PAULA BITTENCOURT VAGO
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS PAULA BITTENCOURT VAGO SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA E FATORES DE VIRULÊNCIA DE Candida spp. ISOLADAS DO DUCTO NASOLACRIMAL E CONJUNTIVA OCULAR DE EQUINOS FORTALEZA 2015
Transcript of PAULA BITTENCOURT VAGO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
PAULA BITTENCOURT VAGO
SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA E FATORES DE VIRULÊNCIA DE Candida spp.
ISOLADAS DO DUCTO NASOLACRIMAL E CONJUNTIVA OCULAR DE
EQUINOS
FORTALEZA
2015
PAULA BITTENCOURT VAGO
SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA E FATORES DE VIRULÊNCIA DE Candida spp.
ISOLADAS DO DUCTO NASOLACRIMAL E CONJUNTIVA OCULAR DE
EQUINOS
FORTALEZA
2015
Tese submetida a Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutorado em Ciências Veterinárias.
Orientação: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha
Rocha
À minha mãe, Ruth, por sempre ter sido minha melhor amiga,
maior companheira e incentivadora, e por estar presente
em todos os momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da
Universidade Estadual do Ceará.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio
financeiro.
Ao Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará.
Ao professor Marcos Fábio Gadelha Rocha pela orientação, dedicação, ensinamentos, apoio e
cobranças, visando sempre o aprimoramento dos seus orientados.
À Professora Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, que no decorrer desses anos passei a
admirar cada dia mais, pela sua inteligência, dedicação, sinceridade, e acima de tudo pela
pessoa que conheci! Só tenho a agradecer por todo o apoio e incentivo que recebi!
À professora Rossana de Aguiar Cordeiro, pela orientação, ensinamentos, paciência,
disponibilidade, pelas palavras de incentivo e confiança.
Ao Professor José Júlio Costa Sidrim, pelos alicerces do Centro Especializado em Micologia
Médica.
À professora Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia pelos ensinamentos desde o ínico
dessa jornada de pós-graduação, pela paciência e apoio, além da alegria que contagia e estimula o
dia a dia.
Ao Professor André Jalles Monteiro, pela sua capacidade estatística.
A todos os colegas do CEMM que dividiram comigo as alegrias, sofrimentos e a busca pelo
conhecimento nessa incrível jornada da pós-graduação.
Ao Jonathas Oliveira pelo apoio incondicional tanto no desenvolvimento do projeto como nas
coletas e, além de tudo, pela amizade sincera que levarei para a vida toda!
À Terezinha de Jesus Santos Rodrigues e Daniel Teixeira Lima, por todo o suporte
proporcionado para a realização de nossas pesquisas.
À Adriana Sales Albuquerque, secretária do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, da Universidade Estadual do Ceará, pela atenção e disponibilidade.
À Dra. Juliana Almeida, diretora da Policlínica Veterinária Metropolitana, pela compreensão
e apoio incondicional nos momentos de ausência para o desenvolvimento dessa tese,
sobretudo pela amizade e companheirismo nos momentos de estresse.
À Dra. Mariana Pinheiro pela disponibilidade e total apoio nas coletas das amostras, pela
paciência e ajuda indispensável na organização dos dados e, por fim, o mais importante, pela
amizade que virou irmandade!
À minha mãe, Ruth Ribeiro Bittencourt, pelo amor incondicional, companheirismo, paciência
e por ser o meu exemplo de vida!
Aos meus amigos de quatro patas: meu gato Saddan (in memorian), minha gata Jujuba, meus
cavalos Prinz Royal e Mahamed, por me mostrarem sentimento puro e leal, e por sempre me
lembrar da escolha da minha profissão.
“Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais inteligente,
mas o que melhor se adapta às mudanças”
(Charles Darwin)
RESUMO
O gênero Candida é composto por leveduras que vivem como comensais na microbiota de
homens e diversas espécies de animais. As pesquisas acerca da microbiota de Candida spp.
em equinos ainda são poucas quando comparados aos trabalhos em humanos. Dessa forma, o
objetivo desta pesquisa foi identificar Candida spp. isoladas da mucosa conjuntival e ducto
nasolacrimal de equinos e determinar a sensibilidade in vitro destas leveduras ante a
anfotericina B, fluconazol, itraconazol e caspofungina, bem como avaliar a produção dos
fatores de virulência proteases e fosfolipases, dos isolados oriundos do ducto nasolacrimal e
de biofilme pelas cepas provenientes da mucosa conjuntival. Para a obtenção de Candida spp.
foram coletadas amostras 103 equinos, escolhidos aleatoriamente, no Estado do Ceará,
Nordeste do Brasil. Para coleta de amostras da conjuntiva ocular e saída do ducto
nasolacrimal foram utilizados swabs estéreis de algodão e para o lúmen do ducto nasolarimal
foi feita instilação de 2mL de solução salina, via sonda uretral. Os isolados foram avaliados
separadamente conforme o sítio anatômico. Dessa forma, um total de 77 isolados de Candida
foram obtidas a partir do ducto nasolacrimal, com C. famata como a espécie mais prevalente,
seguida por C. tropicalis, C. guilliermondii e C. parapsilosis lato sensu. As cepas foram
submetidas a teste de sensibilidade in vitro por meio do método de microdiluição em caldo,
protocolo M27-A3, padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
Como resultado, um isolado de C. glabrata foi resistente a caspofungina, um isolado de C.
parapsilosis lato sensu foi resistente apenas ao fluconazol, 11 foram resistentes somente a
itraconazol (7 C. tropicalis, 2 C. guilliermondii, 1 C. famata, 1 C. parapsilosis sensu lato),
enquanto oito C. tropicalis apresentaram resistência a ambos os azólicos. Nos testes de
produção enzimática, 28 isolados produziram fosfolipases e 12 produziram proteases. No
tocante a mucosa conjuntival foram isoladas 15 cepas de Candida, sendo C. tropicalis a
espécie mais isolada, seguida por C. parapsilosis lato sensu, C. glabrata, C. rugosa, C. famata,
C. ciferrii, C. guilliermondii, C. catenulata e C. krusei. Os isolados foram avaliados quanto a
capacidade de formação de biofilme e sensibilidade do biofilme formado a drogas antifúngicas. Do
total de isolados testados, somente oito cepas apresentaram-se capazes de produzir biofilme, 3 C.
tropicalis, 2 C. glabrata, 1 C. parapsilosis lato sensu, 1 C. guilliermondii e 1 C. catenulate.
Inicialmente foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) dos isolados em sua forma
planctônica. Em seguida, a sensibilidade antifúngica dos biofilmes maduros foi avaliada
utilizando a concentração de 10xCIM e 50xCIM das drogas testadas. Uma cepa de C.
tropicalis não apresentou sensibilidade após a exposição a qualquer dos antifúngicos testados,
enquanto que a atividade metabólica do biofilme de cinco isolados sofreu reduções apenas
após exposição a anfotericina B na concentração de 50xCIM. Uma cepa de C. parapsilosis
lato sensu e uma cepa de C. glabrata mostrou redução significativa do biofilme após a
exposição ao fluconazol, itraconazol e caspofungina, mas não frente a anfotericina B. Estes
resultados destacam a importância de se investigar a sensibilidade antifúngica e os fatores de
virulência de Candida spp. da microbiota do ducto nasolacrimal e mucosa conjuntival de
equinos visto que apresentam isolados resistentes as drogas antifúngicas mais comumente
usadas na medicina humana e também por demonstrarem produção dos fatores de virulência.
Palavras-chave: Equinos. Microbiota. Sensibilidade antifúngica. Resistencia. Virulência.
ABSTRACT
The genus Candida is composed of yeasts that inhabit as commensals in the microbiota of
men and several animal species. Researches on the microbiota of Candida spp. in horses are
still few compared to studies in humans. Thus, the objective of this research was to identify
Candida spp. isolated from the conjunctival mucosa and nasolacrimal duct of horses,
determine the in vitro susceptibility of these yeasts against amphotericin B, fluconazole,
itraconazole, and caspofungin and evaluate the production of the virulence factors: proteases
and phospholipases for the strains isolated from the nasolacrimal duct and biofilm for the
strains isolated from the conjunctival mucosa. To obtain Candida spp., samples were
collected from 103 horses, chosen ramdonly, in Ceará State, northeast Brazil. To collect the
samples from ocular conjunctiva and from the region around the nasolacrimal duct, sterile
swabs were used, and for the lumen of nasolarimal duct, instillation of 2 mL saline with aid of
a urethral probe was performed. Isolates were evaluated separately according to the
anatomical site. Thus, a total of 77 Candida isolates were obtained from the nasolacrimal
duct, being C. famata the most prevalent species, followed by C. tropicalis, C. guilliermondii
and C. parapsilosis lato sensu. As cepas foram submetidas a teste de sensibilidade in vitro por
meio do método de microdiluição em caldo, protocolo M27-A3, padronizado pelo Clinical
and Laboratory Standards Institute (CLSI). Strains were subjected to in vitro susceptibility
testing by microdilution broth method, M27-A3 protocol, standardized by the Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI). As result, an isolate of C. glabrata was resistant to
caspofungin, an isolate of C. parapsilosis lato sensu was resistant only to fluconazole, 11
strains were resistant only to itraconazole (7 C. tropicalis, 2 C. guilliermondii, 1 C. famata, 1
C. parapsilosis sensu lato), and eight C. tropicalis were resistant to both tested azoles.
Regarding the enzymatic production assay, 28 isolates produced phospholipases and 12
isolates produced proteases. As for the conjunctival mucosa, 15 strains of Candida were
isolated, being C. tropicalis the most isolated specie, followed by C. parapsilosis lato sensu,
C. glabrata, C. rugosa, C. famata, C. ciferrii, C. guilliermondii, C. krusei and C. catenulata. Isolates were evaluated for biofilm-forming ability and susceptibility of the formed biofilm against
antifungal drugs. Of all isolates tested, only eight strains showed capacity of producing biofilm (3 C.
tropicalis, 2 C. glabrata, 1 C. parapsilosis lato sensu, 1 C. guilliermondii and 1 C. catenulata).
Initially, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determinated for the isolates in their
planktonic form. Then, the antifungal susceptiblity of mature biofilms was evaluated using
concentrations of 10xMIC and 50xMIC of the antinfungal drugs. A strain of C. tropicalis did not show
susceptibility to any of the tested antifungal agents, whereas the metabolic activity of the biofilm from
five isolates had decrease only after exposure to amphotericin B at concentration of 50xMIC. A strain
of C. parapsilosis lato sensu and a strain of C. glabrata showed a significant reduction of
mature biofilm after exposure to fluconazole, itraconazole, and caspofungin, but not against
amphotericin B. These results highlight the importance of investigating the antifungal
susceptibility and virulence factors of Candida spp. from the microbiota of the nasolacrimal
duct and conjunctival mucosa of horses once these sites can harbor isolates presenting
resistance to the antifungal drugs most often used in human medicine and also demonstrate
the production of virulence factors.
Keywords: Equine. Microbiota. Antifungal susceptibility. Resistance. Virulence.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - A) Placa contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol
demonstrando crescimento de colônias de Candida spp..B) Placa
contendo ágar cromogênico, permitindo a identificação presuntiva de C.
albicans (seta verde), C. tropicalis (seta azul) e complexo C. parapsilosis
(seta rosa). C) Microcultivo de C. tropicalis em ágar fubá acrescido de
Tween 80. Na microscopia observa-se presença de pseudo-hifa
apresentando blastoconidíos al longo da estrutura (aumento 400x). D)
Prova de assimilação de carboidratos. Observa-se a turvação do meio
onde a levedura avaliada assimilou os
açúcares......................................................................................................... 17
Figura 2 - A) Prova de assimilação de nitrogênio. Observa-se a turvação do meio
onde a levedura avaliada assimilou peptona (controle). B) Prova de
fermentação de carboidratos de Candida spp.. Observa-se a formação de
bolha no interior do tubo de Durhan (produção de gás), indicativo de
fermentação positiva..................................................................................... 18
Figura 3 - A) Avaliação da produção de fosfolipases extracelulares por cepas de
Candida spp. em meio ágar gema de ovo. Observa-se a formação de uma
zona esbranquiçada e opaca ao redor da colônia (seta), indicativa da
produção da enzima. B) Avaliação da produção de proteases
extracelulares por cepas de Candida spp. em meio ágar BSA. Observa-se
a formação de uma zona clarificada ao redor da colônia (seta), que indica
a produção da enzima ................................................................................... 21
Figura 4 - Etapas da formação de biofilme de Candida spp. ........................................ 22
Figura 5 - Biofilme de C. guilliermondii por meio de microscopia eletrônica de
varredura ...................................................................................................... 24
Figura 6 - Área e receptores de ação das drogas antifúngicas: poliênicos,
equinocandinas e derivados azólicos............................................................ 27
Capítulo 2
Figura 1 - Mature biofilms of Candida spp. (a): C. tropicalis with strong biofilm
production (OD590nm>1.908)). Notice the multilayer arrangement of
blastoconidia and pseudohyphae; (b): C. glabrata with moderate biofilm
production (0.954<OD590nm≤1.908). Notice the clusters of small round
blastoconidia, in a monolayer arrangement, and the absence of
pseudohyphae, with empty areas on the coverslide; (c): C. guilliermondii
with weak biofilm production (0.477<OD590nm≤0.954). Notice clusters
of blastoconidia and pseudohyphae, in a monolayer arrangement, with
empty areas on the coverslide……………………………………………………….. 70
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1 - Candida species isolated from the outlet and the lumen of the
nasolacrimal duct of horses………………………………………………... 49
Tabela 2 - Minimum inhibitory concentrations of amphotericin B, itraconazole,
fluconazole and caspofungin against strains of Candida spp. Isolated from
the outlet and the lumen of the nasolacrimal duct of horses………………. 50
Tabela 3 - Production of phospholipases and proteases by Candida spp. isolated
from the outlet and the lumen of the nasolacrimal duct of horses………… 51
Capítulo 2
Tabela 1 - Biofilm production of Candida species recovered from the ocular
conjunctiva of horses and antifungal susceptibility of the strains in
planktonic form……………………………………………………………. 71
Tabela 2 - Effect of antifungal drugs on the metabolic activity of mature biofilms of
Candida spp. from the ocular conjunctiva of horses………………………. 72
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PCR – Polymerase chain reaction
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
MLST - Multi-Locus Sequence Typing
DNA-RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA
SAPs – Aspartil proteases secretadas
MDR1/2 – Multidrug resistance gene 1 / Multidrog resistance gene 2
CDR1/2 - Candida drug resistance 1 / Candida drug resistance 2
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 14
2.1 Gênero Candida ........................................................................................... 14
2.1.1 Identificação de Candida spp. ..............................................................
.................................................................................................
16
2.1.2 Patogenicidade e Fatores de Virulência ............................................... 18
2.1.3 Resistência e drogas antifúngicas ......................................................... 24
3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................ 28
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS .............................................................................. 29
5. OBJETIVOS ........................................................................................................ 30
5.1 Objetivo geral ............................................................................................... 30
5.2 Objetivos específicos .................................................................................... 30
6. CAPÍTULO 1 ...................................................................................................... 31
Trends in antifungal susceptibility and virulence of Candida spp. from the
nasolacrimal duct of horses .................................................................................
31
7. CAPÍTULO 2 ...................................................................................................... 52
Biofilms of Candida spp. from the ocular conjunctiva of horses with reduced
azole susceptibility: a complicating factor for the treatment of keratomycosis?.....
………………………………………………………...
52
8. CONCLUSÕES .................................................................................................. 73
9. PERSPECTIVAS .............................................................................................. 74
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 75
APÊNDICES ........................................................................................................... 83
Apêndice A – Comprovante de submissão do artigo referente ao capítulo 2 ......... 83
13
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, no Brasil, a equinocultura tem um papel significativo no setor
econômico e social, visto que gera uma quantidade expressiva de empregos e movimenta em
torno de 7,5 bilhões de reais por ano. Aliado a esse crescimento, a preocupação acerca da
saúde dos equinos também aumentou, ocasionando maior interesse nas doenças que podem
promover perda de desempenho desses animais. Dentre as doenças, as infecções fúngicas
ainda são pouco estudadas quando comparadas a infecções bacterianas e virais,
principalmente nas alterações respiratórias e oculares.
Os fungos pertencentes ao gênero Candida são leveduras que vivem como
comensais na microbiota de homens e animais. As pesquisas acerca da microbiota de Candida
spp. em equinos ainda são escassas quando comparados aos trabalhos em humanos. Todavia,
descreve-se uma maior prevalência de espécies de Candida não-albicans compondo a
microbiota de sítios anatômicos distintos tais como cavidade nasal, mucosa orofaríngea,
conjuntival e retal e trato reprodutivo, como também em ambiente de criação de cavalos.
Normalmente, essas leveduras não causam danos aos seus hospedeiros, entretanto,
quando expostos a fatores de risco, que causam desequilíbrio em suas barreiras física, química
ou imunológica, ocorre a infecção chamada de candidíase. Em equinos, espécies de Candida
têm sido associadas com diarreia, meningite e onfaloflebite em potros e, artrite séptica,
osteomielite, abortos, metrites e ceratomicose em animais adultos.
Semelhante ao descrito em humanos, isolados do gênero Candida demonstram
potencial patogênico em diversas espécies animais, inclusive com cepas apresentando
resistência as drogas azólicas de uso clínico humano e capazes de produzir fosfolipases,
proteases e biofilmes, importantes fatores de virulência do gênero.
Assim, considerando o crescimento da equinocultura e, consequentemente, o maior
contato do homem com esta espécie animal, aliado à escassez de dados acerca da microbiota de
leveduras do gênero Candida e do seu potencial patogênico em equinos, este estudo buscou contribuir
com esta temática, particularmente, identificando as espécies de Candida isoladas da mucosa
conjuntival e ducto nasolacrimal de equinos no Estado de Ceará, com ênfase para a avaliação da
produção dos seus fatores de virulência.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Gênero Candida como componente da microbiota de equinos
Do ponto de vista taxonômico, as leveduras do gênero Candida são descritas
como pertencentes ao reino Fungi, filo Ascomycota, subfilo Saccharomycotina, classe
Saccharomycetes e ordem Saccharomycetales (NCBI TAXONOMY, 2011). Atualmente são
descritas mais de 300 espécies desse gênero (LACHANCE, et al., 2011).
Candida spp. são habitantes comuns da microbiota da pele, trato gastrointestinal,
trato reprodutivo, trato respiratório superior e mucosa conjuntival do homem e de diversas
espécies animais, incluindo equinos (ARAGHI-SOOREH et al., 2014; STEFANETTI et al.
2014; BUU,CHEN, 2013; CARFACHIA et al., 2013; CORDEIRO et al., 2013; RÓZANSKI
et al., 2013a). Ademais, Rózanski et al. (2013b) relataram a ocorrência de diversas espécies de
leveduras desse gênero no ambiente de criação de equinos, bem como no material destinado a
limpeza e trabalho dos mesmos. Contudo, os relatos na literatura sobre a presença de
leveduras como componentes da microbiota de animais saudáveis são escassos quando
comparados aos relatados em humanos (RÓZANSKI et al., 2013a; WROBEL et al., 2008).
A microbiota conjuntival equina é variável na dependência da idade do animal,
estação do ano e localização geográfica, sendo constituída em sua maioria de patógenos
oculares em potencial (GALERA et al., 2012). No Brasil existem poucos trabalhos acerca
dessa microbiota. Pisani et al. (1997) relataram uma taxa de isolamento de 20% de leveduras
do gênero Candida em equinos residentes no estado de São Paulo. Rosa et al. (2003)
descreveram o isolamento de leveduras na mucosa ocular de equinos no estado do Rio de
Janeiro, entretanto, não determinaram a espécie dos isolados. Já Souza et al. (2011) citam uma
taxa de isolamento de 3% de leveduras do gênero Candida em equinos no estado de Alagoas.
Apesar da relação anatômica direta entre a conjuntiva ocular e o ducto
nasolacrimal, não existem artigos que descrevam uma possível correlação entre essas
microbiotas. Cordeiro et al. (2013) investigaram a microbiota da cavidade nasal em dois
sítios de coleta, região caudal (30 cm da entrada da narina) e rostral (10 cm da entrada da
narina, próximo ao ducto nasolacrimal), e relataram a presença das espécies Candida
guilliermondii, C. tropicalis, C. famata e C. parapsilosis sensu latu. Entretanto, a microbiota
do ducto nasolacrimal propriamente dito não está descrita na literatura.
15
Dependendo do estado fisiológico do hospedeiro, Candida spp. podem converte-
se de micro-organismos comensais para patógenos oportunistas, ocasionando infecções tanto
em humanos como animais (BUU,CHEN, 2013). Os fatores predisponentes para infecção por
Candida spp. em animais incluem idade, imunossupressão, muitas vezes ocasionada por
terapia prolongada com corticosteróides, antibioticoterapia, diabetes mellitus, síndrome de
Cushing, hipotireoidismo, leishmaniose, erliquiose, cateterismo venoso e urinário
(BIEGANSKA et al., 2014; BRADFORD et al., 2013; SKORIC et al., 2011).
Nas últimas três décadas têm aumentado significativamente o número de
infecções fúngicas em humanos, nas quais espécies de Candida aparecem como importante
causa de infecções oportunistas (DEORUKHKAR et al., 2014). Atualmente, mais de 30
espécies desse gênero têm sido implicadas como causa de candidíases em humanos, sendo
Candida albicans a espécie mais encontrada seguida por Candida glabrata, Candida
parapsilosis e Candida tropicalis (PFALLER et al., 2014; SILVA et al., 2012).
Em equinos, diversas espécies têm sido implicadas em diferentes manifestações
clínicas. Stefanetti et al. (2014) relataram a ocorrência de aborto em uma égua árabe em
decorrência de infecção por Candida guilliermondii. Rózanski et al. (2013a) descreveram
casos de endometrite e vulvovaginite ocasionados por C. tropicalis e C. guilliermondii.
Brooks et al. (2013) e Reed et al. (2012) citaram casos de ceratomicoses em virtude de C.
albicans. Infecções osteoarticulares também foram associadas a infecção por Candida spp.,
como em relato de caso de osteomielite em garanhão por C. glabrata e artrite séptica por C.
famata (DOYLE et al., 2013; RILEY et al., 1992).
Esses relatos mostram que espécies de Candida podem causar infecções em
animais e que o estudo da microbiota e seus componentes se torna relevante visto que além de
ocasionar prejuízo ao animal podem representar uma fonte de transmissão para humanos.
16
2.1.1 Identificação de Candida spp.
A identificação das espécies de Candida baseia-se nas suas características
fenotípicas, tais como macro e micromorfologia, além das características bioquímicas, como
assimilação e fermentação de carboidratos, assimilação de nitrogênio e prova da urease
(BRITO, 2009).
O processamento das amostras clínicas é realizado em meios de cultura clássicos,
como ágar Sabouraud, ágar Sabouraud com cloranfenicol e ágar Sabouraud acrescido de
cloranfenicol e cicloeximida (SIDRIM, ROCHA, 2004). Macroscopicamente, as culturas de
Candida spp. apresentam colônias lisas, úmidas ou secas, de coloração branca ou creme
(Figura 1A) (VAZQUEZ, SOBEL, 2011; DE HOOG et al., 2000). A utilização de meio
cromogênico é a próxima etapa na identificação de Candida spp., o qual tem como objetivo
identificar colônias mistas, além de realizar um diagnóstico presuntivo rápido (Figura 1B)
(ARAÚJO et al., 2005; QUINDÓS et al., 2001).
As características micromorfológicas são observadas após realização de
microcultivo em placas de Petri com ágar fubá ou ágar arroz acrescido de Tween 80 (MILAN,
ZAROR, 2004; DE HOOG et al., 2000). Microscopicamente Candida spp. são visualizadas
como células globosas ou elipsoidais, cilindroides ou alongadas, podendo formar hifas ou
pseudo-hifas (LACHANCE et al., 2011). Para muitas espécies de Candida, este teste permite
a identificação definitiva, uma vez que são formadas estruturas específicas, como hifas e
pseudo-hifas, dispostas em padrões característicos para cada espécie (Figura 1C) (MILAN,
ZAROR, 2004; DE HOOG et al., 2000).
Em seguida as cepas de Candida são submetidas aos testes bioquímicos,
assimilação e fermentação de carboidratos, a assimilação de nitrogênio e a prova da enzima
urease (BRITO et al., 2009).
A técnica de assimilação de carboidratos se baseia na avaliação do crescimento do
micro-organismo na presença de diferentes fontes de carbono, onde as espécies apresentam
padrões de assimilação distintos (Figura 1D). O teste de assimilação de nitrogênio tem o
mesmo conceito, onde se avalia a capacidade do isolado de crescer tendo somente fontes
inorgânicas de nitrogênio como fonte de nutrição (Figura 2A). A fermentação de carboidratos
é realizada em meio líquido e baseia-se na produção de ácido e/ou dióxido de carbono.
Embora esse teste seja útil para diferenciar as espécies de Candida, é considerado menos
17
sensível e, portanto, menos confiável do que o ensaio de assimilação de carboidratos (Figura
2B) (NEPPELENBROEK et al., 2013).
Figura 1 – A) Placa contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol demonstrando crescimento de colônias
de Candida spp.. B) Placa contendo ágar cromogênico, permitindo a identificação presuntiva de C. albicans (seta
verde), C. tropicalis (seta azul) e complexo C. parapsilosis (seta rosa). C) Microcultivo de C. tropicalis em ágar
fubá acrescido de Tween 80. Na microscopia observa-se presença de pseudo-hifa apresentando blastoconidíos al
longo da estrutura (aumento 400x). D) Prova de assimilação de carboidratos. Observa-se a halo de crescimento
onde a levedura avaliada assimilou os açúcares. Fonte: CEMM 2013.
Diversos métodos automatizados de identificação de micro-organismos têm sido
desenvolvidos nos últimos anos e, atualmente, estão sendo usados em diversos laboratórios de
microbiologia. Estes sistemas permitem uma identificação precisa e mais rápida de leveduras
clinicamente relevantes, melhorando a qualidade e a eficácia do cuidado ao paciente. Dentre
eles, o VITEK 2 (BioMérieux Vitek, Hazelwood, France) tem demonstrado ser um
instrumento confiável para a identificação de leveduras e, por isso, é um dos métodos
automatizados mais comumente utilizados nos laboratórios de todo o mundo
(NEPPELENBROEK et al., 2013).
Os métodos de identificação molecular (reação em cadeia da polimerase – PCR e
suas variações) tornaram-se um advento fundamental no avanço da identificação de Candida
A B
C D
18
spp., bem como para a identificação de novas espécies do gênero (NEPPELENBROEK et al.,
2013; TAVANTI et al., 2005). Os testes mais comumente utilizados incluem polimorfismo de
comprimento dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism -
RFLP), tipagem por sequenciamento multilocus (Multi-Locus Sequence Typing – MLST) e
polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD)
(MENEZES et al., 2015).
Figura 2 – A) Prova de assimilação de nitrogênio. Observa-se a halo de crescimento onde a levedura avaliada
assimilou peptona (controle). B) Prova de fermentação de carboidratos de Candida spp.. Observa-se a formação
de gás no interior do tubo de Durhan (produção de gás), indicativo de fermentação positiva (seta). Fonte: CEMM
2014.
2.1.2 Patogenicidade e fatores de virulência
Candida spp. são consideradas importantes patógenos oportunistas devido a sua
versatilidade e habilidade de sobreviver em diferentes sítios anatômicos (SARDI et al., 2013).
Para o estabelecimento da infecção, o patógeno oportunista deve invadir o tecido do
hospedeiro, evadir-se do sistema imune, sobreviver, reproduzir no ambiente do hospedeiro e,
em casos de infecção sistêmica, disseminar para outros tecidos e órgãos (SILVA et al., 2012).
O consenso atual é que espécies de Candida participam ativamente da
patofisiologia da doença usando mecanismos de agressão chamados fatores de virulência
(SARDI et al., 2013). A expressão desses fatores pode variar de acordo com a espécie
envolvida na infecção, origem geográfica, tipo, local e estágio da infecção bem como a reação
do hospedeiro (DEORUKHKAR et al., 2014).
Os fatores de virulência incluem aderência a células do hospedeiro, variabilidade
fenotípica, formação de tubo germinativo, secreção de enzimas hidrolíticas como proteases e
19
fosfolipases, além da capacidade de formar biofilme tanto em tecidos do hospedeiros quanto
em dispositivos médicos (DEEPA et al., 2015; DEORUKHKAR et al., 2014; SANTANA et
al., 2013; SILVA et al., 2012).
A colonização representa o primeiro estágio da infecção e, para tanto, a aderência
ao tecido do hospedeiro é essencial (MODRZEWSKA, KURNATOWSKI, 2015; VAZQUEZ,
SOBEL, 2011), além de contribuir para a persistência do micro-organismo no hospedeiro,
para o estabelecimento e persistência da infecção como também para posterior produção de
biofilme (SILVA et al., 2012).
A adesão é determinada por vários genes e influenciada por vários fatores
inerentes ao fungo, ao hospedeiro e ao ambiente, como por exemplo, a formação de tubo
germinativo, disponibilidade de carboidratos, pH, temperatura e produção de fosfolipases e
proteases (MODRZEWSKA, KURNATOWSKI, 2015; SANTANA et al., 2013). É um
fenômeno complexo e multifatorial que se baseia na expressão de diversos tipos de adesinas
nas superfícies de células modificadas morfologicamente que se ligam a aminoácidos e
açucares da superfície de outras células ou promovem a aderência em superfícies abióticas
(SANTANA et al., 2013; SARDI et al., 2013).
Para sobreviver sob diversos tipos de estresse fisiológico no hospedeiro, Candida
spp. podem alterar sua forma entre levedura, pseudo-hifas e hifas em resposta a alterações no
ambiente (BUU, CHEN, 2013). Dessa forma, espécies de Candida podem ser encontradas em
ambas as formas no hospedeiro. Durante uma infecção sistêmica, acredita-se que a forma de
levedura seja importante para a rápida disseminação em órgãos-alvo via corrente sanguínea
enquanto hifas e pseudo-hihas desempenham um papel importante na lise dos macrófagos e
neutrófilos, invasão de camadas de células epiteliais e de uma variedade de tecidos, além da
formação de biofilme (SILVA et al., 2012; THOMPSON et al., 2011).
As enzimas hidrolíticas extracelulares desempenham um importante papel na
patogênese da candidíase. Essas enzimas facilitam a adaptação a diferentes tipos de infecção e
aumentam a sobrevivência do patógeno. A maioria dos estudos sobre exoenzimas são focados
nas fosfolipases e proteinases aspárticas secretadas (DEORUKHKAR et al., 2014).
As fosfolipases fazem parte de um grupo heterogêneo de enzimas que estão
associadas a dano na membrana celular do hospedeiro favorecendo, assim, a aderência e
invasão (DEEPA et al., 2015; SARIGUZEL et al., 2015). Em geral, as fosfolipases são
classificadas em cinco subclasses: A, A2, B, C e D, dependendo da ligação éster específica
que a enzima tem como alvo (PARK; DO; JUNG, 2013). Normalmente se localizam na
superfície da levedura ou na extremidade do tubo germinativo e atuam hidrolisando uma ou
20
mais ligações éster nos glicerofosfolipídeos, principais componentes químicos das membranas
celulares hospedeiras, ocasionado dano a membrana celular resultando em lise celular
(DEEPA et al., 2015; SARIGUZEL et al., 2015; SANTANA et al., 2013).
O método mais utilizado para a detecção de produção de fosfolipases é baseado no
crescimento de leveduras em meio ágar Sabouraud dextrose acrescido de gema de ovo, uma
rica fonte de fosfolipídios (Figura 3A). Nos isolados positivos é possível observar a formação
de uma zona de precipitação densa ao redor da colônia, relacionada à quebra dos fosfolipídios
em complexos de cálcio e ácidos graxos decorrente da ação enzimática (GHANNOUM, 2000;
NEGRI et al., 2012).
As proteinases aspárticas secretadas (SAPs) são produzidas por algumas espécies
de Candida durante a infecção (DEEPA et al., 2015). C. albicans é a espécie mais estudada
sendo relatado dez isoenzimas com atividade proteolítica codificadas pelos genes SAP (Sap1-
Sap10). Ademais, já foram descritas SAPs em C. tropicalis, C. parapsilosis e C,
guilliermondii (SARDI et al., 2013). As proteinases hidrolisam as ligações peptídicas das
proteínas presente nas células do hospedeiro (SANTANA et al., 2013) facilitando a invasão e
colonização dos tecidos pelo rompimento das membranas mucosas através da degradação de
colágeno, queratina e caderina-E, principal proteína de junção das células epiteliais. Também
participam na resistência contra o sistema imune do hospedeiro pois degrada anticorpos,
citocinas e proteínas do sistema complemento (CARVALHO-PEREIRA et al., 2015;
DEORUKHKAR et al., 2014, SANTANA et al., 2013; SILVA et al., 2012).
Um dos métodos utilizados para avaliação da produção de proteinase é através de
meio sólido contendo albumina sérica bovina. Nos isolados positivos é possível observar a
formação de halo de proteólise ao redor da colônia (Figura 3B) (VIDOTTO et al., 2004).
21
Figura 3 – A) Avaliação da produção de fosfolipases extracelulares por cepas de Candida spp. em meio ágar
gema de ovo. Observa-se a formação de uma zona esbranquiçada e opaca ao redor da colônia (seta), indicativa
da produção da enzima. B) Avaliação da produção de proteases extracelulares por cepas de Candida spp. em
meio ágar BSA. Observa-se a formação de uma zona clarificada de proteólise ao redor da colônia (seta), que
indica a produção da enzima. Fonte: CEMM 2013.
Estima-se que 80% de todos os micro-organismos no meio ambiente existem na
forma de biofilme (RAMAGE et al., 2012). A produção de biofilme desempenha um
importante papel na patogênese da candidíase e é considerado um dos principais fatores de
virulência de Candida spp.. Evidências recentes sugerem que a maioria das infecções
ocasionadas por C. albicans está associada com a formação de biofilme (SARDI et al., 2013)
Biofilmes são definidos como comunidades bem estruturadas de micro-
organismos que estão aderidos a uma superfície, ligados entre si, e envoltos em uma matriz
extracelular polimérica (MATHÉ, DIJCK, 2013), exibindo um fenótipo diferente das células
planctônicas em relação à transcrição gênica, taxa de crescimento e resistência antifúngica
(TOURNU, DJICK, 2012).
O processo de formação do biofilme inicia-se com a adesão das células
planctônicas em um substrato. Essa adesão primária é mediada por interações não específicas
como forças hidrofóbicas e eletrostáticas como também por ligações especificas das adesinas
(Figura 4A) (PANNANUSORN et al., 2014; SANTANA et al., 2013; SARDI et al., 2013).
Essas células proliferam formando microcolônias que se aglutinam gerando a camada basal
do biofilme (Figura 4B) (DESAI, MITCHELL, 2015).
Em seguida começa a fase de filamentação e proliferação que resulta na formação
de múltiplas camadas de células sésseis com diferentes morfologias incluindo pseudo-hifas e
hifas (Figura 4C) (SANTANA et al., 2013; TOURNU, DJICK, 2012). A formação de hifas é
importante pois confere uma estrutura robusta ao biofilme, além da expressão de várias
A B A
22
moléculas de adesão, como por exemplo as proteínas Als3 e Hwp1, que promovem ligação
célula-célula e célula-substrato (PANNANUSORN et al., 2014). Próximo passo da formação
do biofilme é a fase de maturação com produção da matriz extracelular polimérica, a qual é
constituída de carboidratos, proteínas, hexosamina, fósforo, ácido urônico e DNA extracelular
(TOURNU, DJICK, 2012). A presença da matriz fortalece a estrutura do biofilme e confere
proteção contra o sistema imune do hospedeiro e drogas antifúngicas (Figura 4D)
(PANNANUSORN et al., 2014; SILVA et al., 2012).
A próxima fase da formação do biofilme consiste na dispersão de células que
permitem colonizar outros sítios, o que está associado a candidemia e infecção disseminada
(Figura 4E) (DESAI, MITCHELL, 2015; MATHÉ, DIJCK, 2013). Uppuluri et al. (2010)
relataram que a dispersão das células ocorre ao longo do desenvolvimento do biofilme e não
representa uma fase temporária distinta. Essas células liberadas são leveduriformes e
fenotipicamente distintas das células planctônicas que originaram o biofilme. Ademais,
apresentam níveis mais elevados de aderência as células endoteliais e substratos plásticos
(como cateteres) provavelmente devido a sua maior propensão a produção de hifas. Assim, o
biofilme produz uma classe única de células de levedura com capacidade aumentada de criar
novos biofilmes e causar infecção.
Figura 4 – Etapas da formação de biofilme de Candida spp. Fonte: Adaptado de Chauhan et al. (2013).
As vantagens da formação de biofilme para o microrganismo incluem proteção
contra o ambiente, resistência a estresses físicos e químicos, cooperação metabólica e
regulação da expressão gênica baseada na comunidade (RAMAGE et al., 2012). Ademais, a
produção de biofilmes está associada a resistência antimicrobiana dos microrganismos
associados (SARDI et al., 2013).
A D C B E
23
Os biofilmes são a principal causa de infecções relacionadas a dispositivos
médicos, sendo Candida spp. as mais comumente isoladas em infecções fúngicas. Já foram
relatadas formações de biofilme em cateteres venosos centrais, cateteres urinários,
dispositivos de diálise, aparelhos cardiovasculares, próteses de voz, implantes penianos,
dentaduras e implantes oculares (SARDI et al., 2013; RAMAGE et al., 2012).
Infecções em dispositivos médicos associadas a produção biofilme por Candida
spp. possuem uma taxa de mortalidade maior que 30% nos Estados Unidos (SARDI et al.,
2013). Dentre as espécies de Candida relacionadas a essas infecções, C. albicans é a mais
comumente descrita. Nos últimos anos, entretanto, o número de infecções ocasionada por
espécies de Candida não-albicans tem aumentado significativamente, inclusive relacionado a
formação de biofilme. Mathé & Dijck (2013) e Sardi et al. (2013) relataram que biofilmes
formados por C. glabrata, complexo C. parapsilosis e C. tropicalis têm sido associados com
altas de morbidade e mortalidade. Adicionalmente, Simitsopoulou et al. (2014) relataram que
C. guilliermondii e C. lusitaniae também são capazes de produzir biofilme e que os mesmos
apresentaram resistência aos derivados azólicos. (Figura 5).
Vários estudos relatam que biofilmes formados por Candida spp. são resistentes a
maioria das drogas antifúngicas comumente utilizadas na clínica médica, especialmente os
derivados azólicos (SARKAR et al., 2014, SHINDE et al., 2012). Diversas hipóteses têm sido
formuladas para explicar a diminuição da sensibilidade de biofilmes de Candida spp. frente as
drogas antifúngicas, dentre elas, diminuição do metabolismo ou uma fisiologia específica das
células do biofilme, restrição na penetração das drogas através da matriz do biofilme e a
expressão de genes específicos das células do biofilme que contribuem para a resistência
antifúngica (MITCHELL et al., 2013; VEDIYAPPAN et al., 2010).
Infecções associadas a biofilmes são inerentemente difíceis de tratar e podem requerer
terapia antifúngica a longo-prazo uma vez que células sésseis de biofilme apresentam uma
aumentada resistência a agentes antimicrobianos, bem como proteção contra as defesas do
hospedeiro (RAMAGE et al., 2012).
24
Figura 5 – Biofilme de C. guilliermondii por meio de microscopia eletrônica de varredura. Fonte: CEMM 2015.
2.1.3 Resistência a drogas antifúngicas
A resistência a drogas antifúngicas é um fenômeno que tem aumentado
significativamente nos últimos anos e pode ser clinicamente definida como a persistência de
sinais e sintomas da infecção, apesar da presença de um nível tolerável do fármaco (SILVA et
al., 2012). Do ponto de vista microbiológico, a resistência microbiana refere-se a não-
sensibilidade de um fungo a um agente antifúngico em um teste de sensibilidade in vitro, no
qual a concentração inibitória mínima (CIM) da droga excede o ponto de corte de
sensibilidade daquele micro-organismo (KANAFANI; PERFECT, 2008).
Embora a resistência microbiológica possa contribuir para o desenvolvimento
clínica de resistência, outros fatores também podem estar envolvidos, como a diminuição da
imunidade do hospedeiro, presença de doença de base, redução da disponibilidade da droga e
aumento do metabolismo do fármaco (SANGUINETTI et al., 2015).
Os mecanismos da resistência antifúngica são primários ou secundários e estão
relacionados, respectivamente, às características intrínsecas ou adquiridas do patógeno
fúngico que interferem mecanismo de ação da droga (PFALLER, 2012). A resistência
intrínseca pode ocorrer em todos os membros de uma determinada espécie como no caso de
C. krusei frente ao fluconazol ou apenas em certas cepas pertencentes a uma espécie, em
regra, sensível ao antifúngico. A resistência adquirida ocorre quando cepas sensíveis de uma
espécie desenvolvem resistência a um determinado antifúngico após exposição ao fármaco
(ARENDUP, 2014; PAPPAS et al. 2009).
25
Comparado com antibióticos, o desenvolvimento de drogas antifúngicas tem sido
limitado. Isto pode ser atribuído a fatores inerentes a problemas na identificação de um agente
efetivo que atue na célula fúngica sem ocasionar toxicidade no hospedeiro, visto as
similaridades entre as células animais e fúngicas (SILVA et al., 2012).
Os antifúngicos utilizados na terapêutica de candidíase são provenientes de três
principais classes das drogas antifúngicas: derivados poliênicos, derivados azólicos e as
equinocandidas (KATHIRAVAN et al. 2012; PAPPAS et al. 2009).
A anfotericina B é um derivado poliênico considerado fungicida devido a
habilidade de se ligar de forma irreversível ao ergosterol, principal componente da membrana
celular fúngica, ocasionando a formação de poros nessa membrana e o extravasamento de
conteúdo citoplasmático levando a morte celular (KATHIRAVAN et al. 2012; SILVA et al.,
2012). A resistência a anfotericina B não é frequente, mas foram detectados isolados de
leveduras e fungos filamentosos resistentes. Os mecanismos de resistência ainda são pouco
conhecidos, mas a maior parte deles está relacionado com um decréscimo na quantidade de
ergosterol da membrana ou um aumento dos fosfolipídios que reduzem a interação do
fármaco com os esteróis. Essas alterações estão associadas com mutações nos genes ERG2 ou
ERG3, que codificam enzimas que participam da via de síntese do ergosterol (Figura 6)
(CUENCA-ESTRELLA, 2010).
Os derivados azólicos são a maior classe de drogas antifúngicas de uso clínico e
primeira escolha no tratamento de infecções fúngicas, especialmente as causadas por Candida
spp., incluem fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol (HE et al., 2015). Sua atuação
consiste na inibição da enzima lanosterol-14-α-demetilase, que cataliza a conversão do
lanosterol em ergosterol. Com isso, não ocorre a síntese do ergosterol e existe o acúmulo do
precursor lanosterol, que é convertido em 14-α-metilfecosterol e sofre ação da enzima Δ-5,6-
desaturase, resultando em acúmulo de metabólitos tóxicos (14-a-methyl-3,6-diol) e depleção
do ergosterol. Consequentemente, ocorre uma redução no ergosterol presente na membrana
celular fúngica além de alterações estruturas e funcionais levando a inibição do crescimento
fúngico (Figura 6) (SANGUINETTI et al., 2015; PFALLER et al., 2012).
São descritos três mecanismos de resistência aos derivados azólicos por Candida
spp.. O primeiro está relacionado com a superexpressão das bombas de efluxo que resultam
em diminuição da concentração das drogas na enzima alvo da membrana celular. Essa
superexpressão é regulada tanto pelo gene MDR como pelo gene CDR e têm sido associados
com resistência aos azólicos em C. albicans (MDR1, CDR1, CDR2), C. glabrata (CgCDR1,
CgCDR2), C. dubluniensis (CdMDR1, CdCDR1) (HE et al., 2015; SANGUINETTI et al.,
26
2015; PFALLER et al., 2012) e C. tropicalis (MDR1) (HE et al., 2015). Adicionalmente, a
regulação das bombas de efluxo pelo gene MDR está relacionado com resistência ao
fluconazol (PFALLER et al., 2012).
O segundo mecanismo é através de mutações pontuais no gene que codifica a
enzima alvo (ERG11) ocasionando uma redução da afinidade dos azóis ou até mesmo a
incapacidade de ligação. A superxpressão desse gene também pode ocasionar resistência,
visto que irá aumentar concentração da enzima alvo, necessitando, assim, de uma maior
quantidade droga para inibição do crescimento fúngico (HE et al., 2015). Ademais, a
resistência intrínseca de C. krusei ao fluconazol tem sido atribuída a diminuição da afinidade
da ERG11 pela droga (SANGUINETTI et al., 2015).
O terceiro mecanismo está relacionado com desvio na via de biossíntese do
ergosterol. Como explicado anteriormente, os azóis atuam inibindo a enzima lanosterol-14-α-
demetilase gerando metabólitos tóxicos que causam dano a membrana celular. Baseado nisso,
tem se demonstrado que mutações no gene ERG3 causam a inibição da enzima Δ-5,6-
desaturase anulando o efeito dos azóis na membrana celular (SANGUINETTI et al., 2015;
PFALLER et al., 2012).
A equinocandinas atuam sobre a 1,3-β-glucana-sintetase, enzima necessária para a
formação de polímeros de 1,3- β-glucana, um dos componentes da parede celular fúngica. A
inibição desta enzima reduz a síntese de glucano, causando instabilidade osmótica, lise e
morte celular (CUENCA-ESTRELLA, 2010). A resistência em Candida spp. é atribuída
principalmente à mutações, pontuais ou intrínsecas, em regiões específicas do gene FKS que
codifica a enzima 1,3-β-glucana-sintetase. Essas mutações ocorrem principalmente na
unidade catalítica da enzima1,3-β-glucana-sintetase, chamada de FKS1 e em menor grau na
FKS2. A resistência a caspofungina por C. albicans, C. krusei, C. tropicalis e C. dubliniensis
está relacionada com mutações no FKS1, enquanto C. glabrata apresenta mutações em FKS1
e FKS2 (Figura 6) (SANGUINETTI et al., 2015; KATHIRAVAN et al. 2012; PFALLER et
al., 2012).
27
Figura 6 – Área e receptores de ação das drogas antifúngicas: poliênicos, equinocandinas e derivados azólicos.
Fonte: Adaptado de Tscherner et al., 2011.
Desde o início da década de 1990 foi observado um aumento na resistência de
isolados clínicos a drogas azólicas. Estudos realizados com espécies de Candida relacionadas
a infecções humanas apontam um aumento na resistência desses micro-organismos a essas
drogas, sendo essa resistência relacionada principalmente ao fluconazol (COLOMBO et al.,
2006; PFALLER; DIEKEMA, 2007; DA COSTA et al., 2009; PAM et al., 2012).
Dados da literatura mostram também um aumento na resistência de isolados de
Candida spp. de origem animal, seja esses isolados apresentando-se como comensais e parte
da microbiota ou causando algum tipo de infecção no animal. Assim como nos micro-
organismos isolados de humanos, as cepas de origem animal apresentam uma resistência
elevada aos derivados azólicos, como fluconazol e itraconazol (CORDEIRO et al., 2015,2013;
BRILHANTE et al., 2013,2012,2011; SIDRIM et al., 2010; BRITO et al., 2009).
28
3 JUSTIFICATIVA
O agronegócio desempenha um papel importante na economia do País e o setor da
equinocultura tem crescido nos últimos anos. Com isso, o investimento tanto na compra de
animais quanto na manutenção da sua saúde destes animais, tem gerado uma maior
preocupação acerca de doenças que possam ocasionar prejuízos ao animal e uma possível
diminuição de desempenho.
Dados acerca das infecções fúngicas nos sistemas respiratórios e ocular ainda são
escassos se comparados com infecções bacterianas e virais. Assim, em virtude do potencial
patogênico das leveduras do gênero Candida, o conhecimento acerca da microbiota
conjuntival e do ducto nasolacrimal são importantes para um melhor entendimento de
processos patológicos. Além disso, o conhecimento do perfil de sensibilidade a drogas
antifúngicas e a determinação dos fatores de virulência podem auxiliar os médicos
veterinários na escolha do tratamento, direcionando, assim, a um melhor prognóstico.
29
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Leveduras do gênero Candida isoladas da mucosa conjuntival e ducto
nasolacrimal de equinos saudáveis apresentam resistência a antifúngicos de uso terapêutico.
As leveduras isoladas do ducto nasolacrimal de equinos saudáveis são capazes de
produzir e secretar fosfolipases e proteases.
As leveduras isoladas da mucosa conjuntival de equinos saudáveis são capazes de
produzir biofilme.
Os biofilmes maduros de Candida spp. isoladas da conjuntiva ocular de equinos
apresentam rseistência frente aos antifúngicos anfotericina B fluconazol, itraconazol e
caspofungina.
30
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo geral
Identificar Candida spp. isoladas da mucosa conjuntival e ducto nasolacrimal de
equinos e determinar a sensibilidade in vitro destas leveduras a drogas antifúngicas, bem
como avaliar a produção dos fatores de virulência proteases, fosfolipases e biofilme.
5.2 Objetivos específicos
1) Identificar e quantificar as leveduras presentes na mucosa conjuntival e ducto nasolacrimal
de equinos.
2) Investigar a sensibilidade antifúngica in vitro das leveduras isoladas, frente à anfotericina
B, derivados azólicos e caspofungina;
3) Determinar os fatores de virulências fosfolipases e proteases nos isolados oriundos do
ducto nasolacrimal;
4) Avaliar a capacidade de produção de biofilme e ante as drogas anfotericina B, derivados
azólicos e caspofungina nos isolados provenientes da mucosa conjuntival.
31
6 CAPÍTULO 1
Sensibilidade antifúngica e fatores de virulência de Candida spp. oriundas do ducto
nasolacrimal de equinos
Trends in antifungal susceptibility and virulence of Candida spp. from the nasolacrimal
duct of horses
Periódico: Medical Mycology (Publicado 18 de outubro de 2015)
Fator de impacto: 2,335 (Qualis A2)
32
RESUMO
O objetivo desse estudo foi investigar a sensibilidade antifúngica e a produção de fatores de
virulência em cepas de Candida isoladas do duto nasolacrimal de equinos no Estado de Ceará,
Brasil. As amostras foram obtidas de 103 equinos. Swabs estéreis foram usadas para coletar
material ao redor do ducto nasolacrimal e sondas uretrais, com a instilação de 2 ml de solução
salina, foram utilizadas para obter amostras a partir do lúmen do ducto nasolacrimal. Um total
de 77 Candida isolados foram obtidos, C. famata, C. tropicalis, C. guilliermondii, e C.
parapsilosis lato sensu foram as espécies mais prevalentes. Um isolado (C. glabrata) foi
resistente à caspofungina. Um isolado foi resistente apenas para fluconazol (C. parapsilosis
lato sensu), 11 foram resistentes somente a itraconazol (7 C. tropicalis, 2 C. guilliermondii, 1
C. famata, 1 C. parapsilosis lato sensu), enquanto oito C. tropicalis apresentaram resistência
a ambos os azóis. Em geral, 28 isolados produziram fosfolipases e 12 produziram proteases.
Estes resultados destacam a importância de investigar a sensibilidade antifúngica e os fatores
de virulência de Candida spp. oriundas da microbiota do ducto nasolacrimal de equinos.
Palavras-chave: equinos, leveduras, antifúngicos, resistência, virulência.
33
34
Medical Mycology – Original paper
Trends in antifungal susceptibility and virulence of Candida spp. from the nasolacrimal
duct of horses
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante1,*, Paula Vago Bittencourt2, Débora de Souza Collares
Maia Castelo-Branco1, Jonathas Sales de Oliveira1, Lucas Pereira de Alencar1, Rossana de
Aguiar Cordeiro1, Mariana Pinheiro2, Evilázio Fernandes Nogueira-Filho2, Waldemiro de
Aquino Pereira-Neto3, José Júlio Costa Sidrim1, Marcos Fábio Gadelha Rocha1,2
1Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical
Mycology Center, Graduate Program in Medical Microbiology, Federal University of Ceará,
Fortaleza-CE, Brazil.
2School of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State
University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
3Department of Transport Engineering, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
*Corresponding Author: Raimunda S. N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese.
CEP: 60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 (85) 3295-1736 E. mail: [email protected].
35
Abstract
This was a cross-sectional study to investigate the antifungal susceptibility and
production of virulence factors in strains of Candida isolated from the outlet and the lumen of
the nasolacrimal duct of horses in the state of Ceará, Brazil. The samples were obtained from
103 horses. Sterile cotton swabs were used to collect the material from the outlet of the
nasolacrimal duct and urethral probes, for the instillation of 2 mL of saline solution, were
used to collect samples from the lumen of the nasolacrimal duct. A total of 77 Candida
isolates were obtained, with C. famata, C. tropicalis, C. guilliermondii and C. parapsilosis
sensu lato as the most prevalent species. One isolate (C. glabrata) was resistant to
caspofungin. One isolate was resistant only to fluconazole (C. parapsilosis sensu lato), 11
were resistant only to itraconazole (7 C. tropicalis, 2 C. guilliermondii, 1 C. famata, 1 C.
parapsilosis sensu lato), while eight C. tropicalis showed resistance to both azoles. Overall,
28 isolates produced phospholipases and 12 produced proteases. These results highlight the
importance of investigating the antifungal susceptibility and virulence trends of Candida spp.
from the microbiota of the nasolacrimal duct of horses.
Keywords: horses, yeasts, antifungal, resistance, virulence
36
Introduction
Yeasts of the genus Candida are commensal in the microbiota of the skin and mucosas
of humans and several animal species, including equids.1-7 In the study of Rózanski et al.3, the
nasal cavity was among the three anatomical sites from which yeasts were most often
recovered. Cordeiro et al.4 investigated the microbiota of the nasal cavity at two collection
sites (caudal and rostral regions) and reported the presence of the species Candida famata, C.
guilliermondii, C. parapsilosis, C. tropicalis and C. pelliculosa, while Rózanski and others3
reported the recovery of C. gulliermondii, C. tropicalis and C. ciferrii from the nostrils of
thorough bred mares.
Although the nasal cavity and the outlet and the lumen of the nasolacrimal duct are
interconnected, there are no studies describing the Candida spp. microbiota of the
nasolacrimal duct of horses or the antifungal susceptibility and virulence trends of these
microorganisms. Information on the species of Candida naturally occurring in the
nasolacrimal duct of horses and their susceptibility and virulence traits is important from an
epidemiological point of view, since these microorganisms often become pathogenic when
exposed to favorable conditions.3
Therefore, the aim of this study was to investigate the antifungal susceptibility and the
production of virulence factors by Candida strains isolated from the microbiota of the outlet
and the lumen of the nasolacrimal duct of horses in the state of Ceará, northeastern Brazil.
37
Material and Methods
Animals
A total of 103 horses were included in the study. The animals were housed in stalls
(n=73), paddocks (n=8) or both (n=22) and came from the municipalities of Fortaleza
(03º43´25´´ S, 38º32´36´´ W), Eusébio (03º53´25´´ S, 38º27´05´´ W), Caucaia (3º44´04´´ S,
38º39´23´´ W), Horizonte (04º05´09´´ S, 38º 39´05´´ W), Cascavel (04º07´59´´ S, 38º14´31´´
W), Pacatuba (03º59´03´´ S, 38º37´13´´ W) and Pacoti (04º13´30´´ S, 38º55´24´´ W), in the
state of Ceará, northeastern Brazil. Samples were collected from males (n=63) and females
(n=40), both juveniles (≤4 years, n=30), and adults (>4 years, n=73), of 11 different breeds
(32 quarter horses; 26 undetermined breed; 14 thoroughbred; 12 ponies; 10 Brazilian sport
horses; 2 appaloosas; 2 paint horses; 2 Arabians; 1 Anglo-Arabian; 1 Lusitane; 1 Westfalen).
A clinical-epidemiological form was filled out for each horse with data on origin, age, sex,
breed and clinical characteristicsThe project was approved by the ethics committee of the
State University of Ceará (UECE), under the license number 12776861-0.
Sample collection, isolation and identification
The samples from the nasolacrimal duct outlet were obtained by insertion and rotation
of sterile swabs. The swabs were then placed in individual sterile glass tubes containing 1 mL
of sterile saline (0.9% NaCl) in order to keep the tip of the swab in contact with the saline
solution, until processing the samples, within 12 hours.8 In turn, the samples from the lumen
of the nasolacrimal duct were collected by the method described by Brilhante et al.9, with
some modifications. Sterile urethral catheters (no. 4) were attached to sterile 3-mL syringes
containing 2 mL of sterile saline solution. The urethral catheter was inserted into the
nasolacrimal duct, through the nasal opening, as described by Holtgrew-Bohling10.
Afterwards, the saline solution was injected into the lumen of the nasolacrimal duct and
38
aspirated back into the syringe. The volume obtained from each horse was placed in a sterile
glass tube. All samples were placed in isothermal chests and taken to the Specialized Medical
Mycology Center of the Federal University of Ceará for processing.
The samples from the outlet of the nasolacrimal duct were seeded in Petri dishes
containing chromogenic medium (CHROMagar CandidaTM), with the swabs, while those
obtained from the lumen were seeded on the same medium with sterile microbiological loops.
The dishes were incubated for 48 hours at a temperature of 37 ºC. The colonies suggestive of
yeasts were Gram stained and observed under an optical microscope (40X) to verify the
presence of blastoconidia, hyphae or pseudohyphae, as well as to rule out the possibility of
bacterial contamination.9
The colonies isolated were seeded in Petri dishes containing corn meal agar plus
Tween 80 and incubated for up to 5 days at 25 ºC, after which they were observed under an
optical microscope to note the micromorphology. Biochemical tests (carbohydrate and
nitrogen assimilation, carbohydrate fermentation and urease tests) were performed to finalize
the identification of the strains.11 In cases of dubious identification, the isolates were
identified with the automated VITEK 2 system.4
In vitro antifungal susceptibility testing
The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the antifungals amphotericin B,
caspofungin, fluconazole and itraconazole were determined by the broth microdilution
method, as standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute12, for all the
Candida spp. (n=77) isolates. The strain Candida parapsilosis ATCC 22019 was included as
control in all the tests. The fungal inoculum was prepared from the cultures grown on potato
agar at 28 °C, for 24 hours. For this purpose, samples of the colonies were placed in sterile
tubes containing 5 mL of saline solution (0.9% NaCl), and adjusted to 0.5 on the McFarland
39
scale. The suspensions were diluted in RPMI 1640 medium, buffered with MOPS (3-(N-
morpholino)propanesulfonic acid) at 0.165 M, pH 7.0, to obtain an inoculum of
approximately 1 x 103 to 5 x 103 CFU/mL.12 The final concentrations of the antifungal drugs
(amphotericin B, caspofungin, fluconazole and itraconazole) were determined as
recommended by the CLSI.12 The tests were run in duplicate. The dishes were incubated at 35
º C, for 48 h. The MIC for caspofungin and the azole derivatives (fluconazole and
itraconazole) was considered to be the lowest concentration able to inhibit fungal growth by
50% compared to the control, while for amphotericin B, the MIC was defined as the lowest
concentration able to inhibit 100% of fungal growth. MIC values >1, ≥64 and ≥ 1µg/mL
indicated in vitro resistance to amphotericin, fluconazole and itraconazole, respectively. For
the species C. albicans, C. parapsilosis and C. tropicalis, MIC values ≥8 µg/mL indicated
resistance to fluconazole.13 For caspofungin, MIC values ≥0.5 µg/mL against C. glabrata, ≥1
µg/mL against C. albicans, C. tropicalis and C. krusei and ≥8 µg/mL against C. parapsilosis
lato sensu and C. guilliermondii indicated resistance.13 For the other species, MIC values >2
µg/mL indicated that the strains were non-susceptible to caspofungin.12
Production of proteases
The same strains (n=77) assessed for antifungal susceptibility were also tested for
protease activity. This test was conducted as described by Vidotto et al.14, with modifications.
The medium used was bovine serum agar (BSA), composed of 2% dextrose, 0.1% yeast
extract, 0.5% NaCl, 0.25% K2HPO4, 0.02% MgSO4 7H2O, 1.5% bacteriological agar and
0.25% bovine serum albumin. The yeasts were grown in YEPD broth at 35 ºC, for 24 h, after
which the tubes were centrifuged at 3000 rpm, for 10 min, and the supernatant was discarded.
An inoculum of each strain was prepared in sterile saline solution and adjusted to a final
concentration of 5 on the McFarland scale. Then 10 μL each inoculum was pipetted onto
40
sterilized filter paper disks with diameter of 5 mm, which were placed in dishes containing
BSA agar. The dishes were incubated at 35 °C for up to 5 days. The enzyme activity (Pz) was
determined by calculating the ratio between the diameter of the fungal colony and the total
diameter including the colony and proteolysis zone. When Pz=1, the isolate is negative for
protease production, while Pz<1 indicates the isolate is positive for enzymatic production.
The lower the Pz value, the higher the enzyme activity is.
Production of phospholipases
The same isolates (n=77) tested for antifungal susceptibility were also investigated for
phospholipase activity. For this purpose, 2% Sabouraud dextrose agar, supplemented with 1
mol/L of sodium chloride, 0.05 mol/L of calcium chloride and 8% sterile egg yolk emulsion,
at a concentration of 30%, was used. The medium was spread in Petri dishes to form a 4-mm
film. The inocula were prepared in sterile saline solution with a final concentration of 4 on the
McFarland scale. Sterile filter paper disks (5 mm diameter) were placed on the agar and 5 µL
of each inoculum was added to the surface. The dishes were incubated at 35 °C, for 7 days.15
The phospholipase activity (Phz) was determined by calculating the ratio between the
diameter of the fungal colony and the total diameter, including the colony and precipitation
zone. Therefore, when Phz=1, the isolate is negative for phospholipase activity, while when
0.64≤Phz<1 it is positive and when Phz<0.64 the isolate is strongly positive for this enzyme.16
Statistical analysis
In order to compare the categorical data between horse breed, gender, age, recovered
yeast species and anatomical site, Pearson's Chi-square test and Fisher's exact were applied.
As for the comparisons between MIC values and protease and phospholipase production,
41
Mann-Whitney's non-parametric test was used. Finally, MIC values were submitted to Log2
transformation and compared between different Candida species. P-values lower than 0.5
were adopted for significant conclusions.
Results
Of the total of 103 horses evaluated, Candida species were isolated from 45 animals
(43.68%). Of the positive animals, 29 were males (20 adults and 9 juveniles) and 16 were
females (11 adults and 5 juveniles), with no significant differences between genders and age.
Candida spp. were recovered from the outlet of the nasolacrimal duct of large horses and
ponies, while these microorganisms were only recovered from the lumen of the nasolacrimal
duct of 4 of the 12 tested ponies. Three of these ponies were also positive for the presence of
Candida in the outlet of this duct.
Of these animals, 77 Candida isolates were recovered, of which 70 were obtained
from the outlet of the nasolacrimal duct, while only seven were recovered from the lumen of
the duct. The recovery rate of Candida spp. from the outlet of the nasolacrimal duct was
statistically higher than that from the lumen (P<0.0001).
Of the 70 isolates recovered from the outlet of the nasolacrimal duct, the most
common species was C. famata (n= 27), followed by C. tropicalis (n=18), C. guilliermondii
(n=7), C. parapsilosis sensu lato (n=6), C. glabrata (n=4), C. rugosa (n=2), C. albicans
(n=1), C. krusei (n=1), C. pelliculosa (n=1), C. colliculosa (n=1), C. lusitaniae (n=1) and C.
catenulata (n=1). The species isolated from the lumen of the duct were C. ciferrii (n=4), C.
tropicalis (n=2) and C. intermedia (n=1) (Table 1). C. famata (P<0.0001), C. tropicalis
(P=0.0003) and C. guilliermondii (P=0.029) were more prevalent in the outlet of the
nasolacrimal duct, when compared to the lumen of this duct. In addition, C. tropicalis was
more prevalent in quarter horses than in those with undetermined breed (P=0.0155) and C.
42
ciferrii was more prevalent in Ponies, when compared to quarter horses (P=0.0166),
undetermined breed (P=0.0467) and thoroughbred (P=0.0467). Interestingly, C. ciferii was
only recovered from the lumen of the nasolacrimal duct. Due to the reduced number of
animals belonging to the other breeds, no other statistically significant results were observed.
Concerning the antifungal susceptibility, the MIC values ranged from 0.03125 to 1
µg/mL for amphotericin B, from 0.03125 to 2 µg/mL for caspofungin, from 0.125 to >64
µg/mL for fluconazole and from 0.03125 to >16 µg/mL for fluconazole (Table 2). Resistance
to fluconazole alone (MIC≥8 µg/mL) was observed in one isolate of C. parapsilosis sensu
lato, while resistance to itraconazole alone was noted in seven strains of C. tropicalis, two C.
guilliermondii, one C. famata and one C. parapsilosis sensu lato (MIC≥1 µg/mL). Resistance
to both azole derivatives was observed in eight isolates of C. tropicalis. Only one strain (C.
glabrata) was resistant to caspofungin and none were resistant to amphotericin B (Table 3).
MICs against C. tropicalis were statistically higher than those against C. famata (P=0.015) for
amphotericina B, and C. famata (P=0.0008) and C. parapsilosis sensu lato (P=0.0278) for
itraconazole. As for caspofungin, MICs against C. famata were statistically higher than those
against C. tropicalis. No statistically significant differences were observed between
fluconazole MICs against different Candida spp.
Regarding the production of exoenzymes, of the 77 tested isolates, 28 were positive
for the production of phospholipases (1/1 C. catenulata; 2/4 C. ciferrii; 10/27 C. famata; 1/4
C. glabrata; 2/7 C. guilliermondii; 1/1 C. pelliculosa; 1/1 C. intermedia; 1/2 C. rugosa; and
9/20 C. tropicalis,), of which four strains were strong enzymatic producers (Pz<0.64). Only
12 of the 77 strains were positive for protease production (Pz<1), as follows: 1/1 C.
catenulata; 1/27 C. famata; 1/7 C. guilliermondii; 1/1 C. pelliculosa; 1/2 C. rugosa; and 7/20
C. tropicalis. The results of these tests are presented in Table 3. C. tropicalis presented a
43
higher protease production, when compared to C. famata (P<0.05), while no differences were
observed in phospholipase production between the different Candida spp.
Discussion
This study pioneers the analysis of the yeast microbiota from the nasolacrimal duct of
horses, assessing two different collection sites, the outlet and the lumen. Of the 103 animals
evaluated, 43.68% (45/103) were positive for the presence of Candida sp., considering at least
one collection site. As for the recovery rate from the outlet of the nasolacrimal duct (44/103;
42.72%), it was higher than that obtained by Cordeiro et al.4 (36.08%), and lower than that
obtained by Rózanski et al.3 (64.4%). Both of these studies assessed the microbiota of the
nasal cavity of healthy horses instead of the outlet of the nasolacrimal duct. However, the
latter is located within the rostral portion of the nostril of horses.17
In this study, several Candida species were recovered. In general, among the species
of the Candida genus, C. albicans is most commonly reported as a component of the
microbiota of several animal species.8,18-20 However, this species does not seem to be a
common component of the yeast microbiota of horses, independent of the anatomical site
examined, as demonstrated by Cordeiro et al.4 and Rózanski et al.3, and corroborated by this
research, where only one isolate was recovered from the outlet of the nasolacrimal duct. Both
of these studies report the predominance of non-albicans Candida spp. as part of the
microbiota of different anatomical sites, including nostrils.3,4 Similar results were found in
this study, when assessing the nasolacrimal duct of these animals, suggesting that C. albicans
is not an important component of the equine yeast microbiota.
In our study, C. famata was the most common isolated Candida species (33.3%), a
similar finding to that of Pirrone et al.21, when studying the microbiota of the oropharynx and
44
rectal mucosa of healthy and critically ill neonatal foals. Cordeiro et al.4 also described this
species as being the most common in the microbiota of the nasal cavity of horses.
The second most common species isolated was C. tropicalis, which was previously
reported to be one of the most prevalent species in the nasal cavity of horses.3,4 In the present
study, this species was recovered from both the lumen and the outlet of the nasolacrimal duct.
The latter is the intersection between the lumen of this duct and the nasal cavity, suggesting
that both anatomical sites may share these microorganisms.
Other non-albicans species of Candida we also recovered. C. guilliermondii was the
third most prevalent species and it has been described as a component of the microbiota of
different anatomical sites of horses22, and has also been found in horse breeding facilities of
different breeds. Stefanetti et al.23 described a case of miscarriage in a mare, due to infection
with C. guilliermondii, demonstrating the ability of this yeast species to become pathogenic to
the animal host.
C. parapsilosis complex, C. glabrata and C. ciferii were also recovered in this study,
corroborating previous reports on the yeast microbiota of horses3,4 and/or horse-related
environments.22 In addition, it is important to highlight that C. ciferrii was only recovered
from the lumen of the nasolacrimal duct, representing over 50% of the isolates from this
collection site.
The lumen of the nasolacrimal duct of horses seems to be poorly colonized by
Candida spp., as shown by the low recovery rate from this anatomical site (3.88%), especially
when compared to the outlet of the nasolacrimal duct, which presented a recovery rate of
46.6%. Interestingly, the four animals that were positive for the presence of Candida in the
lumen of the duct were ponies, hence the recovery rate of yeasts from this anatomical site in
ponies is above 30%. Even though only a few ponies were assessed, it seems like they are
more likely to be colonized with yeasts within their nasolacrimal duct, when compared to
45
larger horses. The reasons for that still need to be elucidated, but considering their
dimensional particularities, this breed might accumulate more secretion within the
nasolacrimal duct, contributing to the recovery of microorganisms from this site.
In the antifungal susceptibility analysis, no isolates were resistant to amphotericin B,
similar to the results found in other animal species studied by our group.4,8,15,19 In contrast, we
found resistance to caspofungin (one strain of C. glabrata) and the analyzed azole derivatives.
Of those tested, eight strains of C. tropicalis were resistant to both itraconazole and
fluconazole. This finding is important since these species have been implicated in candidemia
in humans and animals.24,25 Finally, we observed resistance to itraconazole in isolates of C.
tropicalis, C. guilliermondii, C. famata and C. parapsilosis sensu lato.
Resistance to azole derivatives has been documented in several animal species by our
group and the results obtained in this study corroborate those previous findings.4,8,15,18,19,26,27
These findings are important since the animals were healthy and had no previous history of
antifungal treatment. Based on the results reported by Müller et al.28 on cross-resistance
between azole derivatives used for medical and agricultural purposes, we believe our results
can be explained by the exposure of the horses to azole derivatives used on agricultural
practices.
Regarding production of hydrolytic enzymes, 34.5% of the strains produced
phospholipases, with C. famata and C. tropicalis showing highest production, while 16%
were able to produce proteases, with the standout being C. tropicalis. Species of the Candida
genus are considered to be important pathogens due to their versatility and ability to survive
in different anatomical sites. The pathogenicity of Candida spp. is facilitated by several
virulence factors, including secretion of these hydrolytic enzymes. Phospholipases and
proteases play an important role in the growth of Candida spp., by facilitating their adherence,
penetration in the tissues and subsequent invasion of the host.29
46
Conclusion
The present study highlights the importance of investigating the antifungal
susceptibility and virulence trends of commensal microorganisms, since resistance to
clinically important antifungal drugs and production of hydrolytic enzymes were common
features among Candida spp. from the microbiota of the nasolacrimal duct of healthy horses.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq; Brazil; 307606/2013-9; 443167/2014-1).
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49
Table 1. Candida species isolated from the outlet and the lumen of the nasolacrimal duct of
horses
Candida spp. Nasolacrimal duct
outlet
Nasolacrimal duct
lumen Total
C. albicans 01 - 01
C. catenulate 01 - 01
C. ciferrii - 04 04
C. colliculosa 01 - 01
C. famata 27 - 27
C. glabrata 04 - 04
C. guilliermondii 07 - 07
C. intermedia - 01 01
C. krusei 01 - 01
C. lusitaniae 01 - 01
C. parapsilosis sensu lato 06 - 06
C. pelliculosa 01 - 01
C. rugose 02 - 02
C. tropicalis 18 02 20
Total 70 07 77
50
Table 2. Minimum inhibitory concentrations of amphotericin B, itraconazole, fluconazole and caspofungin
against strains of Candida spp. isolated from the outlet and the lumen of the nasolacrimal duct of horses
Candida spp. n Minimum Inhibitory Concentration (µg/mL)
Amphotericin B Itraconazole Fluconazole Caspofungin
Candida albicans 01 1 0.125 4 0.125
Candida catenulata 01 0.25 0.5 2 0.5
Candida ciferrii 04 0.5 (3)
1 (1)
0.0625 (1)
0.25 (1)
0.5 (1)
1 (1)
1 (1)
2 (2)
4 (1)
0.03125 (1)
0.0625 (2)
1 (1)
Candida colliculosa 01 1 0.125 8 0.03125
Candida famata 27 0.125 (3)
0.25 (4)
0.5 (10)
1 (10)
0.0625 (9)
0.125 (10)
0.25 (5)
0.5 (2)
4 (1)R
0.125 (3)
0.5 (2)
1 (4)
2 (7)
4 (8)
8 (2)
16 (1)
0.03125 (5)
0.0625 (2)
0.125 (3)
0.25 (3)
0.5 (8)
1 (5)
2 (1)
Candida glabrata 04 0.25 (2)
1 (2)
0.125 (3)
0.25 (1)
0.5 (1)
2 (1)
4 (1)
16 (1)
0.0625 (1)
0.125 (1)
0.25 (1)
0.5 (1)R
Candida
guilliermondii
07 0.5 (5)
1 (2)
0.0625 (2)
0.25 (1)
0.5 (2)
1 (1)
16 (1)R
0.5 (1)
1 (2)
2 (1)
8 (1)
4 (1)
64 (1)R
0.03125 (1)
0.0625 (1)
0.25 (1)
0.5 (3)
1 (1)
Candida intermedia 01 0.25 0.125 4 0.0625
Candida krusei 01 1 0.0625 0.125 0.03125
Candida lusitaniae 01 0.25 0.0625 2 0.25
Candida parapsilosis
sensu lato
06 0.5 (5)
1 (1)
0.03125 (1)
0.0625 (1)
0.125 (2)
0.5 (1)
1 (1)R
0.5 (2)
2 (2)
4 (1)
8 (1)R
0.03125 (1)
0.0625 (1)
0.125 (1)
0.5 (2)
1 (1)
Candida pelliculosa 01 0.5 0.125 1 0.03125
Candida rugosa 02 0.25 (1)
0.5 (1)
0.03125 (2)
1 (1)
2 (1)
0.5 (1)
2 (1)
Candida tropicalis 20
0.125 (1)
0.25 (1)
0.5 (2)
1 (16)
0.03125 (3)
0.0625 (1)
0.25 (1)
1 (7)R
2 (5)R
16 (3)R
0.25 (1)
0.5 (2)
1 (5)
2 (4)
8 (2)R
16 (1)R
64 (5)R
0.03125 (7)
0.0625 (5)
0.125 (4)
0.25 (3)
0.5 (1)
*The numbers between parentheses are the number of isolates for the indicated MIC value. R Indicates antifungal
resistance (fluconazole: ≥8 µg/mL against C. albicans, C. parapsilosis and C. tropicalis, ≥64µg/mL against other
Candida spp; itraconazole: ≥1µg/mL; caspofungin: ≥0.5 µg/mL against C. glabrata; ≥1µg/mL against C.
albicans, C. tropicalis and C. krusei; ≥8µg/mL against C. parapsilosis sensu lato and C. guilliermondii).
51
Table 3. Production of phospholipases and proteases by Candida spp. isolated from the outlet
and the lumen of the nasolacrimal duct of horses
Candida Species n
Phospholipases
Proteases
Positive
(0.64≤Pz<1)
Strongly
positive
(P < 0.64)
Negative
(Pz=1)
Positive
(Pz<1)
Negative
(Pz=1)
C. albicans 01 - - 1 - 1
C. catenulata 01 1 - - 1 -
C. ciferrii 04 2 - 2 - 4
C. colliculosa 01 - - 1 - 1
C. famata 27 7 3 17 1 26
C. glabrata 04 1 - 3 - 4
C. guilliermondii 07 2 - 5 1 6
C. intermedia 01 1 - - - 1
C. krusei 01 - - 1 - 1
C. lusitaniae 01 - - 1 - 1
C. parapsilosis
sensu lato 06 - - 6
- 6
C. pelliculosa 01 1 - - 1 -
C. rugosa 02 1 - 1 1 1
C.tropicalis 20 8 1 11 7 13
Total 77 24 4 49 12 65
52
7 CAPÍTULO 2
Biofilmes de Candida spp. isoladas da conjuntiva ocular de equinos com baixa sensibilidade
aos derivados azólicos: uma complicação para o tratamento de ceratomicose?
Biofilms of Candida spp. from the ocular conjunctiva of horses with reduced azole
susceptibility: a complicating factor for the treatment of keratomycosis?
Periódico: Mycopathologia (Submetido em 08 de julho de 2015).
Fator de impacto: 1,528 (Qualis B1)
53
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de formação de biofilme de Candida spp. (n
= 15) isoladas a partir da conjuntiva ocular de equinos, bem como investigar a sensibilidade
desses biofilmes a drogas antifúngicas. Inicialmente, avaliou-se a capacidade das cepas de
formar biofilmes pela técnica de coloração por cristal violeta, seguido de avaliação
morfológica por microscopia eletrônica de varredura. Para avaliar a sensibilidade antifúngica
do biofilme, foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) das cepas em
sua forma planctônica contra a anfotericina B, fluconazol, itraconazol e caspofungina pelo
método de microdiluição em caldo, normalizada por CLSI. Em seguida, foi avaliada a
sensibilidade antifúngica dos biofilmes maduros utilizando as concentrações 10xCIM e
50xCIM das drogas testadas. Oito cepas produziram biofilme e foram classificadas como forte
(1/15), moderada (3/15) e fraco (4/15) produtoras. Em relação à sensibilidade antifúngica no
biofilme maduro, uma cepa de C. tropicalis não reduziu sua atividade metabólica após a
exposição a qualquer dos antifúngicos testados, enquanto que cinco isolados sofreram
reduções na atividade metabólica do biofilme, estatisticamente significativas (P <0,05),
apenas após exposição a anfotericina B em 50xCIM. Uma cepa de C. parapsilosis lato sensu
e uma cepa de C. glabrata mostraram redução estatisticamente significativa na atividade
metabólica do biofilme após a exposição ao fluconazol, itraconazol e caspofungina, mas não
anfotericina B. Os resultados demonstram que as espécies de Candida oriundas da conjuntiva
ocular de equinos podem representar risco para a saúde animal, uma vez que são capazes de
formar biofilmes, o qual comumente estão envolvidos em ceratite fúngica.
Palavras-chave: equinos, microbiota, leveduras, sensibilidade aos antifúngicos, biofilme
54
Mycopathologia
Original Research
Biofilms of Candida spp. from the ocular conjunctiva of horses with reduced azole
susceptibility: a complicating factor for the treatment of keratomycosis?
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante1,*, Paula Vago Bittencourt2, Débora de Souza Collares
Maia Castelo-Branco1, Jonathas Sales de Oliveira1, Lucas Pereira de Alencar1, Rossana de
Aguiar Cordeiro1, Mariana Pinheiro2, Evilázio Fernandes Nogueira-Filho2, Waldemiro de
Aquino Pereira-Neto3, José Júlio Costa Sidrim1, Marcos Fábio Gadelha Rocha1,2
1Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical
Mycology Center, Graduate Program in Medical Microbiology, Federal University of Ceará,
Fortaleza-CE, Brazil.
2School of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State
University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
3Department of Transport Engineering, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
* Corresponding Author: R.S.N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese. CEP:
60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 (85) 3295-1736 E. mail: [email protected].
55
ABSTRACT
The aim of this study was to assess the ability of Candida spp. (n=15) isolated from
the ocular conjunctiva of horses to form biofilms and to investigate the susceptibility of these
biofilms to antifungal drugs. Initially, we assessed the ability of the strains to form biofilms
by the crystal violet staining technique, followed by morphological evaluation by scanning
electron microscopy. To assess the biofilm antifungal susceptibility, the minimum inhibitory
concentrations (MICs) of the drugs amphotericin B, fluconazole, itraconazole and
caspofungin were initially determined against the strains in planktonic form by broth
microdilution method, as standardized by CLSI. Then, the antifungal susceptibility of the
mature biofilms was evaluated by exposing them to 10xMIC and 50xMIC of the tested drugs.
Eight strains produced biofilms and were classified as strong (1/15), moderate (3/15) and
weak (4/15) producers. Regarding biofilm antifungal susceptibility, the biofilm metabolic
activity of one strain of C. tropicalis did not reduce after exposure to any of the tested
antifungal drugs, while the biofilm metabolic activity of five strains suffered statistically
significant reductions (P<0.05), only after exposure to amphotericin B at 50xMIC. One strain
of C. parapsilosis stricto sensu and one strain of C. glabrata showed statistically significant
reduction in biofilm metabolic activity after exposure to fluconazole, itraconazole and
caspofungin, but not amphotericin B. The results demonstrate that the Candida species from
the ocular conjunctiva of horses can pose as a risk to animal health since they are capable of
forming biofilms, which are commonly involved in fungal keratitis.
Keywords: horses, microbiota, yeasts, antifungal susceptibility, biofilm.
56
Introduction
Fungi are normally present in places where horses inhabit and are part of their corneal
and conjunctival microbiota [1]. The conjunctival microbiota of horses is variable, depending
on the animal’s age, season of the year, geographic location and presence of bacteria and
fungi, including Candida spp., in the environment where animals are raised. These yeasts
present an isolation rate that varies from 3 to 20% [2-4] and can act as ocular pathogens, when
finding adequate conditions in the host [1, 2, 5, 6]. It is known that the presence of fungi in
the conjunctival microbiota, including Candida spp., is a risk factor for the development of
keratomycosis [1, 4]. Moreover, Candida spp. have been reported as the third most common
etiological agent of equine keratomycosis [7].
The pathogenicity of Candida species is mediated by several virulence factors,
including the ability to adhere to the host’s tissues and medical devices, ability to evade the
host’s defenses, production of hydrolytic enzymes and formation of biofilms [8]. Biofilms are
defined as well-structured communities of microorganisms that are adhered to a surface,
interconnected and involved in an extracellular polymeric matrix [9]. The microbial
advantages of living within a biofilm include protection against the environment, resistance to
physical and chemical stresses, metabolic cooperation and joint regulation of the gene
expression in the associated microorganisms [10]. It is important to highlight that biofilm
growth is often involved in the development of Candida keratitis [11], which can make
treatment more difficult, since biofilm production is commonly associated with antifungal
resistance [12].
Therefore, the aim of this study was to assess the ability of yeasts of the genus
Candida isolated from the ocular conjunctiva of horses of forming biofilms and the
susceptibility of these biofilms to antifungal drugs.
Materials and methods
57
Microorganisms
Fifteen strains of Candida (4 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis stricto sensu, 2 C.
glabrata, 1 C. rugosa, 1 C. famata, 1 C. ciferrii, 1 C. guilliermondii, 1 C. catenulata and 1 C.
krusei) obtained from the ocular conjuntiva of clinically healthy horses from the state of
Ceará, Northeastern Brazil, were used in this study. The stains belong to the culture collection
of the Specialized Medical Mycology Center (CEMM) of the Federal University of Ceará,
where they are stored in saline solution at 4º C. The strains were recovered by seeding on
potato agar. Then, they were subcultured on a chromogenic medium to assure the purity of the
stocks, followed by phenotypical identification based on morphological and biochemical
features. This study was approved by the ethics committee of the Ceará State University
(UECE), protocol number 12776861-0.
Biofilm formation
The 15 studied strains were analyzed for their ability to form biofilm, through the
method described by Chatzimoschou et al. [13], with some modifications. Initially the strains
were grown on Sabouraud agar for 48 h at 30 ºC. Then, they were transferred to Sabouraud
broth and incubated under agitation (150 rpm) for 24 h. After this period, the tubes containing
the isolates were centrifuged (300 rpm, 10 minutes) and the supernatant was discarded. The
resulting pellets were washed with sterile PBS, followed by new centrifuging and washing.
The new pellets were resuspended in RPMI medium and the inoculum was adjusted to 0.5 on
MacFarland scale (1-5 x 106 cfu/mL). Then, 100-µL aliquots of the inoculum were incubated
individually in the wells of a 96-well flat-bottom polystyrene plate and kept under agitation
for 48 h (150 rpm) at 37 ºC. Yeast-free negative control was included in the analysis,
containing RPMI medium only. After incubation, the supernatant from the wells was carefully
aspirated and washed with PBS-Tween three times. Then, the wells were washed with 100 µL
58
of 100% methanol. After drying, 100 µL of a 0.3% crystal violet solution were added to each
well and allowed to act for 20 minutes. After this time, the crystal violet was removed and the
wells were washed twice with 200 µL of sterile distilled water. Then, 150 µL of a 33% acetic
acid solution were added to each stained well and allowed to act for 30 seconds. Immediately
after this period, the volume from each well was transferred to the well of another plate and
read with a spectrophotometer at 590 nm.
The cutoff value (ODc) for the assay was defined as three standard deviations above
the mean absorbance of the yeast-free negative control (OD590 nm) [14]. The strains were
classified as non-biofilm producers (OD590nm≤ODc), weak biofilm producers
(ODc<OD590nm≤2xODc), moderate biofilm producers (2xODc<OD590nm≤4xODc) or
strong biofilm producers (OD590nm>4xODc) [14]. The ODc value obtained in these analyses
was 0.477.
Scanning electron microscopic study of Candida spp. biofilms
The biofilms were analyzed by scanning electron microscopy (SEM) according to
Wang et al. [15], with modifications. The films were formed directly on sterile glass slides
covered with poly-l-lysine, using the method described above. After incubation, biofilm
supernatants were removed and the slides were washed twice with cacodylate buffer (0.15M).
Biofilms were then covered with glutaraldehyde (2.5% in cacodylate buffer 0.15M) and
incubated at 4 °C overnight. After incubation, the biofilms were washed twice with
cacodylate buffer for 5 minutes and the slides were dehydrated in an ascending ethanol series
(50, 70, 80, 95 and 100%) twice, for 10 minutes each time. The slides were dried at room
temperature and covered with hexamethyldisilazane (HMDS) during 30 minutes, after which
the HDMS was removed and the slides were dried overnight, coated with 10 nm of gold
(Emitech Q150T), and observed with an FEI Inspect S50 scanning electron microscope, in
59
high vacuum mode at 15 kV. The images were processed with the Photoshop software
(Adobe Systems, San José, Calif.).
Determination of the antifungal minimum inhibitory concentration against planktonic
Candida spp. cells
The minimum inhibitory concentration (MIC) for the antifungal drugs against the
strains of Candida in planktonic form was determined by the broth microdilution method, as
standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute [16]. The strain Candida
parapsilosis ATCC 22019 was included as a control. The concentration intervals tested were
0.125 to 64 µg/mL for fluconazole and 0.03125 to 16 µg/mL for amphotericin B, itraconazole
and caspofungin. Each test was performed in duplicate. The plates were incubated at 35 ºC for
48 h. The MIC for the azole derivatives and caspofungin was considered to be the lowest
concentration that inhibited yeast growth by 50%, when compared to the growth control well,
while for amphotericin B, the MIC was the smallest concentration able to inhibit 100% of
fungal growth. MIC values ≥64 and ≥1 µg/mL indicated in vitro resistance to fluconazole and
itraconazole, respectively. For the species C. parapsilosis and C. tropicalis, MIC ≥8µg/mL of
fluconazole indicated resistance (CLSI, 2012). For the drug caspofungin, MIC values ≥0.5
µg/mL against C. glabrata, ≥1 µg/mL against C. tropicalis and C. krusei and ≥8 µg/mL
against C. parapsilosis and C. guilliermondii indicated resistance [17]. For the other Candida
species, caspofungin MIC values >2 µg/mL indicated that the strain is not susceptible [16].
Antifungal susceptibility of mature Candida biofilms
The method described by Ramage et al. [18], with modifications, was used to assess
the inhibitory effect of the antifungal drugs on the biofilms formed by the tested strains. The
biofilms were produced as described above, after which the medium was aspirated and the
60
adhered cells were removed by three washes with sterile PBS. The residual PBS was removed
with paper towel before adding the drugs: amphotericin B, fluconazole, itraconazole and
caspofungin, at two concentrations, 10xMIC and 50xMIC. After adding100 µL of each drug
solution, the plates were incubated for 48 h, at 35 ºC.
The viability of the mature biofilms was assessed by the XTT test, according to
Martinez and Casadevall [19], with modifications. The XTT stock solutions (1 mg/mL) were
previously prepared, filtered and stored at -20 °C until use. Menadione (Sigma) (0.4 mM in
acetone), prepared at the moment of use, was employed as an electron-coupling agent.
Aliquots of 50 µL of sterile PBS, 75 μL of XTT solution and 6 μL of menadione solution
were added in each of the wells containing biofilms. The plates were incubated at 35 °C for 5
h in the dark. After this period, the XTT was transferred to a new flat-bottomed 96-well plate
and read through spectrophotometry, at 492 nm. All tests were run in triplicate, and positive
(without antifungal drug) and negative (drug only) controls were included.
Statistical methods
Regarding the biofilm assay, all tests were performed in triplicate and the results of the
absorbance of the XTT assay were evaluated by ANOVA and Tukey’s multiple comparisons
post-test. P-values <0.05 were considered to be statistically significant.
Results
Biofilm formation was evaluated for all 15 strains, out of which eight (3/4 C.
tropicalis; 1/3 C. parapsilosis stricto sensu; 2/2 C. glabrata; 1/1 C. guilliermondii and 1/1 C.
catenulata) were able to form biofilms (Table 1). One strain was classified as a strong biofilm
producer (OD590nm>1.908, Fig. 1A), three as moderate producers (0.954<OD590nm≤1.908,
61
Fig. 1B) and four as weak producers (0.477<OD590nm≤0.954, Fig. 1C), as reported in Table
1. As shown in the SEM analysis, C. tropicalis and C. guilliermondii biofilms are formed by
layers of blastoconidia and pseudohyphae and C. glabrata biofilms are formed by layers of
blastoconidia only (Fig.1).
Regarding antifungal susceptibility, initially, the MIC values against the strains in
planktonic form were determined. These varied from 0.03125 to 1 µg/mL for amphotericin B,
from 0.03125 to >16 µg/mL for itraconazole, from 0.25 to >64 µg/mL for fluconazole and
from 0.03125 to 1 µg/mL for caspofungin (Table 2). Two strains of C. tropicalis and one of
C. catenulata were resistant to itraconazole (MIC≥1 µg/mL), while only one strain of C.
parapsilosis stricto sensu was resistant to fluconazole (MIC ≥8 µg/mL). One strain of C.
glabrata was resistant to both fluconazole and itraconazole, with MICs≥64 µg/mL and 1
µg/mL, respectively, and another one was simultaneously resistant to itraconazole (MIC=1
µg/mL) and caspofungin (MIC=0.5 µg/mL). Resistance to caspofungin was also observed in
one strain of C. krusei (MIC=1 µg/mL). The antifungal susceptibility results are shown in
Table 1.
In order to assess the biofilm antifungal susceptibility, the eight biofilm-producing
strains were used. The biofilm metabolic activity of one strain of C. tropicalis did not reduce
after exposure to any of the tested antifungal drugs. Five strains (2 C. tropicalis, 1 C.
glabrata, 1 C. guilliermondii and 1 C. catenulata) presented significant reduction in biofilm
metabolic activity, when compared to the growth control (P<0.05), only after exposure to
amphotericin B at 50xMIC. The other tested drugs (azoles and caspofungin) presented no
inhibitory effects on the biofilm of these strains. Finally, 2 strains (1 C. parapsilosis stricto
sensu and 1 C. glabrata) did not show reduction in biofilm metabolic activity when exposed
to amphotericin B at either of the tested concentrations. However, biofilm metabolic activity
of the C. parapsilosis stricto sensu strain significantly declined (P<0.05) in the presence of
62
fluconazole, itraconazole and caspofungin, at both tested concentrations. As for the C.
glabrata strain, a significant reduction in the biofilm metabolic activity was observed at both
tested concentrations of fluconazole (P<0.05) and caspofungin (P<0.05), and only at 50xMIC
of itraconazole (P<0.05).
Discussion
The tested species of the Candida genus have been described as components of the
microbiota of several animal species [3, 20-25] and pathogenic agents causing keratitis in
horses [4-7]. Studies on the conjunctival microbiota of healthy horses are scarce. Some
authors reported isolation of Candida spp., but without determining the species [2, 3, 26]. The
strains used in this research were recovered from healthy horses, providing data on the yeast
composition of the conjunctival microbiota.
Fungal infections are a common cause of corneal diseases in horses, and can result in
loss of vision [27]. The high incidence of corneal infections in horses is mainly associated
with the large size of the eye globe with large corneal surface area; the prominent lateral
position of the eye; low resting temperature of the cornea and the presence of fungi in the
conjunctival microbiota and in the environment where the animals are kept [1, 4].
Keratomycosis is a common infection in equines because the tear film of these animals has
weak immunoprotective properties [28].
The intact corneal epithelium is the main barrier against opportunistic infections. In
the presence of injuries or alterations of the tear film, fungi from the conjunctival microbiota,
for example, can reach and colonize the cornea, and if they penetrate the stroma, there is rapid
migration between the collagen layers [29]. The most common fungi associated with cases of
equine keratomycosis are Aspergillus spp., Fusarium spp. and Candida spp. [7, 27].
63
The pathogenicity of Candida species is mediated by several virulence factors,
including biofilm formation on biotic and abiotic surfaces [8], which is associated with
antimicrobial resistance [12]. In veterinary medicine, the presence of microbial biofilms has
also been associated with antimicrobial resistance and clinical relapses. The importance of
biofilm infections in animals still needs to be addressed, but evidences show that several
bacterial infections are associated with biofilm growth, including pneumonia, liver abscesses,
enteritis, otitis, mastitis and wound infections [9], especially in horses [30]. On the other
hand, little is known on the biofilm-forming ability of fungal pathogens from animals and its
association with the development of diseases. For instance, it has been shown that veterinary
strains of Malassezia pachydermatis [31], C. parapsilosis lato sensu [32] and C. tropicalis
[33] are capable of producing biofilms in vitro.
In our study, 53.3% of the strains from the ocular conjunctiva of horses showed the
ability to form biofilms. C. tropicalis was the species with the greatest biofilm production,
with two strains characterized as moderate producers and one as a strong producer. Silva et al.
[8] reported that this species has a strong ability to form biofilm, mainly in silicone and latex
catheters. Additionally, two strains of C. glabrata were able to produce biofilm, and were
classified as weak and moderate producers, corroborating the findings of Silva et al. [8], who
reported a weaker biofilm forming ability for this species.
Several studies have reported that biofilms formed by Candida spp. are resistant to
antifungal drugs commonly used in clinical practice, especially azole derivatives [34, 35]. Our
results corroborate these observations, since only one strain of C. parapsilosis stricto sensu
and one of C. glabrata were inhibited by itraconazole and fluconazole. Some hypotheses have
been suggested to explain the reduced antifungal susceptibility of Candida biofilms, including
the reduced metabolism, specific physiology of biofilm cells, decreased drug penetration
64
through the biofilm matrix and expression of specific genes by biofilm cells that contribute to
antifungal resistance [36, 37].
Regarding the inhibitory activity of amphotericin B, of the eight tested strains, 5
presented reduction in the number of viable sessile cells, a finding that corroborates the
observation of Brucker et al. [38], who reported that amphotericin B has consistent activity
against biofilms of Candida spp.
Caspofungin plays an important role in the treatment of infections caused by different
types of fungi that are resistant to azole derivatives [39]. Moreover, it has been described as
having an excellent activity against C. albicans biofilms [35]. However, in our study, this
drug only significantly reduced the biofilm metabolic activity of one strain of C. parapsilosis
stricto sensu and one C. glabrata.
Our results demonstrate that the isolates from the conjunctival microbiota of horses
were able to produce biofilms, which presented reduced susceptibility to the four tested
antifungal drugs. This fact highlights the potential involvement of Candida spp. from the
conjunctival microbiota of horses in keratomycoses, since these infections are often
associated with biofilm growth on and within corneal tissue [11].
In summary, the data from this study show that the Candida species isolated from the
ocular conjunctiva of horses can pose a risk to animals’ health, since they are capable of
forming biofilms, which are commonly involved in fungal keratitis.
Conflict of interest
None.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq; Brazil; 307606/2013-9; 443167/2014-1).
65
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70
Fig. 1 Mature biofilms of Candida spp. A: C. tropicalis with strong biofilm production
(OD590nm>1.908)). Notice the multilayer arrangement of blastoconidia and pseudohyphae;
B: C. glabrata with moderate biofilm production (0.954<OD590nm≤1.908). Notice the
clusters of small round blastoconidia, in a monolayer arrangement, and the absence of
pseudohyphae, with empty areas on the coverslide; C: C. guilliermondii with weak biofilm
production (0.477<OD590nm≤0.954). Notice clusters of blastoconidia and pseudohyphae, in
a monolayer arrangement, with empty areas on the coverslide
71
Table 1 Biofilm production of Candida species recovered from the ocular conjunctiva of
horses and antifungal susceptibility of the strains in planktonic form.
Strains Candida Species Biofilm
Production
Minimum Inhibitory Concentration (µg/mL)
Amphotericin B Fluconazole Itraconazole Caspofungin
01 C. tropicalis Absent 1 1 0.25 0.03125
02 C. tropicalis Moderate 1 1 1* 0.03125
03 C. tropicalis Strong 1 0.5 4* 0.0625
04 C. tropicalis Moderate 1 1 0.5 0.125
05 C. parapsilosis Absent 0.25 16* 0.0625 0.03125
06 C. parapsilosis Weak 0.25 0.5 0.03125 1
07 C. parapsilosis Absent 0.03125 2 0.03125 0.03125
08 C. glabrata Weak 1 64* 16* 0.03125
09 C. glabrata Moderate 1 2 1* 0.5*
10 C. rugosa Absent 0.5 4 0.5 0.0625
11 C. famata Absent 1 4 0.25 0.0625
12 C. ciferrii Absent 0.5 2 0.0625 0.0625
13 C. guilliermondii Weak 1 0.25 0.0625 0.03125
14 C. catenulata Weak 0.5 4 1* 0.25
15 C. krusei Absent 1 0.25 0.03125 1*
* Indicates antifungal resistance (fluconazole: ≥8 µg/mL against C. parapsilosis and C.
tropicalis, ≥64 µg/mL against C. glabrata; itraconazole: ≥1µg/mL; caspofungin: ≥8µg/mL
against C. parapsilosis and C. guilliermondii, ≥1µg/mL against C. tropicalis and C. krusei,
≥0.5 µg/mL against C. glabrata).
72
Table 2. Effect of antifungal drugs on the metabolic activity of mature biofilms of Candida spp. from the ocular conjunctiva of horses.
Strains Candida Species Control Amphotericin B Fluconazole Itraconazole Caspofungin
10xMIC 50xMIC 10xMIC 50xMIC 10xMIC 50xMIC 10xMIC 50xMIC
2 C. tropicalis 1.1±0.019 1.1±0.035 0.94±0.054 1.1±0.033 0.99±0.025 1±0.15 1.1±0.018 0.99±0.067 1±0.062
3 C. tropicalis 1.3±0.013 0.99±0.067 0.68±0.41* 1.2±0.054 1.2±0.024 1.1±0.017 1.1±0.041 1.2±0.036 1.1±0.053
4 C. tropicalis 1.1±0.011 1.1±0.12 0.88±0.046* 1.2±0.0015 1.1±0.028 1.2±0.028 1.1±0.048 1±0.028 1±0.06
6 C. parapsilosis 0.89±0.19 0.97±0.063 0.95±0.024 0.4±0.064* 0.31±0.008* 0.63±0.098* 0.49±0.017* 0.21±0.023* 0.43±0.036*
8 C. glabrata 1.1±0.059 0.97±0.082 0.85±0.015* 0.34±0.13* 0.19±0.028* 1.1±0.023 0.75±0.15* 0.73±0.16* 0.57±0.05*
9 C. glabrata 1.1±0.051 1.1±0.039 0.14±0.058* 1.2±0.047 1±0.23 1.1±0.033 1.2±0.022 0.96±0.17 1.1±0.013
13 C. guilliermondii 1.2±0.002 1.1±0.058 0.97±0.11* 1.2±0.051 1.1±0.035 1.1±0.033 1.2±0.019 1.2±0.051 1.1±0.027
14 C. catenulata 1.1±0.007 1±0.2 0.82±0.066* 1.1±0.015 1.1±0.026 1.1±0.018 1.1±0.017 1.2±0.013 1.1±0.029
Results are shown as the mean ± standard deviation of the absorbance values obtained through XTT metabolic assay, at a wavelength of 492 nm. *indicates statistically
significant difference, when compared to the values obtained for drug-free growth control.
73
8 CONCLUSÕES
1. O sítio anatômico ducto nasolacrimal apresentou a maior taxa de isolamento de Candida
spp., sendo isoladas espécies de Candida não-albicans.
2. Há resistência primária a derivados azólicos em Candida spp. isoladas do ducto
nasolacrimal de equinos, principalmente em C. tropicalis ao itraconazol e fluconazol.
Ademais C. glabrata apresentou resistência a casponfungina.
3. Os isolados provenientes do sitio anatômico ducto nasolacrimal apresentaram-se produtores
de fosfolipases e proteases.
4. Cepas isoladas da mucosa conjuntival de equinos demostraram ser capazes de produzir
biofilme. Além disso, biofilmes maduros de C. tropicalis apresentaram diminuição da sua
atividade metabólica somente a maior concentração de anfotericina B testada.
74
9 PERSPECTIVAS
O conhecimento acerca da leveduras do gênero Candida presentes no ducto
nasolacrimal e mucosa conjuntival de equinos é importante para o auxilio da compreensão da
microbiota fúngica desses sítios anatômicos, visto que os estudos sobre esses patógenos
oportunistas e sua participação em processos patológicos ainda são escassos em equinos.
O monitoramento do perfil de sensibilidade de cepas de Candida spp. isoladas de
equinos é limitado quando comparado a outras espécies animais e humanos. Nesse trabalho
observou-se resistência aos derivados azólicos em cepas de C. tropicalis isoladas de animais
sem histórico clínico de tratamento com azólicos.
Além disso, nos últimos anos, tem aumentado o número de estudos acerca dos
fatores de virulência das espécies de Candida, principalmente na medicina humana. Ao passo
que na medicina veterinária ainda são escassos. Nossa pesquisa demonstrou que isolados de
Candida provenientes do ducto nasolacrimal e mucosa conjuntival de equinos apresentam
produção desse fatores como fosfolipases, proteases e formação de biofilmes.
Considerando que os animais representam possíveis fontes de infecção para os
seres humanos, é necessária a realização de mais estudos no intuito de se obter um melhor
conhecimento sobre os possíveis fatores envolvidos nesse fenômeno.
75
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APÊNDICES
Apêndice A: Comprovante de submissão do artigo referente ao capítulo 2.
---------- Forwarded message ---------- From: Mycopathologia (MYCO) <[email protected]> Date: 2015-07-08 8:45 GMT-03:00 Subject: MYCO: Submission Confirmation To: Raimunda Samia Brilhante <[email protected]> Dear Brilhante, Thank you for submitting your manuscript, Biofilms of Candida spp. from the ocular conjunctiva of horses with reduced azole susceptibility: a complicating factor for the treatment of keratomycosis?, to Mycopathologia. During the review process, you can keep track of the status of your manuscript by accessing the following web site: http://myco.edmgr.com/ Your username is: [email protected] Your password is: xxxxxxxx Should you require any further assistance please feel free to contact the Editorial Office by clicking on the "contact us" in the menu bar to send an email to us. With kind regards, Springer Journals Editorial Office Mycopathologia
