PLANEJAMENTO E AVALIAÇÃO DE ESTUDOS DE...
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GUSTAVO DUARTE MENDES PLANEJAMENTO E AVALIAÇÃO DE ESTUDOS DE BIODISPONIBILIDADE RELATIVA PARA MEDICAMENTOS GENÉRICOS CAMPINAS 2007 i
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GUSTAVO DUARTE MENDES
PLANEJAMENTO E AVALIAÇÃO DE ESTUDOS DE
BIODISPONIBILIDADE RELATIVA PARA
MEDICAMENTOS GENÉRICOS
CAMPINAS
2007
i
GUSTAVO DUARTE MENDES
PLANEJAMENTO E AVALIAÇÃO DE ESTUDOS DE
BIODISPONIBILIDADE RELATIVA PARA
MEDICAMENTOS GENÉRICOS
Tese de Doutorado apresentada à Pós-Graduação da
Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de
Campinas, para obtenção de título de Doutor em Clínica
Médica, área de concentração em Clínica Médica.
ORIENTADOR: PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI
CAMPINAS
2007
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044
Mendes, Gustavo Duarte M522p Planejamento e avaliação de estudos de biodisponibilidade relativa
para medicamentos genéricos / Gustavo Duarte Mendes. Campinas, SP : [s.n.], 2007.
Orientador : Gilberto De Nucci
Tese ( Doutorado ) Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas.
1. Bioequivalência. 2. Biodisponibilidade. 3. Medicamentos
genéricos. I. Nucci, Gilberto De. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Título em inglês : Planning and evaluation of relative bioavailability studies for generic drugs Keywords: • Therapeutic equivalence • Biological availability • Generic, drugs Titulação: Doutorado em Clínica Médica Área de concentração: Clínica Médica Banca examinadora: Prof Dr Gilberto De Nucci Prof Dr José Francisco Kerr Saraiva Prof Dr Sérgio Marangoni Prof Dr Eros Antônio de Almeida Prof Dr Wellington Ribeiro Data da defesa: 11-04-2007
DEDICATÓRIA
À minha esposa, Geruza
Aos meus irmãos, Antônio Carlos Filho e Fabiana
Aos meus pais, Antônio Carlos e Cleuseni
Aos meus sogros, Geraldo e Edna
À minha avó, Jamile
Ao meu afilhado, Ângelo
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha esposa, Geruza, pela paciência, companheirismo, amizade e
apoio durante este período.
Aos meus pais, Antônio Carlos e Cleuseni, pelo exemplo permanente de força
de vontade e atitude que sempre serão para mim e meus irmãos.
Em especial ao orientador Prof. Dr. Gilberto De Nucci pela grande amizade,
oportunidade de aprendizado e paciência durante estes anos de trabalho. Tenho certeza que
sua experiência e seu conhecimento serão sempre reconhecidos por todos os acadêmicos.
Em especial a Dra. Lilian Mara Babadopulos pela grande amizade, ajuda e
paciência durante estes anos.
Em especial ao Dr. Jaime de Oliveira Ilha pela grande amizade, aprendizado e
ajuda fundamental para o desenvolvimento deste e vários outros trabalhos acadêmicos.
Em especial ao Prof. Dr. José Cássio de Almeida Magalhães pela grande
amizade e aprendizado durante a iniciação científica.
Ao mestrando André Borges pela amizade, disponibilidade de tempo e ajuda
para o desenvolvimento deste e vários outros trabalhos acadêmicos.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
desse trabalho e muitos outros. Especialmente, aos que participam ou participaram dos
grupos de pesquisa do Prof. Dr. Gilberto De Nucci.
A TODOS, O MEU MAIS SINCERO MUITO OBRIGADO!
v
SUMÁRIO
PÁG.
RESUMO............................................................................................................. x
ABSTRACT......................................................................................................... xiii
INTRODUÇÃO................................................................................................... 16
OBJETIVOS........................................................................................................ 27
CAPÍTULOS....................................................................................................... 29
CAPÍTULO I................................................................................................ 30
CAPÍTULO II.............................................................................................. 41
CAPÍTULO III............................................................................................. 48
DISCUSSÃO........................................................................................................ 59
CONCLUSÃO..................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 65
ANEXO................................................................................................................ 68
Anexo I- Publicações durante o período de doutorado................................ 69
vi
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
% ASC0-inf extrapolada Porcentagem de ASCINF que é extrapolada do Túltimo para o
infinito ((ASCINF - ASCúltimo)/ASCINF)*100
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASCinf Área sob a curva de concentração da droga versus tempo do
tempo 0 (zero) extrapolada ao infinito, calculada pelo método
linear-log trapezoidal. AUC[0-∞] = AUC[0-último] + Ct/Ke, onde
Ct é a última concentração quantificável;
ASCultimo Área sob a curva de concentração da droga versus tempo do
tempo 0 (zero) ao tempo da última concentração acima do
Limite de Quantificação (LOQ) comum a todos os períodos,
calculada pelo método linear-log trapezoidal;
BLOQ Abaixo do limite de quantificação
CI Intervalo de confiança
Cúltimo Concentração correspondente à última concentração
quantificada
Cmax Concentração correspondente ao Tmax.
CV Coeficiente variação
EMEA European Medicines Agency - Agência Européia de
Medicamentos
FDA Food and Drug Administration - Agência regulatória dos EUA
Ke Constante de taxa de eliminação terminal determinada por
análise de regressão log-linear
LC-MS/MS /
CLAE-EM/EM
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a
espectrômetria de massa.
Ln Logarítmo
LOQ Limite de quantificação
Max Valor máximo
vii
viii
Média Média aritmética
min Valor mínimo
N Número
P Período
SD Desvio padrão
T/R Teste/Referência
T1/2 Tempo de meia vida = ln(2)/Ke
Túltimo Tempo da última concentração
Tmax Tempo da concentração máxima
LISTA DE FIGURAS
PÁG.
Figura 1- Efeito da forma farmacêutica no TMAX da carbamazepina
(200 mg).........................................................................................
22
Figura 2- Efeito da forma farmacêutica no TMAX do ibuprofeno (400 mg)... 22
Figura 3- Efeito da alimentação no CMAX do saquinavir (Cápsula 200 mg).. 24
Figura 4- Efeito da alimentação no TMAX do ritonavir (Cápsula 100 mg)..... 24
ix
RESUMO
x
Mendes, Gustavo Duarte – Planejamento e avaliação de estudos de biodisponibilidade
relativa para medicamentos genéricos - Faculdade de Ciências Médicas; Universidade
Estadual de Campinas, 2007. Tese de Doutorado.
Os estudos de biodisponibilidade/bioequivalência foram iniciados no Brasil em 1989 e o
processo de regulamentação do setor foi iniciado em 1999 pela promulgação da lei de
genéricos. A regulamentação do setor tem propiciado grande aumento na qualidade de
fabricação dos medicamentos similares e genéricos, já que a realização de estudos de
biodisponibilidade visa, em última análise, comprovar a eficácia terapêutica destes
medicamentos.
O presente trabalho tem por objetivo o planejamento e avaliação de estudos de
biodisponibilidade/bioequivalência e desenvolvimento de metodologia analítica para
quantificação das amostras para os fármacos avaliados (citalopram, ramipril e gliclazida).
Adicionalmente, as avaliações dos estudos visam o aprimoramento dos protocolos de
estudos futuros para novas formulações destes fármacos e a menor exposição possível do
voluntário, respeitando os referenciais básicos de bioética.
Os parâmetros considerados para o desenvolvimento dos protocolos clínicos foram: número
adequado de voluntários, sexo dos voluntários, tempos de coleta para caracterização do
perfil farmacocinético, forma farmacêutica, intervalo entre as administrações, condição de
administração (alimentação/jejum) e metodologia analítica a ser utilizada para o
doseamento das amostras.
Resultados: 1) Para citalopram, o coeficiente de variabilidade intra-sujeito para Cmax e
ASClast foram14.09 e 8.38, respectivamente. 2) Para ramipril, o coeficiente de variabilidade
intra-sujeito para Cmax e ASClast foram menor para o metabólito ativo, como esperado para
em estudos de bioequivalência, confirmando que os fármacos na forma inalterada são mais
discriminativos para estabelecer bioequivalência. 3) Para gliclazida, a média geométrica e
intervalo de confiança de 90% para a razão Gliclazida/Diamicron (Irelanda) foram 588.68%
(90% CI= 491.16, 705.58%) para ASClast e 1395.77% (90% CI= 1116.62, 1744.72%) para
Cmax. A média geométrica e intervalo de confiança de 90% para a razão
Gliclazide/Diamicron (Brasil) foram 249.16% (90% CI= 207.96, 298.54%) para ASClast, e
Resumo
xi
Resumo
xii
188.04% (90% CI= 151.72, 233.05%) para Cmax. A média geométrica e intervalo de
confiança de 90% para a razão Diamicron(Brazil)/Diamicron (Irelanda) foram 236.26%
(90% CI= 197.12, 283.17%) para ASClast e 225.21% (90% CI= 175.25, 289.42%) para
Cmax.
Conclusões: 1) As metodologias analíticas desenvolvidas para ramipril, citalopram e
gliclazida foram adequadas para rotinas com grande quantidade de amostras para
doseamento, como estudos farmacocinéticos ou de biodisponibilidade. 2) A formulação
teste de citalopram é bioequivalente a formulação de referência para velocidade e extensão
de absorção. Estudos futuros de citalopram podem ser realizados com menor número
(14-16) de voluntários, baseado no baixo coeficiente de variabilidade intra-sujeito.
3) A formulação teste de ramipril também é bioequivalente à formulação de referência para
velocidade e extensão de absorção. Estudos futuros de ramipril devem ser realizados pela
quantificação do fármaco na sua forma inalterada e coletas de amostras até 10 horas após a
administração. 4) Com relação ao estudo de gliclazida, as diferenças entre as formulações
teste e referências não demonstram bioequivalência. Interessante, é o fato que as
formulações de referência [Diamicron Brasil e Irlanda] não são bioequivalentes entre si,
indicando diferenças significativas nas formulações de referência produzidas em países
diferentes (neste caso particular, Irlanda e Brasil).
ABSTRACT
xiii
Mendes, Gustavo Duarte – Planning and evaluation of relative bioavailability studies for
generic drugs – Faculty of Medical Sciences; State University of Campinas, 2007. Doctoral
Thesis.
Bioavailability/bioequivalence studies began in Brazil in 1989 and the regulation of this
sector began in 1999 with the promulgation of laws regulating generic medications. The
regulations of this sector have been fostering a growth in the production quality of generic
and similar medications, since the performance of Bioavailability studies aims, at the end,
to prove the efficacy of these medicatons.
This work aims at the planning and evaluation of bioavailability/bioequivalence studies, the
development of analytical methods for quantifying samples of evaluated pharmaceuticals
(citalopram, ramipril and gliclazide). Additionally, this evaluation aims to improve
protocols for future studies for new formulations as well as to decrease volunteer exposure
to a minimum, respecting basic bioethical principles.
The parameters considered for developing the clinical protocols were: the adequate number
of volunteers, volunteer gender, sampling times for characterizing the pharmacokinetic
profile, pharmaceutical form, interval between administrations, administration conditions
such as fasting and non fasting, and the analytical method used for determining sample
dosage.
Three bioequivalence studies (citalopram, ramipril, gliclazide) were used to demonstrate
the parameters considered in developing the clinical protocols.
Results: 1) For citalopram, the intra subject CV% for Cmax and AUClast were14.09 and 8.38,
respectively. 2) For ramipril, the intra-subject variation (% CV) for both Cmax and AUCs
ratios were lower for the active metabolite, as expected in bioequivalence studies,
confirming that the parent compounds are more discriminative to establish bioequivalence.
3) For gliclazide, the geometric mean and 90% confidence intervals (CI) for the
Gliclazide/Diamicron (Ireland) ratio were 588.68% (90% CI= 491.16, 705.58%) for
AUClast and 1395.77% (90% CI= 1116.62, 1744.72%) for Cmax. The geometric mean and
90% confidence intervals (CI) for the Gliclazide/Diamicron (Brazil) ratio were 249.16%
Abstract
xiv
Abstract
xv
(90% CI= 207.96, 298.54%) for AUClast, and 188.04% (90% CI= 151.72, 233.05%) for
Cmax. The geometric mean and 90% confidence intervals (CI) for the
Diamicron(Brazil)/Diamicron (Ireland) ratio were 236.26% (90% CI= 197.12, 283.17%)
for AUClast and 225.21% (90% CI= 175.25, 289.42%) for Cmax.
Conclusion: 1) The analytical method developed for ramipril, citalopram and gliclazide
were adequate for routines with large quantities of samples, such as pharmacokinetic or
bioavailability studies. 2) The citalopram test formulation was bioequivalent to the
reference formulation regarding the rate and extent of absorption. Future studies of
citalopram can be performed with a lower number of volunteers (14-16), based on the low
intra subject CV. 3) Test formulations of ramipril were also bioequivalent to the reference
formulation regarding the rate and extent of absorption. Future studies of ramipril need to
be performed to quantify the pharmaceutical in its unaltered form alone by collecting
samples up until ten 10 hours after administration. 4) Gliclazide was not bioequivalent to its
reference formulations. Interestingly, the reference formulations [Diamicron Brazil and
Ireland] were not bioequivalent with each other, indicating significant differences in
reference formulations produced in different countries.
INTRODUÇÃO
16
Os estudos de biodisponibilidade absoluta e relativa foram iniciados no Brasil
pelo Prof. Dr. Gilberto De Nucci em 1989, através da idealização e criação da primeira
unidade de pesquisa, Unidade de Farmacologia Miguel Servet/Unicamp, destinada a
estudos de biodisponibilidade/bioequivalência (ANVISA, 2002). Nesta época, este tipo de
pesquisa era patrocinado por indústrias farmacêuticas com uma visão mais aprofundada do
processo de qualidade e garantia da qualidade no desenvolvimento de medicamentos
similares e/ou por estratégia de marketing/comercialização dos medicamentos pelas
indústrias farmacêuticas.
Nesta época, as pesquisas eram conduzidas segundo as normas do FDA
(Agência Regulatória Americana) e EMEA (Agência Européia de Medicamentos), devido à
ausência de legislação específica no Brasil para condução de estudos
biodisponibilidade/bioequivalência.
Em 1997, é criada pelo Prof. Dr. Gilberto De Nucci, a Unidade Analítica
Cartesius, no Departamento de Farmacologia da Universidade de São Paulo, que
possibilitou a formação e qualificação de um grande número de
profissionais/pesquisadores, que atualmente desenvolvem suas atividades em vários centros
de pesquisa e indústrias do Brasil. A alta qualificação técnica do laboratório e
equipamentos de última geração permitiram a implementação, mais uma vez pioneira no
Brasil, da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de
massas (CLAE-EM/EM) para quantificação de fármacos em fluídos biológicos.
Seguindo a tendência mundial, o Ministério da Saúde/ANVISA implanta a
política para medicamentos genéricos no país a partir de 1999, através da promulgação da
Lei dos Genéricos (ANVISA, 1999), que estabelece a obrigatoriedade de realizar estudos
de biodisponibilidade relativa/bioequivalência para medicamentos genéricos.
Posteriormente, a resolução RDC nº 133 de 29/05/2003 estabelece a obrigatoriedade de
realizar estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência para medicamentos
similares no Brasil (ANVISA, 2003). A regulamentação do setor acarreta em aumento
contínuo dos estudos e, principalmente, um grande aumento na qualidade de fabricação dos
medicamentos similares e genéricos. Existem ainda vantagens econômicas pelo baixo preço
Introdução
17
e competitividade de preços, no caso dos medicamentos genéricos (Rosenbaum, 1998;
Geitona et al., 2006).
Para a indústria farmacêutica, o custo de desenvolvimento de uma formulação
genérica é bem menor, quando comparado ao investimento necessário a pesquisa e
desenvolvimento de um medicamento inovador, visto que para o medicamento inovador é
necessário realizar estudos de fase I, II e III para garantir eficácia e segurança da
formulação. Já o medicamento genérico necessita somente comprovar a equivalência
terapêutica através de estudos in vitro (equivalência farmacêutica) e in vivo
(bioequivalência), após o término do período de patente, assumindo os resultados de
estudos de eficácia e segurança, realizados durante o desenvolvimento do medicamento
inovador (Rumel et al., 2006).
Atualmente, vários estudos clínicos para determinação de biodisponibilidade
relativa/bioequivalência de medicamentos estão em execução no Brasil. Estes estudos têm
por objetivo demonstrar a intercambialidade dos medicamentos teste e referência, de tal
forma a garantir a premissa básica da bioequivalência: se dois medicamentos são
bioequivalentes, eles apresentam equivalência terapêutica, eficácia e segurança
(Midha et al., 2004). Adicionalmente, os estudos de biodisponibilidade
relativa/bioequivalência têm por objetivo demonstrar evidências in vivo da qualidade
farmacêutica dos produtos (Midha et al., 2004).
A análise estatística de bioequivalência é estabelecida de forma a demonstrar a
equivalência das formulações, através da avaliação dos parâmetros farmacocinéticos de
ASC (extensão de absorção) e Cmax (velocidade de absorção). As formulações são
consideradas com biodisponibilidade equivalente quando o intervalo de confiança (IC) de
90% das médias geométricas da ASC e Cmax está dentro do intervalo de 80-125%
estabelecidos pelo FDA e ANVISA (Rosenbaum, 1998; ANVISA, 2006; FDA, 2003).
Os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência são planejados de tal
forma a garantir a segurança dos voluntários participantes dos estudos, de acordo com os
referenciais básicos de bioética (ANVISA, 1996; ANVISA, 1997) e através da definição de
parâmetros, que permitam demonstrar que os medicamentos testados são bioequivalentes
Introdução
18
(ou não) aos medicamentos de referência. Os parâmetros a serem considerados no
planejamento de estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência são:
• número de voluntários;
• sexo dos voluntários;
• tempos de coleta para caracterização do perfil farmacocinético;
• forma farmacêutica;
• intervalo entre as administrações (“washout”);
• condição de administração: alimentação/jejum;
• metodologia analítica a ser utilizada para o doseamento das amostras;
• fármaco e/ou metabólito ativo na circulação a ser quantificado
Número de voluntários:
O número de voluntários a ser empregado em um estudo de
biodisponibilidade/bioequivalência é geralmente estabelecido através de estudos
anteriormente realizados para o mesmo fármaco, dados de revisão de literatura e estudo
piloto quando não há dado disponível na literatura, sendo que, o número adequado de
voluntários deve assegurar poder estatístico (> 0.8) suficiente para garantir a confiabilidade
dos resultados do estudo de biodisponibilidade/bioequivalência.
Com relação ao coeficiente de variabilidade intra-sujeito, quanto menor o
coeficiente, menor o número de voluntários a ser empregado para a avaliação estatística de
bioequivalência. Os fármacos considerados de alta variabilidade têm um coeficiente de
variabilidade intra-sujeito acima de 30% (Midha et al., 2004; Midha et al., 2005) e os
fármacos considerados com baixa variabilidade tem um coeficiente de variabilidade
intra-sujeito entre 5-15% (Midha et al., 2004).
Introdução
19
Adicionalmente, devemos levar em consideração os seguintes critérios
estabelecidos pela legislação (ANVISA, 2006): número mínimo de 12 voluntários para
qualquer estudo de biodisponibilidade/bioequivalência e 24 voluntários na falta de dados de
estudos anteriores e de revisão de literatura para o coeficiente de variação do fármaco.
Sexo dos voluntários:
A grande maioria dos estudos de biodisponibilidade/bioequivalência é realizada
em voluntários de ambos os sexos e balanceados. Em casos específicos, os estudos podem
ser realizados em homens ou em mulheres somente. Por exemplo, estudo de
bioequivalência de isotretinoína, retinóide que inibe a função das glândulas sebáceas e a
queratinização (Thiboutot et al., 2006; Georgala et al., 2005), é realizado em homens,
devido ao potencial risco teratogênico da droga. A legislação atual (ANVISA, 2006) para
estudos de contraceptivos exige que os estudos sejam realizados com mulheres em idade
fértil, e para medicações com características específicas ao sexo e idade que os estudos
sejam realizados em voluntários com essas características.
Tempos de coleta:
Tempos de coleta adequados devem garantir a caracterização do perfil
farmacocinético do fármaco, sendo desta forma, necessário assegurar:
• determinação mais eficiente possível do Cmax através das coletas de amostras
suficientemente próximas a região do intervalo de tempo previsto para a
ocorrência do Tmax;
• coletas de amostras na fase de eliminação. Geralmente, coletas entre 3 e 5
meias-vidas do fármaco;
• % AUCinf extrapolada menor que 20% para mais de 90% dos voluntários;
• coletas de amostras que possuam níveis quantificáveis por razões de ordem
ética;
Introdução
20
Para fármacos que apresentam meia-vida de eliminação longa
(superior a 24 horas) pode ser utilizado cronograma de coleta de amostras de até 72 horas
(ASCtruncada), visto que permite a caracterização farmacocinética de Cmax e ASC relacionada
à fase de absorção do fármaco, objetivos estes da avaliação de bioequivalência, e permite,
adicionalmente, um menor número de coleta de amostras dos voluntários.
Forma farmacêutica:
Os diferentes tipos (comprimido, cápsula, solução, suspensão, etc.) de formas
farmacêuticas devem ser considerados no planejamento dos tempos de coleta, pois
implicam em variação dos parâmetros farmacocinéticos para uma mesma dose de
determinado fármaco.
Nas Figuras 1 e 2, abaixo, apresentam-se exemplos da influência da forma
farmacêutica quanto ao perfil farmacocinético obtido. Como pode ser observado, os tempos
de coleta a serem planejados para determinação do Cmax são distintos.
Introdução
21
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Carbamazepina comprimido 200 mgCarbamazepina suspensão 200 mg
72 96 120 144 168
Tempo (h)
Con
cent
raçã
o Pl
asm
átic
a M
édia
(ng/
mL)
Figura 1- Efeito da forma farmacêutica no TMAX da carbamazepina (200 mg).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0
10
20
30
40 Advil - comprimido - 2 x 200 mgIbuprofeno - cápsula - 400 mg
Tempo (h)
Con
cent
raçã
o Pl
asm
átic
a(u
g/m
L)
Figura 2- Efeito da forma farmacêutica no TMAX do ibuprofeno (400 mg).
Introdução
22
Efeito da alimentação:
Durante o planejamento do protocolo clínico deve ser levado em consideração a
influência da alimentação na absorção dos fármacos. A alimentação pode seguramente
influenciar a dissolução da forma farmacêutica utilizada (Schug et al., 2002) e efetivamente
comprometer a eficácia terapêutica, principalmente dos produtos de índice terapêutico
estreito. Regulatoriamente (ANVISA, 2006) é exigido estudo de bioequivalência sob
condições alimentares nos seguintes casos:
• formas de liberação prolongada ou controlada (adicionalmente ao estudo em
jejum);
• formas de liberação retardada, que apresentam revestimento
gastro-resistente;
• formas de liberação imediata cujos fármacos tenham a absorção influenciada
pela presença de alimentos, resultando em alterações clinicamente
significativas e indicação de administração do medicamento com alimentos.
Nas figuras 3 e 4, abaixo, apresentam-se exemplos da influência da alimentação
sobre o perfil farmacocinético obtido após a administração de saquinavir e ritonavir,
respectivamente. Como pode ser observado, os tempos de coleta a serem planejados para
determinação do Cmax são distintos para ritonavir. Já para o saquinavir, o Cmax é
aproximadamente 2.5 vezes maior na presença de alimentos do que em jejum.
Introdução
23
Introdução
24
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
5
10
15
20
25 Desjejum 800 caloriasJejum
Tempo (h)
Con
cent
raçã
o Pl
asm
átic
a M
édia
(ng/
mL)
Figura 3- Efeito da alimentação no CMAX do saquinavir (Cápsula 200 mg)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
0
100
200
300
400
500
Desjejum 800 caloriasJejum
Tempo (h)
Con
cent
raçã
o Pl
asm
átic
a M
édia
(ng/
mL)
Figura 4- Efeito da alimentação no TMAX do ritonavir(Cápsula 100 mg)
Introdução
25
Intervalo entre as administrações
"washout" ) deve ser de 7 meias vidas para
garantir qu
odologia analítica
stras em fluídos biológicos é realizada por diferentes
metodologias analíticas, dentre elas:
tografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de
rafia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta;
a;
rafia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria
de massas (CLAE-EM/EM) é, atualm
as
do tempo de análise das amostras pela associação das técnicas,
O intervalo entre as administrações (
e não haja efeito residual do primeiro período no segundo período de
administração.
Met
A quantificação de amo
• Radioimunoensaio;
• Elisa;
• Croma
massas;
• Cromatog
• Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por Fluorescênci
• Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas;
• Absorção atômica;
A técnica de cromatog
ente, a mais utilizada para quantificação de amostras
biológicas de estudos biodisponibilidade/bioequivalência (Kauppila, 2004). Isto se deve:
• a alta sensibilidade e seletividade proporcionadas pela associação d
técnicas;
• diminuição
fator importante a ser considerado em estudos de
biodisponibilidade/bioequivalência, visto que envolvem o doseamento de
um grande número de amostras;
Introdução
26
Do ponto de vista de um estudo biodisponibilidade/bioequivalência, a
sensibilidade e seletividade da técnica CLAE-EM/EM permitem a quantificação de
amostras de baixa concentração da fase de elim
ax médio
esperado. A técnica CLAE-EM/EM permite a validação de metodologias analíticas com
limite de quantificação inferior (LOQ) m
vo na circulação a ser quantificado
ia para os
parâmetros farmacocinéticos velocidade (C ) e extensão (ASC) de absorção é realizada
através da quantificação do fár
quantificação de metabólitos leva em consideração se: (a) o fármaco na
forma inalterada é um pró-droga inativa; (b) a concentração plasmática do fármaco na
forma inalte
ento dos
estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência devem seguir critérios científicos e
regulatórios. Sendo que, é de
inação. Adicionalmente, permitem também
a quantificação de amostras com baixas concentrações de administrações de fármacos em
baixa dose, como por exemplo, os contraceptivos e hormônios utilizados no climatério que
possuem níveis plasmáticos baixos (Licea-Perez et al., 2007; Theron et al., 2004).
O limite de quantificação inferior normalmente aceito é 10% do Cm
enores. Dependendo do analito a ser quantificado
é possível um LOQ de até 0.2% do Cmax médio esperado, o que permite uma melhor
caracterização do perfil farmacocinético.
Fármaco e/ou metabólito ati
Normalmente, a avaliação de biodisponibilidade/bioequivalênc
max
maco na forma inalterada e/ou do metabólito ativo na
circulação.
A
rada é muito baixa para ser quantificada, devido à baixa sensibilidade analítica;
(c) o fármaco na forma inalterada é metabolizado rapidamente para o metabólito ativo; (d)
tanto o fármaco na forma inalterada como o metabólito tem atividades terapêuticas, mas
somente o metabólito é quantificado em altas concentrações (Midha et al., 2004).
Os parâmetros, citados acima, a serem considerados durante o planejam
fundamental importância, que as normas técnicas sejam
baseadas em aspectos científicos.
OBJETIVOS
27
Considerando o exposto acima, este trabalho tem como objetivos:
- O planejamento e avaliação dos parâmetros necessários para a condução de
estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência para os fármacos
gliclazida, ramipril e citalopram.
- Avaliação comparativa da biodisponibilidade dos produtos a fim de
determinar se são bioequivalentes.
- O desenvolvimento de metodologia analítica utilizando a técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
(CLAE-EM/EM) para doseamento dos fármacos gliclazida, ramipril e
citalopram.
- Avaliação dos projetos de pesquisas realizados para o planejamento de novos
estudos com: a) menor número possível de voluntários envolvidos e que
garantam poder estatístico suficiente para determinar a bioequivalência
(ou não) das formulações; b) menor número possível de amostras coletadas
por razões de ordem ética; c) doseamento, sempre que analiticamente viável,
do fármaco na forma inalterada;
Objetivos
28
CAPÍTULOS
29
CAPÍTULO I
ARTIGO I
Mendes GD, Borges NC, Pereira Ados S, Mendes FD, Barrientos-Astigarraga RE, De
Nucci G. A bioequivalence study of citalopram based on quantification by
high-performance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass
spectrometry. Int J Clin Pharmacol Ther. 2005 Aug;43(8):389-98.
Capítulos 30
Capítulos
31
Capítulos
32
Capítulos
33
Capítulos
34
Capítulos
35
Capítulos 36
Capítulos
37
Capítulos
38
Capítulos
39
Capítulos 40
CAPÍTULO II
ARTIGO II
Mendes GD, Dantas Sanfelice AT, do Carmo Borges NC, Cavedal LE, Sverdloff C,
Prado Galuppo M, Modolo JH, De Nucci G. Comparative bioavailability of two
ramipril formulations after single-dose administration in healthy volunteers.
Int J Clin Pharmacol Ther. 2006 Feb;44(2):93-8.
Capítulos 41
Capítulos
42
Capítulos 43
Capítulos
44
Capítulos 45
Capítulos
46
Capítulos
47
CAPÍTULO III
ARTIGO III
Mendes GD, Moreira LD, Pereira AS, Borges A, Yui F, Mendes FD, De Nucci G. A
bioequivalence study of Gliclazide based on quantification by high-performance liquid
chromatography coupled with electrospray tandem mass spectrometry. Int J Clin
Pharmacol Ther. 2007 (in press)
Capítulos 48
Capítulos
49
Capítulos
50
Capítulos
51
Capítulos
52
Capítulos
53
Capítulos
54
Capítulos 55
Capítulos
56
Capítulos
57
Capítulos 58
DISCUSSÃO
59
Segundo, Geitona et al (2006) a substituição por fármacos genéricas permite
uma competitividade de preços. De acordo com Rumel et al (2006), os medicamentos
genéricos ampliaram o acesso a medicamentos de qualidade. O aumento contínuo dos
estudos de biodisponibilidade/bioequivalência nos últimos anos no Brasil acarretou em
aumento da qualidade das medicações disponíveis a população pela obrigatoriedade da
avaliação de eficácia terapêutica. Adicionalmente, há diminuição dos custos para com a
saúde pelo crescente número de medicamentos genéricos disponíveis à população e aos
profissionais da área da saúde.
O planejamento dos protocolos clínicos para os estudos de
biodisponibilidade/bioequivalência para os medicamentos genéricos e similares devem
assegurar a correta avaliação dos medicamentos a serem testados quanto a sua eficácia
terapêutica. Com relação ao voluntário dos estudos de biodisponibilidade/bioequivalência,
é desejável o menor número possível de coletas de amostras e menor número possível de
voluntários envolvidos.
O número de voluntários a ser utilizado na avaliação estatística deve assegurar
poder estatístico suficiente para garantir a confiabilidade dos resultados obtidos da
bioequivalência (Rosenbaum, 1998). O número de voluntários estabelecido para avaliação
de bioequivalência está diretamente relacionado à avaliação da droga na forma inalterada
e/ou metabólito e ao coeficiente de variabilidade destes. Segundo Hauck et al (1998), um
maior número de voluntários é requerido quando a avaliação de bioequivalência leva em
consideração a droga na forma inalterada e do metabólito. Isto se deve ao fato do fármaco
na forma inalterada, ter um coeficiente de variabilidade maior que o metabólito,
acarretando em maior número de voluntários, para garantir o poder estatístico suficiente
para a avaliação, tanto do fármaco na forma inalterada, quanto do metabólito
(Rosenbaum, 1998; Midha, 2004; Midha, 2005).
Segundo o FDA (2003), a quantificação somente da droga na forma inalterada é
recomendada, tendo em vista que a concentração da droga na forma inalterada é mais
sensível a alterações da formulação. Já o metabólito reflete mais a distribuição e eliminação
(Jackson, 2000).
Discussão
60
Discussão
61
A quantificação do metabólito ativo, adicionalmente ao fármaco na forma
inalterada, geralmente, deve ser realizada para a sustentação do estudo
biodisponibilidade/bioequivalência (FDA, 2003; Midha et al., 2004), tendo em vista que o
coeficiente de variabilidade intra-sujeito para Cmax e ASC são menores para o metabólito
ativo. Desta forma, a decisão de biodisponibilidade/bioequivalência deve ser baseada na
análise estatística dos parâmetros farmacocinéticos de Cmax e ASC do fármaco na forma
inalterada, por ser mais discriminativo que o metabólito ativo.
CONCLUSÃO
62
Com relação aos parâmetros (número de voluntários, sexo dos voluntários,
tempos de coleta, forma farmacêutica, intervalo entre as administrações, condição de
administração, metodologia analítica, fármaco e/ou metabólito) considerados para o
planejamento dos estudos de biodisponibilidade/bioequivalência, podemos concluir que tão
importante quanto o resultado (se as formulações são bioequivalentes ou não), é avaliação
pós estudo, tendo em vista, estudos futuros para novos medicamentos genéricos.
As metodologias analíticas desenvolvidas por cromatografia líquida de alta
eficiência associada à espectrometria de massas para os fármacos (citalopram, ramipril e
gliclazida) apresentaram sensibilidade, especificidade, facilidade de extração, pequeno
tempo de análise e a exatidão necessária para rotinas de quantificação de grandes
quantidades de amostras biológicas, como os estudos farmacocinéticos e de
biodisponibilidade. Adicionalmente, este trabalho contribui para a disseminação da técnica
empregada, acarretando em contribuição importante para a quantificação de fármacos,
principalmente de estudos de farmacocinética e biodisponibilidade.
Particularmente, para novos protocolos dos medicamentos avaliados neste
estudo devem ser considerados:
Citalopram - O baixo coeficiente de variabilidade intra-sujeito apresentado no
estudo permite a realização de estudos futuros de bioequivalência para citalopram com um
menor número de voluntários, entre 14 – 16 voluntários para demonstrar a bioequivalência.
Ramipril - O coeficiente de variabilidade intra-sujeito de Cmax e ASC é menor
para o metabólito ativo, como esperado em estudos de bioequivalência, confirmando que o
fármaco inalterado é mais discriminativo para estabelecer bioequivalência. Certamente, as
exigências do FDA para quantificação do metabólito ativo são somente para sustentação do
estudo do bioequivalência. Sendo assim, estudos futuros de biodisponibilidade comparativa
de ramipril podem ser realizados com a quantificação somente da droga na forma
inalterada. Esta abordagem permite ainda que seja realizado um menor número de coletas
(até 10 horas) por voluntário, visto que a meia vida média do fármaco na forma inalterada é
aproximadamente 1.5 horas e do metabólito de 36 horas.
Conclusão
63
Conclusão
64
Gliclazida: Os níveis plasmáticos de gliclazida atingidos para as formulações
Diamicron comprimidos 80 mg do Brasil e Irlanda são compatíveis com níveis plasmáticos
equivalentes às características de uma formulação de comprimido liberação modificada
[Diamicron 30 mg]. Interessante é o fato que as formulações de referência
[Diamicron Brasil e Irlanda] não são bioequivalentes entre si, indicando diferenças
significativas nas formulações de referência produzidas em países diferentes (neste caso
particular, Irlanda e Brasil). Embora as formulações de liberação imediata e liberação
modificada sejam recomendadas para o tratamento da mesma doença, diabetes tipo II, o
método da administração é marcadamente diferente. Assim, é provável que as diferenças
observadas nos parâmetros farmacocinéticos de ambas as formulações de referência possam
ter conseqüências clínicas para os pacientes no tratamento do diabetes. Atualmente, não há
mais produto de referência para gliclazida 80 mg comprimido, no Brasil.
Com relação à demonstração de intercambiliadade ou não das formulações
testadas pode-se concluir que:
Citalopram - que a formulação citalopram, comprimido 20 mg, elaborado pelo
laboratório Eurofarma Laboratórios Ltda é bioequivalente à formulação Cipramil®,
comprimido 20 mg, elaborado pelo laboratório Schering-Plough, para velocidade e
extensão de absorção.
Ramipril - que a formulação Ramipril, comprimido 5 mg, elaborado pelo
laboratório Laboratórios Biosintética Ltda é bioequivalente à formulação Triatec®,
comprimido 5 mg, elaborado pelo laboratório Aventis Pharma, para velocidade e extensão
de absorção de ramipril.
Gliclazida: As diferenças entre as formulações teste e referências não
demonstram bioequivalência dentro dos critérios (IC 80-125%) estabelecidos pelo FDA e
ANVISA.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de boas práticas em
biodisponibilidade: bioequivalência/Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Gerência-
Geral de Inspeção e Controle de Medicamentos e Produtos. 2002.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução – RDC nº 133, de 29 de
maio de 2003.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução - RE 1170, de 19 de abril
DE 2006.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução – Resoluçao nº 196, de 10
de outubro de 1996.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução – Resoluçao nº 251, 1997.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº 391 de 09 de Agosto de
1999.
Geitona M, Zavras D, Hatzikou M, Kyriopoulos J. Generics market in Greece: the
pharmaceutical industry's beliefs. Health Policy. 2006 Nov;79(1):35-48. Epub 2005
Dec 28.
Georgala S, Papassotiriou I, Georgala C, Demetriou E, Schulpis KH. Isotretinoin therapy
induces DNA oxidative damage. Clin Chem Lab Med. 2005;43(11):1178-82.
Jackson AJ. The role of metabolites in bioequivalency assessment. III. Highly variable
drugs with linear kinetics and first-pass effect. Pharm Res. 2000 Nov;17(11):1432-6.
Kauppila T. – Atmospheric Pressure Photoionization-Mass Spectrometry [Academic
Dissertation]. Helsinki (Finland); University of Helsinki; 2004.
Licea-Perez H, Wang S, Bowen CL, Yang E. A semi-automated 96-well plate method for
the simultaneous determination of oral contraceptives concentrations in human plasma
using ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J
Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Jan 13; [Epub ahead of print]
Referências Bibliográficas
66
Referências Bibliográficas
67
Midha KK, Rawson MJ, Hubbard JW. The bioequivalence of highly variable drugs and
drug products. Int J Clin Pharmacol Ther. 2005 Oct;43(10):485-98. Review.
Midha KK, Rawson MJ, Hubbard JW. The role of metabolites in bioequivalence. Pharm
Res. 2004 Aug;21(8):1331-44. Review.
Rosenbaum SE. Effects of variability in hepatic clearance on the bioequivalence parameters
of a drug and its metabolite: simulations using a pharmacostatistical model. Pharm Acta
Helv. 1998 Aug;73(3):135-44.
Rumel D, Nishioka Sde A, Santos AA. Drug interchangeability: clinical approach and
consumer's point of view. Rev Saude Publica. 2006 Oct;40(5):921-7.
Schug BS, Brendel E, Wolf D, Wonnemann M, Wargenau M, Blume HH. Formulation-
dependent food effects demonstrated for nifedipine modified-release preparations marketed
in the European Union. Eur J Pharm Sci. 2002 Apr;15(3):279-85.
Theron HB, Coetzee C, Sutherland FC, Wiesner JL, Swart KJ. Selective and sensitive
liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of
levonorgestrel in human plasma. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004
Dec 25;813(1-2):331-6.
Thiboutot DM, Gollnick HP. Treatment considerations for inflammatory acne: clinical
evidence for adapalene 0.1% in combination therapies. J Drugs Dermatol. 2006
Sep;5(8):785-94
U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration, Center for
Drug Evaluation and Research (CDER), - Guidance for Industry Bioavailability and
Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products - Revision 1, 2003.
ANEXO
68
ANEXO I- OUTRAS PUBLICAÇÕES DURANTE O PERÍODO DE DOUTORADO
1. Okuyama CE, Mendes GD, Faro R, Rezende VM, Lagos RM, Astigarraga RE, Antunes
E, De Nucci G. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a nitric oxide-releasing
derivative of enalapril in male beagles. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007 Apr;34(4):290-5.
Pharmacological compounds that release nitric oxide (NO) have been useful tools in the
evaluation of the broad role of NO in physiopathology and therapeutics. The present study
compared the pharmacokinetics and pharmacodynamics of enalapril and an NO-releasing
enalapril molecule (NCX899) in conscious male beagles. The effects of both enalapril and
NCX899 in the arterial hypertension and bradycardia induced by acute NO inhibition in
anaesthetized dogs were also investigated. 2. Dogs received either NCX899
(4 micromol/kg, i.v.) or enalapril (4 micromol/kg, i.v.), after which plasma concentrations
of the analytes and metabolites were quantified by liquid chromatography coupled to
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). 3. In the NCX899 group, the area under the time-
course curve (AUC(0-24h)) was 29.18 +/- 4.72, 229.37 +/- 51.32 and 5159.23 +/- 514.88
microg.h/L for the analytes nitro-enalapril, enalapril and enalaprilat, respectively. In the
enalapril group, the AUC(0-24h) was 704.53 +/- 158.86 and 4149.27 +/- 847.30 microg.h/L
for the analytes enalapril and enalaprilat, respectively. Statistical analysis of data from both
groups showed a significant difference for the analyte enalapril, but not for enalaprilat.
Moreover, NCX899 and enalapril were equally effective in inhibiting the activity of serum
angiotensin-converting enzyme. 4. In anaesthetized dogs, i.v. administration of the NO
synthase (NOS) inhibitor N(G)-nitro-l-arginine methyl ester (l-NAME; 0.1-10 mg/kg)
significantly elevated arterial blood pressure, with concomitant bradycardia. The compound
NCX899 significantly attenuated both arterial hypertension and bradycardia, whereas
enalapril had no significant effect. 5. In conclusion, the present results showed that the NO-
releasing derivative of enalapril NCX899 presents a pharmacokinetic/pharmacodynamic
relationship similar to its parent compound enalapril. Moreover, NCX899 (but not
enalapril) was effective in protecting against the cardiovascular changes induced by acute
NOS inhibition.
Anexo
69
2. Mendes GD, Hamamoto D, Ilha J, Pereira AD, De Nucci G. Anastrozole quantification
in human plasma by high-performance liquid chromatography coupled to photospray
tandem mass spectrometry applied to pharmacokinetic studies. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci. 2007 Jan 18;
A rapid, sensitive and specific method for quantifying the aromatase inhibitor (anastrozole)
in human plasma using dexchlorpheniramine as the internal standard (I.S.) is described
herein. The analyte and the I.S. were extracted from 200mul of human plasma by liquid-
liquid extraction using a mixture of diethyl ether:dichloromethane (70:30, v/v) solution.
Extracts were removed and dried in the organic phase then reconstituted with 200ml of
acetonitrile:water (50:50; v/v). The extracts were analyzed by high performance liquid
chromatography coupled with photospray tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS).
Chromatography was performed isocratically on a Genesis, C18 4mum analytical column
(100mmx2.1mm i.d.). The method had a chromatographic run time of 2.5min and a linear
calibration curve ranging from 0.05-10 ng*ml-1. The limit of quantification (LOQ) was 0.05
ng*ml-1. This HPLC-MS-MS procedure was used to assess pharmacokinetic studies.
Anexo
70
3- Cavedal LE, Mendes FD, Domingues CC, Patni AK, Monif T, Reyar S, Pereira Ados S,
Mendes GD, De Nucci G. Clonazepam quantification in human plasma by
high-performance liquid chromatography coupled with electrospray tandem mass
spectrometry in a bioequivalence study. J Mass Spectrom. 2007 Jan;42(1):81-8.
A rapid, sensitive and specific method for quantifying clonazepam in human plasma using
diazepam as the internal standard (IS) is described. The analyte and the IS were extracted
from plasma by liquid-liquid extraction using a hexane/diethylether (20 : 80, v/v) solution.
The extracts were analysed by high-performance liquid chromatography coupled with
electrospray tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS). Chromatography was performed
on a Jones Genesis C8 4 microm analytical column (100 x 2.1 mm i.d.). The method had a
chromatographic run time of 3.0 min and a linear calibration curve over the range 0.5-50
ng/ml (r2 > 0.9965). The limit of quantification was 0.5 ng/ml. This HPLC/MS/MS
procedure was used to assess the bioequivalence of two clonazepam 2 mg tablet
formulations (clonazepam test formulation from Ranbaxy Laboratories Ltd and Rivotril
from Roche Laboratorios Ltda as standard reference formulation).
Anexo
71
4. Rigato HM, Mendes GD, Borges NC, Moreno RA. Meloxicam determination in human
plasma by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry (LC-MS-MS) in Brazilian bioequivalence studies. Int J Clin Pharmacol Ther.
2006 Oct;44(10):489-98.
OBJECTIVE: In this study, the bioavailability of 2 meloxicam 15 mg tablet formulations
was compared. A single dose of each formulation was administered to 24 healthy
volunteers (12 males and 12 females). MATERIAL AND METHODS: The study was
conducted using an open, randomized and crossover design with a 2-week washout interval.
The plasma samples were obtained over a 96-hour interval and meloxicam concentrations
were analyzed by high-performance liquid chromatography (an agilent) coupled to an API
2000 turboionspray tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). An electrospray ionization
(ESI) source operating in the positive ion mode, using a cross flow counter electrode and
set for the multiple reaction monitoring (MRM) was employed. The plasma protein
precipitate was reconstituted with acetonitrile/water + 10 mM acetic acid (20/80, v/v) and
injected in a Prevail C8 5 microm (150 mm x 4.6 mm i.d.) analytical column with reverse-
phase liquid chromatography. The retention time observed for meloxicam and tenoxicam
(internal standard) was 1.8 and 1.4 minutes, respectively. The mean recovery of meloxicam
was 95.9% and the limit ofquantification was 0.02 microg/ml. RESULTS: The geometric
mean of meloxicam/movatec 15 mg individual % ratio was 101.3% for AUC(last), 99.9%
for AUC(0-infinity) and 107.7% for C(max). The 90% confidence intervals were 97.3 -
105.4%, 96.0 - 104.0% and 98.8 - 117.4%, respectively. CONCLUSION: Since the 90% CI
for both AUC(Iast), AUC(0-infinity) and C(max), ratios were all inside the 80 - 125%
interval proposed by the US Food and Drug Administration Agency and accepted by
Brazilian ANVISA (Sanitary Surveillance Agency), it was concluded that the meloxicam
formulation produced by Merck S.A. lndustrias Quimicas is bioequivalent to the movatec
formulation regarding both the rate and extent of absorption. This assay method was faster,
more simple, specific, precise and accurate in determining the bioequivalence of
meloxicam than any method previously described.
Anexo
72
5. Guilherme MC, Pereira DG, Galuppo MP, Mendes GD, Donato JL, De Nucci G.
Bioequivalence of two lithium formulations in healthy volunteers. Arzneimittelforschung.
2006;56(7):524-8.
OBJECTIVE: The purpose of this study was to compare the maximum exposure and extent
of bioavailability of two lithium carbonate (CAS 554-13-2) containing 300 mg tablet
formulations (test and reference) for oral administration. METHOD: This bioequivalence
study was conducted in a 2-period crossover design with a washout phase of 7 days. Plasma
samples were obtained by blood sampling over 72 h in each period. Twenty-four healthy
volunteers of both genders participated in the trial. Samples were analyzed by a flame
atomic absorption spectrometer. Resulting Li+ concentrations were used for determination
of the pharmacokinetic parameters AUC(last), AUC(inf) and C(max). RESULTS: 90 %
confidence intervals for AUC(last), AUC(inf) and C(max) were 96.81-107.44%,
98.44-109.54% and 98.60-111.33%, respectively. CONCLUSION: All 90% and 95%
confidence intervals were inside the limits defined by the FDA Guidance for Industry
(80%-125%) and thus stated that test and reference formulation may be accepted as
bioequivalent, with regard to both, maximum exposure and extent of bioavailability.
Anexo
73
6. Oliveira CH, Medeiros Silva R, Santagada V, Caliendo G, Perissutti E, Prado Galuppo
M, Marcondes Rezende V, Barrientos-Astigarraga RE, Mendes GD, De Nucci G.
Comparative bioavailability of two losartan formulations in healthy human volunteers after
a single dose administration. Int J Clin Pharmacol Ther. 2006 Mar;44(3):142-8.
OBJECTIVE: To compare the bioavailability of two potassic losartan immediate release
tablet (50 mg) formulations (Losartan from Laboratorios Cristalia Ltd., Brazil, as a test
formulation and Cozaar from Merck Sharp & Dohme Farmaceutica Ltd., Brazil, as a
reference formulation) in 25 volunteers of both sexes. MATERIAL AND METHODS: The
study was conducted in an open, randomized, 2-period crossover design and a 1-week
washout period. Plasma samples were obtained over a 24-hour interval. The concentrations
of losartan and its active metabolite losartan acid were analyzed by combined reversed
phase liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS-MS) with negative
ion electrospray ionization using a selected ion monitoring method. From the losartan and
losartan acid plasma concentrations vs. time curves the following pharmacokinetic
parameters were obtained: AUClast, AUC0-inf and Cmax. RESULTS: The geometric mean
and respective 90% confidence interval (CI) of Losartan/Cozaar losartan percent ratios
were 92.9% (82.2-105.0%) for Cmax, 99.0% (92.5-105.9%) for AUClast, and 99.1% (92.7-
105.8%) for AUC0-inf. Furthermore, the geometric mean and respective 90% CI of
Losartan/Cozaar losartan acid percent ratios were 98.5% (91.5-106.0%) for Cmax, 97.9%
(93.3 102.7%) for AUClast, and 98.1% (93.6-102.9%) for AUC0-inf. CONCLUSION:
Since the 90% CI for Cmax, AUClast and AUC0-inf were within the 80-125% interval
proposed by the US Food and Drug Administration, it was concluded that the potassic
losartan immediate release 50 mg tablet was bioequivalent to the Cozaar immediate release
50 mg tablet, according to both the rate and extent of absorption. While there were no
significant differences in the bioequivalence assessed by either losartan or losartan acid,
future bioequivalence studies on losartan may be performed by quantifying losartan alone
as the parent compounds are more discriminative.
Anexo
74
7. Silva LC, Oliveira LS, Mendes GD, Garcia G, Pereira Ados S, De Nucci G.
Quantification of isosorbide 5-mononitrate in human plasma by liquid chromatography-
tandem mass spectrometry using atmospheric pressure photoionization. J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci. 2006 Mar 7;832(2):302-6.
Isosorbide 5-mononitrate (5-ISMN) is an organic nitrate widely used for its vasodilating
properties in the treatment of angina pectoris. In the present study, an efficient, sensitive,
robust method was developed for the determination and quantification of isosorbide
5-mononitrate, in human plasma, by liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS), using photospray ionization. Isosorbide 5-mononitrate was
extracted from 0.5 mL human plasma by liquid-liquid extraction (LLE). The method had a
chromatographic run of 2.0 min using a C(8) analytical column (100 mm x 2.1 mm i.d.)
and the linear calibration curve over the range was linear from 20 to 2000 ng mL(-1)
(r(2)>0.995). The between-run precision, based on the relative standard deviation replicate
quality controls, was 7.9% (60 ng mL(-1)), 5.2% (300 ng mL(-1)) and 7.0% (1800 ng mL
(-1)). The between-run accuracy was 94.9%, 94.1% and 88.8% for the above-mentioned
concentrations, respectively. The method herein described was employed in a
bioequivalence study of two tablet formulations of isosorbide 5-mononitrate 40 mg.
Anexo
75
8. Pereira AS, Mendes GD, Oliveira LS, Valle HF, De Nucci G. Atmospheric pressure
photoionization applied to quantitation of cyproterone acetate in human plasma. J
Chromatogr Sci. 2005 Nov-Dec;43(10):513-7.
Cyproterone acetate [6-chloro-1beta,2beta-dihydro-17alpha-hydroxy- 3'H-cyclopropa(1,2)-
pregna-1,4,6-triene-3,20-dione acetate] is a powerful antiandrogen used in the treatment of
women suffering from disorders associated with androgenization such as hirsutism and
acne. A fast, sensitive, and robustness method is developed for the determination and
quantitation of cyproterone acetate in human blood plasma by liquid chromatography
coupled with tandem mass spectrometry. Cyproterone acetate is extracted from 0.2 mL
human plasma by liquid-liquid extraction. The method has a chromatographic run of 4.5
min, using a C18 analytical column (100- yen 2.1-mm i.d.), and the linear calibration curve
over the range is linear from 1 to 500 ng/mL (r2 > 0.994). The between-run precision,
based on the relative standard deviation replicate quality controls, is 96.2% (3 ng/mL),
97.5% (120 ng/mL), and 99.1% (400 ng/mL). The between-run accuracy was +/- 2.7%,
3.1%, and 4.8% for the previously mentioned concentrations, respectively. The method is
employed in a bioequivalence study of two tablet formulations of cyproterone acetate
(100 mg).
Anexo
76
9. Bicalho B, Guzzo GC, Lilla S, Dos Santos HO, Mendes GD, Caliendo G, Perissutti E,
Aiello A, Luciano P, Santagada V, Pereira AS, De Nucci G. Pharmacokinetics of
dihydroergocristine and its major metabolite 8'-hydroxy-dihydroergocristine in human
plasma. Curr Drug Metab. 2005 Dec;6(6):519-29.
Dihydroergocristine (DHEC) is a semi-synthetic drug mainly used for age-related cognitive
impairment. In this study, its major metabolite 8'-hydroxy-dihydroergocristine (8'-OH-
DHEC) was produced in incubates of a bovine liver preparation using dihydroergocristine
mesylate (DHECM) as substrate. Purification was achieved by flash silica gel column and
reverse phase liquid chromatographies, and identification was based on accurate molecular
mass measurements, mass fragmentation spectra and NMR ((1)H/(13)C) chemical shifts.
By using the substance produced in vitro, a fast, sensitive, specific and robust LC/MS/MS
method for the simultaneous determination of DHEC and its major metabolite in human
plasma was developed and validated. Bromocriptine was used as internal standard and
limits of quantification for DHEC and 8'-OH-DHEC were 10 pg/ml and 20 pg/ml,
respectively. Pharmacokinetic parameters were investigated on 12 male healthy volunteers
to whom a single dose of 18 mg DHECM was administered in tablets (Iskevert). The peak
of DHEC was 0.28 +/- 0.22 microg/l, the t(max) 0.46 +/- 0.26 h, the AUC(last)
0.39 +/- 0.41 microg/l.h and the terminal elimination half-life 3.50 +/- 2.27 h. The peak of
8'-OH-DHEC was 5.63 +/- 3.34 microg/l, the t(max) 1.04 +/- 0.66 h, the AUC(last) 13.36
+/- 5.82 microg/l.h and the terminal elimination half-life 3.90 +/- 1.07 h. Dosing of 18 mg
DHECM was well tolerated, causing no adverse events.
Anexo
77
Pereira Ados S, Oliveira LS, Mendes GD, Gabbai JJ, De Nucci G. Quantification of
betamethasone in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
using atmospheric pressure photoionization in negative mode. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci. 2005 Dec 15;828(1-2):27-32.
Betamethasone is a synthetic corticosteroid designed to exert a marked glucocorticoid
activity. As the free alcohol, betamethasone finds widespread clinical applications related
to its anti-inflammatory and immunosuppressant activity. In the present study, a fast,
sensitive, robust method was developed for the determination and quantification of
betamethasone in human plasma by liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry, using photospray ionization in negative mode. Betamethasone was extracted
from 0.5 ml human plasma by liquid-liquid extraction (LLE) using chloramphenicol as
internal standard. The method has a chromatographic run of 2.5 min using a C(18)
analytical column (100 mm x 2.1 mm i.d.) and the linear calibration curve over the range
was linear from 0.05 to 50 ng ml(-1) (r(2)>0.993). The between-run precision, based on the
relative standard deviation replicate quality controls was 94.1% (0.15 ng ml(-1)), 90.7%
(4.0 ng ml(-1)) and 97.2% (40 ng ml(-1)). The between-run accuracy for the above-
mentioned concentrations was 11.9, 9.0 and 9.8%, respectively. The method herein
described was employed in a bioequivalence study of two formulations of
dexchlorpheniramine/betamethasone 2 mg/0.25 mg tablets.
Anexo
78
Borges NC, Mendes GD, Barrientos-Astigarraga RE, Galvinas P, Oliveira CH, De Nucci
G. Verapamil quantification in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem
mass spectrometry. An application for bioequivalence study. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci. 2005 Dec 5;827(2):165-72.
An analytical method based on liquid chromatography with positive ion electrospray
ionization (ESI) coupled to tandem mass spectrometry detection (LC-MS/MS) was
developed for the determination of Verapamil in human plasma using Metoprolol as the
internal standard. The analyte and internal standard were extracted from the plasma
samples by liquid-liquid extraction and chromatographed on a C(8) analytical column. The
mobile phase consisted of methanol-water (70:30; v/v)+12 mM formic acid. The method
had a chromatographic total run time of 3.5 min and was linear within the range 1.00-500
ng/mL. Detection was carried out on a Micromass Quattro Ultima tandem mass
spectrometer by multiple reaction monitoring (MRM). The intra-run imprecision was less
than 5.1% calculated from the quality control (QC) samples, and 16.3% from the limit of
quantification (LOQ). The accuracy determined from QC samples were between 92.9 and
103.1%, and 95.2 and 115.3% from LOQ. Concerning the inter-batch analysis, the
imprecision was less than 5.8% and 17.3% from QC samples and LOQ, respectively. The
accuracy varied between 98.2 and 100.8% from QC and it was 103.1% from LOQ. The
protocol herein described was employed in a bioequivalence study of two tablet
formulations of Verapamil.
Anexo
79
10. Borges NC, Mendes GD, Barrientos-Astigarraga RE, Zappi E, Mendes FD, De Nucci
G. Comparative bioavailability study with two gemfibrozil tablet formulations in healthy
volunteers. Arzneimittelforschung. 2005;55(7):382-6.
OBJECTIVE: To assess the bioequivalence of gemfibrozil (CAS 25812-30-0) 900 mg
tablet formulation from EMS Farmaceutica as test formulation versus a 900 mg tablet
formulation as reference in 36 healthy volunteers of both sexes. METHODS: The study was
conducted using an open, randomized, two-period crossover design with a 1-week washout
interval. Plasma samples were obtained over a 24-h period. Plasma gemfibrozil
concentrations were analyzed by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-MS-MS) with negative ion electrospray ionization using multiple
reaction monitoring (MRM). From the gemfibrozil plasma concentration vs time curves,
the following pharmacokinetic parameters were obtained: AUClast, AUC(0-inf) and Cmax.
RESULTS: The limit of quantification was 0.05 microg/mL for plasma gemfibrozil
analysis. The geometric mean and respective 90% confidence interval (CI) of
Test/Reference percent ratios were 90.29 (81.39-100.17) for Cmax, 96.26 (90.33-102.59)
for AUClast, 96.04 (90.21-102.23) for AUC(0-24 h) and 96.62 (90.82-102.78) for
AUC(0-infinity). CONCLUSION: Since the 90% CI for AUClast, AUC(0-inf) and Cmax,
ratios were within the 80-125% interval proposed by the U.S. FDA, it was concluded that
gemfibrozil 900 mg tablet (test formulation) was bioequivalent to the 900 mg tablet
reference formulation for both rate and extent of absorption.
Anexo
80
11. do Carmo Borges NC, Mendes GD, de Oliveira Silva D, Marcondes Rezende V,
Barrientos-Astigarraga RE, De Nucci G. Quantification of carvedilol in human plasma by
high-performance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass
spectrometry: application to bioequivalence study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed
Life Sci. 2005 Aug 5;822(1-2):253-62.
A rapid, sensitive and specific method to quantify carvedilol in human plasma using
metoprolol as the internal standard (IS) is described. The analyte and the IS were extracted
from plasma by liquid-liquid extraction using a diethyl-ether solvent. After removed and
dried the organic phase, the extracts were reconstituted with a fixed volume of acetonitrile-
water (50/50; v/v). The extracts were analyzed by a high performance liquid
chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).
Chromatography was performed isocratically on Alltech Prevail C18 5 microm analytical
column, (150 mm x 4.6 mm i.d.). The method had a chromatographic run time of 3.5 min
and a linear calibration curve over the range 0.1-200 ng ml(-1) (r2>0.997992). The limit of
quantification was 0.1 ng ml(-1). This HPLC-MS/MS procedure was used to assess the
bioequivalence of two carvedilol 25 mg tablet formulations (carvedilol test formulation
from Laboratorios Biosintetica Ltda and Coreg from Roche Quimicos e Farmaceuticos S.A
standard reference formulation). A single 25 mg dose of each formulation was administered
to healthy volunteers. The study was conducted using an open, randomized, two-period
crossover design with a 2-week wash-out interval. Since the 90% CI for C(max) and AUCs
ratios were all inside the 80-125% interval proposed by the US Food and Drug
Administration Agency, it was concluded that carvedilol formulation elaborated by
Laboratorios Biosintetica Ltda is bioequivalent to Coreg formulation for both the rate and
the extent of absorption.
Anexo
81
12. Borges NC, Mendes GD, Borges A, Oliveira SE, Barrientos-Astigarraga RE, Nucci
GD. Ticlopidine quantification in human plasma by high-performance liquid
chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry. Application to
bioequivalence study. J Mass Spectrom. 2004 Dec;39(12):1562-9.
A rapid, sensitive and specific method to quantify ticlopidine in human plasma using
clopidogrel as the internal standard (IS) is described. The analyte and the IS were extracted
from acidified plasma by liquid-liquid extraction using diethyl ether-hexane (80 : 20, v/v).
The extracts were analyzed by high-performance liquid chromatography coupled to
electrospray tandem mass spectrometry (HPLC/MS/MS). Chromatography was performed
isocratically on a Jones Genesis C(8) 4 microm analytical column (150 x 4.1 mm i.d.). The
method had a chromatographic run time of 3.0 min and a linear calibration curve over the
range 1.0-1000 ng ml(-1) (r(2) > 0.999427). The limit of quantification was 1.0 ng ml(-1).
This HPLC/MS/MS procedure was used to assess the bioequivalence of two ticlopidine 250
mg tablet formulations (ticlopidine test formulation from Apotex do Brasil, Brazil, and
Ticlid from Sanofi-Synthelabo, standard reference formulation). A single 250 mg dose of
each formulation was administered to healthy volunteers. The study was conducted using
an open, randomized, two-period crossover design with a 2 week washout interval. Since
the 90% confidence interval for C(max) and area under the curve ratios were all inside the
80-125% interval proposed by the US Food and Drug Administration, it was concluded that
ticlopidine formulation from Apotex do Brasil is bioequivalent to Ticlid formulation with
respect to both the rate and the extent of absorption.
Anexo
82
13. Padua AA, Barrientos-Astigarraga RE, Rezende VM, Mendes GD, De Nucci G.
Lisinopril quantification in human plasma by liquid chromatography-electrospray tandem
mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004 Oct
5;809(2):211-6.
An analytical method based on liquid chromatography with positive ion electrospray
ionization (ESI) coupled to tandem mass spectrometry detection was developed for the
determination of Lisinopril in human plasma using Enalaprilat as internal standard. The
analyte and internal standard were extracted from the plasma samples by solid-phase
extraction using Waters HLB Oasis SPE cartridges and chromatographed on a C8 analytical
column. The mobile phase consisted of acetonitrile/water (60:40, v/v) + 20 mM acetic acid
+ 4.3 mM of triethylamine. The method had a chromatographic total run-time of 6.5 min
and was linear within the range 2.00-200 ng/ml. Detection was carried out on a Micromass
triple quadrupole tandem mass spectrometer by multiple reaction monitoring (MRM). The
precision (CV%) and accuracy, calculated from limit of quantification (LOQ) samples
(n = 8), were 8.9 and 98.9%, respectively. The method herein described was employed in a
bioequivalence study of two tablet formulations of Lisinopril 20mg.
Anexo
83
Anexo
84
14. Peres O, Oliveira CH, Barrientos-Astigarraga RE, Rezende VM, Mendes GD, de Nucci
G. Determination of pantoprazole in human plasma by LC-MS-MS using lansoprazole as
internal standard. Arzneimittelforschung. 2004;54(6):314-9.
An analytical method based on liquid chromatography with positive ion electrospray
ionization (ESI) coupled to tandem mass spectrometry detection was developed for the
determination of pantoprazole (CAS 102625-70-7) in human plasma using lansoprazole
(CAS 103577-45-3) as the internal standard. The analyte and internal standard were
extracted from the plasma samples by liquid/liquid extraction using
diethyl-ether/dichloromethane (70:30; v/v) and chromatographed on a C8 analytical
column. The mobile phase consisted of acetonitrile/ water/methanol (57:25:18; v/v/v)
+ 10 mmol/l acetic acid + 20 mmol/l ammonium acetate. The method has a
chromatographic total run time of 4.5 min and was linear within the range 5.0-5,000 ng/mL.
Detection was performed on a triple quadrupole tandem mass spectrometer by Multiple
Reaction Monitoring (MRM). The intra- and inter-run precisions calculated from quality
control (QC) samples were 4.2 % and 3.2 %, respectively. The accuracies as determined
from QC samples were -5.0 % (intra-run) and 2.0 % (inter-run). The method herein
described was employed in a bioequivalence study of two tablet formulations of
pantoprazole.
