Patologia molecular: do gen ótipo ao fen ótipo · A maioria das mutações da 21-hidroxilase...

Patologia molecular: do Patologia molecular: do

gengenóótipo ao fentipo ao fenóótipotipo

Genética Médica

Henriqueta Coimbra Silva

6044

5135 68

22 anos

Cancro da mama

Cancro do ovário

Cancro da mama

Diagnóstico pré-sintomático e de portadoresPesquisa de mutações constitucionais

Medicina preventiva e personalizada

controlo

doente

??Coreia de Huntington

Síndroma de X Frágil

??

◨◨ ◑◑

Diagnóstico pré-sintomático e de portadoresPesquisa de mutações constitucionais

Fibrose quística

Diagnóstico de mutações somáticas no cancro

RAS

RAF

MAP cinases

EGFR

MEKK1

RACGRB2

SOS

membrana celular

Identificação de mutações do KRAS e EGFR: identificação de alvos terapêuticos; avaliação

prognóstica e selecção terapêutica

Patologia molecular: correlaçãogenótipo-fenótipo

Objectivos:

1. Identificar e descrever os diversos tipos de mutações

2. Descrever as características das sequências associadas a elevada taxa de mutação

3. Explicar a correlação genótipo -fenótipo

1. Tipo de Mutações

Inserção com frameshiftVal-Lys-Gly-Cys-CAA TTT CCG ACG A

Delecção com frameshiftVal-Arg-Leu-...stopCAA _TC CGA CGA...

Mutação nonsenseValCAA ATC CGA CGA

Mutação missenseVal-Glu-Ala-AlaCAA CTC CGA CGA

Mutação sinónimaVal-Lys-Ala-AlaCAA TTT CGA CGA

NormalVal-Lys-Ala-AlaCAA TTC CGA CGA

ResultadoAminoácidosDNA

Classifique quanto ao tipo de mutação:

1. Tipo de mutações: mutação nonsense

Gene normal Gene mutado

Transcrição Transcrição

Tradução

Interrupção da tradução

Codão stop

Formação de peptídeo truncado, não funcionalFormação de peptídeo

completo

• mRNA instável → degradação → ausência de síntese de proteína

• Polipeptídeo truncado com alguma função

• Polipeptídeo que interage com outras proteínas

Sequência da cadeia beta normal

Delecção de AA

frameshift Codão stop

Mutação do gene da ββββ-globina associada a ββββ-talassémia

1. Tipo de mutações: mutação com frameshift

Nonsense Mediated Decay: mecanismo que detecta codõesSTOP prematuros.

Actua ao nível do mRNA de modo a impedir a síntese de proteínas truncadas.

Só detecta os codões stop situados a > 50 nucleótidos a montante do local de splicingseguinte

1. Tipo de mutações: mutação missense

A substituição do aminoácido éconservadora?

A mutação está numa região conservada do ponto de vista evolutivo?

A mutação está em algum domínio funcionalmente importante da proteína?

Outros critérios...

Mutação do codão 13 do gene KRAS (GGC>GAC) num cancro do pulmão

Gli13Asp (G13D)

H – CH - COOH

NH2

HOOC - CH2– CH - COOH

NH2

Glicina; grupo I Ácido aspártco; grupo IV

Distância fisicoquímica entre pares de aminoácidos

Tabela de Grantham, compara os aminoácidos quanto à polaridade, volume molecular e composição química.

Frequentemente associam-se a efeito de frameshift e co dões stop prematuros a jusante .

Splicing normal

Retenção de intrão

Eliminação de exão

AG

SR

SRSR

SR

SR

SR

1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas sequências de splicing

GT

AG

AG

AG

AG

AG

AG

AG

GT

GT

GT

GT

GT

GT

GT

Transplantada renal (glomerulonefrite crónica membranoproliferativa)

• Amenorreia

• Genitais externos hipotróficos

• Cariótipo 46,XY


Síndroma de Frasier


A proteína WT1 é um factor de transcrição com funções supressoras tumorais, e que também desempenha um papel crucial no desenvolvimento embrionário do rim e gónadas.

Gene do tumor de Wilms, WT1. Podem formar-se 24 isoformas da proteína WT1 por combinação de 3 mecanismos de controlo da expressão génica.

A variante de splicing do exão 9 permite a inclusão ou exclusão de três aminoácidos (KTS). As duas isoformas, KTS positivas e KTS negativas, parecem ter diferentes funções e diferentes localizações ao nível do núcleo.

KTS+

KTS-

K - LysT - Thr

S - Ser

Segmento amplificado do exão 9.

Mutação intrónica alterando o segundo local dador de splincing, dando origem preferencial às isoformas WT1-KTS.

A mutação cria um site de restrição para a enzima HinP I


Exão 9

T>CD FF DC CC ϕX

Estudaram-se os familiares e 50 controlos (100 alelos) por

RFLP coma enzima HinP I

Neomutação, freq <1% na população

Não se estudou o mRNA: o gene só é transcrito durante o desenvolvimento embrionário e no rim


As mutações intrónicas afectam o splicing

1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica de splicing

1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica de splicing num exão

Uma mutação sinónima pode activar uma sequência crípti ca dadora de splicing no exão 2: parte do exão é eliminado

GT AGGT AG

1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica de splicing

• Uma mutação sinónima pode ser patogénica

GAG GGC AAA GGC AAA ACA AGT..... GT AG CCA CAG CCT...

GAG G GT AG CC ACA GCC T...

Intrão 16

Intrão 16

GAG GGT AAAG...

exão 16 exão 17

Mutação do gene calpaína 3 responsável por uma forma de distrofia muscular, a LGMD2A. Aparentemente a mutação é silenciosa porque é sinónima , dado que ambos os codões,

GGC e GGT codificam a glicina. No entanto, a mutação activa uma sequência críptica dadora

de splicing originando perda de parte do exão 16, introdução de frameshift e stop prematuro a

jusante.

frameshift

1. Tipos de mutações: mutações das regiões reguladoras

Porque serão patogénicas?

Gene da β-globina e localização das várias mutações associadas à β-talassémia

-29A →→→→G -88C →→→→T

Alguns dos tipos de mutações do gene do receptor das LDL, o LDLR, na origem da hipercolesterolémia familiar.

Frequentemente, uma patologia pode ser provocada por diferentes tipos de mutações num gene – heterogeneidade alélica

Mutation hotspots

Dinucleótidos CpG: 8 a 12 x mais mutações

Transição citosina →→→→ timina, a qual vai emparelhar com adenina

C5 C6

1N

2C

C4

N3

NH2 OCH3

OO

NH2

O

C5 C6

1N

2C

C4

N3

H

H HC5 C6

1N

2C

C4

N3

CH3

H

Desaminação espontâneaMetilação

timina5-metilcitosinacitosina

2. Regiões mais susceptíveis às mutações

citosina metiltransferase

Replicação normal

Mecanismo de inserção

Mecanismo de delecção

Por deslizamento para trás da nova cadeia

Por deslizamento para trás da cadeia molde


Sequências repetitivas – os microssatélites favorecem a ocorrência de inserções e delecções por deslizamento das cadeias durante a replicação. Para certos loci, um número excessivo de repetições pode originar mutações patogénicas, as mutações

dinâmicas .

36 -100

62-86

38-62

10-26

12-39

9-35

(CAG)n

(CAG)n

(CAG)n

Codificante

Codificante

Codificante

AD

AD

XR

Repetições CAG

D. de Huntington

D. de Machado Joseph

D. de Kennedy

Etc..

200-1000

200-1700

50-4000

6-54

7-22

5-35

(CGG)n

(GAA)n

(CTG)n

Não codificante

5’UTR

Intrão 1

3’UTR

XR

AR

AD

Grandes repetições

X frágil

Ataxia de Friedreich

Distrofia miotónica (DM1)

InstávelNormalSequênciaLocalizaçãoTransmissãoDoença

Pré-mutação

Doenças associadas a mutações dinâmicas

Mutações com diversos mecanismos patogénicos

Motivos extensos de DNA repetitivo ou com grandes homologias , por exemplo genes e respectivos pseudogenes favorecem a ocorrência de crossing-overs assimétricos entre cromátides irmãs ou entre cromátides de cromossomas homólogos dá origem a delecções /inserções e genes de fusão


C4A C4BCYP21A CYP21B

30 Kb 30 Kb

21-hidroxilasePseudogeneNão funcionalCom mutações

O gene CYP21B e o pseudogene CYP21A localizam-se numa sequência repetitiva de DNA de cerca de 30Kb que inclui ainda outro gene também em duplicado, o C4 (C4A e C4B).

Formação de crossing-oversassimétricos; 25% das

mutações

Conversão génica 75% das mutações

Gene de fusão, inactivo

Delecção

Gene mutante com mutações

inactivadoras

Rotura e

reconstrução

Micro conversão

Emparelhamento assimétrico

A maioria das mutações da 21-hidroxilase devem-se a trocas de sequências do CYP21B, com um pseudogene próximo, o CYP21A, por emparelhamento assimétrico.

Mutações da 21-hidroxilase

Mutações patogénicas do gene da 21-hidroxilase (CYP21B) podem ocorrer por cópia a partir do pseudogene CYP21A.

Colesterol

Pregnanolona

Progesterona

Corticosterona

↓↓↓↓ Aldosterona(Perda renal de sódio)

17 α–OH Pregnanolona

↑ 17 α–OH Progesterona

11-deoxicortisol

↓↓↓↓ Cortisol

Deidroepian-drosterona

↑↑↑↑Androstenediona ↑↑↑↑ Testosterona

EstronaEstradiol

Deoxicorticos-terona

CYP21

CYP21

Hipotálamo/Hipófise

Feed-backnegativo

ACTH

Hiperplasia congénita da supra-renal

Hiperplasia congénita da supra-renal por défice da 21-hidroxilase

Pseudo-hermafroditismo femininoVirilização precoce no sexo masculinoSíndrome de perda de sal

Ambiguidade dos genitais externos

A existência de sequências homólogas pode ainda dar origem a outras alterações graves como inversões. Exemplo da hemofi lia A.

No intrão 22 do gene F8 há outros dois genes, o F8B e o F8A. A cerca de 300 Kb, na direcção do telómero, localizam-se os genes F8A* e F8A**, homólogos de F8A. Pode ocorrer inversão por emparelhamento do gene F8A (do intrão 22 do gene F8) com dois genes homólogos, o F8A* e F8A**.


Pequenas sequências repetitivas são frequentemente encontradas nos limites de muitas delecções patogénicas do mtDNA na síndroma de Kearns-Sayre.


Porque surge a patologia?

Porque há doenças recessivas e dominantes?

3.Mutações: consequências

As consequências de uma mutação dependem da alteração da função da proteína e da função da proteína

na célula/organismo.

• Perda/diminuiçãode função

• Aumento de função

• Nova função

Fenótipos dominantes

Fenótipos recessivos

Doença autossómica recessiva

Doença autossómica dominante

3. Mutações: consequências

Mutação

Proteína anormal

Perda de função(a maioria)

Aumento de função

Efeito lesivo

Expressão ectópicaou heterocrónica

Causa de Patologia

Acondroplasia

d. Huntington

Hemofilia, β talassémia, etc

Cancro

Proteína normal

↓↓↓↓ quantidade

↑↑↑↑ quantidade

Expressão inapropriada

Mutações que afectam a regulação ou a dosagem génica

Mutações da região codificante

Mutações que afectam a estabilidade do RNA ou o seu processamento

Nova funçãoGene híbrido

α talassémia

D. Charcot-Marie-tooth I

1 3

2

Mutações com perda de função:delecções; frameshift; nonsense; inversões, missense,

Fenótipo recessivo (enzimas, factores de coagulação,..)

50% da proteína assegura a função

Podem associar-se a fenótipos dominantes


Mutações com perda de função: exemplo da β-talassémia

A figura representa o gene da β-globina e a localização das várias mutações associadas à β-talassémia. Algumas das mutações localizam-se na região reguladora e limitam a taxa de transcrição. Outras originam proteínas mutantes não funcionais. Doença autossómica recessiva com heterogeneidade alélica.

α-talassémias; Distrofia muscular de Duchenne

De LINE-1 no gene F8 na hemofilia A

Distrofia muscular de Duchenne

gene F8 na hemofilia A

β-talassémia

CDKN2A no cancro

Mutação da α-globina na α talassémiaβ-talassémia (Q39X)

β-talassémia; mucoviscidose; ...

β-talassémia; s. Papillon-Lefèvre

β-talassémia; s. Papillon-Lefèvre

Mucoviscidose

s. Ehlers Danlos tipo VII (procolagénio resistente à clivagem)

Fibrose quística (pF508del)

Delecção

Inserções

Disrupção da estrutura de um gene

translocação

nversão

Inibição do promotor

mutação

metilação

Destabilização do mRNAmutação do site de poliadenilação

pelo NMD

Interferência no splicing

Frameshift

Mutação nonsense

Mutação missense em aac. essencial

Mutação que interfira com o processamento pós-tradução

Mutação que impeça a correcta localização na célula

ExemploAlteração com perda de função

• X frágil : (CGG)>200 na região 5’UTR do gene FMR1→ metilação da região promotora e ausência de expressão do gene – perda de função – X recessiva

Mutações dinâmicas em regiões não codificantes

Principal causa de atraso mental hereditário no sexo masculino

Prognatismo; grandes pavilhões auriculares

Mutações com perda de função

Síndroma de X-frágil

A proteína FMR1 é importante para o desenvolvimento e maturação do SNC onde regula a tradução de vários mRNAs.


A osteogénese imperfeita é uma doença que afecta o esqueleto e que surge por mutações nos genes que codificam as cadeias α1 ou α2 do colagénio.

GeneCOL1A1

GeneCOL1A2

O colagénio é uma proteína multimérica formada por duas cadeias αααα1 e uma cadeia αααα2

2n αααα1

n αααα2

Cromossoma 17 Cromossoma 7

αααα2 αααα1


Apenas n/4 de proteínas normais

3n/4 de proteínas anormais não funcionais

Mutação missense

GeneCOL1A1

GeneCOL1A2

n αααα2n αααα1 normais e n cadeias αααα1 mutadas

COL1A1 COL1A2

n/2 moléculas normais

n α1 n α2

Só se sintetizampeptídeos normais

Delecções

Efeito dominante negativo – a proteína mutada interfere com a proteína normal

→→→→ Os heterozigotos são doentes

→→→→ Mutação missense com consequências mais graves do qu e a delecção

Efeito dominante negativo: mutação com perda de função associada a fenótipos dominantes

n αααα2n αααα1

Gene

Localização da mutação nonsense Efeito

Na ausência de correcção pelo NMD, mutações nonsense podem originar proteínas truncadas na origem de fenótipos dominantes por efeito dominante negativo


Haploinsuficiência : redução de 50% da função causa

patologia- fenótipo dominante

JAG1

EXT1PMP22

ELN

TRPS1PAX3

118340

133700162500

185500

190350193500

S. de Alagille

Exostose múltiplaNeuropatia Tomaculosa

Estenose aórtica supra-valvular

S. Trico-rino-falângicoS. Waardenburg tipo 1

GeneMIM#Patologia

Efeito de dosagem génica

• via de sinalização “quantitativa” – taxa de ocupação de receptor

• actuação por competição

• cooperação ou interacção entre proteínas

Mutações com perda de funçãoFenótipo recessivo (enzimas, factores de coagulação,..)

50% da proteína assegura a função

Podem associar-se a fenótipos dominantesEfeito dominante negativoHaploinsuficiência


Mutações com ganho de função

Fenótipo dominantes50% da proteína não asseguram a função

Mutações com ganho de função – efeito tóxico da proteína

Doença de Huntington:

(CAG) 36 a >100

Autossómica dominante

• No 1º exão do gene HD → sequência de poliglutamina no terminal

amina da proteína huntingtina

• Formam-se agregados de proteína no núcleo e citoplasma

• Morte celular no estriado e cortex cerebral

6-35 normal36-40 penetrância incompleta> 40 penetrância completa

Redução de 25-30% do peso do cérebro

Acondroplasia. Normalmente, a ligação de factor de crescimento FGF activa o receptor FGFR3 tendo como consequência a inibição da proliferação dos condrócitos na placa de crescimento. A mutação causa a activação constitutiva do receptor , independentemente da ligação do ligando, pelo que o crescimento dos ossos longos é inibido.

G1138A

90% mutação missense (glicina>arginina)


Activação constitutiva do receptor

Fenótipo dominante

Mutações pontuais: protooncogene RET

Codão609611618620634

Dimerização

Autofosforilação

Activação das vias de transdução de sinal

Proliferação celular e cancro

Síndroma MEN2A: cancro medular da tiróide e adenoma das supra-renais


Ganho de função ou nova função

Leucemia mielóide crónica

Paramiotonia congénita

BCR-ABLOncogene

SCN4A

Insensibilidade a inibidores(proteína quimérica)

Canal iónico permanentemente aberto

Doença de Huntington

Distrofia miotónica

HD

DMPK

Efeito citotóxicoproteínaRNA?

MEN2A (síndroma tumoralhereditária)RET

oncogene

Activação de receptor(mutação pontual)

Doença de Charcot-Marie-ToothPMP22Aumento da expressão(duplicação do gene)

Mecanismo Gene Doença

• Espectro de mutações mais restrito

• A patologia não se associa a delecções ou disrupções do gene

• Mutações em locais específicos

• Modelos in vitro: “knockout”

Ganho de função?

Há muitas excepções,...

Variabilidade das doenças monogénicas?

• Penetrância incompleta

• Expressividade variável

• Penetrância com a idade

6044

5135 68

22 anos

RAD51

MAP3K1

FGFR2

MAP3K

TNRC9

Associação de polimorfismos dos genes FGFR2 e TNRC9:

↑ cancro da mama aos 70 anos, para portadoras de mutação do

BRCA2, de 41% (sem alelos de risco) para 70% (4 alelos de risco)

Genes modificadores do BRCA1 e do BRCA2

Common Breast Cancer-Predisposition Alleles Are Associated with Breast Cancer Risk in BRCA1and BRCA2 Mutation CarriersAntoniou et al, Am J Hum Genet, 2008Estudo em 10.358 portadoras de mutações do BRCA1/BRCA2

Cancro da mama hereditário: genes modificadores

Querubismo – penetrância variável com o sexo

• Querubismo (Displasia fibrosa familiar dos maxilares)

• Expansão progressiva, indolor e simétrica, dos maxilares; regride após a puberdade

• Alterações da erupção dentária

� AD� Mutações no gene 3BP2� Penetrância de 100% no

sexo masculino e de 50 a 70% no sexo feminino

Proteína 3BP2 – envolvida na activação e desgranulação dos mastócitos e activação dos osteoclastos

Proliferação do tecido conjuntivo fibroso com numerosas células gigantes multinucleadas

A presença da mutação não assegura o fenótipo patológico

Exemplo da fenilcetonúria: metabolopatia autossómica recessiva, por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase, com deficiência mental e alterações neurológicas em homozigotos mutados, apenas na ausência de dieta pobre em fenilalanina. Diagnóstico perinatal pelo “teste de Guthrie ”.

◨◨ ◑◑

Doença por efeito tóxico de metabolitos maternos sobre os fetos, mesmo que estes sejam heterozigotos - fenocópia

Mãe com fenilcetonúria, homozigota mutada.

Se não fizer dieta durante a gravidez

Penetrância incompleta e expressividade variável em doenças monogénicas

� Correlação genótipo-fenótipo (tipo e localização da mutação)

� Interferências do meio

� Genes modificadores: polimorfismos, mutações

� Interferências com polimorfismos do mesmo gene

� Dificuldades no diagnóstico

� e no prognóstico� DPN? � Diagnóstico de portadores?� Avaliação do risco para a descendência?

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