrográficas, sugere que o surgimento de barreiras que dividiram as bacias de
drenagem pode ter funcionado como barreira alopátrica para muitos eventos de
especiação (Wilkinson et al., 2010). Em termos genéticos, dá-se que, com o
isolamento das populações por alopatria, a distância genética entre elas foi
aumentando gradativamente com o tempo até que se tornassem espécies
diferentes.
Na bacia amazônica, um dos principais afluentes do rio Amazonas é o
Madeira, que contribui com 16% de toda a descarga anual de água da bacia no
Atlântico. O rio Madeira é formado pela confluência entre os rios Mamoré e Beni.
Atualmente, ambos são provenientes da Bolívia e compõem a sub-bacia chamada
boliviana, que possui origem nos Andes. A sub-bacia boliviana compreende além
dos rios Beni e Mamoré, a porção da drenagem do alto rio Madeira, sendo separada
da bacia amazônica principal por uma série de 16 cachoeiras localizadas entre
Guajará-Mirim e Porto Velho (Goulding et al., 2003). Essas cachoeiras
23
correspondem a regiões onde o Madeira rompe e ultrapassa o escudo brasileiro pré-
cambriano.
Estudos envolvendo diferentes animais amazônicos, como peixes (Lovejoy &
Collette, 2001; Torrente-Vilara, 2009; Farias et al., 2010), botos (Banguera-
Hinestroza et al., 2002) e quelônios (Pearse et al., 2006) têm sugerido que as
cachoeiras do alto rio Madeira atuam como barreira ao fluxo gênico entre
populações. Para jacarés, talvez as corredeiras não funcionem como uma barreira
direta à migração de indivíduos entre localidades, no entanto essa região tem sido
relatada como uma zona de hibridização entre C. crocodilus e C. yacare (Hrbek et
al., 2008), podendo existir ou ter existido uma barreira histórica e/ou ecológica nesta
região.
Paleosuchus palpebrosus é uma espécie muito pouco estudada, como
consequência do seu comportamento críptico, mas principalmente em decorrência
de seu baixo valor econômico, devido ao pequeno porte e alta ossificação da pele
(Rebêlo & Magnusson, 1983; Magnusson & Campos, 2010b). As características
citadas tornaram suas populações menos exploradas pelo comércio de peles e
carnes, e assim, pouco estudadas.
Medidas para a conservação de espécies precisam estar fundamentadas em
conhecimentos sobre ecologia, comportamento e genética, para que sejam mais
eficazes. Desse modo, a ausência de informações básicas é um dos fatores que
eventualmente afetam a conservação de Paleosuchus palpebrosus (Magnusson,
1985).
O objetivo deste trabalho foi determinar padrões de distribuição da
variabilidade genética em P. palpebrosus, utilizando sequências do gene
mitocondrial Citocromo b a fim de testar as seguintes hipóteses: (1) as cachoeiras do
24
rio Madeira não representam uma barreira natural para P. palpebrosus; (2) a
distribuição da variabilidade genética nas populações de P. palpebrosus estudadas
não tem sofrido influência de nenhum evento demográfico histórico; (3) populações
de P. palpebrosus localizadas em diferentes bacias hidrográficas sofrem restrição no
fluxo gênico entre si; (4) existe estruturação genética entre localidades da mesma
bacia hidrográfica, como resultado de isolamento por distância.
MATERIAL E MÉTODOS
Área de estudo e coleta das amostras
As amostras foram coletadas retirando-se uma ou mais escamas caudais de
indivíduos adultos, subadultos ou filhotes não aparentados de Paleosuchus
palpebrosus. Os indivíduos foram coletados à noite, as escamas coletadas foram
conservadas em tubos contendo álcool 70% e depositadas na Coleção de Tecidos
de Genética Animal (CTGA), localizada na Universidade Federal do Amazonas
(UFAM), Brasil.
Ao todo foram utilizados 172 indivíduos de P. palpebrosus, provenientes de
19 localidades distribuídas nas bacias dos rios Madeira, Mamoré, Guaporé (Além de
uma localidade, lago Cururu, fora desse eixo, no rio Solimões), todos pertencentes à
Amazônia Brasileira, e bacia do rio Paraguai, no bioma Pantanal.
Na Amazônia foram coletadas amostras de 12 localidades: lago Cururu (N=
13), no rio Solimões; Nova Olinda do Norte (N= 12), Novo Aripuanã (N= 10),
Manicoré (N=12), Humaitá A e B (NA= 08; e NB= 12, respectivamente) em pontos
distanciados 80Km na BR319, que liga os municípios de Humaitá e Manaus, Porto
Velho (N=11), em igapó em frente à cidade no local onde está sendo construída a
Hidrelétrica de Santo Antônio, em afluentes no alto rio Madeira, classificados como
25
um grupo chamado “Entre Cachoeiras” (N= 12), todos ao longo do rio Madeira; e
Guajará-Mirim (N= 07), Guaporé-Mamoré (N= 07), compreendendo indivíduos
coletados entre Costa Marques e a comunidade Surpresa, Pimenteiras do Oeste (N=
09) e Vila Bela da Santíssima Trindade (N= 09), localizados nos rios Guaporé e
Mamoré (Fig. 1).
No Pantanal foram sete localidades: Barra dos Bugres (N= 06), Tangará da
Serra (N= 02), que são geograficamente próximas, Rondonópolis (N= 09), Coxim
(N= 11), Serra das Araras (N= 11), Serra do Urucum (N= 06) e Serra do Amolar (N=
05) (Fig. 1).
Processamento em laboratório As amostras de tecido foram conservadas em tubos contendo álcool 95% e
armazenadas no banco de tecidos do Laboratório de Evolução e Genética Animal
(LEGAL), localizado na Universidade Federal do Amazonas (UFAM).
O material genético (DNA) foi isolado através do protocolo de extração com
proteinase K/fenol-clorofórmio (Sambrook et al., 1989) e amplificado por meio da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando um par de primer (especificados
na Tab. 1). A amplificação do Citocromo b foi feita para um volume total de 15 µL,
contendo 7,75 µL de ddH2O; 1,25 µL de MgCl2 (25mM); 1,25 µL de dNTP (2,5 mM);
1,25 µL de tampão 10X (100mM Tris-HCl, 500mM KCl), 1,25 µL de cada um dos
pares de primer do Cytb (0,2 µM) e 1,0 µL de DNA (cerca de 20 ng).
As reações de sequenciamento foram realizadas com cada um dos dois
primers específicos para sequenciamento, um inicial e outro interno, ambos no
sentido forward (5’ para 3’). Para tais reações, utilizamos o kit da Life Technology
BigDye terminator seguindo o protocolo do fabricante. O produto da reação de
26
sequenciamento foi precipitado com etanol de acordo com recomendações do
fabricante (Applied Biosystems), ressuspendido em 10 µL de formamida deionizada
(ABI) e posteriormente injetado e resolvido no sequenciador automático ABI 3130xl
(Applied Biosystems).
As sequências produzidas foram submetidas ao alinhamento múltiplo
automático através do programa BioEdit (Hall, 1999) com a aplicação da ferramenta
Clustal W (Thompson et al., 1996), além de conferidas e corrigidas manualmente no
próprio BioEdit, a fim de determinar a ordem exata dos nucleotídeos de cada
indivíduo. O alinhamento foi analisado em programas de bioinformática para a
obtenção de índices estatísticos relevantes para os estudos genéticos
filogeográficos e populacionais propostos.
Estimativa do número de grupos biológicos
O número real de grupos biológicos foi definido estatisticamente, a posteriori,
por meio do método bayesiano desenvolvido por Corander et al. (2007), através do
programa BAPS 4.14 (Bayesian Analysis of Genetic Population Structure). Nesta
análise, o número de grupos foi definido usando um algorítimo que estima a
distribuição das frequências alélicas de todas as populações. As populações cujas
sequências tiveram diferenças não significativas foram recalculadas e foram feitas
novas distribuições usando populações combinadas até encontrar a partição ideal
(Corander et al., 2007). Cada combinação recebeu valores de probabilidade
posterior associado que foi usado para escolher o melhor valor do número de grupos
na partição ideal (números de clusters). O número de grupos indicados por esta
análise foi utilizado em todas as outras como o número real de grupos de biológicos.
27
Para estimar relações genealógicas entre os indivíduos, foi produzida uma
rede de haplótipos, com base na topologia de uma árvore filogenética, no programa
HAPLOVIEWER (Salzburger et al., 2011). Essa árvore de máxima verossimilhança
foi gerada no programa TREEFINDER (Jobb et al., 2004) e posteriormente importada
para o HAPLOVIEWER. Para o enraizamento da árvore de máxima verossimilhança,
foi utilizado um grupo externo, ou seja, uma sequência da espécie irmã (P.
trigonatus) obtida do Genbank (Tab. 2).
Além do BAPS, a árvore de haplótipos também permitiu discriminar as
populações reais, por agrupar localidades com indivíduos genealogicamente
relacionados, além de estabelecer relações genealógicas entre elas.
Análises Filogeográficas e Populacionais
As amostras foram agrupadas em macrorregiões e a história coalescente de
cada uma delas foi investigada por meio da Markov Chain Monte Carlo (MCMC).
Nós usamos o programa BEAST (Drummond & Rambaut, 2007) para estimar o
tempo do ancestral mais recente e investigar mudanças no tamanho efetivo
populacional através de uma história coalescente de cada grupo. Para ambas as
análises citadas, o modelo evolutivo GTR+G foi o modelo selecionado pelo
programa jMODELTEST (Posada, 2008).
Para estimar o tempo do ancestral comum a todas as populações de P.
palpebosus analisadas e o tempo de diversificação de cada grupo, utilizou-se o
ponto de calibração sugerido por Muler & Reisz (2005), que é a divergência mais
conservadora entre Caiman e Alligator (66–75 Ma). Nesta análise, foram utilizadas
sequências de um indivíduo representante de cada população de P. palpebrosus do
presente trabalho e sequência de cada uma das espécies da família Alligatoridae,
28
além de uma de Crocodilus porosus, usada como grupo externo (Tab. 2). Análises
de mutações (transições x transversões) plotadas com a distância genética não
indicaram saturação para as transversões e somente foi observada saturação entre
as comparações que envolveram o outgroup Crocodilus porosus. Essa análise foi
realizada para testar a congruência do sinal filogenético desse gene em relação aos
utilizados por Roos et al. (2007), que estimou em 17 milhões de anos o tempo de
divergência entre as espécies de Paleosuchus. Esta calibração foi usada para
calcular o período de diversificação das populações estudadas.
Tais análises, conduzidas no programa BEAST, foram realizadas assumindo
um relógio molecular relaxado do tipo lognormal, que assume taxas independentes
sobre diferentes ramos (Drummond et al., 2006). As árvores prévias foram
modeladas de acordo com o processo de especiação Yule considerando o modelo
de sítios heterogêneos gama com três partições, que assume evolução
independente para cada posição do códon. A cadeia (MCMC) utilizada na análise de
divergência do BEAST teve um tamanho de 10 milhões de passos, com uma árvore
consenso gravada a cada 10 mil passos. Desse modo, foram gravadas 1.000
árvores e descartadas as 50 primeiras, considerando um burn-in de 5%.
Utilizou-se também o TREEANNOTATOR, que faz parte do programa BEAST
para sumarizar as árvores amostradas, depois de descartar o burn-in inicial, e o
programa FIGTREE 1.3.1 (Rambaut 2009) para visualizar e editar a árvore contendo
os dados de divergência.
Com o intuito de estimar as taxas de migração (m) entre as populações ao
longo da história coalescente e o número de imigrantes e emigrantes de cada
população, foi adotado o programa IMa (Hey & Nielsen, 2007), que usa a
abordagem de MCMC. Para isso, cada par de populações foi analisado utilizando 15
29
cadeias independentes, com 10 mil passos cada e amostragem a cada 100
gerações. Foram armazenadas 100 árvores com descarte das 10 primeiras
(considerando burn-in= 10%) para cada uma das cadeias.
Para estimar mudanças históricas no tamanho efetivo populacional de cada
população de P. palpebrosus, foi utilizado o modelo de coalescência na análise
Bayesian skyline plots do pacote BEAST considerando, também, o relógio molecular
do tipo relaxado e lognormal. Nesse modelo coalescente, o tempo do ancestral
comum dos grupos analisados até a atualidade foi dividido em 15 partes, o tamanho
efetivo populacional para cada tempo foi calculado e as diferenças foram testadas
quanto a sua significância.
As corridas das Markov Chains Monte Carlo nesta análise foram realizadas
com 100 milhões de gerações para populações grandes e 10 milhões de gerações
para pequenas. Uma árvore consenso foi amostrada a cada 100 mil e a cada 10 mil
gerações, respectivamente. Para todas essas corridas, 1.000 árvores foram
armazenadas, de modo que os resultados foram obtidos após o descarte de 5% do
total delas (burn-in= 50 primeiras árvores).
Todos os arquivos de entrada para o programa BEAST foram criados usando
a aplicação BEAUTI (Drummond & Rambaut, 2007), e a convergência de todos os
parâmetros foi avaliada por inspeção dos parâmetros utilizando o programa TRACER
(Drummond & Rambaut, 2007). O número de corridas foi otimizado para obter o
mínimo de 200 árvores independentes expresso no effective sample sizes (ESS) do
programa TRACER.
A estruturação genética em P. palpebrosus foi investigada ao longo das áreas
coletadas por meio da Análise de Variância Molecular (AMOVA) (Excoffier et al.,
1992). Na AMOVA, a variação genética distribuída dentro e entre as populações
30
definidas a priori foi quantificada por meio do índice ФST, análogo ao FST (Weir &
Cockerham, 1984), analisado par a par entre localidades. Essas análises foram
feitas no programa Arlequim 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010).
Para testar a correlação entre as distâncias genéticas (ФST) e distâncias
geográficas, foi realizado o teste de Mantel (Mantel, 1967). Nesta análise, uma
matriz de distâncias geográficas foi comparada com uma matriz de distâncias
genéticas e, no programa Arlequim 3.5, foi calculado o índice de correlação. As
distâncias geográficas foram calculadas em linha reta e seguindo o curso do rio.
Considerando o comportamento da espécie, relacionado ao ambiente de terra firme,
essas duas possibilidades foram testadas e de maneira a não excluir a hipótese de
que podem transitar entre corpos d’água por terra, ou seja, independentemente do
curso do rio.
Nas análises intrapopulacionais, foram calculados índices de diversidade
genética que representam a probabilidade de que duas sequências escolhidas ao
acaso em uma população sejam diferentes entre si (Li, 1997). Os principais
estimadores calculados para o DNAmt de P. palpebrosus foram a diversidade
nucleotídica e a diversidade gênica de Nei (1987). Esses valores foram comparados
com os obtidos para espécies próximas, como M. niger e C. crocodilus, a fim de
verificar se a diversidade genética da espécie é semelhante à de outras simpátricas.
Para as análises de demografia histórica foram utilizados os Testes de D
(Tajima, 1989) e Fs (Fu, 1997), calculados por meio do programa Arlequin 3.5
(Excoffier & Lischer, 2010). Eles baseiam-se no modelo de sítios infinitos sem
recombinação (Kimura, 1969), que é apropriado para sequências curtas de DNA,
pois considera que as mutações nesse fragmento são independentes e irregulares e
31
que a probabilidade de um mesmo sítio sofrer mutações duas vezes é infinitamente
pequena.
Os valores de D e Fs significativamente diferentes de zero indicam desvios da
neutralidade e são interpretados como resultantes de algum evento demográfico.
Tendem a ser negativos quando há excesso de mutações recentes, o que indica
crescimento populacional, ou atuação de outras forças evolutivas como efeito carona
(hitchhiking), seleção de fundo (Background Selection) ou recombinação (Fu, 1997).
Valores positivos indicam possível seleção balanceadora, subdivisão populacional
ou gargalo de garrafa (bottleneck) (Tajima, 1989).
RESULTADOS
O gene mitocondrial Citocromo b foi polimórfico em nível intrapopulacional.
Apresentou 35 sítios informativos para parcimônia além de cinco singletons de um
total de 1,102 pb sequenciados.
O número real de grupos biológicos, estimado pelo método bayesiano do
programa BAPS foi quatro (Fig. 2). Associando esses grupos à distribuição espacial
de seus indivíduos, as populações foram classificadas como segue: lago Cururu,
Madeira, Bolívia e Pantanal.
A árvore de haplótipos, gerada no HAPLOVIEWER, permitiu observar que
três grupos (Lago Cururu, Bolívia e Pantanal) são separados por muitos passos
mutacionais (Fig. 3) e que as populações do Madeira e da sub-bacia boliviana ainda
compartilham haplótipos em localidades próximas: entre Cachoeiras-EC, Guajará-
Mirim-GM e Guaporé-Mamoré-GuMa (localidades 8, 9 e 10, respectivamente) (Fig.
3).
32
O tempo de separação entre Paleosuchus trigonatus e Paleosuchus
palpebrosus, calculado pela análise bayesiana no programa BEAST usando o
modelo de especiação Yule, foi de 18,7 Ma. Entretanto, o tempo de diversificação
das populações analisadas é bem mais recente, de 2,7 Ma. O tempo de divergência
entre Pantanal e Madeira/Bolívia foi há cerca de dois milhões de anos, enquanto a
divergência encontrada entre as populações do Madeira e Bolívia foi mais recente,
na ordem de 300 mil anos (Fig. 4).
As análises no programa IMa evidenciaram ausência de fluxo gênico entre os
pares de populações: lago Cururu/Madeira e Bolívia/Pantanal, porém taxa diferente
de zero entre as localidades do Madeira e Guaporé-Mamoré. A taxa de fluxo gênico
foi mais de duas vezes maior no sentido de Madeira para Bolívia (2Nm1= 1.655
indivíduos/geração) que no sentido contrário (2Nm2= 0.629 indivíduos/geração).
O tamanho efetivo populacional coalescente de cada uma das populações foi
estimado por meio da análise de coalescência utilizando o modelo Bayesiano de
skyline plot. Foi possível avaliar se houve mudanças significativas no tamanho
efetivo populacional ao longo da história coalescente de somente duas populações,
da bacia boliviana e do Pantanal, de um total de quatro analisadas. Não foi possível
investigar o tamanho efetivo populacional coalescente do lago Cururu, pois o
número amostral dessa população (13 indivíduos) foi muito pequeno, e do Madeira,
pois a quantidade de variação genética foi insuficiente para essa análise.
Encontrou-se tamanho coalescente constante para as populações da bacia
boliviana e do Pantanal, uma vez que não foram detectadas variações significativas
no tamanho efetivo ao longo dos 15 cenários de tempo da análise Baysian skyline
plot. O tamanho efetivo populacional encontrado para ambas as populações foram
semelhantes, na ordem 600 e mil indivíduos, respectivamente. Quando todas as
33
populações foram analisadas juntas, verificou-se uma expansão populacional
recente e tamanho populacional na ordem de quatro mil indivíduos.
Os testes D de Tajima e Fs de Fu indicaram expansão recente somente para
a população do Madeira. Essa expansão foi evidenciada por valores negativos e
significativos (D= -1.943/ p<0.001; Fs= -5.881/ p< 0.001, Tab. 3).
A análise de variância molecular (AMOVA) revelou forte nível de estruturação
genética na espécie, com 65.34% da variação existente distribuída entre as
populações reais. O índice ФST próximo de um e altamente significativo (ФST= 0,65;
p<0,001) indica que o fluxo gênico entre as populações é muito restrito.
A comparação par a par dos níveis de ФST entre as localidades amostradas,
sem definir os reais grupos biológicos, permitiu confirmar quatro grupos bem
distintos devido ao grande número de diferenças genéticas entre indivíduos de
populações diferentes e pouca entre os da mesma população (dados não
mostrados). É interessante observar a grande diferença genética entre lago Cururu e
todas as outras localidades analisadas, mesmo quando comparadas a localidades
muito próximas como as do baixo rio Madeira.
O teste de correlação entre distância genética e distância geográfica (teste de
Mantel) não foi significativo para nenhuma das populações analisadas, indicando
que não há isolamento por distância em P. palpebrosus das bacias do Madeira,
Bolívia e Pantanal.
Os índices de diversidade encontrados em P. palpebrosus foram
consideravelmente altos (Tab. 3), com níveis elevados de diversidade gênica (H=
0.749 ± 0.026) e haplotípica (0.0161 ± 0.0079).
34
DISCUSSÃO
Análises Bayesianas no programa BAPS sugerem que existem quatro
populações nas áreas analisadas. Esses grupos populacionais foram confirmados
na árvore de haplótipos, através da qual foi possível estabelecer as relações
genealógicas entre as localidades amostradas (Fig. 3). Além disso, os resultados de
ФST par a par (dados não mostrados) também permitiram confirmar a formação
desses quatro grupos devido ao grande número de diferenças genéticas entre
indivíduos de populações diferentes e pouca entre os da mesma população.
As populações reais de P. palpebrosus coincidem com bacias e sub-bacias
hidrográficas separadas por acidentes geológicos bem definidos e confirmam o
padrão de distribuição encontrado em outros jacarés amazônicos, a não ser pela
população do lago Cururu que indicou forte estruturação da espécie na bacia
amazônica.
Padrões filogeográficos em P. palpebrosus
O rio Amazonas é formado pela confluência dos rios Negro e Solimões e tem
como principal afluente, tanto em volume como em aporte de sedimentos, o rio
Madeira. Assim, a população do lago Cururu não está isolada da população do
Madeira por nenhuma barreira geográfica aparente.
As configurações atuais dos rios Solimões e Amazonas, correndo para o
Atlântico, e a formação da drenagem do rio Madeira ocorreram após a “quebra” do
arco do Purus. Alguns autores defendem que isso ocorreu no Mioceno superior há
~8 Ma (Lundberg et al., 1998; Figueiredo et al., 2009) e outros que ocorreu mais
recentemente, há cerca de ~2.5 Ma (Campbell et al., 2006).
35
A água branca desses rios indica um grande aporte de sedimentos
provenientes dos Andes e do desbarrancamento das margens, que é um indício de
que estes rios ainda não definiram completamente seu leito principal,
frequentemente transbordando e formando regiões de florestas sazonalmente
alagadas, denominadas várzea.
Historicamente, mudanças consecutivas no curso dos rios alteraram a
topografia de cumes e vales pelo processo deposicional rítmico de sedimentos finos
e grandes, criando numerosos lagos marginais férteis e de diversos tamanhos (Hess
et al., 2003) que hoje conectam-se sazonalmente com o rio durante o regime de
cheia. Tais regiões férteis marginais ao leito atual dos rios são denominadas
paleovárzeas. Atualmente, as paleovárzeas são facilmente identificáveis, pois
exibem a mesma estrutura de uma várzea recente, no entanto com características
enfraquecidas.
O corredor de várzea existente hoje provavelmente foi formado após o
período glacial do Pleistoceno, cerca de 700 mil anos atrás, no qual ocorreram
grandes e sucessivas mudanças no nível do mar e consequentemente variações no
nível dos rios (Irion, 1979; Berger & Wefer, 1992). Quando o vale atual foi formado,
todas as relíquias de um vale menor pré-existente podem ter sido destruídas (Irion &
Kalliola, 2010).
Considerando que o rio Madeira deságua no rio Amazonas (que é formado
pela confluência dos rios Negro e Solimões) e que os jacarés, de um modo geral,
são representados por espécies “anfíbias” que dependem da água para reproduzir e
dispersar (Lang, 1976) é possível afirmar que aparentemente não existem barreiras
ao fluxo gênico entre as populações do lago Cururu e Madeira. Entretanto, nossos
resultados evidenciam uma forte estruturação genética entre tais populações (ФST =
36
0.56 e p< 0.001), sendo separadas por muitos passos mutacionais de acordo com a
árvore de haplótipos (Fig. 3).
Análises Bayesianas no BEAST mostraram claramente uma diversificação
relativamente antiga dessas duas linhagens (Lago Cururu e Madeira), de
aproximadamente 2, 7 milhões de anos, maior que entre a Bolívia e o Madeira, por
exemplo (ver Fig. 4). A nossa estimativa de divergência dessas linhagens é
coincidente com a datação sugerida por Campbell et al. (2006), de 2.5 Ma, para o
evento de reorientação da drenagem da bacia amazônica em direção ao Atlântico.
Nossos resultados não fornecem uma explicação conclusiva para a
diversificação entre essas duas populações, mas a hipótese que nos parece mais
provável é que a espécie não utiliza a calha principal dos rios Solimões/Amazonas
para dispersão de indivíduos entre localidades. Nesta hipótese, a população estaria
restrita à paleovárzea desses rios desde a reorientação da bacia amazônica para o
Atlântico. Assim, rios de grande porte como o Solimões, o Negro e o Amazonas
poderiam representar uma barreira física para P. palpebrosus. No entanto, é
necessário realizar uma amostragem mais adequada para responder a essa
hipótese, uma vez que para as populações do rio Madeira esta hipótese não pode
ser confirmada.
Outras duas populações (Madeira e Bolívia), por sua vez, tiveram distribuição
geográfica coincidente com a sub-bacia do baixo rio Madeira e sub-bacia boliviana,
respectivamente. A sub-bacia boliviana corresponde a cerca de 60% da área total da
bacia de drenagem do Madeira. Sua origem está relacionada à elevação do arco de
Fitzcarrald, no início do Plioceno médio (4-3 Ma), que gradualmente isolou e elevou
a bacia boliviana (Campbell et al., 2001; Hoorn et al., 1995; Räsänen et al., 1987).
Isso resultou em grandes mudanças no padrão de drenagem, de modo que todos os
37
principais rios da bacia ao norte da Bolívia começaram a drenar para a bacia
amazônica através do rio Madeira (Campbell et al., 2001; Hoorn et al., 1995;
Räsänen et al., 1987).
Atualmente, a sub-bacia Boliviana compreende os rios Beni, Mamoré,
Guaporé e a porção da drenagem do alto rio Madeira, sendo separada da bacia
amazônica principal por uma série de 16 cachoeiras localizadas entre Guajará-Mirim
e Porto Velho (Goulding et al., 2003). Essas cachoeiras correspondem a regiões
onde o Madeira rompe e ultrapassa o escudo brasileiro pré-cambriano.
Reconhecidamente, estas cachoeiras representam uma barreira ao fluxo gênico
para várias espécies aquáticas como: peixes (Lovejoy & Collette, 2001; Torrente-
Vilara, 2009; Farias et al., 2010), botos (Banguera-Hinestroza et al., 2002) e
quelônios (Pearse et al., 2006).
Nossos resultados evidenciam que as populações de P. palpebrosus do
Madeira e da Bolívia compartilham haplótipos e, por isso, estão separadas por uma
barreira mais permeável, ou seja, que permite a existência de fluxo gênico restrito. O
compartilhamento de haplótipos e o tempo de divergência mais recente entre essas
linhagens indicam que o fluxo gênico limitado entre as duas bacias hidrográficas é
suficiente para não permitir que elas estejam separadas por completo.
Pode-se observar também que compartilhamento de haplótipos entre Madeira
e Bolívia ocorreu somente entre três localidades mais próximas ao conjunto de
cachoeiras do rio Madeira (entre Cachoeiras-EC, Guajará-Mirim-GM e Guaporé-
Mamoré-GuMa; localidades 8, 9 e 10, respectivamente - Fig. 2 e 3), sugerindo que a
região funciona como zona de contato ou transição entre essas duas populações de
P. palpebrosus, de maneira que a primeira cachoeira, próximo a Guajará-Mirim, deve
representar a principal barreira para essa espécie. Essa zona de contato é
38
coincidente com a zona de hibridização encontrada entre C. crocodilus e C. yacare
(Hrbek et al., 2008).
Esses resultados indicam que tais cachoeiras formam uma barreira que
apenas limita o fluxo gênico entre duas populações de P. palpebrosus, não as
isolando absolutamente. As taxas de migração entre as sub-bacias do Madeira e
Boliviana são bidirecionais, porém não simétricas. A taxa de migração no sentido
Madeira-Bolívia (2Nm1= 1.655 indivíduos/geração) é mais de duas vezes maior que
no sentido contrário (2Nm2= 0.629 indivíduos/geração).
Apesar de a formação das cachoeiras do rio Madeira serem muito mais
antigas que a diversificação dessas duas populações, assumiu-se que elas atuam
como uma barreira parcial, uma vez que o fluxo gênico entre as localidades, ao
longo das gerações, contribuiu para que o tempo estimado de coalescência entre as
populações (300 mil anos) seja mais recente que o possível tempo real de
divergência entre elas.
A sub-bacia boliviana, por sua vez, está separada da bacia do rio Paraguai,
no Pantanal, pelo complexo de serras dos Parecis. Essas elevações de terra
correspondem à borda do escudo brasileiro, que é uma região cratônica. Há sinais
de que essa borda foi escavada e erodida pelo mar antes do soerguimento dos
Andes (Heckman, 1998). Posteriormente aos Andes, houve uma elevação gradual
devido à deposição de grande quantidade de sedimentos finos transportados pelo ar
e ao escasso regime de chuvas na região, com valores próximos de zero (Heckman,
1998).
Essas rochas sedimentares da borda do escudo brasileiro possuem idade
entre um e 2.5 milhões de anos (Ma), com alguns sítios registrando uma idade de 3
39
Ma. O domínio do Craton em que está localizada a serra dos Parecis possui rochas
com idade de até 1.8 Ma (Hoorn et al., 2010).
O tempo que nós estimamos de divergência entre Pantanal e bacia boliviana
foi de 2 Ma. Essa idade estimada é próxima à datação de soerguimento das serras
que isolam a bacia amazônica da bacia do Paraguai-Paraná. O surgimento de
barreiras dividindo bacias hidrográficas explica a divergência vicariante entre
espécies irmãs, ou mesmo linhagens evolutivas, distribuídas em bacias diferentes
(Wilkinson et al., 2010). Esse processo vicariante provavelmente foi o que ocorreu
para isolar as duas populações de P. palpebrosus por um tempo suficiente para criar
consideráveis diferenças genéticas entre elas. Além disso, essas serras são
importantes para outro jacaré neotropical, M. niger, pois elas representam uma das
barreiras que limitam a sua distribuição.
Neste trabalho, nós também consideramos a possibilidade de P. palpebrosus
dispersar entre corpos d’água utilizando a via terrestre, principalmente quando as
cabeceiras de microbacias diferentes estão próximas em uma planície. Essa
possível explicação é sustentada pela relativa homogeneidade genética populacional
ao longo do rio Madeira, pelo isolamento do lago Cururu na paleovárzea do
Solimões, uma vez que não há conexão desta com microbacias de terra firme, e
principalmente, no Pantanal.
No Pantanal, P. palpebrosus é restrito às partes altas e periféricas da bacia
do rio Paraguai e não há registros da espécie na planície alagada do Pantanal
(Campos et al., 1995; Campos & Mourão, 2006). Desse modo, a forma mais
provável de os indivíduos de microbacias diferentes trocarem fluxo gênico sem
dispersar pela planície alagada do rio Paraguai é tendo a capacidade de dispersar
entre microbacias também por via terrestre.
40
Assumindo então essa capacidade de dispersão da espécie por vias
terrestres, é possível indicar que o parcial isolamento entre as sub-bacias do
Madeira e boliviana está associado, além das cachoeiras, ao conjunto de serras que
separam as duas bacias de drenagem (serra dos Pacaas Novos, Rondônia, Brasil).
Essas serras funcionam literalmente como um divisor de águas, impedindo que
indivíduos possam migrar entre as microbacias.
O levantamento de barreiras históricas para a espécie, bem como a
distribuição natural de populações na bacia amazônica e do Pantanal, contribuirá
para o entendimento de padrões biogeográficos e de como barreiras à migração
podem ter influenciado ou vir a influenciar em processos genéticos na espécie.
Demografia Histórica e Divergência Genética
O grande número de passos mutacionais separando as populações de lago
Cururu, Madeira/Bolívia e Pantanal indicam que elas possam representar Unidades
Evolutivas Significantes (ESU) e devem ser tratadas como populações
completamente independentes.
O tempo de separação entre Paleosuchus palpebrosus e P. trigonatus
encontrado em nossas análises com base no gene Citocromo b foi de 18,7 Ma
(Milhões de anos). Tal resultado é compatível com o sugerido por Ross et al. (2007),
entre 17 e 19 Ma que teve em sua estimativa uma menor variância em relação ao
trabalho aqui apresentado, pois seus resultados basearam-se em uma análise
mitogenômica (sequenciamento de todo o gene mitocondrial). Apesar das
estimativas serem próximas, suas precisões não podem ser confrontadas com os
registros fósseis, pela ausência deles.
41
De acordo com os testes de neutralidade na forma dos índices D de Tajima e
Fs de Fu verificou-se que a população da sub-bacia do Madeira sofreu expansão
populacional recente, por valores significativamente negativos (Tab. 3). A análise
Bayesiana Skyline plot com a população do Madeira não pôde ser feita e, portanto, o
tempo em que a expansão demográfica ocorreu não foi calculado. No entanto,
quando todas as populações foram analisadas juntas, verificou-se uma pequena e
recente expansão populacional. Esse resultado pode ser um provável reflexo da
expansão da população da sub-bacia do Madeira.
Essa expansão possivelmente ocorreu devido à crescente disponibilidade de
hábitat dessa espécie na Amazônia após a última glaciação pleistocênica, há 700 mil
anos. Com o fim da era glacial e o consequente aumento no nível do mar, houve
represamento do rio Amazonas na sua foz, aumentando seu volume de água
residente e de seus principais afluentes (Irion & Kalliola, 2010). Aliado a isso, no
início do Holoceno, houve mudanças drásticas no regime de chuvas, o que
contribuiu para o crescente aumento do volume de água da bacia amazônica
(Behling et al., 2010). Com isso, provavelmente criaram-se novos ambientes
propícios aos P. palpebrosus, como igarapés que drenam para lagos nas
paleovárzeas e aumento no número de igarapés de cabeceira devido ao maior
aporte de água para os lençóis freáticos. Apesar de essa ser uma hipótese plausível,
é necessário que seja feita análise com amostras de toda a Amazônia para
confirmá-la.
Os resultados também sustentam uma forte estruturação genética entre as
populações de P. palpebrosus (ФST= 0.65; p<0,001) como consequência da baixa ou
inexistente taxa de fluxo gênico entre elas. Para populações geneticamente
estruturadas, espera-se um maior nível de adaptações locais que, se forem
42
perdidas, representam uma perda de variabilidade genética global da espécie (Haig,
1998).
O teste de Mantel indicou ausência de isolamento por distância no rio
Madeira, na sub-bacia da Bolívia e no Pantanal. P. palpebrosus não é representado
por uma única população panmítica em toda a Amazônia, como é o caso de M.
niger, portanto, a ausência de isolamento por distância nessa espécie pode ser
resultado de suas populações ocuparem uma menor área de abrangência. Desse
modo, não ocupam áreas suficientemente grandes e contínuas para que o
isolamento por distância seja observado.
Portanto, os resultados mostram que o suposto comportamento sedentário
não é a melhor explicação para a estruturação genética encontrada em P.
palpebrosus. Sustenta-se a hipótese de que esta estruturação está relacionada às
barreiras físicas que dividem bacias e sub-bacias, assumindo sua capacidade de
migrar por terra, e também à restrição de habitat, não usando a calha principal dos
rios principais para dispersar entre localidades.
Estudos de diversidade genética nos Caimaninae têm sido feito
recentemente, porém nenhum dado havia sobre a diversidade genética em
Paleosuchus. Foram encontrados altos níveis de diversidade genética na espécie,
com diversidade gênica (H= 0.749) comparável à de espécies de jacarés, panmíticas
na Amazônia, como é o caso de M. niger e C. crocodilus.
Farias et al. (2004) encontrou altos valores de diversidade genética para C.
crocodilus (H= 0.692) e M. niger (H= 0.715), porém, Vasconcelos et al. (2006 e
2008) encontraram valores ainda maiores que os encontrados por Farias et al.
(2004) tanto em C. crocodilus (H= 0.733) como em M. niger (H= 0.911),
respectivamente. Godshalk (2006) também mostrou altos níveis de diversidade
43
genética para as distribuições norte e sul de C. yacare (H= 0.573 norte; H= 0.778
sul), correspondentes à bacia boliviana e bacia do Paraguai-Paraná.
Esses valores são altos em relação aos encontrados em outros grupos de
crocodilianos que não os Caimaninae, como por exemplo, os encontrados por Glenn
et al. (2002) para A. mississipienssis (H= 0.313) e os de Ray et al. (2004) para
Crocodylus moreletii (H= 0.502) (Tab. 4). Além disso, os níveis de diversidade
genética encontrados em P. palpebrosus do Pantanal (H= 0.494) e da Bolívia (H=
0.518) foram semelhantes aos encontrados em Caiman yacare da mesma região
(Pantanal, H= 0.778; Bolívia, H= 0.573) (Tab. 3 e 4). Apesar das diferenças
comportamentais, ecológicas e de estruturação genética, entre as espécies de
jacarés, encontrou-se uma diversidade genética semelhante. Isso sugere que a
ampla disponibilidade de habitat e recursos disponíveis, bem como uma sucessão
de grandes mudanças históricas na Amazônia e Pantanal tem contribuído para que
a diversidade genética de boa parte das espécies de crocodilianos da região
neotropical seja alta.
Implicações para a conservação
A ausência de informações básicas é um dos fatores que eventualmente afeta
a conservação de Paleosuchus palepebrosus (Magnusson, 1985). Ações voltadas à
conservação são mais efetivas quando consideram o grau de estruturação genética
e as taxas de fluxo gênico entre as populações (Frankham et al., 2002). Portanto,
este trabalho fornece importantes informações genéticas e inferências
comportamentais que poderão auxiliar na conservação da espécie.
Na realização desse trabalho, encontrou-se forte estrutura genética
populacional entre as populações de P. palpebrosus estudadas. Esse resultado tem
44
importantes implicações para conservação, pois se espera um maior nível de
adaptações locais em populações geneticamente estruturadas do que em
populações panmíticas. Assim, a diversidade genética nessa área precisa ser
preservada, pois as adaptações acumuladas nesses indivíduos são únicas e se
perderiam se tal população viesse a ser extinta (Haig, 1998).
As principais ameaças às populações de P. palpebrosus são a perda e a
modificação de habitat (Campos et al., 1995; Magnusson & Campos, 2010a),
causadas principalmente pela ação humana. Alguns exemplos são: construção de
barragens, caça de subsistência, urbanização e poluição (Magnusson & Campos,
2010b). Isso é ainda mais importante se considerarmos que existem pequenas e
grandes hidrelétricas construídas ou em construção no trecho Pantanal-Madeira e,
ainda com o agravante de que a urbanização e a poluição ocorrem em escala mais
ampla (Kearns et al., 2005), e vêm sendo praticadas simultaneamente em grande
parte da área de distribuição de Paleosuchus palpebrosus.
Essas hidrelétricas provavelmente resultarão em fortes impactos ambientais,
causando alterações na qualidade da água e interrompendo processos ecológicos e
de dinâmica populacional de muitas espécies aquáticas (Farias et al., 2010),
afetando a biodiversidade local, tanto no Madeira quanto no Pantanal. Isso trará
grande efeito negativo sobre as populações de P. palpebrosus, já que essa é uma
espécie predadora de topo de cadeia que requer ampla disponibilidade de recursos.
Além do mais, no Pantanal, as Pequenas Centrais Hidrelétricas (PCHs) estão sendo
construídas justamente em áreas de vida dos Paleosuchus palpebrosus,
transformando muitas regiões de cachoeiras em Lagos.
O presente trabalho fornece importantes informações para que futuros
estudos comparativos e programas previstos de monitoramento tenham referenciais
45
sobre o padrão de fragmentação genética natural das populações de P.
palpebrosus, uma vez que a caracterização genética foi feita antes da construção
das hidrelétricas. Assim, poderão avaliar com mais exatidão os impactos gerados
pelas hidrelétricas sobre essa espécie.
AGRADECIMENTO
Agredecemos ao CNPq e CT-Amazônia pelo financiamento do projeto intitulado “Rio
Madeira: sua contribuição nos mecanismos de diversificação da fauna na Amazônia”
(CNPq/CT-Amazônia 575603/2008-9) que subsidiou esse trabalho e à Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pelo apoio financeiro.
Também queremos agradecer a todos aqueles que contribuíram direta ou
indiretamente para a concretização desse trabalho, em especial a: Ari, Augusto,
Daniel, Dênis, Deyla, Seu Manoel, Pedro, Valéria, que ajudaram nas coletas de
amostras em campo.
46
REFERÊNCIAS
Banguera-Hinestroza, E., Cárdenas, H., Ruiz-García, M., Marmontel, M., Gaitán, E., Vázquez, R. & García-Vallejo, F. (2002) Molecular identification of evolutionarily significant units in the Amazon River dolphin Inia sp. (Cetacea: Iniidae). Journal Heredity, 93, 312-322.
Behling, H., Bush, M. & Hooghiemstra, H. (2010) Biotic development of Quaternary Amazonia: a palynological perspective. Amazonia - landscape and species evolution: A look into the past. (ed. by C. Hoorn and F.P. Wesselingh), pp. 162-184. Wiley-Blackwell, Oxford.
Berger, W.H. & Wefer, G. (1992) Klimageschichte aus Tiefseesedimenten. Naturwissenschaften, 79, 541-550.
Brochu, C.A. (2003) Phylogenetic approaches toward crocodylian history. Annual Review of Earth and Planetary Sciences, 31, 357-397.
Campbell, J.K.E., Heizler, M., Frailey, C.D., Romero-Pittman, L. & Prothero, D.R. (2001) Upper Cenozoic chronostratigraphy of the southwestern Amazon Basin. Geology, 29, 595-598.
Campbell, J.K.E., Frailey, C.D. & Romero-Pittman, L. (2006) The Pan-Amazonian Ucayali Peneplain, late Neogene sedimentation in Amazonia, and the birth of the modern Amazon River system. Palaeogeography Palaeoclimatology Palaeoecology, 239, 166-219.
Campos, Z. & Mourão, G. (2006) Conservation status of the dwarf caiman, Paleosuchus palpebrosus, in the region surrounding Pantanal. Crocodile Specialist Group Newsletter, 25, 9-10.
Campos, Z. & Sanaiotti, T. (2006). Paleosuchus palpebrosus (Dwarf caiman) nesting. Herpetological Review, 37, 81.
Campos, Z., Coutinho, M. & Abercrombie, C. (1995) Size structure and sex ratio of dwarf caiman in the Serra Amolar, Pantanal, Brazil. Herpetological Journal, 5, 321-322.
Campos, Z., Sanaiotti, T. & Magnusson, W.E. (2010) Maximum size of dwarf caiman, Paleosuchus palpebrosus (Cuvier, 1807), in the Amazon and habitats surrounding the Pantanal, Brazil. Amphibia-Reptilia, 31, 439-442.
Carvalho, A.L. (1951) Os Jacarés do Brasil. Arq. Mus. Nac., 42, 127-152, Rio de janeiro.
47
Corander, J., Waldmann, P., Marttinen, P. & Sillanpaa, M.J. (2007) Baps 2: enhanced possibilities for the analysis of genetic population structure. Bioinformatics, 20, 2363-2369.
Da Silveira, R., Magnusson, W.E. & Campos, Z. (1997) Monitoring the distribution, abundance and breeding areas of Caiman crocodilus crocodilus and Melanosuchus niger in the Anavilhanas Archipelago, Central Amazonia, Brazil. Journal of Herpetology, 31, 514-520.
Drummond, A.J. & Rambaut, A. (2007) BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evololutionary Biology, 7, 214.
Drummond, A.J., Ho, S.Y.W., Phillips, M.J. & Rambaut, A. (2006) Relaxed phylogenetics and dating with confidence. PLoS Biology, 4, 88.
Excoffier, L. & Lischer, H.E.L. (2010) Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10, 564-567.
Excoffier, L., Smouse, P.E. & Quattro, J.M. (1992) Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 131, 479-491.
Farias, I.P., Da Silveira, R., De Thoisy, B., Monjeló, L.A.S., Thorbjarnarson, J. & Hrbek, T. (2004) Genetic diversity and population structure of Amazonian crocodilians. Animal Conservation, 7, 265–272.
Farias, I.P., Torrico, J.P., García-Dávila, C., Santos, M.C.F., Hrbek, T. & Renno, J.F. (2010) Are rapids a barrier for floodplain fishes of the Amazon basin? A demographic study of the keystone floodplain species Colossoma macropomum (Teleostei: Characiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 56, 1129-1135.
Figueiredo, J., Hoorn, C., Van der Ven, P. & Soares, E. (2009) Late Miocene onset of the Amazon River and the Amazon deep-sea fan: Evidence from the Foz do Amazonas Basin. Geology, 37, 619-622.
Frankham, R., Ballou, J.R. & Briscoe, D.A. (2002) Introduction to conservation genetics. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
Fu, Y.X. (1997) Statistical tests of neutrality of mutations against population growth, hitchhiking and background selection. Genetics, 147, 915-925.
Glenn, T.C., Stanton, J.L., Lu, A., Davis, L.M., Bremer, A.J.R., Rhodes, W.E., Brisbin, J.I.L. & Sawyer, R.H. (2002) Low mitochondrial DNA variation among American alligators and a novel non-coding region in crocodilians. Journal of Experimental Zoology, 294, 312-324.
48
Godshalk, R.E. (2006) Phylogeography and conservation genetics of the yacare caiman (Caiman yacare) of south America. PhD Thesis, University of Florida, USA.
Goulding, M., Barthem, R.B. & Ferreira, E.J.G. (2003) The Smithsonian Atlas of the Amazon. Smithsonian Institution Press, Washington, DC.
Haig, S.M. (1998) Molecular contributions to conservation. Ecology, 79, 413-425.
Hall, T. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/ NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41,95-98.
Heckman, C.W. (1998) The Pantanal of Poconé: biota and ecology in the northern section of the world's largest pristine wetland. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht .
Hess, L.L., Melack, J.M., Novo, E.M.L.M., Barbosa, C.C.F. & Gastil, M. (2003) Dual-season mapping of wetland inundation and vegetation or the central Amazon basin. Remote Sensing of Environment, 87, 404-428.
Hey, J. & Nielsen, R. (2007) Integration with the Felsenstein equation for improved Markov chain Monte Carlo methods in population genetics. Proceedings of the National Academy of Sciences-USA, 104, 2785-2790.
Hoorn, C., Guerrero, J., Sarmiento, G.A. & Lorente, M.A. (1995) Andean tectonics as a cause for changing drainage patterns in Miocene northern South America. Geology, 23, 237-240.
Hoorn C., Roddaz, M., Dino, R., Soares, E., Uba, C., Ochoa-Lozano, D. & Mapes, R. (2010) The Amazonian Craton and its influence on past fluvial systems (Mesozoic-Cenozoic, Amazonia). Amazonia - landscape and species evolution: A look into the past. (ed. by C. Hoorn and F.P. Wesselingh), pp. 103-122. Wiley-Blackwell, Oxford.
Hrbek, T., Vasconcelos, W.R., Rebelo, G.H. & Farias, L.P. (2008) Phylogenetic relationships of South American alligatorids and the Caiman of Madeira River. Journal Experimental Zoology, 309, 600-613.
Irion, G. (1979) Jung-Tertiär und Quartär im Tiefl and Amazoniens – probleme der landwirtschaftlichen Erschließung einer Tropenland-schaft. Natur und Museum, 109, 120-127.
Irion, G. & Kalliola, R. (2010) Long-term landscape development processes in Amazonia. Amazonia - landscape and species evolution: A look into the past. (ed. by C. Hoorn and F.P. Wesselingh), pp. 185-197. Wiley-Blackwell, Oxford.
Jobb, G., Haeseler, A. & Strimmer, K. (2004) TREEFINDER: a powerful graphical analysis environment for molecular phylogenetics. BMC Evolutionary Biology, 4, 1-9.
49
Kearns, F.R., Kelly, N.M., Carter, J.L. & Resh, V.H. (2005) A method for the use of landscape metrics in freshwater research and management. Landscape Ecology, 20, 113-125.
King, F.W. & Burke, R.L. (1989) Crocodilian, Tuatara and Turtle Species of the World. A taxonomic and geographic reference. Associations Systematics Collections, Washington, DC. p. 216.
Lang, W. J. (1976) Amphibious behavior of Alligator mississippiensis. Science, 191, 575-577.
Li, W-H. (1997) Molecular evolution. Sinauer Associates. Sunderland, MA.
Lovejoy, N.R. & Collette, B.B., (2001) Phylogenetic relationships of New World needlefishes (Teleostei: Belonidae) and the biogeography of transitions between marine and freshwater habitats. Copeia, 2001, 324–338.
Lundberg, J.G., Marshall, L.G., Guerrero, J., Horton, B., Malabarba, M.C.S.L. & Wesselingh, F. (1998) The stage for Neotropical fish diversification: A history of tropical South American rivers. Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes (ed. by R.E. Reis, R.P. Vari, Z.M. Lucena and C.A.S. Lucena), pp. 13-48. Edipucrs, Porto Alegre, Brazil.
Magnusson, W.E. (1985) Habitat selection, parasites and injuries in Amazonian crocodilians. Amazoniana, 2, 193-204.
Magnusson, W.E. (1992). Paleosuchus palpebrosus. Catalogue of American Amphibians and Reptiles, 554.
Magnusson, W.E., Da Silva, E.V. & Lima, A.P. (1987) Diets of Amazonian crocodiles. Journal of Herpetology, 2, 85-95.
Magnusson, W.E. & Campos, Z. (2010a) Cuvier’s Smooth-fronted Caiman Paleosuchus palpebrosus. Crocodiles: Status Survey and Conservation Action Plan (ed. by S.C. Manolis and C. Stevenson), 3, pp. 40-42, Crocodile Specialist Group, Darwin.
Magnusson, W.E. & Campos, Z. (2010b) Schneider’s Smooth-fronted Caiman Paleosuchus trigonatus. Crocodiles: Status Survey and Conservation Action Plan (ed. by S.C. Manolis and C. Stevenson), 3, pp. 43-45, Crocodile Specialist Group, Darwin.
Magnusson, W.E. & Lima, A.P. (1991) The ecology of a cryptic predator, Paleosuchus trigonatus, in a tropical rainforest. Journal of Herpetology. 25, 41-48.
Mantel, N. (1967) The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research, 27, 209-220.
50
Medem, F. (1981) Los Crocodylia de Sur America, Vol 1. Colciencias, Bogotá, Colômbia.
Medem, F. (1983) Los Crocodylia de Sur America. Editora Carrera, Bogotá, Colômbia.
Ministério do Meio Ambiente (1997) Plano de Conservação da Bacia do Alto Paraguai (Pantanal) - PCBAP. Diagnóstico dos meios físico e biótico: meio físico. Brasília, 2, 120-293.
Muller, J. & Reisz, R.R. (2005) Four well-constrained calibration points from the vertebrate fossil record for molecular clock estimates. BioEssays, 27, 1069-1075.
Nei, M. (1987) Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press. New York, NY.
Pearse, D.E., Arndt, A.D., Valenzuela, N., Miller, B.A., Cantarelli, V.H. & Sites W.Jr. (2006) Estimating population structure under non equilibrium conditions in a conservation context: continent-wide population genetics of the giant Amazon River turtle, Podocnemis expansa (Chelonia; Podocnemididae). Molecular Ecology, 15, 985-1006.
Posada, D. (2008) jModelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and Evolution, 25, 1253-1256.
Rambaut, A. (2009) Tree Figure Drawing Tool Version 1.3.1. Institute of Evolutionary biology, University of Edinburgh, UK.
Räsänen, M.E., Salo, J.S. & Kalliola, R.J. (1987) Fluvial perturbance in the western Amazon Basin: Regulation by long-term Sub-Andean tectonics. Science, 238, 1398-1401.
Ray, D.A., Dever, J.A., Platt, S.G., Rainwater, T.R., Finger, A.G., McMurry, S.T., Batzer, M.A., Barr, B., Stafford, P.J., McKnight, J. & Densmore, L.D. (2004) Low levels of nucleotide diversity in Crocodylus moreletii and evidence of hybridization with C. acutus. Conservation Genetic, 5, 449-462.
Rebelo, G.H. & Magnusson, W.E. (1983) An analysis of the effect of hunting on Caiman crocodilus and Melanosuchus niger base on the sizes of confiscated skins. Biological Conservation, 26, 95-104.
Roos, J., Aggarwal, R.K. & Janke, A. (2007) Extended mitogenomic phylogenetic analyses yield new insight into crocodylian evolution and their survival of the Cretaceous–Tertiary boundary Molecular. Phylogenetics and Evolution, 45, 663-673.
Ross, C. & Magnusson, W.E. (1990) Crocodilianos actuales. Crocodilos y Camanes. (ed. by C. Ross and S. Gamett), pp. 216-230. Facts On File, Inc., New York.
51
Ross, J.P. (1998) Crocodiles. Status Survey and Conservation Action Plan, 2nd Edn. IUCN Publication Gland, Switzerland.
Salzburger, W., Ewing, G.B. & Von Haeseler., A. (2011) The performance of phylogenetic algorithms in estimating haplotype genealogies with migration. Molecular Ecology, 20, 1952-1963.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, NY.
Tajima, F. (1989) Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics, 123, 585-595.
Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1996) Clustal W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680.
Thorbjarnarson, J. (1992) Crocodiles. An Action Plan for their Conservation. IUCN, Gland.
Torrente-Vilara, G. (2009) Heterogeneidade ambiental e Diversidade ictiofaunística do trecho de corredeiras Dio rio Madeira, Rondônia, Brasil. PhD Thesis, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Brazil.
Vasconcelos, W. & Campos, Z. (2007) Geographic variation between Pantanal caiman (Caiman crocodilus yacare) and Amazonian caiman (Caiman crocodilus crocodilus): First phase. Crocodile Specialist Group Newsletter, 26, 6-7.
Vasconcelos, W.R., Hrbek, T., Da Silveira, R., De Thoisy, B., Marioni, B. & Farias, I.P. (2006) Population genetic analysis of Caiman crocodilus (Linnaeus, 1758) from South America. Genetic Molecular Biology, 21, 220-230.
Vasconcelos, W.R., Hrbek, T., Da Silveira, R., De Thoisy, B., Ruffeil, L.A.S. & Farias, I.P. (2008) Phylogeographic and conservation genetic analysis of the black caiman (Melanosuchus niger). Journal Experimental Zoology, 309, 600-613.
Weir, B.S. & Cockerham, C.C. (1984) Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution, 38, 1358-1370.
Wilkinson, M.J., Marshall, L.G., Lundberg, J.G. and Kreslavsky, M.H. (2010) Megafan environments in northern South America and their impact on Amazon Neogene aquatic ecosystems. Amazonia - landscape and species evolution: A look into the past. (ed. by C. Hoorn and F.P. Wesselingh), pp. 162-184. Wiley-Black
52
Tabela 1 - Primers utilizados nas PCRs (Reação em Cadeia da Polimerase) e no sequenciamento do gene mitocondrial, Citocromo b. Abaixo são mostrados: nome do primer, sua sequência no sentido de 5’ para 3’, temperatura de anelamento (TA) e reação em que foi utilizado.
Primer Sequencia 5’-3’ TA (ºC) Reação
GluCRf.1 CAACCAAAACCTGAGGYCTGA 52 Amplificação
ProCRr.1 ATTAGAAYGTCGGCTTTGGGG 52 Amplificação
CytbCRf.3 CCATACATYGGAGACACCAT 50 Sequência
CytbCRr.2 AAGATYAGGTGGGTKATGAG 50 Sequência
Suas respectivas sequências, temperatura de anelamento (TA) em graus Celsius (ºC) e reações em que serão utilizados.
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Tabela 2. Lista de sequências utilizadas nesse artigo e depositadas no Genbank. Nós mostramos também a espécie, a região e o a referência de cada uma das sequências.
Código Espécie Região GenBank Referência
1 P. trigonatus Amazon-Brasil EU161679.1 Hrbek et al. (2008)
2 M. Níger Amazon-Brasil EU161678.1 Hrbek et al. (2008)
3 Caiman crocodilus Amazon-Brasil EU161666.1 Hrbek et al. (2008)
4 Caiman latirostris São Paulo-Brasil EU161674.1 Hrbek et al. (2008)
5 Caiman yacare Não informado JF315314.1 Oaks (2011)
6 A. mississipiensis United States (EUA) JF315322.1 Oaks (2011)
7 A. sinensis China JF315320.1 Oaks (2011)
8 Crocodylus porosus Australia JF315296.1 Oaks (2011)
9 P. palpebrosus Lago Cururu, Am-Brasil 01LCU Este estudo
10 P. palpebrosus Lago Cururu, Am-Brasil 01LCU Este estudo
11 P. palpebrosus Lago Cururu, Am-Brasil 01LCU Este estudo
12 P. palpebrosus Lago Cururu, Am-Brasil 01LCU Este estudo
13 P. palpebrosus Nova Olinda, Am-Brasil 01NON Este estudo
14 P. palpebrosus Manicoré, Am-Brasil 05Mnc Este estudo
15 P. palpebrosus Humaitá, Am-Brasil 11HuB Este estudo
16 P. palpebrosus Porto Velho, Ro-Brasil 13EC Este estudo
17 P. palpebrosus Guajará-Mirim, Ro-Brasil 01GM Este estudo
18 P. palpebrosus Com. Deolinda, Ro-Brasil 04GuMa Este estudo
19 P. palpebrosus Com. Deolinda, Ro-Brasil 05GuMa Este estudo
20 P. palpebrosus Vila Bela, MT-Brasil 02VB Este estudo
21 P. palpebrosus Vila Bela, MT-Brasil 06VB Este estudo
22 P. palpebrosus Serra das Araras,MS-Brasil
15SAR Este estudo
23 P. palpebrosus Barra dos Bugres, MT- 04BB Este estudo
54
Brasil
24 P. palpebrosus Serra do Urucum, MS-Brasil
01SU Este estudo
25 P. palpebrosus Coxim, MS-Brasil 05Co Este estudo
26 P. palpebrosus Serra do Amolar, MS-Brasil
04SAM Este estudo
55
Tabela 3. Índices de diversidade e teste de neutralidade em cada uma das populações de Paleosuchus palpebrosus encontrada nesse trabalho e também para todos os indivíduos amostrados.
Populações N Hp π ± SD Diversidade gênica ± SD
D de Tajima (p) Fs de Fu (p)
Lago Cururu 13 5 0.0944 ± 0.0488 0.705 ± 0.122 -0.4782 (0.323) -0.9402 (0.1180)
Madeira 77 4 0.0001 ± 0.0002 0.101 ± 0.047 -1.9436 (0.000)* -5.8813 (0.000)*
Bolívia 32 4 0.0010 ± 0.0007 0.518 ± 0.100 -0.6803 (0.264) -1.2005 (0.231)
Pantanal 50 5 0.0006 ± 0.0005 0.494 ± 0.080 -0.4499 (0.380) -1.0203 (0.258)
Todos os indiv. 172 18 0.0161 ± 0.0079 0.749 ± 0.026 1.3403 (0.934) 6.4341 (0.9260)
N, número de indivíduos; Hp, número de haplótipos únicos; π, diversidade nucleotídica de Nei e o desvio padrão; diversidade gênica de Nei e o desvio padrão (SD); D de Tajima (valor de P); Fs de Fu (valor de p). (*) indica valores de p significativos.
56
Tabela 4. Comparação entre a diversidade genética encontrada em P. palpebrosus e em outras espécies de crocodilianos.
Specie N Hp DNAmt (pb) Diversidade gênica ± SD
Referência
Paleosuchus palpebrosus 172 18 1,102 0.749 ± 0.026 Este estudo
Caiman crocodilus 32 09 1,142 0.692 ± 0.079 Farias et al. (2004)
125 38 1,085 0.733 ± 0.042 Vasconcelos et al. (2006)
Melanosuchus Níger 47 10 1,142 0.715 ± 0.049 Farias et al. (2004)
130 39 1,027 0.911 ± 0.023 Vasconcelos et al. (2008)
Caiman yacare Norte 143 16 1,143 0.573 ± 0.033 Godshalk (2006)
Sul 65 09 1,143 0.778 ± 0.031
Alligator mississipiensis 25 02 624 0.313 ± 0.092 Glenn et al. (2002)
Crocodylus moreletii 140 20 537 0.502 ± 0.048 Ray et al. (2004)
N, tamanho amostral; Hp, número de haplótipos; mtDNA, número de pares de base (pb) sequenciados de algum gene do DNA mitocondrial; diversidade gênica e seu desvio padrão.
57
Figura 1. Mapa de coleta de P. palpebrosus. As coordenadas geográficas de cada
localidade são: (01) lago Cururu - 03º30’ S 60º41’ W; (02) Nova Olinda do Norte -
03º43’ S 59º04’ W; (03) Novo Aripuanã - 05º19’ S 60º38’ W; (04) Manicoré - 05º52’ S
61º22’ W; (05) Humaitá A - 07º22’ S 63º12’ W; (06) Humaitá B - 07º35’ S 63º09’ W;
(07) Porto velho - 08º47’ S 63º56’ W; (08) Entre Cachoeiras - 09º38’ S 64º55’ W; (09)
Guajará-Mirim - 10º48’ S 65º20’ W; (10) Guaporé-Mamoré - 12º24’ S 64º12’ W; (11)
Pimenteiras do Oeste - 13º30’ S 61º05’ W; (12) Vila Bela - 15º12’ S 59º21’ W; (13)
Barra dos Bugres - 15º04’ S 57º10’ W; (14) Rondonópolis - 16º28’ S 54º37’ W; (15)
Coxim - 18º31’ S 54º44’ W; (16) Serra das Araras - 18º44’ S 53º35’ W; (17) Serra do
Urucum - 19º11’ S 57º36’ W; (18) Serra do Amolar - 17º52’ S 57º36’ W; (19) Tangará
da Serra - 14º30’ S 57º34’ W.
Figura 2. Mapa mostrando as localidades de coleta divididas em quatro populações
que podem ser distinguidas por cores diferentes (vermelho – lago Cururu; verde –
Madeira; azul – Bolívia; amarelo - Pantanal). O gráfico acima na figura foi gerado no
programa BAPS. Nele, cada barra vertical expressa uma localidade, distinguidas
pelo número na parte inferior, e as cores representam os haplótipos. É possível
identificar o compartilhamento ou não de haplótipos entre populações e as
localidades em que isso ocorre.
Figura 3. Mapa de localidades e árvore de haplótipos gerada no programa
HAPLOVIEWER. Os quadrados representam as localidades e suas cores mostram
se há haplótipo de uma ou mais populações. As populações estão representadas
pelos triângulos. Na árvore de haplótipos, cada nó azul representa uma mutação
segregante, cada círculo representa um haplótipo e o número dentro desse círculo
indica quantos indivíduos compartilham esse haplótipo. No caso da árvore de
haplótipo, as cores indicam a que população os indivíduos pertencem.
58
Figura 4. Árvore filogenética gerada no programa BEAST. As barras horizontais azuis
representam a variância e os números indicam o tempo de divergência entre os
grupos em milhões de anos.
59
Figura 1.
60
Figura 2.
61
Figura 3.
62
Figura 4.
63
3. CONCLUSÃO GERAL
Os resultados encontrados em nosso trabalho permitem concluir que:
Lago Cururu, Madeira, Bolívia e Pantanal possuem populações distintas de
Paleosuchus palpebrosus.
As cachoeiras do rio Madeira representam uma barreira que apenas limita o
fluxo gênico entre as populações do Madeira e da Bolívia. O fluxo gênico é
bidirecional, mas não simétrico, sendo maior no sentido Madeira-Bolívia.
As regiões do rio Madeira e Mamoré próximas à primeira cachoeira em
Guajará-Mirim podem ser consideradas como uma zona de transição entre as
duas populações.
A serra dos Parecis separa a bacia amazônica da bacia do Paraguai e é a
provável barreira geográfica que divide dois grupos de Paleosuchus
palpebrosus.
Ocorreu evento demográfico histórico somente na população do Madeira,
com crescimento populacional recente, provavelmente após a última era
glacial.
Paleosuchus palpebrosus é composto por populações fortemente
estruturadas geneticamente como resultado da baixa ou inexistente taxa de
fluxo gênico entre elas.
As populações de lago Cururu, Madeira/Bolívia e Pantanal podem ser
consideradas Unidades Evolutivas Significantes (Evolutionarily Significant
Unit- ESU) e devem ser tratadas como populações completamente
independentes.
A espécie possui alto nível de diversidade genética, comparável a de outros
Caimaninae da região Neotropical.
Nossa caracterização prévia fornece o padrão de fragmentação genética
natural da espécie, importante para que futuros estudos possam avaliar com
mais exatidão os impactos gerados pelas hidrelétricas sobre essa espécie.
64
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aguilera, O.A.; Riff, D.; Bocquetin-Villanueva, J.C. 2006. A new giant Purussaurus
(Crocodyliformes, Alligatoridae) from the Upper Miocene Urumaco Formation,
Venezuela. Journal of Systematic Palaeontology, 4: 221-232.
Aleixo, A. 2004. Historical diversification of a terra-firme forest bird superspecies: a
Phylogeographic perspective on the role of different hypotheses of Amazonian
diversification. Evolution, 25(6): 1303-1317.
Amavet, P.S.; Rosso, E.L.; Ariani, R.M.M.; Larriera, A.; Patricia, S. 2007. Analysis of
the Population Structure of Broad-Snouted Caiman (Caiman latirostris) in Santa
Fe, Argentina, using the RAPD technique. Journal of Herpetology, 41(2): 294-
300.
Avise, J.C. 1986. Mitochondrial DNA and evolutionary genetics of higher animals.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 312: 325-342.
Avise, J.C. 2000. Phylogeography; The history and formation of species. Harvard
University Press, Cambridge, Massechussetts. 447 p.
Avise, J.C. 2004. Molecular markers, natural history and evolution, 2nd Edn. Sinauer
Associates, Sunderland, MA. 541p.
Banguera-Hinestroza, E.; Cárdenas, H.; Ruiz-García, M.; Marmontel, M.; Gaitán, E.;
Vázquez, R.; García-Vallejo, F. 2002. Molecular identification of evolutionarily
significant units in the Amazon River dolphin Inia sp. Cetacea: Iniidae). Journal
Heredity, 93: 312-322.
Barret, S.C.H.; Kohn, J.R. 1991. Genetic and evolucionary consequences of small
population size in plants: implication for conservation. In: Falk, D.A.; Holsinger,
K.E. (Eds). Genetics and conservation of rare plants. Oxford University Press,
Oxford, USA. p.3-30.
65
Bates, J.M.; Haffer, J.; Grismer, E. 2004. Avian mitochondrial DNA sequence
divergence across a headwater stream of the Rio Tapajós, a major Amazonian
river. Journal of Ornithology, 145: 199-205.
Benton, M. J.; Clark, J.M. 1988. Archosaur phylogeny and the relationships of the
Crocodylia; In: Benton, M.J. (Ed). The Phylogeny and Classification of the
Tetrapods. Clarendon Press, Oxford. p. 295–338
Behling, H.; Bush, M.; Hooghiemstra, H. 2010. Biotic development of Quaternary
Amazonia: a palynological perspective. In: Hoorn, C.; Wesselingh, F.P. (Eds).
Amazonia - landscape and species evolution: A look into the past. Wiley-
Blackwell, Oxford. p. 162-184.
Berger, W.H.; Wefer, G. 1992. Klimageschichte aus Tiefseesedimenten.
Naturwissenschaften, 79: 541-550.
Blake, D. K. 1982. Crocodile ranching in Zimbabwe. The Zimbabwe Science News,
26: 208-209.
Botero-Arias, R. 2007. Padrões de movimento, uso de microhábitat e dieta do jacaré-
paguá, Paleosuchus palpebrosus (Crocodilia: Alligatoridae), em uma floresta de
paleovárzea ao sul do rio Solimões, Amazônia Central, Brasil. Dissertação de
mestrado, Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, Manaus, Brazil. 59pp.
Brochu, C.A. 1997. A review of “Leidyosuchus” (Crocodyliformes, Eusuchia) from the
Cretaceous through Eocene of North America. Journal of Vertebrate
Paleontology, 17: 679-697.
Brochu, C.A. 1999. Phylogeny, systematics, and historical biogeography of
Alligatoroidea. Society of Vertebrate Paleontology Memoir, 6: 9-100.
Brochu, C.A. 2003. Phylogenetic approaches toward crocodylian history. Annual
Review of Earth and Planetary Sciences, 31: 357-397.
66
Brochu, C.A. 2004. Alligatorine phylogeny and the status of Allognathosuchus Mook,
1921. Journal of Vertebrate Paleontology, 24: 856-872.
Brown, W.M.; Prager, E.M.; Wang, A.; Wilson, A.C. 1982. Mitochondrial DNA
sequences of primates: Tempo and mode of evolution. Proceedings of the
National Academy of Sciences, USA. 76: 1976-1971.
Campbell, J.K.E.; Heizler, M.; Frailey, C.D.; Romero-Pittman, L.; Prothero, D.R.
2001. Upper Cenozoic chronostratigraphy of the southwestern Amazon Basin.
Geology, 29: 595-598.
Campbell, J.K.E.; Frailey, C.D.; Romero-Pittman, L. 2006. The Pan-Amazonian
Ucayali Peneplain, late Neogene sedimentation in Amazonia, and the birth of the
modern Amazon River system. Palaeogeography Palaeoclimatology
Palaeoecology, 239: 166-219.
Campos, Z.; Mourão, G. 2006. Conservation status of the dwarf caiman,
Paleosuchus palpebrosus, in the region surrounding Pantanal. Crocodile
Specialist Group Newsletter, 25: 9-10.
Campos, Z.; Sanaiotti, T. 2006. Paleosuchus palpebrosus (Dwarf caiman) nesting.
Herpetological Review, 37: 81.
Campos, Z.; Coutinho, M.; Abercrombie, C. 1995. Size structure and sex ratio of
dwarf caiman in the Serra Amolar, Pantanal, Brazil. Herpetological Journal, 5:
321-322.
Campos, Z.; Llobet, A.Q.; Piña, C.I.; Magnusson, W.E. 2010. Yacare Caiman Caiman
yacare. In: Manolis, S.C.; Stevenson, C. (Eds). Crocodiles: Status Survey and
Conservation Action Plan, Crocodile Specialist Group, Darwin. p. 23-28.
Campos, Z.; Sanaiotti, T.; Magnusson, W.E. 2010. Maximum size of dwarf caiman,
Paleosuchus palpebrosus (Cuvier, 1807), in the Amazon and habitats
surrounding the Pantanal, Brazil. Amphibia-Reptilia, 31: 439-442.
67
Carvalho, A.L. 1951. Os Jacarés do Brasil. Arq. Mus. Nac., 42: 127-152, Rio de
janeiro.
Chadwick, M.A.; Dobberfuhl, D.R.; Benke, A.C.; Huryn, A.D.; Suberkropp, K.; Thiele,
J.E. 2006. Urbanization Affects Stream Ecosystem Function by Altering
Hydrology, Chemistry and Biotic Richness. Ecological Applications, 16(5): 1796-
1807.
Clark, J. M. 1994. Patterns of evolution in Mesozoic Crocodyliformes. In: Fraser,
N.C.;Sues, H.D. (Eds). In the Shadow of Dinosaurs: Early Mesozoic Tetrapods.
Cambridge University Press, New York. p. 84-97.
Cohn-Haft, M. 2000. A case study in amazonian biogeography: vocal and DNA-
sequence variation in Hemitriccus flycatchers. PhD Thesis, Lousiana State
University, Baton Rouge, EUA. 136p.
Corander, J.; Waldmann, P.; Marttinen, P.; Sillanpaa, M.J. 2007. Baps 2: enhanced
possibilities for the analysis of genetic population structure. Bioinformatics, 20:
2363-2369.
Cracraft, J. 1988. Deep-history biogeography: Retrieving the historical pattern of
evolving continental biotas. Systematic Zoology, 37(3): 221-236.
Cracraft, J.; Prum, R.O. 1988. Patterns and process of diversification: speciation and
historical congruence in some Neotropical birds. Evolution, 3 (42): 603-620.
Crandall, K.A.; Bininda-Edmonds, O.R.P.; Mace, G.M.; Wayne, R.K. 2000.
Considering evolutionary processes in conservation biology. Trends in Ecology
and Evolution, 15(7): 290-295.
Da Silveira, R.; Magnusson, W.E.; Campos, Z. 1997. Monitoring the distribution,
abundance and breeding areas of Caiman crocodilus crocodilus and
68
Melanosuchus niger in the Anavilhanas Archipelago, Central Amazonia, Brazil.
Journal of Herpetology, 31: 514-520.
Davis, L.M.; Glenn, T.C.; Strickiland, D.C.; Guillette, L.J.; Elsey, R.M.; Rhodes, W.E.;
Dessauser, H.C.; Sawer, R.H. 2002. Microsatellite DNA analysis support an
eastwest phylogeographic split of American alligator population. Journal of
Experimental Zoology, 294: 352-372.
De Thoisy, B.; Hrbek, T.; Farias, I.P.; Vasconcelos, W.R.; Lavergne, A. 2006. Genetic
structure and population dynamics of black caiman (Melanosuchus niger).
Biological Conservation. 133: 474–482.
Densmore LD. 1983. Biochemical and immunological systematics of the order
Crocodilia. In: Hecht, M.K.; Wallace, B.; Prance, G.H. (Eds). Evolutionary
Biology. Plenum, New York. p. 397-465.
Densmore, L.D.; Owen, R.D. 1989. Molecular systematics of the order Crocodilia.
American Zoologist, 29: 831-41.
Drummond, A.J.; Rambaut, A. 2007. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by
sampling trees. BMC Evololutionary Biology, 7: 214.
Drummond, A.J.; Ho, S.Y.W.; Phillips, M.J.; Rambaut, A. 2006. Relaxed
phylogenetics and dating with confidence. PLoS Biology, 4: 88.
Eizirik, E.; Kim, J.; Raymond, M.M.; Crawshaw, P.G.; O’Brien, S.J.; Johnson, W.E.
2001. Phylogeography, population history and conservation genetics of jaguars
(Panthera onca, Mammalia, Felidae). Molecular Ecology, 10: 65-79.
Excoffier, L.; Lischer, H.E.L. 2010. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs
to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular
Ecology Resources, 10: 564-567.
69
Excoffier, L.; Smouse, P.E.; Quattro, J.M. 1992. Analysis of molecular variance
inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human
mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 131: 479-491.
Farias, I.P.; Da Silveira, R.; De Thoisy, B.; Monjeló, L.A.S.; Thorbjarnarson, J.;
Hrbek, T. 2004. Genetic diversity and population structure of Amazonian
crocodilians. Animal Conservation, 7: 265–272.
Farias, I.P.; Torrico, J.P.; García-Dávila, C.; Santos, M.C.F.; Hrbek, T.; Renno, J.F.
2010. Are rapids a barrier for floodplain fishes of the Amazon basin? A
demographic study of the keystone floodplain species Colossoma macropomum
(Teleostei: Characiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 56: 1129-
1135.
Ferguson, D.J.P. 1985. Ultrastructural characterization of the proliferative (stem?)
cells within the parenchyma of the normal "resting" breast. Virchows Arch,
Springer Berlin, Heidelberg. 407: 379-385.
Figueiredo, J.; Hoorn, C.; Van der Ven, P.; Soares, E. 2009. Late Miocene onset of
the Amazon River and the Amazon deep-sea fan: Evidence from the Foz do
Amazonas Basin. Geology, 37: 619-622.
Frankham, R.; Ballou, J.R.; Briscoe, D.A. 2002. Introduction to conservation genetics.
Cambridge University Press, Cambridge, UK.
Fu, Y.X. 1997. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth,
hitchhiking and background selection. Genetics, 147: 915-925.
Gatesy, G.; Amato, G.; Norell, M.; Desalle, R.; Hayashi, C. 2003. Combined Support
for Wholesale Taxic Atavism in Gavialine Crocodylians. Systematic Biology,
52(3): 403-422.
Glenn, T.C.; Dessauer, H, Braun, M. 1998. Characterisation of microsatellite DNA
loci in American alligators. Copeia.1998: 591-601.
70
Glenn, T.C.; Stanton, J.L.; Lu, A.; Davis, L.M.; Bremer, A.J.R.; Rhodes, W.E.; Brisbin,
J.I.L.; Sawyer, R.H. 2002. Low mitochondrial DNA variation among American
alligators and a novel non-coding region in crocodilians. Journal of Experimental
Zoology, 294: 312-324.
Godshalk, R.E. 2006. Phylogeography and conservation genetics of the yacare
caiman (Caiman yacare. of south America. PhD Thesis, University of Florida,
USA. 249pp.
Goulding, M.; Barthem, R.B.; Ferreira, E.J.G. 2003. The Smithsonian Atlas of the
Amazon. Smithsonian Institution Press, Washington, DC.
Grigg, G.C.; Gans, C. 1993. Crocodilia: Morphology e physiology of the crocodylia.
In: Ross, G.J.; Beasley, P.L. (Eds). Fauna of Australia. Amphibia and Reptilia.
Australian Government Publishing Service, Canberra, Australia.
Haffer, J. 1969. Speciation in Amazonian forest birds. Science, 165: 131–137.
Haig, S.M. 1998. Molecular contributions to conservation. Ecology, 79: 413-425.
Hall, T. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/ NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41:
95-98.
Harshman, J.; Huddleston, C.J.; Bollback, J.P.; Parsons, T.J.; Braun, M.J. 2003. True
and False Gharials: A Nuclear Gene Phylogeny of Crocodylia. Systematic
Biology, 52(3): 386-402.
Heckman, C.W. 1998. The Pantanal of Poconé: biota and ecology in the northern
section of the world's largest pristine wetland. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht.
71
Hess, L.L.; Melack, J.M.; Novo, E.M.L.M.; Barbosa, C.C.F.; Gastil, M. 2003. Dual-
season mapping of wetland inundation and vegetation or the central Amazon
basin. Remote Sensing of Environment, 87: 404-428.
Hey, J.; Nielsen, R. 2007. Integration with the Felsenstein equation for improved
Markov chain Monte Carlo methods in population genetics. Proceedings of the
National Academy of Sciences-USA, 104: 2785-2790.
Hickam, C.P; Roberts, L.S; Larson, A. 2006. Princípios integrados de zoologia.
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.
Hoorn, C.; Guerrero, J.; Sarmiento, G.A.; Lorente, M.A. 1995. Andean tectonics as a
cause for changing drainage patterns in Miocene northern South America.
Geology, 23: 237-240.
Hoorn C.; Roddaz, M.; Dino, R.; Soares, E.; Uba, C.; Ochoa-Lozano, D.; Mapes, R.
2010. The Amazonian Craton and its influence on past fluvial systems
(Mesozoic-Cenozoic, Amazonia). Hoorn, C.; Wesselingh, F.P. (Eds). Amazonia -
landscape and species evolution: A look into the past., Wiley-Blackwell, Oxford.
p. 103-122.
Hrbek, T.; Vasconcelos, W.R.; Rebelo, G.H.; Farias, L.P. 2008. Phylogenetic
relationships of South American alligatorids and the Caiman of Madeira River.
Journal Experimental Zoology, 309: 600-613.
Irion, G. 1979. Jung-Tertiär und Quartär im Tiefl and Amazoniens – probleme der
landwirtschaftlichen Erschließung einer Tropenland-schaft. Natur und Museum,
109: 120-127.
Irion, G.; Kalliola, R. 2010. Long-term landscape development processes in
Amazonia. Amazonia - landscape and species evolution: A look into the past.
Hoorn, C.; Wesselingh, F.P. (Eds), Wiley-Blackwell, Oxford. p. 185-197.
72
Jobb, G.; Haeseler, A.; Strimmer, K. 2004. TREEFINDER: a powerful graphical
analysis environment for molecular phylogenetics. BMC Evolutionary Biology, 4:
1-9.
Johns, G.C.; Avise, J.C. 1998. A comparative summary of genetic distances in the
vertebrates from the mitochondrial cytochrome b gene. Molecular Biology and
Evolution, 15: 1481-1490.
King, F.W.; Burke, R.L. 1989. Crocodilian, Tuatara and Turtle Species of the World. A
taxonomic and geographic reference. Associations Systematics Collections,
Washington, DC. p. 216.
Kearns, F.R.; Kelly, N.M.; Carter, J.L.; Resh, V.H. 2005. A method for the use of
landscape metrics in freshwater research and management. Landscape Ecology,
20: 113-125.
Lang, W. J. 1976. Amphibious behavior of Alligator mississippiensis. Science, 191:
575-577.
Li, W-H. 1997. Molecular evolution. Sinauer Associates. Sunderland, MA.
Lovejoy, N.R.; Collette, B.B. 2001. Phylogenetic relationships of New World
needlefishes (Teleostei: Belonidae) and the biogeography of transitions between
marine and freshwater habitats. Copeia, 2001: 324–338.
Lundberg, J.G.; Marshall, L.G.; Guerrero, J.; Horton, B.; Malabarba, M.C.S.L.;
Wesselingh, F. 1998. The stage for Neotropical fish diversification: A history of
tropical South American rivers. Reis, R.E.; Vari, R.P.; Lucena, Z.M.; Lucena,
C.A.S. (Eds). Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes, Edipucrs, Porto
Alegre, Brazil. p. 13-48.
Magnusson, W.E. 1985. Habitat selection, parasites and injuries in Amazonian
crocodilians. Amazoniana, 2: 193-204.
73
Magnusson, W.E. 1992. Paleosuchus palpebrosus. Catalogue of American
Amphibians and Reptiles, 554.
Magnusson, W.E.; Da Silva, E.V.; Lima, A.P. 1987. Diets of Amazonian crocodiles.
Journal of Herpetology, 2: 85-95.
Magnusson, W.E.; Campos, Z. 2010a. Cuvier’s Smooth-fronted Caiman Paleosuchus
palpebrosus. Manolis, S.C.; Stevenson, C. (Eds). Crocodiles: Status Survey and
Conservation Action Plan, Crocodile Specialist Group, Darwin. 3: p. 40-42.
Magnusson, W.E.; Campos, Z. 2010b. Schneider’s Smooth-fronted Caiman
Paleosuchus trigonatus. In: Manolis, S.C.; Stevenson, C. (Eds). Crocodiles:
Status Survey and Conservation Action Plan, Crocodile Specialist Group, Darwin.
3: p. 43-45.
Magnusson, W.E.; Lima, A.P. 1991. The ecology of a cryptic predator, Paleosuchus
trigonatus, in a tropical rainforest. Journal of Herpetology, 25: 41-48.
Mantel, N. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression
approach. Cancer Research, 27: 209-220.
Marks, B.D.; Hackett, S.J.; Capparella, A.P. 2002. Historical relationship among
neotropical lowland forest areas of endemism as determined by mitochondrial
DNA sequence variation within the wedge-billed woodscreeper (Aves:
Dendrocolaptidae: Glyphorynchus spirurus). Molecular Phylogeny and Evolution
24: 153-167.
Martin, S. 2008. Global diversity of crocodiles (Crocodilia, Reptilia) in freshwater.
Hydrobiologia, 595: 587-591.
Martins, M.; Araujo, M.S.; Sawaya, R.J.; Nunes, R. 2001. Diversity and evolution of
macrohabitat use, body size and morphology in a monophyletic group of
Neotropical pitviper (Bothrops). Journal of Zoology, 254: 529-538.
74
Meyer, A. 1993. Evolution of mitochondrial DNA in fishes. In: Hochachka, W.;
Mommsen T.P. (Eds). Molecular biology frontiers, biochemistry and molecular
biology of fishes. Vol. 2. Elsevier Science Publishers, Amsterdam. p. l-38.
McAliley, L. R.; Willis, R. E.; Ray, D. A.; White, P. S.; Brochu, C. A.; Densmore, L. D.
2006. Are crocodiles really monophyletic? Evidence for subdivisions from
sequence and morphological data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 39:
16-32.
Medem, F. 1953. Contribuciones a la taxonomia y distribución del Yacaré Negro
Paleosuchus palpebrosus (Cuvier) em Colômbia. Revista Colombiana de
Antropologia, 1(1): 407-420.
Medem, F. 1981. Los Crocodylia de Sur America, Vol. 1. Colciencias, Bogotá,
Colômbia.
Medem, F. 1983. Los Crocodylia de Sur America. Editora Carrera, Bogotá, Colômbia.
Ministério do Meio Ambiente 1997. Plano de Conservação da Bacia do Alto Paraguai
(Pantanal) – PCBAP. Diagnóstico dos meios físico e biótico: meio físico. Brasília,
Brazil. 2: p. 120-293.
Morse, C.C.; Huryn, A.D.; Cronan. C. 2003. Impervious Surface Area as a Predictor
of the Effects of Urbanization on Stream Insect Communities in Maine, U.S.A.
Environmental Monitoring and Assessment, 89: 95-127.
Moutinho, L.; Porsani, J.L.; Porsani, M.J. 2005. Deconvolução preditiva de dados
GPR adquiridos sobre lâmina d'água: exemplo do Rio Taquari, Pantanal
Matogrossense. Revista Brasileira de Geofísica, 23 (1): 61-74.
Muller, J.; Reisz, R.R. 2005. Four well-constrained calibration points from the
vertebrate fossil record for molecular clock estimates. BioEssays, 27: 1069-1075.
75
Nedbal, M.A.; Flynn, J.J. 1998. Do the combined effects of the asymmetric process of
replication and DNA damage from oxygen radicals produces a mutation rate
signature in the mitochondrial genome. Molecular Biology, 15: 219-223
Nei, M. 1987. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press. New York.
Norell, M.A. 1988. Cladistic approaches to paleobiology as applied to the phylogeny
of alligatorids. PhD thesis. Yale University, New Haven.
Pearse, D.E.; Arndt, A.D.; Valenzuela, N.; Miller, B.A.; Cantarelli, V.H.; Sites W.J.
2006. Estimating population structure under non equilibrium conditions in a
conservation context: continent-wide population genetics of the giant Amazon
River turtle, Podocnemis expansa (Chelonia; Podocnemididae). Molecular
Ecology, 15: 985-1006.
Porcella, D.B.; Sorenson, D.L. 1980. Characteristics of Nonpoint Source Urban
Runoff and its Effect on Stream Ecosystems. EPA, 600 (3): 80-032.
Posada, D. 2008. jModelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and
Evolution, 25: 1253-1256
Puorto, G.; Da Graça Salomão, M.; Theakston, D.G.; Thorpe, R.S.; Warrell, D.A.;
Wüster, W. 2001. Combining mitochondrial DNA sequences and
morphological data to infer species boundaries: phylogeography of
lanceheaded pitvipers in the Brasilian Atlabtic forest, and the status of
Bothrops pradoi (Squamata: Sepentes: Viperidae). Journal of Evolutionary
Biology, 14: 527-538.
Rambaut, A. 2009. Tree Figure Drawing Tool Version 1.3.1, Institute of Evolutionary
biology, University of Edinburgh, UK.
Räsänen, M.E.; Salo, J.S.; Kalliola, R.J. 1987. Fluvial perturbance in the western
Amazon Basin: Regulation by long-term Sub-Andean tectonics. Science, 238:
1398-1401.
76
Ray, D.A.; Dever, J.A.; Platt, S.G.; Rainwater, T.R.; Finger, A.G.; McMurry, S.T.;
Batzer, M.A.; Barr, B.; Stafford, P.J.; McKnight, J.; Densmore, L.D. 2004. Low
levels of nucleotide diversity in Crocodylus moreletii and evidence of
hybridization with C. acutus. Conservation Genetic, 5: 449-462.
Rebêlo, G.H.; Magnusson, W.E. 1983. An analysis of the effect of hunting on Caiman
crocodilus and Melanosuchus niger base on the sizes of confiscated skins.
Biological Conservation, 26: 95-104.
Rebêlo, G.H.; Lugli L. 2001. Distribution and abundance of four caiman species
(Crocodylia: Alligatoridae) in Jaú National Park, Amazonas, Brazil. Revista de
Biologia Tropical, 49: 1095-1109.
Ribas, C.C.; Joseph, L.; Miyaki, C.Y. 2006. Molecular systematics and biogeography
in the Neotropical Pyrrhura parakeets (Aves: Psittacidae) with special reference
to the picta/leucotis complex. AUK, 123: 660-680.
Roos, J.; Aggarwal, R.K.; Janke, A. 2007. Extended mitogenomic phylogenetic
analyses yield new insight into crocodylian evolution and their survival of the
Cretaceous–Tertiary boundary Molecular. Phylogenetics and Evolution, 45: 663-
673.
Ross, C.; Magnusson, W.E. 1990. Crocodilianos actuales. Ross, C.; Gamett, S.
(Eds). Crocodilos y Camanes. Facts On File, Inc. New York. p. 216-230.
Ross, J.P. 1998. Crocodiles. Status Survey and Conservation Action Plan, 2nd Edn.
IUCN Publication Gland, Switzerland.
Ruban, G.I. 1997. Species structure, contemporary distribution and status of the
Siberian sturgeon, Acipenser baerii. Enivironmental Biology of Fishes, 48: 221-
230.
77
Salisbury, S. W.; Molnar, R. E.; Frey, E.; Willis, P. M. A. 2006. The origin of modern
crocodyliforms: new evidence from the Cretaceous of Australia. Proceeding
Biology Science. 273 (1600): 2439–2448.
Salisbury, S.W.; Willis, P.M.A. 1996. A new crocodylian from the early Eocene of
south-eastern queensland and a preliminary investigation of the phylogenetic
relationships of crocodyloids. Alcheringa, 20: 179-227.
Salzburger, W.; Ewing, G.B.; Von Haeseler, A. 2011. The performance of
phylogenetic algorithms in estimating haplotype genealogies with migration.
Molecular Ecology, 20: 1952-1963.
Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York.
Smith, N.J.H. 1980. Caimans, capybaras, otters, manatees, and man in Amazônia.
Biological Conservation, 19: 177-187.
Sole-Cava, A.M. 2001. Biodiversidade Molecular e Genética da Conservação. In:
Matioli, S.R. (Ed). Biologia Molecular e Evolução. Holos, Ribeirão Preto. p. 171-
192.
Souza, O.C. 1998. Modern geomorphic processes along the Taquari River in the
Pantanal: a model for development of a humid tropical aluvial fan. PhD Thesis,
University of California, Santa Barbara. 135 pp.
Souza, W.L. 2000. Impacto Ambiental de Hidrelétricas: Uma Análise Comparativa de
Duas Abordagens. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
COPPE.
Tajima, F. 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by
DNA polymorphism. Genetics, 123: 585-595.
78
Taplin, L. 1984. Evolution and zoogeography of crocodilians: a new look at an
ancient order. In: Archer, M.; Clayton, G. (Eds). Vertebrate Evolution and
Zoogeography in Australasia. Hesperian Press, Perth. p. 361-370.
Taylor, R.W.; Turnbull, D.M. 2005. Mitochondrial DNA mutations in human disease.
Nature Reviews Genetics. 6(5): 389-402.
Thompson, J.D.; Higgins, D.G.; Gibson, T.J. 1996. Clustal W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids
Research, 22: 4673-4680.
Thorbjarnarson, J. 1992. Crocodiles. An Action Plan for their Conservation. IUCN,
Gland.
Torrente-Vilara, G. 2009. Heterogeneidade ambiental e Diversidade ictiofaunística do
trecho de corredeiras Dio rio Madeira, Rondônia, Brasil. PhD Thesis, Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Brazil.
Vasconcelos, W.; Campos, Z. 2007. Geographic variation between Pantanal caiman
(Caiman crocodilus yacare) and Amazonian caiman (Caiman crocodilus
crocodilus): First phase. Crocodile Specialist Group Newsletter, 26: 6-7.
Vasconcelos, W.R.; Hrbek, T.; Da Silveira, R.; De Thoisy, B.; Marioni, B.; Farias, I.P.
2006. Population genetic analysis of Caiman crocodilus (Linnaeus, 1758. from
South America. Genetic Molecular Biology, 21: 220-230.
Vasconcelos, W.R.; Hrbek, T.; Da Silveira, R.; De Thoisy, B.; Ruffeil, L.A.S.; Farias,
I.P. 2008. Phylogeographic and conservation genetic analysis of the black
caiman (Melanosuchus niger). Journal Experimental Zoology, 309: 600-613.
Voelz, N.J.; Zuellig, R.E.; Shieh, S.H.; Ward, J.V. 2005. The Effects of Urban Areas
on Benthic Macro invertebrates in two Colorado Plains Rivers. Environmental
Monitoring and Assessment, 101: 175-202.
79
Walsh, C.J. 2006. Biological Indicators of Stream health Using Macroinvertebrate
Assemblage Composition: A Comparison of Sensitivity to an Urban gradient.
Marine and Freshwater Research, 57: 37-47.
Weir, B.S.; Cockerham, C.C. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of
population structure. Evolution, 38: 1358-1370.
Willis, R.E. 2009. Transthyretin gene (TTR) intron 1 elucidates crocodylian
phylogenetic relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution, 54: 1049-
1054.
Willis, R.E.; McAliley, L.R.; Neeley, E.D.; Densmore, L.D. 2007. Evidence for placing
the false gharial (Tomistoma schlegelii) into the Family Gavialidae: inferences
from nuclear gene sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 43: 787-
794.
Wilkinson, M.J.; Marshall, L.G.; Lundberg, J.G. and Kreslavsky, M.H. 2010. Megafan
environments in northern South America and their impact on Amazon Neogene
aquatic ecosystems. Hoorn, C.; Wesselingh, F.P. (Eds). Amazonia - landscape
and species evolution: A look into the past. Wiley-Blackwell, Oxford. p. 162-184.
Wilson, A.C.; Cann, R.L.; George, M.Jr.; Gyllensten, K.M.; Bychowiski, V.B.H.;
Higuchi, R.G.; Palumbi, S.R.; Prager, E.M.; Sage, R.D.; Stoneking, M. 1985.
Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological
Journal of the Linnean Society. 26: 375-400.
Zucoloto, R.B.; Verdade, L.M.; Coutinho, L.L. 2002. Microsatellite DNA lirary for
Caiman latirostris. Journal of Experimental Zoology (Mol dev Evol). 294: 346-351.
