PARTICIPAÇÃO DA NEUROTRANSMISSÃO DOPAMINÉRGICA … · Catalogação da Publicação na Fonte...

MANARA BEZERRA BARBOSA COSTA DAMASCENO

PARTICIPAÇÃO DA NEUROTRANSMISSÃO

DOPAMINÉRGICA NO EFEITO HIPERLOCOMOTOR DO

NEUROPEPTÍDEO S

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.

Natal - RN

2014

MANARA BEZERRA BARBOSA COSTA DAMASCENO



NEUROPEPTÍDEO S

Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.

Orientadora: Profa. Dra. Elaine C. Gavioli

Natal – RN

2014

Catalogação da Publicação na Fonte

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Costa, Manara Bezerra Barbosa.

Participação da neurotransmissão dopaminérgica no efeito hiperlocomotor do neuropeptídeo S / Manara Bezerra Barbosa Costa. – Natal, 2014. 76f: il. Orientadora: Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.

1. Atividade locomotora - Dissertação. 2. Dopamina - Dissertação. 3. Neuropeptídeo S. - Dissertação. I. Gavioli, Elaine Cristina. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE01 CDU 615.21



NEUROPEPTÍDEO S

Manara Bezerra Barbosa Costa Damasceno

Defesa: 25/04/2014

A harmonia das leis naturais revela uma

inteligência de tal superioridade que,

comparada a ela, todo o pensamento

sistemático e a ações dos seres humanos

são uma reflexão totalmente insignificante.

Albert Einstein

AGRADECIMENTOS

Em primeiríssimo lugar, agradeço à Eterna e Superior Inteligência, a

quem chamo Deus, o idealizador, criador e mantenedor de toda informação

que rege tudo que existe. Dou graças a Ele “pois desde a criação do mundo os

atributos invisíveis de Deus, seu eterno poder e sua natureza divina, têm sido

vistos claramente, sendo compreendidos por meio das coisas criadas”

(Romanos 1:20 – Bíblia Sagrada). A Ele, meu criador, meu companheiro

ajudador, meu mantenedor e meu salvador, dou sempre graças.

Agradeço com profundo carinho e admiração à minha orientadora prof.

Dra. Elaine Gavioli, que por muitas vezes foi também amiga e conselheira.

Sou grata por me ensinar com zelo, por me confortar nos momentos de

angústia, e por se alegrar comigo nas minhas conquistas. Agradeço por todo

ensinamento concedido com humildade, seriedade e verdade. Obrigada,

professora, por ser um exemplo em tantos aspectos que nem sei contar.

Agradeço ilimitadamente à minha família. Nos últimos meses passamos

por momentos difíceis, mas vencemos e aprendemos, porque toda tempestade

é pedagógica, e graças a Deus, também é passageira. Meu esposo, Gerdian,

tem sido meu melhor amigo e meu amor. Você me deu um desafio a mais

nesse período: casar em pleno mestrado. Fui noiva, daquelas cheia de planos,

no período mais difícil de disciplinas. Qualifiquei na semana do casamento.

Tive que aprender a ser esposa, dona de casa, tomar conta de tudo e de você.

Esse desafio fez crescer em mim o significado do amor, e me deu a certeza de

que é com você que quero estar. Aos meus pais, David e Betânia, devo

gratidão eterna! Vocês me ensinaram o amor e o cuidado apesar das

dificuldades! Hoje agradeço a vocês especificamente por terem se sacrificado

por mim, pois eu me lembro das dificuldades que enfrentaram pra dar a mim e

a minhas irmãs a melhor educação possível. Portanto, amados pais, essa

conquista é de vocês! Às minhas irmãs, Yanne e Ingrid, “irmãs mais chegadas

que amigas”, vocês têm sido minhas verdadeiras amigas, me amando

independentemente das circunstâncias, isso já é mais do que mereço! Sem

vocês, minha vida seria mais difícil! Obrigada! Não posso deixar de agradecer à

minha sogra, Rose, e a meu sogro, s. Gerd, que se preocuparam comigo e me

concederam suporte quando necessário. Sei que posso contar com vocês, já

que agora também são meus pais! Muito obrigada!

Também agradeço aos meus colegas de laboratório, que muitas vezes

trouxeram leveza ao ambiente estressante de experimentos, seja com as

literalmente altas gargalhadas de Lisi, seja com as “novidades de corredor” (né

Victor?), e ainda, com os papos com as doutorandas Íris, Laila, Júlia e

Adriana sobre qualquer coisa. Não posso deixar de citar “certas pessoas”,

Décio, aquele que alegrava o lab mesmo “enchendo o saco” de todo mundo.

Muito obrigada pela amizade e companheirismo, queridos! Agradeço de

coração aquela que se chegou com amizade, incentivo e com a ajuda na parte

experimental desse trabalho: a Nataly. Muitas vezes trabalhamos juntas, e

também rimos, brigamos, choramos e isso tudo foi muito bom! Você foi

essencial, muito obrigada! Você também é meu motivo de orgulho, sei que com

você vai longe! Enfim, queridos do laboratório, citados ou não, muito obrigada!

Agradeço também a todos os professores da Psicobiologia, pelo

conhecimento adquirido.

Aos componentes da banca, prof. Dr. Marcelo Duzzioni e prof. Dr.

Judney Cavalcante, muito obrigada pela disponibilidade e contribuição para

este trabalho.

Agradeço à professora Dra. Vanessa, que além de ser um modelo, é

também uma fofa. Que honra ter você na minha banca de TCC, de

qualificação, e agora, apesar das circunstâncias não terem permitido sua

presença na minha banca, agradeço-lhe por todo incentivo e pela

disponibilidade como suplente.

8

SUMÁRIO

RESUMO .......................................................................................................... 10

ABSTRACT ...................................................................................................... 11

LISTA DE FIGURAS......................................................................................... 12

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. 14

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 16

1.1. O Sistema do Neuropeptídeo S ........................................................ 16

1.2. Ações motoras do NPS ..................................................................... 19

1.3. NPS e sistema dopaminérgico ......................................................... 20

1.4. A neurotransmissão dopaminérgica ............................................... 22

1.4.1. Síntese, envesiculamento e metabolismo da dopamina ............... 23

1.4.2. Receptores dopaminérgicos ......................................................... 26

1.4.3. Vias dopaminérgicas .................................................................... 28

2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 32

3. OBJETIVOS .............................................................................................. 33

3.1. Geral ................................................................................................... 33

3.2. Específicos ........................................................................................ 33

4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 34

4.1. Animais .............................................................................................. 34

4.2. Drogas e tratamentos farmacológicos ............................................ 34

4.3. Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular

(ICV) em camundongos .............................................................................. 36

4.4. Avaliação da atividade locomotora espontânea de camundongos

........................................................................................................................36

4.5. Delineamento experimental .............................................................. 37

4.6. Análise estatística ............................................................................. 45

9

5. RESULTADOS .......................................................................................... 46

5.1. Experimento I: Efeito da administração de NPS na atividade

locomotora dos camundongos no teste do campo aberto ..................... 46

5.2. Experimento II: Efeito do tratamento prévio com AMPT na

hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS ........................... 46

5.3. Experimento III: Efeito do tratamento prévio com reserpina na


5.4. Experimento IV: Efeito do tratamento prévio com sulpiride na


6. DISCUSSÃO ............................................................................................. 55

7. CONCLUSÃO ............................................................................................ 69

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 71

10

RESUMO

Neuropeptídeo S (NPS) é um peptídeo endógeno formado por 20 aminoácidos e é o ligante de um receptor acoplado à proteína G chamado NPSR, o qual está envolvido na modulação de várias funções biológicas centrais como locomoção, ansiedade, nocicepção, ingestão de alimento e comportamentos motivacionais. Já é conhecido que o efeito hiperlocomotor do NPS é mediado pelos receptores NPSR e parece depender da ativação do sistema adenosinérgico, dopaminérgico e do sistema peptidérgico do CRF. Considerando o pouco conhecimento acerca do envolvimento do sistema dopaminérgico na mediação do aumento da atividade locomotora induzido pelo NPS, o presente estudo objetiva investigar as ações motoras da administração intracerebroventricular (icv) de NPS em camundongos pré-tratados com α-metil-p-tirosina (AMPT, inibidor da enzima de síntese de dopamina), reserpina (inibidor do armazenamento da dopamina em vesículas) ou sulpiride (inibidor de receptores D2 de dopamina), em animais submetidos ao teste de atividade locomotora no campo aberto. Para fins de comparação, um grupo distinto de animais recebeu os mesmos pré-tratamentos acima descritos (AMPT, reserpina ou sulpiride) e o efeito hiperlocomotor do metilfenidato (inibidor da recaptação de dopamina) foi investigado no campo aberto. O NPS e o metilfenidato aumentaram a atividade locomotora dos animais. O AMPT per se não causou alteração na locomoção dos animais. Por outro lado, o AMPT reduziu parcialmente o efeito hiperlocomotor do metilfenidato, mas não foi capaz de afetar a ação hiperlocomotora do NPS. Tanto o pré-tratamento com reserpina

como com sulpiride foram capazes de inibir o efeito estimulatório do NPS, assim como o do metilfenidato. Estes achados mostram que o efeito hiperlocomotor do metilfenidato, mas não do NPS, foi afetado pela administração de AMPT. Além disso, tanto o efeito do metilfenidato quanto do NPS foram prejudicados pelos pré-tratamentos com reserpina e sulpiride. Em conjunto, sugere-se que o NPS pode promover estímulo excitatório mesmo quando a síntese de catecolaminas está prejudicada. Ainda conclui-se que o efeito hiperlocomotor do NPS e do metilfenidato depende dos estoques vesiculares de monoaminas, em particular dopamina, e da ativação do receptor dopaminérgico D2. O efeito psicoestimulante do NPS por meio da ativação do sistema dopaminérgico pode apresentar importância clínica no tratamento de doenças que envolvem a via dopaminérgica, como a doença de Parkinson e a dependência química.

Palavras-chaves: neuropeptídeo S; atividade locomotora; dopamina;

camundongo.

11

ABSTRACT

Neuropeptide S (NPS) is an endogenous 20-aminoacid peptide which binds a G protein-coupled receptor named NPSR. This peptidergic system is involved in the modulation of several biological functions, such as locomotion, anxiety, nociception, food intake and motivational behaviors. Studies have shown the participation of NPSR receptors in mediating the hyperlocomotor effects of NPS. A growing body of evidence suggests the participation of adenosinergic, dopaminergic and CRF systems on the hyperlocomotor effects of NPS. Considering that little is known about the role of dopaminergic system in mediating NPS-induced hyperlocomotion, the present study aims to investigate the locomotor actions of intracerebroventricular (icv) NPS in mice pretreated with α-metil-p-tirosine (AMPT, inhibitor of dopamine synthesis), reserpine (inhibitor of dopamine vesicle storage) or sulpiride (D2 receptor antagonist) in the open field test. A distinct group of animals received the same pretreatments described above (AMPT, reserpine or sulpiride) and the hyperlocomotor effects of methylphenidate (dopamine reuptake inhibitor) were investigated in the open field. NPS and methylphenidate increased the mouse locomotor activity. AMPT per se did not change the locomotion of the animals, but it partially reduced the hyperlocomotion of methylphenidate. The pretreatment with AMPT did not affect the psychostimulant effects of NPS. Both reserpine and sulpiride inhibited the stimulatory actions of NPS and methylphenidate. These findings show that the hyperlocomotor effects of methylphenidate, but not NPS, were affected by the pretreatment with AMPT. Furthermore, methylphenidate- and NPS-induced hyperlocomotion was impaired by reserpine and sulpiride pretreatments. Together, data suggests that NPS can increase locomotion even when the synthesis of catecholamines was impaired. Additionally, the hyperlocomotor effects of NPS and methylphenidate depend on monoamines vesicular storaged, mainly dopamine, and on the activation of D2 receptors. The psychostimulant effects of NPS via activation of dopaminergic system display clinical significance on the treatment of diseases which involves dopaminergic pathways, such as Parkinson’s disease and drug addiction.

Keywords: neuropeptide S; locomotor activity; dopamine; mice.

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de Humano, chimpanzé,

camundongo, rato, cachorro e galinha. ............................................................ 16

Figura 2 - NPS e o receptor NPSR. .................................................................. 18

Figura 3 – Esquema ilustrativo dos neurônios dopaminérgicos pré- e pós-

sinápticos mostrando o ciclo da dopamina.. ..................................................... 24

Figura 4 - Esquema das estruturas evidenciando diferenças gerais

comparativas entre receptores dopaminérgicos dos tipos D1 e D2. .................. 27

Figura 5 – Vias centrais de dopamina. ............................................................. 29

Figura 6 – Diagrama ilustrativo das vias dopaminérgicas direta e indireta. ...... 30

Figura 7 - Delineamento experimental do Experimento I.................................. 38

Figura 8 - Delineamento experimental da etapa A do experimento II. .............. 39

Figura 9 – Delineamento experimental da etapa B do experimento II. ............. 40

Figura 10 - Delineamento experimental da etapa C do experimento II. ........... 40

Figura 11 - Delineamento experimental da etapa A do experimento III ............ 41

Figura 12 - Delineamento experimental da etapa B do experimento III. ........... 42

Figura 13 - Delineamento experimental da etapa C do experimento III. .......... 43

Figura 14 - Delineamento experimental da etapa A do experimento IV. .......... 43

Figura 15 - Delineamento experimental da etapa B do experimento IV. .......... 44

Figura 16 - Delineamento experimental da etapa C do experimento IV. .......... 45

Figura 17 – Efeito da administração de NPS nas doses de 0,1 e 1 nmol e na

atividade locomotora de camundongos submetidos ao teste do campo aberto 46

13

Figura 18 – Efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e

300 mg/kg, ip, 24h após o tratamento,em camundongos submetidos ao teste do

campo aberto ................................................................................................... 47

Figura 19. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção

causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 48

Figura 20. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção

causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do

campo aberto ................................................................................................... 49

Figura 21 – Efeito da administração de reserpina nas doses de 1, 2 e 5 mg/kg,

sc, 24h,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto. ................... 50

Figura 22 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção

induzida por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 50

Figura 23 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção

causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do

campo aberto ................................................................................................... 51

Figura 24 – Efeito da administração de sulpiride nas doses de 25 e 50 mg/kg,

ip, 45 min, em camundongos submetidos ao teste do campo aberto ............... 52

Figura 25 – Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção

causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 53

Figura 26. Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção

induzida pelo NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto. . 54

Figura 27 – O ciclo sináptico.. .......................................................................... 59

14

LISTA DE ABREVIATURAS

6-OHDA – 6-hidroxidopamina

AADC – aminoácido aromático descaboxilase

AMPc – adenosina monofosfato cíclico

AMPT – alfa-metil-para-tirosina

AP – ântero-posterior

ATP – adenosina tri-fosfato

CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais

CRF – fator liberador de corticotropina

DAT – transportador de dopamina

DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético

DV – dorso-ventral

GPCR –receptores acoplados a proteína G

GABA – ácido gama-aminobutírico

Gs – proteína G estimulatória

Gq – proteína G que ativa fosfolipase C

HPLC – do inglês, high performance liquid chromatography

icv - intracerebroventricular

ip – intraperitonial

iv – intravenoso

KO – knockout

15

L-DOPA - L-3,4-dihidroxifenilalanina

MAO-B – enzima monoamina oxidase-B

ML – médio-lateral

MPTP – 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina

NAcSh - parte shell do núcleo accumbens

NMOL – nanomolar

NPS – neuropeptídeo S

NPSR – receptor do neuropeptídeo S

REL – retículo endoplasmático liso

RNAm – ácido ribonucléico mensageiro

RRP – do inglês, readily releasable pool

S – serina

sc – subcutânea

TH – enzima tirosina hidroxilase

VMAT – transportador vesicular de monoaminas

VTA - área tegmental ventral

WT – wildtype

16

1. INTRODUÇÃO

1.1. O Sistema do Neuropeptídeo S

Novos neurotransmissores ou moduladores podem ser descobertos pelo

uso da técnica da farmacologia reversa, especialmente quando tais ligantes

possuem afinidade por receptores órfãos acoplados a proteínas G (GPCRs, do

inglês G protein-coupled receptors). GPCRs órfãos são proteínas clonadas

cujos ligantes endógenos não foram ainda identificados. Usando GPCRs

órfãos, vários neuropeptídeos têm sido descobertos nos últimos anos, o que

tem ampliado a compreensão de funções particulares do cérebro e auxiliado a

revelar novos alvos terapêuticos para transtornos psiquiátricos (CIVELLI et al.,

2001). Xu e colaboradores (2004) descreveram pela primeira vez as funções

fisiológicas do Neuropeptídeo S (NPS), que foi identificado pela técnica da

farmacologia reversa. O NPS é o ligante endógeno de um GPCR deorfanizado

que foi denominado de NPSR. O NPS foi assim denominado devido à presença

de um aminoácido serina (S) na porção amino-terminal da estrutura primária

desse peptídeo, que se encontra preservada em várias espécies animais, como

mostra a Figura 1.

Figura 1 – Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de Humano, chimpanzé, camundongo, rato, cachorro e galinha. Aminoácidos divergentes da seqüência humana são mostrados em negrito. O aminoácido Serina (S) na porção N-terminal está conservado em todas as espécies que expressam o peptídeo. (XU et al., 2004)

17

O receptor NPSR é amplamente distribuido no encéfalo, enquanto a

expressão do peptídeo precursor é limitada a poucas áreas do tronco

encefálico. A expressão do RNAm do precursor do NPS no cérebro exibe uma

distribuição muito limitada, pois a maioria dos neurônios que expressam o NPS

foram encontrados em poucas regiões do tronco cerebral, a citar: núcleo

sensitivo principal do trigêmeo, núcleo parabraquial lateral e na área próxima

ao locus coeruleus (XU et al., 2007). Estudos de hibridização in situ

demonstraram que a maioria das células que expressam NPS na área do locus

coeruleus são neurônios glutamatérgicos, poucos são colinérgicos, enquanto

nenhum produz GABA. No núcleo sensitivo principal do trigêmeo, muitos dos

neurônios que expressam NPS utilizam glutamato como um neurotransmissor.

Finalmente, células positivas para NPS no núcleo parabraquial lateral co-

expressam CRF (XU et al., 2007). O NPS parece estar expresso juntamente

com neurotransmissores excitatórios e, baseado nisso, tem sido proposto que o

NPS fornece elementos excitatórios adicionais aos alvos pós-sinápticos destes

neurônios (XU et al., 2007).

Em oposição ao precursor do NPS, o NPSR é amplamente distribuído no

cérebro. De fato, altos níveis de expressão do RNAm do NPSR foram

encontrados no córtex, núcleo olfatório, tálamo, hipotálamo, amígdala e

subiculum (XU et al., 2004; 2007). Vale ressaltar que o receptor NPSR

encontra-se expresso moderadamente na substância negra e na área

tegmental ventral, o que sugere um papel modulatório desempenhado por este

sistema sobre a neurotransmissão dopaminérgica (XU et al., 2007).

O perfil da expressão do receptor NPSR sugere o envolvimento do

sistema NPS-NPSR na regulação de múltiplas funções centrais, como

18

locomoção, ciclo cicardiano, ingestão de alimentos, ansiedade, memória e

aprendizado, nocicepção, via da recompensa, entre outras funções (para uma

revisão: GUERRINI et al., 2009).

O NPSR é um típico receptor acoplado a proteína G, formado por 7

domínios transmembrana. As características farmacológicas da interação entre

NPS e NPSR foram determinadas pelo uso de linhagens celulares CHO e

HEK293 T, expressando NPSR recombinante (XU et al., 2004), nas quais,

quando o NPSR foi ativado por NPS em concentrações nanomolares, foi

induzida mobilização de cálcio intracelular, aumento dos níveis intracelulares

de AMPc e aumento na concentração intracelular de proteínas quinases

fosforiladas (Figura 2; XU et al., 2004; REINSCHEID et al., 2005), sugerindo

que o NPSR pode sinalizar via proteína Gq e Gs a fim de aumentar a

excitabilidade celular.

Figura 2 - NPS e o receptor NPSR. A ligação do NPS ao seu receptor NPSR desencadeia a síntese de AMPc intracelular via proteína G (G) por ativação da adenililciclase (AC). Além disso, a interação entre o NPS e o NPSR leva a um aumento significante da concentração de cálcio (Ca2+), devido a ativação de canais de Ca2+ da membrana plasmática e/ou do retículo endoplasmático liso (REL). Fonte: PAPE et al., 2010.

19

1.2. Ações motoras do NPS

Fisiologicamente, Xu e colaboradores (2004) demonstraram pela

primeira vez que a administração supraespinhal de NPS 0,1 nmol causou

hiperlocomoção em camundongos familiarizados ou não ao ambiente. A

duração do efeito hiperlocomotor produzido pela administração

intracerebroventricular (icv) de NPS foi de aproximadamente uma hora. Estes

resultados foram posteriormente confirmados por vários grupos de pesquisa,

tanto para camundongos (ROTH et al., 2006; LEONARD et al., 2008;

OKAMURA et al., 2008; RIZZI et al., 2008; CASTRO et al., 2009; PAÑEDA et

al., 2009), quanto para ratos (SMITH et al., 2006), mostrando que o efeito

estimulatório da atividade locomotora é robusto e consistente apesar das

diferentes condições experimentais e das espécies animais.

O envolvimento do NPSR na atividade locomotora foi demonstrado com

o uso de três antagonistas quimicamente não relacionados, o composto não-

peptídico SHA 6824 (OKAMURA et al., 2008; RUZZA et al., 2010) e os

peptídicos [D-Val5]NPS (GUERRINI et al., 2010) e [tBu-D-Gly5]NPS (RUZZA

et al., 2012). Os antagonistas foram eficazes em antagonizar o efeito

estimulatório do NPS na locomoção, mas não produziram efeito na locomoção

per se. Estes achados obtidos em diferentes condições laboratoriais e

utilizando moléculas de naturezas diferentes demonstram que a ação do

peptídeo na atividade locomotora ocorre devido à ativação do NPSR e sugerem

que o sistema endógeno de NPS não exerce um controle tônico no

comportamento motor do animal.

20

Estudos com diferentes linhagens de camundongos knockout (KO) tem

confirmado essa hipótese. Camundongos KO para o gene do

NPSR(NPSR(−/−)), não apresentaram diferenças no comportamento locomotor

em relação aos animais selvagens, e ainda, o efeito hiperlocomotor do NPS foi

observado em camundongos NPSR(+/+) mas não em camundongos

NPSR(−/−), quando injetados com NPS icv (DUANGDAO et al., 2009; FENDT

et al., 2011; RUZZA et al., 2010). Em conjunto, estes dados indicam que o NPS

produz efeito estimulatório sobre a atividade locomotora mediado pela ativação

do NPSR.

1.3. NPS e sistema dopaminérgico

Baseados no fato de o NPSR estar distribuído em várias áreas

cerebrais, incluindo a área tegmental ventral (VTA; XU et al., 2007), Mochizuki

e colaboradores (2010) propuseram o estudo do envolvimento do sistema

dopaminérgico pela via mesolímbica, que tem sua origem na VTA, na atividade

locomotora de ratos sob o efeito do NPS. A hipótese do grupo era de que a

atividade hiperlocomotora induzida por NPS pode ser mediada por ativação da

via dopaminérgica mesolímbica através da ativação do NPSR expresso na

VTA. A injeção intra-VTA de NPS causou aumento da atividade motora

horizontal e vertical em ratos de forma significativa, nas doses de 0,05 nmol e

0,5 nmol (por hemisfério), e a hiperatividade foi dose-dependente e

significativamente inibida por pré-administração local na parte shell do núcleo

accumbens (NAcSh) de sulpiride, um antagonista do receptor D2 de dopamina,

21

nas doses de 0,5 e 5 nmol (por hemisfério). Por meio de microdiálise, foi

possível mensurar e constatar o aumento significativo de metabólitos de

dopamina (DOPAC) no NAcSh. Estes resultados suportam a hipótese de que o

NPS ativa o sistema mesolímbico dopaminérgico, presumivelmente através do

NPSR localizado na VTA, estimulando a atividade motora (MOCHIZUKI et al.,

2010). Além desse estudo, Si e colaboradores (2010) investigaram o efeito do

NPS na liberação de dopamina e serotonina no córtex medial pré-frontal por

microdiálise em ratos e observaram que o NPS icv aumentou os níveis de

dopamina e de seu principal metabólito, mas não encontraram diferença nos

níveis de serotonina. Em conjunto, esses dados evidenciam a participação da

neurotransmissão dopaminérgica no efeito hiperlocomotor do NPS (SI et al.,

2010).

Estudos de diferentes grupos avaliaram a capacidade do NPS em

modular comportamentos relacionados à ativação do sistema de recompensa.

Em 2008, BADIA-ELDER e colegas concluíram que administração de NPS

aumentou a busca pela ingestão de álcool em ratos (BADIA-ELDER et al.,

2008). Já foi demonstrado também que a administração icv de NPS reintegrou

o comportamento extinto de busca por cocaína de forma dose-dependente, no

qual o NPS causou aumento do pressionamento da alavanca em níveis

equivalentes aos observados durante a auto-administração de cocaína

(CANNELLA et al., 2009; PAÑEDA et al., 2009). Em oposição a estes estudos,

Li e colaboradores (2009) relataram que o NPS bloqueou a aquisição da

preferência condicionada por lugar causada por morfina, enquanto que o NPS

per se não causou nem preferência nem aversão por lugar (LI et al., 2009).

Mais recentemente, CAO e colegas observaram que ratos pressionavam com

22

alta frequência a alavanca de auto-administração de NPS icv, o que foi

diminuído por antagonista de receptor de dopamina e de hipocretina-1(orexina-

1), concluindo-se que o NPS pode interferir com o sistema de recompensa

induzindo a procura por reforço positivo e isto parece ser mediado pelos

receptores de dopamina e de hipocretina (CAO et al., 2011).

Tendo em vista a relação intrínseca entre a dopamina e a Doença de

Parkinson, um estudo feito em nosso laboratório visou investigar o papel do

NPS no prejuízo motor de camundongos induzido pela administração de 6-

OHDA. Os danos motores induzidos pela administração de 6-OHDA foram

revertidos pelo tratamento central com NPS, sugerindo que o NPS parece

facilitar a liberação de dopamina na via nigroestriatal, o que justificaria a

melhora do desempenho motor induzida pela administração do NPS em

animais tratados com 6-OHDA. Estes dados apontam, pela primeira vez, para a

possibilidade de agonistas do receptor NPSR atuarem como agentes

terapêuticos ou adjuvantes no tratamento da Doença de Parkinson (DIDONET

et al., 2014).

1.4. A neurotransmissão dopaminérgica

Dopamina é um neurotransmissor catecolaminérgico conhecido por

regular muitas atividades neuronais e fisiológicas. Este neurotransmissor

participa do ciclo sono-vigília (DZIRASA et al., 2006), é crítico para a

motivação, recompensa e aprendizado (WISE, 2004) e modula o controle do

movimento voluntário (GRAYBIEL, 2005) (para revisão: BEST et al., 2009;

PANDEY et al., 2013). Estudos indicam que há uma regulação anormal da

23

liberação e recaptação de dopamina na síndrome de Tourette (JANKOVIC,

2001). Além disso, a dopamina parece ser essencial para mediar respostas

sexuais (HEATON, 2000). Vários transtornos comportamentais/sociais, como

alcoolismo e transtorno bipolar também parecem estar associadas com

desequilíbrio do sistema de dopamina (para revisão: BEAULIEU e

GAINETDINOV, 2011). Estudos de microdiálise têm mostrado que drogas de

abuso aumentam a dopamina extracelular e imagens cerebrais têm mostrado

uma correlação entre euforia e aumento da dopamina extracelular induzido por

psicoestimulantes (DI CHIARA, et al., 2004). Essas e outras consequências da

disfunção do metabolismo da dopamina indicam a importância da manutenção

da funcionalidade através de mecanismos homeostáticos que têm sido

atribuídos ao delicado balanço entre síntese, estoque, liberação, metabolismo e

recaptação de dopamina (BEST et al., 2009; ELSWORTH e ROTH, 1997;

GAINETDINOV et al., 1998; KIENAST e HEINZ, 2006).

1.4.1. Síntese, envesiculamento e metabolismo da dopamina

A síntese de dopamina ocorre primariamente no terminal pré-sináptico

via hidroxilação de tirosina pela enzima tirosina hidroxilase (TH), para formar L-

3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). L-DOPA é, então, descarboxilada pela

enzima aminoácido aromático descarboxilase (AADC) para produzir dopamina

(KUHN, 1983). Após a síntese, a dopamina é sequestrada do citosol e

armazenada dentro de vesículas sinápticas pelo transportador de monoaminas

vesicular (VMAT) (ERICKSON et al., 1992; LIU et al., 1992). A dopamina

vesicular é liberada na sinapse no terminal neuronal por exocitose após

estimulação (TRIFARÓ et al., 1992). A dopamina extracelular é reciclada de

volta para dentro do terminal pelo transportador de dopamina (DAT), quando é

24

também recolocada dentro das vesículas pelo VMAT ou é degradada pela

monoamino oxidase B (MAOB) para formar peróxido de hidrogênio (H2O2) e

3,4-dihidroxifeniladeildo, que é rapidamente oxidado pela aldeído

desidrogenase a ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC). A figura 3 mostra um

esquema simplificado desse processamento (para revisão: EISENHOFER et

al., 2004).

Figura 3 – Esquema ilustrativo dos neurônios dopaminérgicos pré- e pós-sinápticos mostrando o ciclo da dopamina. (SMITH et al., 1999).

Inúmeras substâncias capazes de alterar a homeostase da

neurotransmissão dopaminérgica têm sido utilizadas na pesquisa científica

básica (para revisão: BEAULIEU e GAINETDINOV, 2011). Muitas delas

simulam estados semelhantes aos transtornos que acontecem na clínica, como

na doença de Parkinson, e assim, novos alvos terapêuticos podem ser

estudados, como alternativa aos tratamentos que ainda não são satisfatórios,

ou ainda, pode-se promover entendimento mais aprofundado sobre o

funcionamento fisiológico e o mecanismo de ação dos fármacos. A depleção

25

farmacológica de catecolaminas tem sido uma ferramenta útil nesse tipo de

estudo.

A substância α-metil-para-tirosina (AMPT) é um agente de depleção

conhecido por inibir a etapa limitante da síntese de dopamina no citosol

catalizada pela TH, reduzindo a quantidade de dopamina encefálica

(PAPESCHI, 1975; SCHEEL-KRÜGER, 1971; SPECTOR et al., 1965). A

reserpina é outro instrumento utilizado na depleção de catecolaminas,

inicialmente utilizado empiricamente como agente anti-hipertensivo (FRIEDEN,

1963). A reserpina é conhecida atualmente por bloquear o VMAT, impedindo

que a dopamina seja estocada em vesículas (ERICKSON et al., 1992;

WATANABE et al., 2005). São necessárias duas bombas moleculares

separadas para o transporte da dopamina nas vesículas sinápticas. Uma

ATPase de prótons concentra prótons na vesícula, criando uma concentração

elevada de prótons, e um interior eletropositivo da vesícula. Esse gradiente é

explorado por um antiportador de prótons, o VMAT, que permite o

deslocamento de prótons ao longo do gradiente (para fora da vesícula)

enquanto efetua o transporte simultâneo de DA para dentro da vesícula, contra

o seu gradiente de concentração (GOLAN et al., 2009).

Após o estímulo neural e a consequente liberação do conteúdo das

vesículas sinápticas para o meio extracelular, o transportador de dopamina,

que fica na membrana pré-sináptica, exerce a função de recaptar a dopamina

da fenda sináptica para ser recolocada em vesículas sinápticas ou ser

metabolizada. A inibição desse processo pode ser feita pela injeção de

metilfenidato, um potente inibidor do transportador de dopamina (EMILIEN et

al., 1999). O metilfenidato é um medicamento psicoestimulante usado no

26

tratamento do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade e da

narcolepsia, embora também venha sendo utilizado com fins não terapêuticos,

por exemplo para produzir euforia, aumentar a autoestima e obter o chamado

aprimoramento neurocognitivo, diminuindo a sensação de cansaço e

aumentando o foco e a atenção, o que tem gerado extrema discussão no

âmbito social. Entretanto, o metilfenidato é uma substância que promove

robusto efeito hiperlocomotor em roedores, amplamente utilizado para estudo

de perturbações comportamentais, como por exemplo, para promover em

animais de laboratório o comportamento semelhante ao estado de mania do

transtorno bipolar (BARBOSA et al., 2011).

1.4.2. Receptores dopaminérgicos

Interações moleculares específicas determinam a especificidade e

eficácia da sinalização das vias dopaminérgicas, que são amplamente

conservadas em animais vertebrados e invertebrados. O efeito da dopamina é

transduzido através de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) presentes

na superfície das células, que são caracterizados por sete domínios

transmembranas e baseado nos perfis farmacológicos e na especificidade de

ligação ao tipo de proteína G, são classificados como do tipo D1 ou D2

(GINGRICH e CARON, 1993; MISSALE et al., 1998). Os receptores do tipo D1

sinalizam por meio de proteína G estimulatória, enquanto os receptores do tipo

D2 sinalizam por meio de proteína G inibitória (figura 5).

27

Figura 4 - Esquema das estruturas evidenciando diferenças gerais comparativas entre receptores dopaminérgicos dos tipos D1 e D2.O 3º loop intracelular de D2 é maior que o de D1, característica peculiar dos receptores acoplados a proteína G inibitória (Fonte: PANDEY et al., 2013).

Ambos os tipos de receptor de dopamina, D1 e D2, estão envolvidos no

controle da locomoção. Desde que foram identificados, observou-se que os

diferentes subtipos de receptores da dopamina possuem papeis

fisiopatológicos distintos nas vias de sinalização de disfunções (ZHANG et al.,

2007). Estes receptores têm representado alvos para o desenvolvimento de

drogas e radioligantes para tratamentos e diagnósticos por imagem.

Componentes que se ligam especificamente a certo tipo de receptor de

dopamina podem ativar ou inibir suas ações biológicas, assim como promover

um tratamento racional para o mau funcionamento da sinalização decorrente

deste subtipo de receptor (para revisão: ZHANG et al., 2007; BEAULIEU et al.,

2011).

Embora a família D1 de receptores seja mais abundante no cérebro de

mamíferos, há grande interesse terapêutico no estudo da família D2. Agonistas

do receptor D2 têm sido utilizados com sucesso para reduzir sintomas da

doença de Parkinson, enquanto que os antagonistas deste têm sido úteis no

28

tratamento da esquizofrenia e de transtornos psicóticos (para revisão, ZHANG

et al., 2007).

O sulpiride é um antagonista seletivo de receptores D2 e tem sido

classificado clinicamente como um antipsicótico atípico ou de segunda geração

(BEAULIEU e GAINETDINOV, 2011). Na pesquisa básica, a inibição do

receptor D2 por meio da administração de sulpiride tem sido uma ferramenta

oportuna para influenciar a transmissão dopaminérgica e as funções

dependentes de dopamina bloqueando essa atividade, o que auxilia o estudo

de novos compostos e distúrbios em nível sistêmico.

1.4.3. Vias dopaminérgicas

Para efeitos didáticos, sumariamente são descritas quatro vias

dopaminérgicas: mesolímbica, mesocortical, nigroestriatal e túbero-infundibular.

As vias dopaminérgicas centrais estão esquematizadas na figura 6. Os

neurônios dopaminérgicos que se originam na área tegmentar ventral formam

duas vias: a via mesolímbica, com neurônios que se projetam para regiões

subcorticais límbicas (núcleo accumbens, septo, corpo amigdalóide), que está

envolvida na regulação de emoções e motivação; e a via mesocortical, cujos

terminais se distribuem para áreas corticais límbicas, como o córtex piriforme, o

córtex entorrinal e, principalmente, para o córtex pré-frontal. Já os neurônios

dopaminérgicos hipotalâmicos que se projetam para a glândula pituitária

formam a via túbero-infundibular, cujo papel funcional é suprimir a liberação de

prolactina (para revisão: TARAZI, 2001).

Ainda, a via nigroestriatal tem origem em neurônios do mesencéfalo

provenientes da parte compacta da substância nigra (SNc). Os axônios desses

29

neurônios fornecem inervação rica em dopamina para o estriado e também, de

forma mais limitada, para outras regiões nos núcleos basais (para revisão:

RICE, PATEL e CRAGG, 2011).

O desequilíbrio das vias centrais produtoras de dopamina pode levar a

diferentes estados patológicos. Redução da dopamina no córtex pré-frontal e a

desinibição da liberação de dopamina na via mesolímbica são vistas em

pacientes esquizofrênicos (KIENAST e HEINZ, 2006). Além disso, os neurônios

dopaminérgicos do núcleo accumbens encontram-se implicados em estados de

dependência e também exercem papel nos processos de recompensa,

motivação, aprendizado e memória (para revisão: GRAYBIEL, 2005). Ainda,

perda da dopamina do estriado é a causa da perda do controle motor em

pacientes com doença de Parkinson (LOTHARIUS e BRUNDIN, 2002).

Figura 5 – Vias centrais de dopamina. Os neurônios dopaminérgicos originam-se de certo número de núcleos específicos no cérebro. Os neurônios que se originam no hipotálamo e projetam-se para a hipófise (seta azul - via túbero-infundibular) são tonicamente ativos e inibem a secreção de prolactina. Os neurônios que se projetam da substância negra para o estriado (setas em pontilhado – via nigroestriatal) regulam o movimento. Acredita-se que os neurônios dopaminérgicos que se projetam da área tegmental ventral para o sistema límbico e o córtex pré-frontal (setas pretas cheias – vias mesolímbica e mesocortical, respectivamente) desempenham papéis na regulação do humor e do comportamento. (GOLAN et al., 2009)

30

É sabido que os núcleos da base, cujos neurônios recebem projeções

dopaminérgicas da substância nigra, controlam finamente o movimento

voluntário. Os núcleos da base contêm caminhos distintos para exercer o

controle do movimento: a via direta e a via indireta. Em linhas gerais, a via

direta é a via estimulatória do movimento, enquanto a via indireta é inibitória, e

o equilíbrio de atividade entre as vias direta e indireta regula o movimento

conforme esquematizado na figura 6.

Figura 6 – Diagrama ilustrativo das vias dopaminérgicas direta e indireta. (a) A via direta (que conduz à liberação de movimento) é constituído por duas conexões GABAérgicas sucessivas, partindo do corpo estriado para o pálido interno, e do pálido interno para o tálamo. Este diagrama de fluxo sugere que o influxo excitatório (glutamato; Glu) do neocórtex para o estriado iria desinibir neurônios talâmicos. A dopamina modula o sistema principalmente no estriado, onde ativa os receptores de dopamina D1-classe e da classe D2. (b) Na via indireta (que conduz à inibição de movimento), há um passo extra após o pálido externo, de modo que o núcleo subtalâmico excita o pálido interno. (c) O equilíbrio é atingido quando estes sistemas antagonistas são combinados sob circunstâncias normais. Figura adaptada de GRAYBIEL, 2000

31

A via direta, formada por neurônios estriatais que expressam

primariamente receptores D1, projeta fibras inibitórias para o segmento interno

do globo pálido, o qual inibe tonicamente o tálamo, que, por sua vez, envia

projeções excitatórias ao córtex dando início ao movimento. Dessa maneira, a

ativação da via direta desinibe o tálamo, isto é, a via direta estimula o

movimento. A dopamina oriunda da substância negra estimula os receptores

excitatórios D1, que por sua vez, estimulam a via direta. A via indireta, formada

por neurônios estriatais que expressam predominantemente receptores D2,

projeta-se para o segmento externo do globo pálido, que, por sua vez, inibe

neurônios no núcleo subtalâmico. Os neurônios no núcleo subtalâmico são

neurônios glutamatérgicos excitatórios que se projetam para o segmento

interno do globo pálido. Em consequência dessa via em múltiplas etapas, a

ativação da via indireta desinibe os neurônios do núcleo subtalâmico, que, por

sua vez, estimulam neurônios no segmento interno do globo pálido a inibir o

tálamo, isto é, a via indireta inibe o movimento. Os receptores inibitórios do tipo

D2 presentes no estriado exercem o papel de bloquear essa via indireta,

contribuindo para a execução o movimento (para revisão: GRAYBIEL, 2000).

Dessa forma, a dopamina tem papel fundamental na locomoção, pois

age como neurotransmissor excitatório na via direta, e inibitório na via indireta,

de modo que a via nigroestriatal facilita o movimento estimulando a via que

promove o movimento e dificultando a via que inibe o movimento.

32

2. JUSTIFICATIVA

Pouca informação está disponível na literatura sobre o papel da

neurotransmissão dopaminérgica na mediação das ações biológicas induzidas

pelo NPS. Apenas um estudo comportamental destacou a participação do

neurotransmissor dopamina no efeito hiperlocomotor oriundo da administração

central de NPS em ratos (MOCHIZUKI et al., 2010). Os mecanismos pelos

quais a ativação do receptor NPSR desencadeia a estimulação das vias

dopaminérgicas centrais ainda não foram completamente compreendidos. No

presente estudo, a administração central de NPS e seu efeito comportamental

na atividade locomotora serão avaliados mediante o desafio do sistema

dopaminérgico com substâncias que interferem com a homeostase da

dopamina em diferentes níveis.

Uma vez que a ativação do receptor NPSR produz ações mais restritas,

devido ao perfil único de expressão encefálica desses receptores, em

detrimento de drogas que influenciam sistemas de neurotransmissores

clássicos e, portanto, expressos de maneira indiscriminada no cérebro, o NPS

e seu receptor tornam-se um sistema de transmissão de grande valor para

novos alvos farmacológicos que podem ser úteis no tratamento de transtornos

que sabidamente envolvem a participação do sistema dopaminérgico, tais

como doença de Parkinson, esquizofrenia e abuso de drogas.

33

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Este estudo objetivou investigar os efeitos locomotores da administração

icv de NPS em camundongos pré-tratados com substâncias mediadoras de

diferentes fases do processamento da neurotransmissão dopaminérgica.

3.2. Específicos

1. Verificar o efeito da injeção intracerebroventricular de NPS nas doses de

0,1 e 1 nmol na atividade locomotora espontânea de camundongos

avaliada no teste do campo aberto;

2. Avaliar o efeito do tratamento prévio com AMPT, um inibidor da síntese

de dopamina, na hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS

em camundongos submetidos ao teste do campo aberto;

3. Avaliar o efeito do tratamento prévio com reserpina, um inibidor do

transportador vesicular de catecolaminas, na hiperlocomoção induzida

por metilfenidato e por NPS em camundongos submetidos ao teste do

campo aberto;

4. Avaliar o efeito do tratamento prévio com o antagonista de receptor de

dopamina do tipo D2, o sulpiride, na hiperlocomoção induzida por

metilfenidato e por NPS em camundongos submetidos ao teste do

campo aberto.

34

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Animais

Para a execução deste estudo, foram empregados camundongos Swiss

machos pesando entre 30 e 35 g provenientes do biotério do Departamento de

Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os

animais foram alojados em caixas de polietileno, com livre acesso a comida e

água e foram mantidos em ciclo de 12 horas luz-escuro (6:00-18:00 h), em

ambiente climatizado. Todos os procedimentos experimentais deste plano de

trabalho foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolos Nº 001/2009 e

015/2013).

4.2. Drogas e tratamentos farmacológicos

Para a realização deste estudo, foi utilizada a forma humana do

Neuropeptídeo S (hNPS), doado pelo Prof. R. Guerrini (Dept. of Biotechnology

and Pharmaceutical Chemistry, University of Ferrara, Itália). O NPS foi

solubilizado em solução salina e administrado intracerebroventricularmente

(icv) (XU et al., 2004).

O metilfenidato (Ritalina®; Novartis Brasil; São Paulo, SP) é um inibidor

preferencial da recaptação de dopamina. O metilfenidato foi utilizado como

controle positivo dos nossos experimentos devido ao fato desta droga produzir

efeito hiperlocomotor mediado pelo neurotransmissor dopamina. O

metilfenidato foi dissolvido em solução salina e administrado por via

subcutânea (sc), 15 min antes do início dos testes comportamentais

(BARBOSA et al., 2011).

35

O inibidor da enzima tirosina hidroxilase, α-metil-p-tirosina (AMPT;

Sigma-Aldrich, San Louis, MO, USA), foi utilizado para inibir a síntese de

dopamina. A substância foi dissolvida em solução salina com 2% de Tween-80,

administrado intraperitonealmente (ip), 24 horas antes do teste do campo

aberto, cujo protocolo foi adaptado de Fuentes et al.(2010).

A reserpina (Sigma-Aldrich, San Louis, MO, USA) é um fármaco

alcalóide que se liga aos transportadores presentes nas vesículas de

armazenamento de neurotransmissores catecolamínicos (a citar a dopamina,

noradrenalina e adrenalina) e serotonina, tornando estes neurotransmissores

indisponíveis para serem liberados na fenda sináptica. A reserpina foi

solubilizada em salina com quanto bastasse de ácido clorídrico. Depois de

solubilizada, a solução teve seu pH corrigido para níveis fisiológicos através da

adição de bicarbonato de sódio. A reserpina foi administrada sc 24h antes do

teste (BISONG et al., 2010).

O antagonista seletivo de receptores D2 sulpiride (Sigma-Aldrich, San

Louis, MO, USA) foi dissolvido em solução salina com ácido clorídrico e o pH

foi controlado com bicarbonato de sódio. O sulpiride foi administrado por via ip

45 minutos antes do teste comportamental (BINFARÉ et al., 2009).

As doses de AMPT, reserpina e sulpiride foram padronizadas em nossas

condições experimentais e foram testadas de acordo com a literatura, e com o

intuito de não causar alteração na atividade locomotora dos animais quando

submetidos ao teste do campo aberto em relação aos animais controles.

36

Grupos tratados com o veículo apropriado foram utilizados

simultaneamente como forma de controle. Todas as drogas foram

administradas em um volume de 10 ml/kg de camundongo.

4.3. Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular

(ICV) em camundongos

A implantação de uma cânula no ventrículo lateral de camundongos foi

realizada em camundongos anestesiados com ketamina 100 mg/kg e xilasina

10 mg/kg, ip, com auxílio do aparelho estereotáxico. A pele dos camundongos

da região craniana foi removida para facilitar a visualização do bregma, o qual

serve de ponto de partida para a orientação das coordenadas. Uma cânula-

guia de 8 mm foi implantada unilateralmente no ventrículo lateral de acordo

com as seguintes coordenadas: AP - 0,6 mm; ML + 1,1 mm; DV - 1,0 mm (de

acordo com Paxinos e Franklin (2008)). A cânula foi fixada com acrílico. Todo o

procedimento foi executado em condições de higiene e o local da incisão foi

tratado com o agente antisséptico iodo-povidine. Três a cinco dias após a

cirurgia de implantação da cânula no ventrículo lateral, os animais foram

tratados pela via intracerebroventricular com o auxílio de uma agulha (cujo

comprimento excede 1 mm a cânula-guia implantada), que permite a

administração da droga através da cânula-guia. A agulha foi ligada a um tubo

de polietileno, que por sua vez se encontrava conectado a uma microseringa

de Hamilton. O NPS foi injetado por meio desse sistema, em volume de 2 µl

administrados na velocidade de 1 µl/minuto.

4.4. Avaliação da atividade locomotora espontânea de camundongos

37

Cinco minutos após a injeção icv de NPS ou salina, os animais foram

submetidos ao teste do campo aberto por 60 min, sendo este período dividido

em blocos de 5 min. Este teste foi realizado em uma caixa de fórmica preta

quadrada contendo quatro campos abertos medindo 40 cm x 40 cm x 40 cm

cada um, de forma que quatro animais foram filmados e avaliados

simultaneamente. Os animais foram submetidos individualmente à exploração

no aparato e durante este período tiveram sua atividade locomotora aferida

através do emprego do software Any-Maze (Stoelting, USA), usando os

seguintes parâmetros comportamentais: distância percorrida (m) e tempo de

imobilidade (s), sendo que o tempo de imobilidade só foi mostrado para os

grupos testes NPS.

No início do teste, os animais costumam explorar mais o ambiente do

campo aberto, uma vez que não estão habituados àquele local. Ao longo do

teste, existe uma tendência dos animais a permanecerem menos ativos e mais

imóveis. Uma vez que o efeito do NPS é duradouro (XU et al., 2004), neste

trabalho as sessões de teste tiveram duração de uma hora.

4.5. Delineamento experimental

Experimento I: Avaliação do efeito comportamental do NPS em camundongos

no campo aberto

A fim de buscar a dose de NPS que provocasse efeito hiperlocomotor nos

animais em nossas condições experimentais, um grupo de camundongos foi

submetido à cirurgia estereotáxica para implantação da cânula-guia no

ventrículo lateral. Depois de 3 a 5 dias de recuperação, os camundongos foram

38

administrados com salina, NPS 0,1 nmol ou NPS 1 nmol via icv por meio da

cânula-guia, e submetidos ao campo aberto 5 min após a administração (figura

7).

Figura 7 - Delineamento experimental do Experimento I.

Experimento II: Efeito do tratamento prévio com AMPT na hiperlocomoção

induzida por metilfenidato e por NPS

Etapa A: Avaliação do efeito comportamental do AMPT em camundongos

no campo aberto

Na etapa A do experimento II, demonstrada na figura 8, os camundongos

receberam a injeção de veículo ou de uma das seguintes doses de AMPT:

100, 200, 250 ou 300 mg/kg, ip. Após o período de 24 h, os animais foram

submetidos ao campo aberto. A atividade locomotora dos animais foi

acessada a fim de saber qual das doses não alterava a locomoção dos

animais em relação ao grupo controle (veículo).

39

Figura 8 - Delineamento experimental da etapa A do experimento II.

Etapa B: Efeito da administração prévia de AMPT sobre a

hiperlocomoção do metilfenidato em camundongos no campo aberto

Vinte e quatro horas antes do teste comportamental, uma parte dos

animais recebeu injeção de AMPT 250 mg/kg, ip, e a outra parte

recebeu a injeção apenas do veículo onde o AMPT foi solubilizado. No

dia do teste, parte dos animais que receberam AMPT foi administrada

com metilfenidato 5 mg/kg, sc, e a outra parte foi administrada com

veículo de metilfenidato; da mesma forma, uma parte dos animais que

haviam recebido apenas o veículo de AMPT foi injetada com

metilfenidato e o restante recebeu o veículo do metilfenidato (figura 9).

Quinze minutos após a administração de metilfenidato ou veículo, os

animais foram submetidos ao campo aberto. O metilfenidato foi

empregado como forma de controle positivo do experimento, por possuir

efeito hiperlocomotor consistente ocasionado por aumento da

disponibilidade sináptica de dopamina.

40

Figura 9 – Delineamento experimental da etapa B do experimento II.

Etapa C: Efeito da administração prévia de AMPT sobre a

hiperlocomoção do NPS em camundongos no campo aberto

Camundongos passaram por cirurgia estereotáxica para implantação da

cânula no ventrículo lateral e tiveram 3 a 5 dias de recuperação. Os

animais devidamente canulados receberam AMPT 250 mg/kg, ip, ou

veículo de AMPT, ip, e 24 h depois, receberam NPS 1 nmol ou salina,

icv, visando avaliar se a pré-administração de AMPT modifica a

atividade locomotora dos animais que receberam NPS. O esquema

dessa etapa está mostrado na figura 10 a seguir.

Figura 10 - Delineamento experimental da etapa C do experimento II.

41

Experimento III: Efeito do tratamento prévio com reserpina na hiperlocomoção


Etapa A: Avaliação do efeito comportamental da reserpina em

camundongos no campo aberto

A fim de investigar a dose de reseprina a ser empregada neste estudo,

camundongos foram administrados com as doses de 1, 2 ou 5 mg/kg de

reserpina, sc, ou ainda, veículo de reserpina. Vinte e quatro horas

depois, os animais foram submetidos ao campo aberto, conforme mostra

a figura 11.

Figura 11 - Delineamento experimental da etapa A do experimento III

Etapa B: Efeito da administração prévia de reserpina sobre a


Camundongos receberam reserpina 2 mg/kg ou veículo, por via s.c., e

vinte e quatro horas depois, foram administrados com o controle positivo

metilfenidato 5 mg/kg, s.c. ou salina, conforme esquematizado na figura

42

12. A avaliação do comportamento locomotor do animal foi acessada no

campo aberto.

Figura 12 - Delineamento experimental da etapa B do experimento III.

Etapa C: Efeito da administração prévia de reserpina sobre a


A figura 13 demonstra o esquema da etapa C. Camundongos foram

submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânula guia no

ventrículo lateral, e foram tratados 3 a 5 dias depois com reserpina 2

mg/kg, sc, ou com veículo. Após 24 h, os animais receberam NPS 1

nmol ou salina icv e foram submetidos ao campo aberto depois de 5 min,

a fim de avaliar se o tratamento com reserpina altera a atividade

locomotora dos animais que receberam NPS.

43

Figura 13 - Delineamento experimental da etapa C do experimento III.

Experimento IV: Efeito do tratamento prévio com sulpiride na hiperlocomoção


ETAPA A: Avaliação do efeito comportamental de sulpiride em

camundongos no campo aberto

Camundongos foram tratados com veículo ou sulpiride nas doses de 25

ou 50 mg/kg, ip, então, depois de 45 min, foram colocados no campo

aberto para avaliação da atividade locomotora, conforme esquematizado

na figura 14. Essa etapa visou escolher a dose de sulpiride que não

afetasse a locomoção espontânea dos animais no campo aberto.

Figura 14 - Delineamento experimental da etapa A do experimento IV.

44

ETAPA B: Efeito da administração prévia de sulpiride sobre a


Camundongos foram pré-tratados com sulpiride 25 mg/kg ou veículo, ip,

e 45 min depois, foram administrados com metilfenidato 5 mg/kg ou

veículo, sc, conforme esquematizado abaixo na figura 15. Quinze

minutos após a administração de metilfenidato ou veículo, os animais

foram submetidos ao campo aberto.

Figura 15 - Delineamento experimental da etapa B do experimento IV.

ETAPA C: Efeito da administração prévia de sulpiride sobre a


Camundongos canulados no ventrículo lateral por meio de cirurgia

estereotáxica foram utilizados. Três a 5 dias após o procedimento, eles

receberam injeção de sulpiride 25 mg/kg ou veículo, ip. Os animais

foram administrados com NPS 1 nmol ou salina, icv, 45 min depois da

administração de sulpiride ou veículo, conforme esquematizado abaixo

45

(figura 16), a fim de avaliar se a pré-administração de sulpiride provoca

alteração na hiperlocomoção causada pela administração de NPS em

camundongos submetidos ao campo aberto.

Figura 16 - Delineamento experimental da etapa C do experimento IV.

4.6. Análise estatística

Os dados foram demonstrados por média ± erro padrão da média da

distância percorrida e do tempo de imobilidade dos animais. Os grupos

controles foram tratados com veículo do pré-tratamento e do NPS, os quais

foram a referência para os grupos com diferentes pré-tratamentos. As

diferenças entre os grupos experimentais foram determinadas por ANOVA de

uma via seguida do teste de post-hoc Gabriel. O nível de significância

assumido foi para valores de p≤0,05. Para a realização das análises

estatísticas empregadas neste estudo foram utilizados os softwares GraphPad

Prism 5 e PASW Statistic 18.

46

5. RESULTADOS

5.1. Experimento I: Efeito da administração de NPS na atividade

locomotora dos camundongos no teste do campo aberto

A atividade locomotora de camundongos submetidos ao teste do campo

aberto após a administração de duas doses de NPS, a saber, 0,1 e 1 nmol, foi

acessada no experimento I. ANOVA de uma via seguida pelo teste de post hoc

de Gabriel apontou diferença estatística na distância total percorrida entre o

grupo que recebeu a dose de 1 nmol de NPS e o grupo controle (F(2,27)=13,580,

p<0,05) (figura 17). Portanto, apenas a dose mais alta de NPS promoveu ação

hiperlocomotora em nossas condições experimentais, sendo esta a escolhida

para guiar as fases seguintes deste estudo.

Figura 17 – Efeito da administração de NPS nas doses de 0,1 e 1 nmol e na atividade locomotora de camundongos submetidos ao teste do campo aberto: (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min;(b)distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo. *p<0,05 vs. controle, ANOVA, post hoc de Gabriel.

5.2. Experimento II: Efeito do tratamento prévio com AMPT na

hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS

47

O efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e 300

mg/kg na atividade locomotora de camundongos foi avaliado no teste do campo

aberto. Os animais que foram tratados com a dose de 300 mg/kg

demonstraram menor distância percorrida (F(4,37)=4,517, p<0,05) em relação ao

grupo controle, enquanto que as outras doses administradas não causaram

efeito na locomoção, como mostrado da figura 18 abaixo. A dose de 250 mg/kg

de AMPT foi a escolhida para ser usada na fase experimental por não causar

prejuízo na locomoção espontânea dos animais e por estar em conformidade

com a literatura (FUENTES et al., 2009).

Figura 18 – Efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e 300 mg/kg, ip, 24h após o tratamento,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 60 min de observação. (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min; (b) distância total percorrida. Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo. *p<0,05, ANOVA, post hoc Gabriel.

A figura 19 a seguir mostra o efeito do pré-tratamento com AMPT 250

mg/kg na atividade locomotora de animais tratados com metilfenidato 5 mg/kg e

submetidos ao teste do campo aberto. O metilfenidato per se causou

hiperlocomoção nos animais. A hiperlocomoção causada pelo metilfenidato foi

parcialmente revertida pelo pré-tratamento com AMPT, mostrando que o

comprometimento na síntese de dopamina afetou a ação hiperlocomotora de

48

metilfenidato (F(3,30)=35,968, p<0,05 metilfenidato vs. controle; p<0,05

AMPT/metilfenidato vs. metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel).

Figura 19. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto, durante 60 min de observação. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo.*p<0,05 vs. controle; #p<0,05 vs. metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel.

A figura 20 mostra o efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na

hiperlocomoção causada pelo NPS. ANOVA de uma via seguida do post hoc

de Gabriel apontou diferença estatística entre o grupo NPS em relação ao

grupo controle, bem como entre o grupo que foi administrado com a associação

AMPT/NPS em relação ao grupo controle (distância total percorrida:

F(3,43)=8,926, p<0,05 vs. controle; tempo de imobilidade total: F(3,43)=10,120,

p<0,05), porém não apontou diferença estatística entre o grupo NPS e o grupo

da associação AMPT/NPS em nenhum dos parâmetros, demonstrando que o

efeito hiperlocomotor do NPS não fora prejudicado pelo pré-tratamento com

AMPT.

49

Figura 20. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto por 60 min. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo,apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). (c) Tempo de imobilidade (s) apresentado em blocos de 5 min. (d) Tempo de imobilidade (s) acumulado durante o teste. *p<0,05 vs. Controle; ANOVA, post hoc de Gabriel.

5.3. Experimento III: Efeito do tratamento prévio com reserpina na


A figura 21 ilustra o efeito da administração de reserpina nas doses de 1,

2 e 5 mg/kg na distância percorrida (m) e no tempo de imobilidade (s) dos

camundongos durante 60 min de teste do campo aberto. ANOVA de uma via

não apontou diferença estatística entre as doses administrada. A dose

intermediária de 2 mg/kg foi escolhida para conduzir os experimentos

seguintes.

50

Figura 21 – Efeito da administração de reserpina nas doses de 1, 2 e 5 mg/kg, sc, 24h,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 60 min de observação. (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min; (b)distância total percorrida. Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo.

A figura 22 ilustra o efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na

hiperlocomoção induzida por metilfenidato. ANOVA de uma via seguida do post

hoc de Gabriel mostrou diferença significativa entre o grupo metilfenidato e o

grupo controle, assim como mostrou diferença entre o grupo

reserpina/metilfenidato em relação ao grupo metilfenidato (F(3,51)=85,227,

p<0,05), mostrando que o pré-tratamento com reserpina reduziu parcialmente o

efeito hiperlocomotor induzido por metilfenidato.

Figura 22 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção induzida por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto, durante 60 min de observação. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total

51

percorrida. Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo.*p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. Metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel.

O resultado da pré-administração de reserpina 2 mg/kg na atividade

locomotora de animais tratados com NPS está demonstrado na figura 23.

ANOVA de uma via seguida do post hoc de Gabriel apontou diferença

estatística na distância total percorrida entre o grupo reserpina/NPS e o grupo

NPS, mostrando que a reserpina provocou perda parcial do efeito

hiperlocomotor induzido pelo NPS (F(3,50)=8,46; p<0,05).

Figura 23 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto por 60 min. (a) Distância percorrida(m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). (c) Tempo de imobilidade (s) , apresentadoem blocos de 5 min. (d) Tempo de imobilidade (s) acumulado durante o teste. *p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. NPS. ANOVA, post hoc de Gabriel.

5.4. Experimento IV: Efeito do tratamento prévio com sulpiride na


52

A figura 24 mostra o efeito da administração de sulpiride nas doses de

25 e 50 mg/kg na distância percorrida (m) e no tempo de imobilidade (s) de

camundongos submetidos ao teste do campo aberto. ANOVA de uma via

apontou diferença estatística entre o grupo que recebeu a dose de 50 mg/kg

em relação ao grupo controle (F(2,25)=3,548, *p<0,05). A dose de 25 mg/kg foi a

escolhida para dar prosseguimento ao estudo por não causar alteração na

atividade locomotora dos animais.

Figura 24 – Efeito da administração de sulpiride nas doses de 25 e 50 mg/kg, ip, 45 min, em camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 60 min de observação. (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min, (b) distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo. *p<0,05 vs. Controle. ANOVA, post hoc de Gabriel.

O efeito da administração de sulpiride em animais tratados com

metilfenidato está demonstrado nos gráficos da figura 25. O pré-tratamento

com sulpiride inibiu de forma parcial a hiperlocomoção induzida por

metilfenidato, conforme apontado pela ANOVA de uma via seguida de post hoc

de Gabriel (F(3,37)=40,202, p<0,05).

53

Figura 25 – Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto, durante 60 min de observação. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo.*p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. Metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel.

Os gráficos da figura 26 abaixo apresentam o efeito do pré-tratamento

com sulpiride na distância percorrida (m) e no tempo de imobilidade (s) dos

animais tratados com NPS e submetidos ao teste do campo aberto. ANOVA de

uma via seguida do teste de post hoc de Gabriel apontou diferença estatística

entre o grupo tratado com sulpiride/NPS e o grupo tratado somente com NPS

(distância total percorrida: F(3,43)=9,932, p<0,05 para NPS vs. controle e

sulpiride/NPS vs. NPS; tempo de imobilidade: F(3,43)=13,363, p<0,05 para NPS

vs. controle e sulpiride/NPS vs. NPS).

54

Figura 26. Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção induzida pelo NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto por 60 min. (a) Distância percorrida(m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). (c) Tempo de imobilidade (s) apresentado em blocos de 5 min. (d) Tempo de imobilidade (s) acumulado durante o teste. *p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. NPS. ANOVA, post hoc de Gabriel.

55

6. DISCUSSÃO

Dados da literatura apontam para um efeito hiperlocomotor consistente

produzido pela administração de NPS em roedores. No entanto, pouca

informação está disponível sobre o mecanismo pelo qual o NPS promove ação

psicoestimulante. Assim, considerando que os fármacos psicoestimulantes

clássicos, como anfetaminas, cocaína e metilfenidato, promovem ação

mediada pelo incremento da neurotransmissão dopaminérgica, o presente

estudo visou investigar o papel da neurotransmissão dopaminérgica no efeito

hiperlocomotor do NPS. Para tanto, inicialmente verificou-se o efeito da

administração icv de NPS bem como do metilfenidato, administrado por via

sistêmica, em camundongos em nossas condições experimentais.

No experimento I deste estudo, foram testadas as doses de NPS que

causariam efeito hiperlocomotor em nosso ambiente de experimentação, e

conforme mostrado na figura 17, a dose que produziu efeito hiperlocomotor

consistente e duradouro foi a de 1 nmol de NPS. O efeito psicoestimulante da

administração central de NPS (icv) em roedores já foi observado em vários

laboratórios, e em diversas doses, variando entre 0,07 nmol (LEONARD et al.,

2008) e 1 nmol (RIZZI et al., 2008). A dose de 0,1 nmol foi utilizada em

diferentes condições experimentais e, na maioria dos estudos publicados na

literatura, esta dose promoveu efeito hiperlocomotor tanto em animais naive

quanto naqueles familiarizados ao ambiente, com duração de efeito de

aproximadamente uma hora (XU et al., 2004; ROTH et al., 2006; RIZZI et al.,

2008; CASTRO et al., 2009; JÜNGLING et al., 2009).

56

Estudos que utilizaram antagonistas do receptor NPSR mostraram que o

efeito psicoestimulante do NPS se dá exclusivamente por meio da ativação do

receptor NPSR, uma vez que a administração de antagonistas de NPSR não

mostrou efeito per se na atividade locomotora dos animais (GUERRINI et al.,

2010; OKAMURA et al., 2008; RUZZA et al., 2010, 2012). Outros estudos

utilizando camundongos knockout (KO) para o receptor NPSR observaram que

animais KO que receberam NPS via icv não apresentaram hiperlocomoção e

exibiram comportamento indistinguível de animais wildtype (WT) ou de animais

KO que receberam administração de veículo (DUANGDAO et al., 2009; FENDT

et al., 2011; RIZZI et al., 2012). Tomados em conjuntos, estes dados sugerem

que o sistema do NPS não controla de forma tônica a atividade locomotora e

promove seu efeito psicoestimulante por meio da ativação do receptor NPSR.

Para dar prosseguimento a discussão dos dados aqui descritos, foi útil o

emprego de animais tratados com metilfenidato, que é considerada uma droga

psicoestimulante clássica. O metilfenidato possui mecanismo de ação

conhecido, interferindo com o turnover de dopamina por inibir os recaptadores

desse neurotransmissor (GATLEY et al., 1999), permitindo que as moléculas

de dopamina fiquem mais tempo disponíveis na fenda sináptica, livres para

ativar receptores dopaminérgicos. Gatley e colaboradores (1999) fizeram um

estudo de avaliação da ocupação do transportador de dopamina após injeção

intravenosa de metilfenidato e cocaína em camundongos, e observaram que

doses de 1 mg/kg de ambas as substâncias foram associadas com ocupação

de cerca de 80% dos transportadores no estriado, 5 minutos depois da injeção,

e isso causou aumento da atividade locomotora dos animais, sendo que o

metilfenidato produziu ação estimulatória mais pronunciada que a cocaína.

57

Neste estudo, por se tratar de um agente psicoestimulante clássico, o efeito

hiperlocomotor do metilfenidato foi avaliado em animais pré-tratados com as

mesmas substâncias que foram administradas aos grupos experimentais de

NPS, como o AMPT, a reserpina e o sulpiride.

Na fase experimental II, na etapa A, foi avaliado o efeito do pré-

tratamento com a dose de AMPT, 250 mg/kg em animais tratados com

metilfenidato e NPS (figuras 19 e 20). Nesta fase do estudo, foi observado que

o tratamento prévio com AMPT reduziu o efeito estimulatório do metilfenidato,

mas não causou alteração na hiperlocomoção promovida pelo NPS. Espera-se

que com o tratamento com AMPT 24 h antes da administração de metilfenidato

e do teste do campo aberto, feito na etapa B, tenha ocorrido uma inibição

provisória da síntese de catecolaminas, reduzindo os estoques de dopamina e

noradrenalina “recém-sintetizadas” e não necessariamente citosólicos. Logo,

sendo a dopamina o neurotransmissor principal responsável por causar

hiperlocomoção quando os animais são tratados com metilfenidato, acredita-se

que a disponibilidade reduzida de dopamina “recém-sintetizada” devido ao

bloqueio da enzima tirosina hidroxilase afetou o efeito estimulante do

metilfenidato, reduzindo-o.

A redução do efeito hiperlocomotor do metilfenidato em animais pré-

tratados com AMPT não está de acordo com a literatura. De fato, Finn e

colegas (1990) mostraram que o pré-tratamento com AMPT per se,

administrado em duas doses de 50 mg/kg, 6 h e 2 h antes do teste, não

apresentou efeito na atividade locomotora de ratos e também não afetou o

efeito hiperlocomotor produzido por nenhuma das doses de metilfenidato

administradas (1-30 mg/kg) (FINN et al., 1990). O mesmo protocolo de

58

administração de AMPT (50 mg/kg, 6h e 2h antes da decaptação) foi utilizado

para contagem de catecolaminas e foi observada redução nos conteúdos de

dopamina e noradrenalina de 52% e 37%, respectivamente, em relação aos

animais controles (FINN et al. 1990). Portanto, pode-se concluir que a

administração de AMPT em doses e tempos de pré-tratamento bem menores

que as utilizadas no presente estudo afetaram significativamente os níveis de

monoaminas no encéfalo. Entretanto, neste mesmo estudo, os autores

mostraram que o pré-tratamento com AMPT produziu um robusto bloqueio da

estimulação da atividade locomotora de ratos tratados com anfetamina. Diante

desses achados, os autores concluíram que o metilfenidato, diferente da

anfetamina, tinha seu efeito estimulante baseado nos estoques de dopamina

vesicular (mas não citosólica). Ainda, conclui-se que a dopamina “recém-

sintetizada” e livre no citosol tem importância no efeito estimulatório produzido

pela anfetamina. Em acordo com esta hipótese, estudos apontam que a

anfetamina libera dopamina para o espaço extracelular por meio da inversão da

função do transportador de dopamina (para revisão: ESPAÑA e JONES, 2014).

No presente estudo, a dose de AMPT administrada e o tempo de sua

administração podem ter favorecido a redução da dopamina citosólica, mas

também vesicular, o que contribuiria para reduzir o efeito hiperlocomotor do

metilfenidato, haja visto que esse efeito parece depender somente dos níveis

de dopamina vesicular. De fato, o emprego de altas doses de AMPT (250

mg/kg) têm por objetivo induzir um estado semelhante ao Parkinson em

camundongos mutantes para o transportador da dopamina (FUENTES et al.,

2009).

59

Evidências apontam que a dopamina vesicular está separada em 3

pools: o pool “prontamente liberável” (readily releasable pool – RRP, que sofre

exocitose a estimulação moderada), o pool de reciclagem (que reabastece o

RRP) e o pool de reserva (que constitui cerca de 80 % das vesículas e é

mobilizado em períodos longos de estimulação) (NEVES e LAGNADO, 1999;

ORTIZ et al., 2011; RIZZOLI e BETZ, 2005). As vesículas que estocam

neurotransmissores nas sinapses químicas participam de um ciclo de

reciclagem (figura 4; para revisão, SUDHOF, 2004). Sudoff e colaboradores

(2004) propuseram um modelo de reciclagem e re-preenchimento de vesículas

por meio de duas vias: uma via rápida, quando as vesículas permanecem

ligadas a membrana pré-sináptica e estão prontas para liberar os

neurotransmissores novamente, e uma lenta, envolvendo endocitose, conforme

esquematizado na figura 27 (SUDHOF, 2004).

Figura 27 – O ciclo sináptico. Vesículas sinápticas são preenchidas com neurotransmissores por transporte ativo (passo 1) e formam um aglomerado de vesículas que podem representar o pool de reserva (passo 2). Vesículas cheias

ancoram na zona ativa (passo 3), onde elas passam por uma reação de fusão (passo 4) que deixam elas prontas para uma abertura de um poro de fusão desencadeado por

60

Ca2+ (passo 5). Depois da abertura do poro de fusão, as vesículas sinápticas sofrem endocitose e se reciclam por diferentes vias: reutilização local (passo 6), reciclagem rápida em intermediário endossomal (passo 7), ou endocitose mediada por clatrina (passo 8) com reciclagem via endossomo (passo 9). Os passos na exocitose estão indicados por setas vermelhas e os passos de endocitose e reciclagem por setas amarelas. Figura adaptada de SUDHOF, 2004.

De acordo com essa teoria, pode-se propor que quando ocorre a inibição

reversível da enzima produtora de dopamina por meio da administração de

AMPT, os estoques de dopamina continuam sendo suficientes para

manutenção basal das funções motoras, de modo que não é observado

qualquer estado hipolocomotor nos animais, embora estejam com a reposição

de dopamina recém-sintetizada deficiente. Cabe ressaltar que apesar do pré-

tratamento com AMPT ter prejudicado o efeito hiperlocomotor do metilfenidato,

nenhuma alteração da ação do NPS foi observada, sugerindo que

possivelmente o efeito hiperlocomotor do NPS não dependa do pool de

vesículas dopaminérgicas e noradrenérgicas possivelmente afetadas por este

protocolo de tratamento do AMPT. Experimentos que visam inibir a atividade da

enzima tirosina hidroxilase e, consequentemente, reduzir especificamente os

níveis citosólicos de dopamina, como através da administração de AMPT em

doses menores e com menores períodos de pré-tratamento, são fundamentais

para verificar se o efeito hiperlocomotor do metilfenidato e NPS é dependente

dos estoques citosólicos de catecolaminas. .

A proposição de que nos neurônios dopaminérgicos existem dois tipos

de dopamina é para fins didáticos. Sugere-se que a dopamina recém-

sintetizada ou citosólica é sensível ao AMPT (BESSON et al., 1969), e aquela

guardada em vesículas, é sensível à reserpina (ARBUTHNOTT et al., 1990). A

reserpina afeta todos os estoques de dopamina vesicular, deixando intacto o

61

compartimento de dopamina que não é guardado em vesículas, ou seja, aquele

disponível no citosol. Propõe-se que em situação de emergência, como aquela

durante estimulação elétrica de alta frequência nas vias dopaminérgicas,

ambos os estoques de dopamina são mobilizados (MICHAEL et al., 1987).

A fim de avaliar a participação dos estoques vesiculares na

hiperlocomoção causada por NPS, no experimento III, a reserpina, substância

que prejudica o armazenamento de catecolaminas em vesículas, foi utilizada

como pré-tratamento. Os neurotransmissores que estão contidos em vesículas

são liberados na fenda sináptica para atingirem seus respectivos receptores e

produzir uma resposta neuronal. Em resposta à sinalização gerada pelo

impulso nervoso, ocorre a fusão entre a membrana da vesícula e a membrana

pré-sináptica, liberando no espaço sináptico os neurotransmissores estocados.

A dopamina é uma das catecolaminas que teve o processo de armazenamento

em vesículas prejudicado nos animais que receberam injeção de reserpina, 24h

antes do tratamento com metilfenidato ou NPS. Thomas e colaboradores

(2008) realizaram um trabalho em que a administração de reserpina foi feita

usando um protocolo muito próximo ao que foi feito no presente estudo, 2,5

mg/kg, ip, 24 h de pré-tratamento em camundongos, e eles encontraram que a

reserpina causou a perda quase total de dopamina do estriado, diminuindo o

conteúdo deste neurotransmissor em até 97% (THOMAS et al., 2008).

A capacidade tanto do metilfenidato quanto do NPS em causar efeito

hiperlocomotor foi reduzida após o tratamento prévio com reserpina, como

mostram os dados das etapas B e C do experimento III (figuras 22 e 23); porém

cabe ressaltar que o pré-tratamento com reserpina não inibiu completamente o

efeito hiperlocomotor do metilfenidato e nem do NPS. Nossos achados estão

62

de acordo com os estudos de Scheel-Kruger (1971) que mostrou que altas

doses de reserpina (7,5 mg/kg, 18 h) inibem completamente o efeito

hiperlocomotor de metilfenidato em ratos, enquanto que baixas doses (1 mg kg)

só reduzem esse efeito parcialmente.

É esperado que devido ao efeito estimulante do NPS, ao ativar o

receptor NPSR, ocorra elevação do Ca+2 citoplasmático (PAPE et al., 2010),

promovendo consequentemente estimulação intracelular e inclusive liberação

de vesículas de neurotransmissores. Porém, supõe-se que o tratamento prévio

com reserpina tenha reduzido a quantidade de monoaminas estocadas em

vesículas, o que pode, por consequência, afetar o efeito hiperlocomotor do

NPS. Todavia, com os dados oriundos do pré-tratamento com reserpina não

podemos afirmar que dopamina é o único neurotransmissor envolvido na

mediação do efeito estimulante do NPS. Cabe considerar também uma

possível participação dos neurotransmissores serotonina e noradrenalina nesse

efeito. No entanto, é importante mencionar que as drogas estimulantes

atualmente conhecidas, como as anfetaminas e cafeína, promovem sua ação

mediada pela ativação da neurotransmissão dopaminérgica e bloqueio de

receptores adenosinérgicos, respectivamente (SCHEEL-KRÜGER, 1971; FINN

et al., 1990). Considerando que o efeito psicoestimulante do metilfenidato é

dependente do estoque dopaminérgico sensível à reserpina, pois depende da

dopamina que é liberada na fenda sináptica, é possível dizer que, de fato, o

tratamento com reserpina nas nossas condições experimentais tenha reduzido

a quantidade de dopamina que teve acesso ao interior das vesículas de

dopamina, haja visto que o metilfenidato teve seu efeito prejudicado.

63

Não há relato na literatura sobre a atuação do NPS especificamente em

pools vesiculares de dopamina, mas aqui neste estudo encontrou-se evidência

de que a atuação de NPS depende do estoque de dopamina vesicular, uma

vez que a inibição do processo de envesiculamento promovido pelo tratamento

com reserpina impediu que o NPS produzisse efeito hiperlocomotor nos

camundongos. No entanto, conforme já discutido, a inibição prévia da síntese

de dopamina por meio da administração de AMPT não inibiu o efeito do NPS,

evidenciando que o pool de dopamina “recém-sintetizada”, conforme o

protocolo de pré-tratamento com AMPT aqui utilizado, parece não ser relevante

para o aumento da atividade locomotora do NPS.

A fim de avaliar a participação dos receptores D2 dopaminérgicos no

efeito hiperlocomotor do NPS, foi utilizado o sulpiride como pré-tratamento no

experimento IV, devido ao seu papel de antagonista seletivo do receptor D2. O

receptor D2 de dopamina é modulador da própria transmissão dopaminérgica, e

participa da via indireta de coordenação do movimento. Os receptores

dopaminérgicos estão envolvidos em muitas funções, mas estão fortemente

comprometidos com a coordenação dos movimentos. Os receptores

dopaminérgicos do tipo D2 são predominantemente autorreceptores que estão

envolvidos na regulação pré-sináptica da taxa de disparo neuronal, bem como

no controle da síntese e da liberação de dopamina (BEAULIEU e

GAINETDINOV, 2011).

Os receptores D1 e D2 estão presentes na substância nigra, estriado e no

núcleo accumbens. O estriado é um dos principais componentes dos núcleos

basais, responsáveis pelo controle do movimento. A importância da liberação

de dopamina no estriado é evidente a partir das dificuldades motoras

64

apresentadas por pacientes com doença de Parkinson, a qual é caracterizada

por uma perda acentuada de neurônios nigroestriatais. A dopamina liberada no

estriado controla o movimento por duas vias, a direta e a indireta, que já foram

comentadas neste trabalho. Vale relembrar que o receptor D2 de dopamina

está expresso na via indireta, e a ativação desta se faz importante no controle

voluntário do movimento, tanto quanto a via direta, onde estão presentes os

receptores do tipo D1 (ELSWORTH e ROTH, 1997; GRAYBIEL, 2000;

BEAULIEU e GAINETDINOV, 2011).

Na primeira etapa do experimento IV do presente estudo (figura 24),

observou-se que a dose escolhida de sulpiride, 25 mg/kg, não causou alteração

da atividade locomotora per se. Na segunda etapa, a administração de sulpiride

antecedida à administração de metilfenidato reduziu o efeito hiperlocomotor

deste (figura 25).

De acordo com um estudo feito por Koek e Colpaert (1993), vários

antagonistas dopaminérgicos, seletivos ou não, inibiram de forma dose-

dependente os efeitos comportamentais (movimentos estereotipados e

hiperlocomoção) causados por metilfenidato em ratos (KOEK e COLPAERT,

1993). Outro estudo mostrou que a buspirona, agonista parcial de receptor de

serotonina 5-HT1A e antagonista de receptores D2 de dopamina, inibia os

comportamentos induzidos por metilfenidato em ratos, inclusive a

hiperlocomoção, e esse efeito era devido à sua atividade em receptores D2,

uma vez que a administração de um antagonista de serotonina não inibiu essa

ação da buspirona (KLEVEN et al., 1996).

O efeito do NPS mediante a pré-administração de sulpiride foi avaliado

na terceira etapa do estudo. O sulpiride administrado sistemicamente foi capaz

65

de inibir o efeito hiperlocomotor induzido pela administração central de NPS.

Dados da literatura mostram que a administração de NPS diretamente na área

tegmental ventral não promoveu efeito hiperlocomotor quando sulpiride foi

administrado no núcleo accumbens de ratos (MOCHIZUKI et al., 2010),

mostrando que a ativação da via dopaminérgica mesolímbica participa do efeito

do NPS na intensificação da locomoção.

No presente estudo, sulpiride foi administrado sistemicamente, na dose

de 25 mg/kg, 45 min antes da administração de metilfenidato ou NPS e

submissão ao teste. Embora o grupo tenha encontrado evidência da

participação da via mesolímbica no efeito hiperlocomotor do NPS, visto que as

administrações de NPS e sulpiride foram feitas na área tegmentar ventral e no

núcleo accumbens, respectivamente, a via nigroestriatal constitui a maior via da

transmissão dopaminérgica, possuindo cerca de 80% dos neurônios

dopaminérgicos. Além disso, esta via está completamente relacionada com

coordenação do movimento, uma vez que a perda desses neurônios está

relacionada à doença de Parkinson, uma das doenças degenerativas centrais

mais incapacitantes. Tendo em vista que a substância nigra, de onde partem os

neurônios dopaminérgicos da via, apresenta receptores NPSR, não se pode

descartar a participação desta via na excitação da atividade locomotora

promovida por NPS.

Visando investigar especificamente a participação da via nigroestriatal

no efeito hiperlocomotor do NPS, seriam úteis testes experimentais para

detecção local de monoaminas em decorrência do tratamento com NPS. O

modo mais comum de detecção de monoaminas é através de técnicas

eletroquímicas ou de microdiálise. Em técnicas eletroquímicas, com a ajuda de

66

microeletrodos implantados no cérebro, pode-se detectar de forma específica o

aumento de determinado neurotransmissor, no caso, a dopamina. A técnica de

microdiálise baseia-se no implante encefálico de sondas que recolhem

amostras do conteúdo extracelular, e este conteúdo é posteriormente separado

para detecção de substâncias por cromatografia líquida de alta performance

(HPLC, do inglês, high performance liquid chromatography) (PERRY, LI e

KENNEDY, 2009). Portanto, o emprego destas técnicas de detecção de

dopamina pode gerar resultados interessantes sobre a participação direta da

dopamina na mediação do efeito hiperlocomotor do NPS.

Outros dados da literatura suportam a participação da neurotransmissão

monoaminérgica, em particular dopaminérgica e serotoninérgica, na mediação

das ações induzidas por NPS. Si e colaboradores (2010) avaliaram o efeito da

administração central (icv) de NPS na liberação de dopamina e serotonina no

córtex medial pré-frontal por meio de microdiálise seguida de HPLC com

detecção eletroquímica para analisar as mudanças de dopamina, serotonina e

seus metabólitos extracelulares in vivo. Estes autores observaram por meio

dessa técnica que os níveis extracelulares de dopamina e de seus metabólitos

aumentaram no córtex pré-frontal de forma dose-dependente, enquanto que

não houve efeito significativo na transmissão serotoninérgica. Diante destes

dados, os autores defendem que o NPS pode aumentar a síntese de dopamina

nos neurônios pré-sinápticos, ou simplesmente aumentar o turnover de

dopamina, incluindo a liberação e a recaptação deste neurotransmissor (SI et

al., 2010). No entanto, na contramão da hipótese aqui proposta, Raiteri e

colegas (2009) demonstraram, através da técnica in vitro de sinaptossomas em

córtex frontal de camundongos, que o NPS inibiu fracamente a liberação de

67

dopamina dos sinaptossomas, enquanto que, neste mesmo estudo, o NPS, em

baixas concentrações (na faixa picomolar), inibiu a liberação dos

neurotransmissores serotonina e noradrenalina (RAITERI et al., 2009). O

presente estudo está baseado nessas hipóteses dos autores supracitados, os

quais apoiam a proposição da participação da dopamina no efeito

hiperlocomotor do NPS. Aqui neste estudo, buscou-se avaliar o comportamento

de camundongos frente à manipulação farmacológica do funcionamento da

neurotransmissão dopaminérgica por meio de substâncias que inibem alguma

das etapas limitantes do trajeto da dopamina no neurônio dopaminérgico,

compreendendo a síntese, o estoque e a ativação de receptores de dopamina.

Outros mecanismos de ação, além do dopaminérgico, já foram

propostos para explicar o efeito hiperlocomotor do NPS. Pañeda e

colaboradores (2009) demonstraram que o comportamento hiperlocomotor

induzido pelo NPS em camundongos foi prevenido quando os animais foram

previamente tratados com o antagonista do receptor CRF1 e também quando o

NPS foi administrado em camundongos knockout para o receptor CRF1.

Posteriormente, foi demonstrado o papel do sistema adenosinérgico na

hiperlocomoção induzida por NPS (BOECK et al., 2010). A administração de

antagonistas não-seletivos e seletivos para o receptor A2A inibiu o efeito

hiperlocomotor dos animais. No entanto, a administração do antagonista

seletivo para o receptor A1 aumentou a distância percorrida pelos animais

tratados com NPS (BOECK et al., 2010). Além disso, Pacheco e colaboradores

(2011) observaram a dependência do efeito hiperlocomotor induzido pelo NPS

da enzima ecto-5´-nucleotidase, responsável pela geração de adenosina a

partir do ATP. Em conjunto, estas evidências suportam a participação dos

68

sistemas adenosinérgico e peptidérgico do CRF na mediação do efeito

hiperlocomotor do NPS.

Os dados aqui apresentados trazem evidências que reforçam a

participação do sistema dopaminérgico no efeito psicoestimulante do NPS. O

sistema dopaminérgico tem sido alvo de discussão devido a vários motivos. Os

neurônios dopaminérgicos estão envolvidos criticamente em várias funções

vitais desenvolvidas pelos sistemas centrais incluindo movimento voluntário,

ingestão de alimento, reforço, sono, atenção, memória e aprendizado entre

outras tarefas. Devido aos problemas sociais e clínicos envolvidos no

desequilíbrio das vias dopaminérgica, especialmente no abuso de drogas,

pelas propriedades de reforço exercidos pela dopamina, e na doença de

Parkinson, onde há degeneração irreversível de neurônios dopaminérgicos,

esse sistema tem sido estudado intensivamente a fim de buscar novas

propostas para tratamentos com efeitos colaterais mínimos. O envolvimento do

sistema dopaminérgico nas ações promovidas pelo NPS candidatam o receptor

NPSR como alvo farmacológico para novos antiparkinsonianos, por exemplo,

embora deva ser considerado a dependência química como potencial efeito

adverso.

69

7. CONCLUSÃO

No presente estudo observou-se que, em nossas condições de

experimentação, o efeito hiperlocomotor do NPS, revelado no aumento da

distância percorrida e na redução do tempo de imobilidade de camundongos

submetidos ao campo aberto, foi presente em animais tratados com a dose de

1 nmol, mas não com doses mais baixas.

O efeito hiperlocomotor do NPS não foi afetado em camundongos que

foram previamente administrados com AMPT, inibidor da síntese de dopamina,

administrado 24 h antes da administração de NPS. Esse pré-tratamento

diminuíu o efeito estimulante do metilfenidato, sugerindo que a ação

hiperlocomotora do metilfenidato, mas não do NPS, dependa dos estoques de

catecolaminas “recém-sintetizadas”.

Foi encontrado também que o efeito do NPS foi prejudicado pelo tratamento

prévio com reserpina (inibidor da captação da monoaminas pelas vesículas

sinápticas) e sulpiride (antagonista de receptores dopaminérgicos D2), assim

como o foi prejudicado o efeito do metilfenidato, que foi parcialmente inibido.

Esses dados propõem que as monoaminas, em particular a dopamina, contidas

em estoques vesiculares, bem como a ativação dos receptores dopaminérgicos

D2 são necessários para a manutenção da hiperlocomoção promovida por NPS

e metilfenidato.

Tomados em conjunto, esses dados apontam para novas evidências da

participação do sistema dopaminérgico central no efeito hiperlocomotor do

NPS. Esses resultados reafirmam a potencialidade do sistema do NPS em ser

70

candidato para novos alvos terapêuticos, como no tratamento da doença de

Parkinson, porém, para isso, ainda ficam outros questionamentos que serão

discutidos em estudos futuros.

71

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PARTICIPAÇÃO DA NEUROTRANSMISSÃO DOPAMINÉRGICA … · Catalogação da Publicação na Fonte...

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