Potencial de Fitorremediación del Glifosato en la Planta ...

Trabajo de Grado de Pregrado

Potencial de Fitorremediación del Glifosato en la Planta

Acuática Egeria densa

Presentado por:

Adriana Gómez Unda

Código: 200121347

Dirigida por:

Manuel Rodríguez Susa

Universidad de los Andes

Co-Dirigida por:

Victor Manuel Sarria

Lucía Cristina Lozano

Universidad de los Andes

INGENIERÍA AMBIENTAL

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA CIVIL Y AMBIENTAL

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

BOGOTÁ, 2008

Potencial de Fitorremediación del Glifosato de la planta acuática Egeria densa

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Índice Introducción........................................................................................................................ 2 Objetiv os ............................................................................................................................. 4

Objetiv o General ............................................................................................................. 4 Objetiv os Específicos ....................................................................................................... 4

Hipótesis ............................................................................................................................. 4 Justif icación......................................................................................................................... 4

Marco Teórico ..................................................................................................................... 5 Propiedades y generalidades del Glifosato ........................................................................ 5 Modo de acción............................................................................................................... 6 Medición del Glifosato ..................................................................................................... 7 Regulaciones ................................................................................................................... 9 Dosis utilizadas en Colombia ............................................................................................ 9 El Roundup y Los S urfactantes .........................................................................................10

COSMOF LUX 411F ......................................................................................................11 El POEA ......................................................................................................................12 Fusarium oxysporum ...................................................................................................13

Toxicidad del Roundup y sus constituyentes .....................................................................14 Efectos sobre los organismos ...........................................................................................15

Estudios I nternacionales .............................................................................................15 Situación en Ecuador y Colombia .................................................................................17

Efectos sobre las relaciones ecológicas ............................................................................19

Destino en el suelo .........................................................................................................20 Fitorremediación de Pesticidas ........................................................................................24 Biorremediación del Glifosato .........................................................................................26 Egeria densa ...................................................................................................................29

Materiales y métodos .........................................................................................................31 Muestras Vegetales ........................................................................................................31 Reactivos .......................................................................................................................31 Montaje 1 ......................................................................................................................31 Montaje 2 ......................................................................................................................32 Preparación de las muestras ............................................................................................32 Determinación de Glifosato por Espectrofotometría UV ....................................................32 Análisis de los datos ........................................................................................................33 Análisis estadístico..........................................................................................................33

Resultados y Discusión ........................................................................................................34 Montaje 1 ......................................................................................................................34 Montaje 2 ......................................................................................................................35

Actividad enzimática .......................................................................................................38 Tiempos de vida media ...................................................................................................39 Discusión general............................................................................................................41

Conclusiones ......................................................................................................................41 Referencias ........................................................................................................................42


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Introducción

Hemos estado utilizando una flota de aviones de fumigación para lanzar cantidades sin

precedentes de glifosato sobre cientos de miles de acres en uno de los ecosistemas más

delicados y biodiversos del mundo. Este fútil esfuerzo ha hecho poco por reducir la oferta de

cocaína en nuestras calles, pero podría ser e l comienzo de una epidemia de F usarium en la

cuenca del Amazonas. La guerra de la droga ha tratado en vano que la cocaína no llegue a las

narices de la gente, pero podría, en su lugar, abrasar los pulmones de la tierra.

Sanho Tree (2003)1

El glifosato es el herbicida de amplio espectro (no selectiv o) más v endido en el mundo (Mallat & Barceló, 1998). Se trata de un herbicida organofosforado, altamente polar, muy soluble en el agua e insoluble en la mayoría de los solv entes orgánicos (Calderón, 2005). El glifosato es el ingrediente activo del herbicida Roundup, manufacturado por la Compañía Química Monsanto (St. Louis, MO, US A). Varios estudios lo han descrito como un compuesto amigable con el ambiente, altamente biodegradable (Strange-Hansen et al., 2004; Wirén-Lehr et al., 1997; Rueppel et al., 1977) y con bajo riesgo de lixiv iación (Baylis, 2000). Sin embargo, un gran número de investigaciones han demostrado lo contrario. Por ejemplo, estudios recientes muestran que los pesticidas basados en glifosato afectan la regulación del ciclo celular de

peces y anfibios, lo que podría llegar a implicar un riesgo crónico de cáncer en los humanos (Rubio et al., 2003). Por otro lado, la Comisión Europea, a trav és de diversos estudios realizados por la ONG francesa Eaux et Riv ières de Bretagne (ERB), clasificó al g lifosato como tóxico para los

organismos acuáticos, capaz de provocar efectos nefastos para el ambiente a largo plazo y demostró la presencia de las dos principales moléculas del Roundup - glifosato y AMPA (su principal metabolito) - en el 55% y 35% de las aguas superficiales francesas respectivamente (Amorín, 2007). De igual forma, otros estudios mostraron que puede ser lixiv iado como consecuencia de su uso extensivo (de Jonge et al., 2000; S trange-Hansen et al., 2004; Dousset et al., 2004) y, de hecho, ya ha sido detectado en aguas subterráneas de Dinamarca (S ørensen et al., 2006).

En Colombia, el Roundup se aplica en forma de aspersión aérea sobre un área no despreciable del país desde el año 1994 como una alternativ a para combatir los cultivos ilícitos (Vargas, 2004). Esta alternativ a propuesta por el gobierno de Estados Unidos fue aprobada basándose

principalmente en un estudio realizado por la División de la Comisión Interamericana para el Control del Abuso de Drogas (CICAD) de la Organización de Estados Americanos (OEA), donde se hace énfasis en el carácter inocuo, selectivo y a ltamente biodegradable de dicho herbicida (Solomon et al., 2005). Sin embargo, este documento ha s ido ampliamente criticado por diferentes instituciones por carecer de una base científica y por obtener conclusiones basadas en datos inexistentes, entre otras razones (S icard et al., 2005). No se requiere profundizar en el documento para reconocer su carácter ambiguo y dubitativ o. La comunidad científ ica internacional ha manifestado su preocupación a l identificar la presencia del glifosato en el agua y el suelo de sus países, y han desarrollado inv estigaciones

1 Director del Proyecto de Política de Drogas en el Instituto de Estudios Políticos de Washington, DC. Miembro del

Plan Colombia - Mencionado por Jeremy Bigwood en La Guerra tóxica contra las drogas. Agosto 2003


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para establecer los v erdaderos efectos del herbicida y sus diferentes formulaciones sobre los organismos y el medio ambiente. Los resultados no son nada a lentadores: El glifosato, además de no ser selectivo como afirma el documento de la OEA, afecta de forma crítica los suelos, es tóxico para organismos acuáticos y tiene efectos adversos sobre la vida animal (Amorín, 2007). Si esto está ocurriendo en países donde el uso del g lifosato se limita a eliminar plagas en cultiv os de manera manual, con gran seguridad sucede en Colombia, donde el glifosato es aplicado de forma masiva sobre bosques y fuentes de agua sin discriminar si hay presencia o no de poblaciones animales o humanas, y en concentraciones muy superiores (26%) a la

permitida en Estados Unidos (1%) (César Paz y Miño, 2007). A esto se le suma el agravante de que en las fumigaciones se utiliza el Roundup que contiene surfactantes que multiplican por cuatro la potencia de su acción (Diamond & Durk in, 1997) y por ende, de su toxicidad (Abdelghani et al., 1997).

Aunque es bien sabido que los cultiv os ilícitos también tienen un efecto dev astador sobre las condiciones ambientales, el informe generado por la JIFE (Junta Internacional para la Fiscalización de Estupefacientes) demuestra que pese a la disminución del área sembrada de coca en el 2005 con relación a cinco años atrás se registra un aumento en número de hectáreas del 4% con respecto a l año anterior. En general se observa que la cantidad de cocaína producida en Colombia se mantiene estable: Luego de 10 años de lucha, de decenas

de miles de hectáreas fumigadas con glifosato y de centenares de millones de dólares

gastados, la producción colombiana de cocaína casi se ha triplicado. El hecho de que los

cultivadores pudieran trasladar sus operaciones de una zona a otra socavó los resultados de la

campaña de erradicación emprendida por e l Gobierno de Colombia.

Por todo esto es de vita l importancia adelantar investigaciones que se encaminen no sólo a entender los efectos reales que están teniendo las fumigaciones con Roundup sobre nuestra fauna, f lora y población humana, s ino también comenzar a construir propuestas que contribuyan a remediar el efecto adverso de este contaminante. En este trabajo se investigará el potencia l de remediación tanto del g lifosato por sí solo, como del Roundup Spectra (una formulación comercia l) en la planta acuática Egeria densa. La fitorremediación (del griego “phy to”, que s ignifica “planta”) es una técnica relativamente nueva que se ha venido utilizando como una opción efectiva, sencilla y económica para limpiar ambientes contaminados. Esta fitotecnología se basa en la capacidad de algunas especies vegetales para tolerar, absorber, acumular y degradar compuestos contaminantes (Garbisu, 2004).

La mayoría de estudios de biorremediación de compuestos organofosforados se han limitado a microorganismos o microflora asociada a plantas (Gao et al., 2000). Igual es el caso específico del g lifosato (Balthazor & Hallas, 1986; Lipok J. et al., 2007; Pipk e & Amrheint, 1988; Liu C.M.

et al., 1991; Hallas et al., 1992), por lo tanto, la capacidad de las plantas para transformar el glifosato permanece aún desconocida. S in embargo, en el estudio de Gao y colaboradores,

(2000) se demostró el potencial de fitorremediación de compuestos organofosforados (Malathión, demeton-s-metil y rueleno) en las especies de plantas acuáticas Myriophyllum

aquaticum, Spirodela oligorrhiza y Elodea canadensis. Igualmente, en el estudio de Rice, P.J. y colaboradores (1996), se cataloga a la especie Elodea canadensis como una planta resistente a herbicidas y se demostró su capacidad de remediar los herbicidas metoalchlor y atrazina. Por su parte, esta especie es un género hermano de Egeria densa, la especie utilizada en este estudio (Tanaka et al., 1997).


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Objetivos

Objetivo General

Determinar el potencia l de fitorremediación del g lifosfato de la planta acuática Egeria densa.

Objetivos Específicos

• Determinar el efecto de diferentes concentraciones de g lifosato sobre el crecimiento de la planta acuática Egeria densa.

• Determinar el efecto diferencial que se da sobre la planta Egeria densa cuando es sometida a l glifosato y cuando es sometida al Roundup Spectra.

• Evaluar la reducción en la concentración del g lifosato y Roundup Spectra en el agua.

Hipótesis

Hipótesis Nula 1: La planta acuática Egeria densa tiene potencial para remediar el glifosato.

Justificación La fumigación masiva del glifosato constituye uno de los problemas ambientales más importantes de Colombia. Las autoridades del país se niegan a reconocer las evidencias sobre

los impactos adversos de las fumigaciones y se basan en estudios impulsados por Monsanto (empresa fabricante del producto) y por la OEA (Organización de Estados Americanos) que promuev en su uso alegando su carácter inocuo. Sin embargo, el extenso documento realizado por la OEA (S olomon, 2005) ha sido ampliamente criticado por su falta de validez científ ica2 y la compañía Monsanto es famosa por su historial de fraudes científicos (Tokar, 2007). Bigwood redactó en el 2002 en un informe elaborado para el Ministerio del Ambiente del Ecuador que “Ni e l gobierno de Colombia ni el de EEUU han hecho investigaciones sobre los

efectos ambientales de las varias formulaciones que han estado utilizando sobre los diversos

ecosistemas de Colombia. Tal uso masivo de unas formulaciones de herbicidas no investigadas

y la continua sustitución de una formulación por otra no estaría permitido en los EEUU ni en la

mayoría de los países del mundo. Como resultado de esta utilización masiva de una

formulación no estudiada y la falta de Investigación, Ecuador podría estar enfrentando un

peligro de proporciones desconocidas” (CODHES, 2004) Solo hasta ahora se están dilucidando los verdaderos efectos del g lifosato y sus constituyentes sobre el medio ambiente, después de que por 13 años consecutiv os se ha utilizado para fumigar los cultiv os ilícitos y zonas a ledañas en concentraciones muy superiores a las recomendadas, y después de que Ecuador realizara los estudios que demostraban la realidad sobre la toxicidad del herbicida y decidiera demandar al gobierno colombiano. Sin embargo, ni la demanda ecuatoriana ni las miles de denuncias que llegan diariamente a la defensoría del pueblo, con la evidencia de animales muertos, miles de hectáreas de cultiv os lícitos destruidos y un s innúmero de enfermedades que se desarrollan después de las fumigaciones; han s ido suficiente para que el gobierno decida parar una lucha que además no ha logrado reducir la

producción de drogas ilícitas en el país (Rodas León S. et al., 2003; Maldonado A. & Martínez A.L., 2007; Calderón D. R., 2001; CODHES, 2004; Vargas, 2004)

2 Ver todas las críticas en: Sicard, Tomás et al., (2005) Observaciones al “Estudio de los efectos del programa de

Erradicación de Cultivos Ilícitos medi ante la aspersión aérea con el herbicida Glifosato (PECIG) y de los cultivos ilícitos en la salud humana y en el medio ambi ente”, Instituto de Estudios Ambientales (IDEA) de la Universidad Nacional de Colombia.


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El enfoque de este trabajo se basa en la alta probabilidad de que las aguas colombianas se encuentren contaminadas con el herbicida. A pesar de que no hay pruebas tang ibles de que esto esté sucediendo debido a que en Colombia no se han publicado estudios enfocados a detectar la presencia del glifosato en el agua; hay suficientes bases para asumir que esto es un hecho. Especialmente si se tiene en cuenta que la molécula ya se ha detectada en agua subterráneas y superficia les de mucho países donde el uso del g lifosato se limita a la eliminación de plagas en cultivos y nunca a aspersiones aéreas a gran escala. A esto se le puede sumar que las concentraciones utilizadas en Colombia son 26 veces más a ltas de lo que

es recomendado, que el herbicida cuenta con la ay uda de surfactantes que aumentan su potencia y toxicidad, y que los campos son rociados repetida veces (César Paz y Miño, 2007; Maldonado A. & Martínez A.L., 2007; Diamond & Durk in, 1997).

La presencia de pesticidas en el agua es un problema para la salud humana y de ecosistemas acuáticos (Solomon K. R. et al, 1996). La principal preocupación con respecto a la exposición humana involucra la exposición a concentraciones ba jas por un tiempo prolongado, a través de la ingestión de agua (Fawell J. K., 1991). Dicho lo anterior, investigar el potencial de fitorremediación del glifosato en plantas acuáticas es un paso lógico en la búsqueda de alternativas que busquen empezar a amortiguar estos efectos.

Marco Teórico

Propiedades y generalidades del Glifosato

El glifosato (N-(fosfonometil) glicina) es el ingrediente activ o del herbicida Roundup, manufacturado por la Compañía Química Monsanto (St. Louis, MO, USA). Este se usa principalmente en su forma de sa l isopropilamina (Calderón, 2005). Como se mencionó antes, se trata de un herbicida organofosforado, de amplio espectro (no es selectivo), altamente

polar y muy soluble en agua e insoluble en la may oría de los solv entes orgánicos y su principal metabolito es el ácido aminometilfosfónico (AMPA) (Calderón, 2005). El Glifosato fue introducido en los años 70 (Williams, Kroes & Munro, 2000) y desde hace un tiempo es el herbicida más vendido en el mundo (Mallat & Barceló, 1998). S u uso aumenta cada año, como es el caso de F rancia donde de un año a otro (1996-1997) la cantidad de toneladas utilizadas subió un 25% (Crouzet, 1998), s in embargo esta tasa se ha visto sustancialmente incrementada en los últimos años debido a la introducción de plantas transgénicas resistentes al herbicida, las cuales han s ido desarrolladas por Monsanto (Li Bo et

al., 2007). Los fosfonados, donde se incluye el g lifosato, tienen el enlace C-P que resulta ser inusual en la

naturaleza y los diferencia de otros pesticidas organofosforados los cuales no cuentan con este enlace sino con un éster P-O-C (Zeleznick et a l. 1963). Este herbicida tiene la apariencia de un cristal incoloro a temperatura ambiente, con peso molecular de 169, 8 g/mol y alta solubilidad en el agua (12 mg/L a 25°C). Su carácter es ácido y presenta cuatro constantes de acidez, las cuales ya han sido bien determinadas por Wauchope en 1976 (pKa: 0, 78, 2,09, 5,96 y 10,98). S u punto de F usión se da a 200°C y el coeficiente de adsorción estimado es de 24, 000 (Cox, 1995).


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Figura 1. Estructuras químicas del glifosato, AMPA y g lufosinato. F igura obtenida de Ibáñez et

al. (2005) El glifosato es un agente quelante de metales pesados (Subramaniam V. & Hoggard P.E., 1988) y cationes orgánicos (Abate et al., 1999). El proceso quelante ocurre porque el anión glifosato tiene tres grupos químicos (amina, carboxilato y fosfonato) que se pueden unir fuertemente a cationes (Pearson, 1963). Debido a esto, se cree que este herbicida puede afectar potencialmente la biodisponibilidad, toxicidad y bioacumulación de metales pesados al ser aplicado directamente sobre ecosistemas acuáticos (Martin & Tsui, 2005). Particularmente se ha estudiado la formación de complejos entre glifosato y metales tales como calcio, magnesio (Subramaniam, V. & Hoggard P.E., 1988), cobre (Daniele P. G. et al., 1997; S heals, J., et al., 2003), cobalto (Ganson, R.J. & Jensen R.A., 1988; Barja, B.C et al., 2001), hierro, aluminio (Barja, B.C et al., 2001) y cadmio (Ramstedt M. et al., 2005), entre otros.

Además, se ha comprobado su fuerte adsorción sobre suelos y en general sobre gran cantidad de minerales (de Jonge et al., 2001). Esto es de gran importancia ya que la persistencia del herbicida en el medio puede ser incrementada debido a la fácil producción de especies

estables. Dicho comportamiento ha sido reportado para minerales como manganita (γMnOOH) (Ramstedt M. et al., 2005), montmorillonitas (Damonte, M. et al., 2007) y goetita (γF eOOH) (Sheals, J., et al., 2003; Dideriksen, K. & Stipp S.L.S., 2003). El producto mayoritario que se generarse a partir de la degradación del glifosato es el ácido aminometil fosfónico (AMPA) (Rueppel et al., 1977). Se considera que este subproducto es igual o menos tóxico que el glifosato (Carlis le & Trev ors, 1988; Giesy et al., 2000). Sin embargo, el AMPA también se puede formar por la degradación de ácidos fosfónicos en detergentes (Skark et al., 1998). Otro producto que se puede generar es el N-nitroso glifosato (NNG). Este producto es cancerígeno y se puede producir s i el glifosato entra en contacto con nitrato en el ambiente. El formaldehido, otro carcinógeno conocido, es también otro producto de descomposición del glifosato (Cox, 1995; Dinham, 1999; Williams et. al., 2000).

Modo de acción El mecanismo primario del g lifosato es la inhibición de la enzima 5-enolpiruv ilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintasa (EC 2.5.1. 19) que es esencia l en la ruta del ácido chiquímico, responsable de la formación de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) en a lgas,

plantas y microorganismos lo cual es esencial para su superv ivencia (Steinrucken & Amrhein, 1980). Debido a que la ruta del ácido chiquímico está ausente en los mamíferos (Haslam E., 1993; Kishora G.M. & Shan D.M., 1988), se asumió que su efecto no podía perjudicar a animales ni humanos. Por otro lado, Roberts F. et al. (1998) demostraron que el glifosato inhibe el crecimiento de los parásitos patógenos Plasmodium falciparum (malaria), Toxoplasma gondii (toxoplasmosis) y Cryptosporidium parvum. Aunque en la literatura se refleja la asunción de que el modo de acción del glifosato en la naturaleza opera de una forma única y universal; hay razones para creer en la posibilidad de

Glifosato Glufosinato AMPA


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que éste actúe sobre otras enzimas en diferentes organismos y hasta múltiples enzimas en un mismo organismo (Rubin J. L. et al., 1982). Para empezar, se ha demostrado que los detalles de regulación y s íntesis de aminoácidos aromáticos son inmensamente diversos en los organismos (By ng G.S., Jensen R.A., 1982) y también a niv el de plantas (Rubin J.L. et al., 1982). También se ha visto que la rev ersión de la inhibición por glifosato varía de organismo en organismo: en Escherichia coli son requeridos los tres aminoácidos (fenila lanina, tirosina y triptófano) para la rev ersión completa (Roisch U, Lingens U., 1974), en Rhizobium japonicum, se requiere la combinación de fenilalanina y tirosina y en Lemna gibba sólo requiere de fenila lanina (Jaworski E.G., 1972).

En contraste, en Euglena gracilis, los aminoácidos aromáticos solo rev ersan la inhibición parcia lmente (40%) (Byng G.S., Jensen R.A., 1982). En las may oría de plantas analizadas (tabaco, zanahoria, Arabidopsis thaliana) su sensibilidad a l glifosato puede ser reversada por la

combinación de L-tirosina y L-fenilalanina (Gresshoff P.M., 1979; Haderlie, Widholm & S lide, 1977); sin embargo en la zanahoria se demostró que la reversión no era posible después del octav o día de la aplicación sug iriendo que el glifosato puede afectar el crecimiento de manera irreversible si está en contacto con la células por un largo tiempo (Haderlie, Widholm & S lide, 1977). Dicho lo anterior, se justifica mantener un estado más conservativ o en cuanto a las generalizaciones sobre los mecanismos de acción del g lifosato.

Medición del Glifosato

A pesar de que el glifosato es aplicado en grandes cantidades en todo el mundo, es uno de los herbicidas menos monitoreado debido a la dificultad que implica su medición debido a su alta solubilidad en agua, baja solubilidad en compuestos orgánicos, baja volatilidad, carácter iónico, baja masa, falta de grupos químicos que faciliten su detección y gran capacidad para formar complejos muy estables con iones metálicos (Manuel Méndez, Comunicación personal; Landry D. et al., 2005; Pearson, 1963; S ubramaniam, V. & Hoggard P.E., 1988; T. Lanini, en prensa). La dificultad es aun may or cuando debe ser determinado en el suelo debido a la complejidad de extraerlo de esta matriz (Ibáñez et al., 2005; F uentes C., Profesora de Agronomía U. Nacional, Comunicación personal).

Dentro de los métodos más utilizados para llev ar a cabo la determinación de glifosato están la cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas (CG-EM) y la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) acoplada a detectores UV y de fluorescencia. En la primera de está técnicas mencionadas (CG-EM), el análisis directo del glifosato se hace imposible ya que este compuesto es poco volátil a l igual que la may oría de los aminoácidos y por ta l razón se debe efectuar a lguna reacción de ta l forma que se obtenga un compuesto menos polar y más volátil. Para tal efecto, en la mayoría de los casos se realizan reacciones de esterificación que usualmente comprenden dos pasos. Las reacciones más comunes para

realizar esta derivatización son llevadas a cabo en presencia de cloroformiato de isopropilo y diazometano (Kataoka, H., et al., 1996) o de anhídrido trif luoroacético y alcoholes fluorinados como trif luoroetanol o heptafluorobutanol (Roy D. N. & Konar S.K., 1989; Alferness, P.L. & Iwata Y, 1994; Guinivan, R. A. et al., 1982; Dey rup C. L., et al., 1985) Por su parte, la cromatografía liquida a pesar de no tener el problema de la v olatilidad del glifosato, los inconvenientes surgen a nivel de la detección, debido a que el glifosato no cuenta


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con grupos cromóforos para ser monitoreado por espectrometría UV-vis ible ni tampoco grupos fluoróforos que permita cuantificarlo por medio de fluorescencia (Manuel Méndez, Comunicación personal). Por ta l razón se requiere llegar a un derivado que de respuesta a este tipo de detectores, proceso que se denomina derivatización. Dentro de los procedimientos más comunes se encuentra la formación de su 2,4-dinitrofenil derivado para su cuantificación usando un detector UV-v is ible (Lundgren L.N., 1986) o la formación del aducto formado entre el glifosato y el 9-fluorenilmetil cloroformiato (FMOC-Cl) (Glass R.L., 1983; Sancho J.V., et al., 1996; Llasera M.P.G. et al., 2005; Hogendoorn E.A. et al., 1999) u o-ftalaldehido (Abdullah M.P. et al., 1995; Archer T.E. & Stok es J.D., 1984; Patsias J. K et al., 2001; Cowell J. E. et al., 1986)

para ser cuantificado posteriormente mediante fluorescencia. El agente derivatizante más comúnmente utilizado es el 9-fluorenilmetil cloroformiato (FMOC-Cl) (F igura 2).

Figura 2. Reacción de derivatización de g lifosato con FMOC-Cl (Diagrama de Manuel Méndez, estudiante de Maestría)

El uso de detectores sensibles a cambios en la conductividad permite la cuantificación directa de esta sustancia s in necesidad de llev arse a cabo reacciones prev ias a su inyección (Zhu Y. et

al., 1999; Zhen C. H. et al., 2004). Sin embargo, se presentan en ocasiones alteraciones en la línea base lo cual dificulta el anális is de las muestras. De igual forma, el uso de columnas iónicas, cuya durabilidad en general es reducida, hace que el método sea bastante costoso. Se han desarrollado técnicas a lternativas como ensay os de bio-reconocimiento eléctrico (BERA) y ensayos de radioinmunoanálisis enzimático (ELISA). En la primera técnica, se

determinan las interacciones electrofisiológicas entre el herbicida y células vegetales inmovilizadas mediante medidas de potencia l (Kintzios S. et al., 2001). En la segunda, se pueden obtener límites de detección inclusive menores a los obtenidos por HPLC (Clegg et al.,

1999). Sin embargo se hace necesario el uso de enzimas específicas y sueros antigénicos de alto va lor agregado (Rubio F. et al., 2003).

El procedimiento utilizado en la Universidad de los Andes consiste en derivatizar las muestras con FMOC-Cl y luego iny ectarlas en un cromatógrafo Waters 2690 equipado con un detector ultrav ioleta de arreglo de diodos Waters 996. Cabe anotar que este tipo de detector tiene la ventaja de que se pueden obtener los espectros ultravioleta (200 – 400 nm) para todos los compuestos que se separen ya que se adquiere continuamente la totalidad del espectro y el cromatograma final se obtiene extrayendo la información a una sola longitud de onda (Méndez M., comunicación personal), sin embargo el límite de detección no es muy bueno (1mg/L). La fase estacionaria empleada para este caso fue una columna de fase rev ersa C18 marca Allitech de diámetro interno de 4.6 mm y una longitud de 250 mm. La fase móvil utilizada para eluir las sustancias de interés está compuesta por acetonitrilo en un 85% y en un 15% por una solución acuosa 0.1 M de K2HPO4 de pH aproximado de 5.4 unidades.


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Regulaciones

En la producción de g lifosato se pueden generar impurezas a partir de su síntesis. Entre estas impurezas del g lifosato comercial está el N-nitroso glifosato (NNG) el cual es

cancerígeno. Desde el 2000, la máxima concentración aceptada para el N-Nitroso-Glifosato, según la FAO (Organización para la Alimentación y la Agricultura) se estableció en 1 mg/kg (10 veces menor a lo establecido durante los años 80). (Khrolenko, Wieczorek, 2005; Kim M. et al.,

2006). Sin embargo, la metodología para determinar el N-Nitroso-Glifosato propuesta por Monsanto en 1986 (Monsanto Agricultural Products Company, 1986) no fue modificada para alcanzar a cuantificar este nuev o límite de detección sino hasta el 2006 por Kim M. y colaboradores. La metodolog ía aceptada para la determinación del glifosato, propuesta por la compañía Monsanto, ha sido objeto de muchas objeciones debido a que ésta vagamente alcanza los límites de detección exig idos por la FAO. Afortunadamente, en la actualidad se cuenta con procedimientos mucho más eficientes, como el del HPLC mencionado, que cuenta con límites

de detección de 0, 01 mg/L (Khrolenko, Wieczorek, 2005). La MCLG (Meta para los Niveles de Concentración Máximos del Contaminante) del glifosato en el agua potable, fue establecida por la EPA, basándose solo en riesgos a la sa lud y exposición para el agua potable y no en los efectos que podría tener sobre otras formas de vida. Este es de 0, 7 partes por millón (ppm o mg/L) (EPA, 2007). Según la EPA, una exposición continua a aguas con concentraciones de g lifosato superiores a 0,7 mg/L puede tener efectos sobre la reproducción en seres humanos además de respiración acelerada, congestión pulmonar y daño renal (Dinham, 1999). Adicionalmente, la concentración de Roundup recomendada para uso agrícola en agua está entre 1 y 2% (10-20 ppm). El límite máximo de glifosato residual en soya establecido en EE.UU. y Europa, era de 0,1

mg/kg. Con el advenimiento de cultivos transgénicos tolerantes a l glifosato desarrollados por Monsanto en 1996, el límite se elevó a 20 mg/kg (un incremento de 200 veces con respecto al límite anterior) (Comisión Científica Ecuatoriana, 2007). Este aumento, afirma el documento realizado por la Comisión Científica Ecuatoriana, se da en respuesta a las presiones de las

empresas productoras de glifosato con la intención de que se les extiendan permisos y se

apruebe la presencia de mayores concentraciones de glifosato en alimentos derivados de

cultivos transgénicos. En el caso de Monsanto, por e jemplo, ya fue autorizada para un triple

incremento en soya transgénica en Europa y EE. UU. (de 6 ppm a 20 ppm).

El Manual de instrucciones de utilización del Roundup elaborado por la empresa M onsanto advierte que las aplicaciones aéreas deben evitarse si existe peligro de que el químico se ponga en contacto con especies deseables. Cantidades mínimas de este herbicida pueden

causar daños severos o destrucción de cultivos y plantas hacia las cuales no estaba dirigido el

tratamiento. El riesgo de daño por Roundup es mayor cuando la ve locidad del viento excede de

8 k ilómetros por hora. Igualmente debe evitarse la contaminación de semillas y alimentos de

consumo humano o animal (Comisión Científica Ecuatoriana, 2007).

Dosis utilizadas en Colombia La dosis utilizada en las fumigaciones es uno de esos aspectos difíciles de dilucidar en cuanto a su veracidad. En la literatura he encontrado muchas versiones distintas sobre las


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concentraciones que se están utilizando y que se han utilizado desde que empezaron las fumigaciones. Según el ex- ministro de Medio Ambiente de Colombia, Manuel Rodríguez, las concentraciones se han ido cambiando sin ningún tipo de regulación a lo largo de los años. (Vargas, 2004) Una versión es la de Solomon (2005), que como ya se ha mencionado, es un documento bastante controversia l. S egún este informe, la concentración utilizada de glifosato es del 16,53% (equivalente ácido) que es un valor superior al anticipado (14,80%) pero dentro del

margen aceptable de error de la condiciones de mezclado en e l campo. E l mismo informe dice

que los componentes del Roundup son mezclados por la Policía Nacional colombiana en los siguientes porcentajes: 55% de agua, 44% de la formula de glifosato y 1% de Coso-Flux 411F. Se sabe que Monsanto recomienda concentraciones de 2. 5 g/l (2.5 l/ha), mientras que

Estados Unidos recomienda 147 g/ l y según la Policía Nacional, las concentraciones suministradas son de 158 g/l. Esto es casi 60 veces la dosis recomendada. (Carrizosa, 1998) La fórmula internacional más común del Roundup es de 360 g/L en su forma ácida y de 480 g/L cuando es suministrado en su forma sa lina, como es el caso de Colombia (Williams G.M et al., 2000). El 31 de Enero de 2003, el Ministerio de Medio Ambiente de Colombia desarrolló una resolución donde aprobaba una petición de cambio en la formulación utilizada del Roundup. La resolución aprobó el uso de una dosis de 10 L/ha de Roundup 480 g/L (ingrediente activ o) + 1% Cosmoflux, comparado con la dosis anterior de 8 L/ha de Roundup 480 g/L (i.a.) + 1% Cosmoflux, aprobada por el Ministerio el 26 de Noviembre de 2001 (W hitman C., 2003).

Un extenso estudio realizado por Gary L. Diamond & Patrick R. Durkin, (1997) sobre el efecto de los surfactantes en la toxicidad del glifosato, revela que el Roundup contiene el surfactante POEA en una concentración de 15% (150 g/L) y que el g lifosato está presente en una concentración de 35.6% (356 g/L).

Según las indicaciones del Roundup Ultra, la utilización de éste producto no debe exceder los 8 cuartos por acre por año. Esto equivale a 18. 7 litros por hectárea por año. Por lo tanto, si se sabe que en el 2003 se aprobó la dosis de 10 litros por hectárea y que las aspersiones se realizan sobre un mismo campo hasta 3 veces a l año, entonces ciertamente el límite está siendo excedido (Whitman C., 2003). Por otro lado, el doctor César Paz y Miño, director del laboratorio de genética molecular y citogenética humana de la Universidad Central del Ecuador afirma que el g lifosato se aplica en concentraciones del 26%, y no al 1% recomendado en Estados Unidos para aplicaciones terrestres. Además, la mezcla con el surfactante Cosmoflux 411F puede incrementar hasta 4

veces la acción biológica del herbicida, los cual significa que se están utilizando concentraciones 104 v eces may ores que la recomendada (Nivia E., 2001). Según Nivia E., (2001) esta dosis puede intoxicar y hasta matar rumiantes, sobretodo s i las fumigaciones pasan más de una vez sobre la misma área, como han evidenciado denunciadas ante la Defensoría

del Pueblo en Colombia (Nivia E., 2001).

El Roundup y Los Surfactantes


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Como se dijo anteriormente, el glifosato es el ingrediente activo del herbicida Roundup, manufacturado por la Compañía Química Monsanto (S t. Louis, MO, USA). Este herbicida también se encuentra en el mercado con otros nombres comerciales como Roundup Ultra®, Roundup Pro®, Rodeo®, Accord®, Honcho®, Pondmaster®, Protocol®, Rascal®, Expedite®, Ranger®, Bronco®, Campain®, Landmaster®, Fa llow Master®, Kleen up®, Ranger®, Arrasador®, Basura®, Coloso®, Glifoklin®, Glitex®, Ruster®, Thoranto®, Gly phomax® y Gly pro®, entre otros (Maldonado A. & Martínez A.L., 2007; Tu et al., 2001) Todas las formulaciones de pesticidas son una mezcla de ingredientes activ os, subproductos de

la s íntesis del método y una gran variedad de aditivos como solventes y surfactantes (Kim M. et al., 2006). Aunque hay regulaciones para la comercialización de estos productos, los productores no están obligados a div ulgar los ingredientes inertes, ya que éstos son considerados secretos de la formulación.

Se sabe desde hace un tiempo que los adyuvantes o surfactantes (erróneamente conocidos como ‘ inertes’) pueden ser tóxicos y pueden promov er o suplementar los efectos tóxicos del ingrediente activ o del pesticida (S urgan M.H., 2005). En el caso del g lifosato por si solo, por ejemplo, la EPA lo catalogó de ‘lev emente tóxico’ a ‘prácticamente no-tóxico’ y los productos formulados fueron calificados como ‘ moderadamente tóxico’ a ‘prácticamente no-tóxico’. Sin embargo, el coady uvante POEA (identificado como inerte) es clasif icado como ‘altamente tóxico’ a ‘levemente tóxico’. Aún así, Monsanto utiliza los resultados de la EPA para el glifosato solo en sus formulaciones. El término ‘surfactante’ se refiere a químicos que tienen una actividad superficial pronunciada en soluciones acuosas. La actividad superficia l se deriva de la orientación de grupos hidrofílicos

e hidrofóbicos de la molécula del surfactante cuya interacción reduce la tensión superficia l. La hidrofobicidad de los surfactantes se deriva de cadenas de hidrocarbones saturados de varias longitudes y uniones con el grupo hidrofílico. Todos los surfactantes son no-iónicos. (Gary L. Diamond, Patrick R. Durkin, 1997). En Colombia se está aplicando el Roundup Ultra® que contiene glifosato como ingrediente activo, el surfactante POEA y el adyuvante CosmoFlux 411F que promueven la eficiencia del glifosato. Estos surfactantes prov ocan la disminución del tamaño de las gotas del g lifosato, efecto que permite que éste se sostenga más tiempo en el aire y que la deriva aérea sea importante incluso con escaso viento. (Áv ila R. et al., 2007) Una gran cantidad de estudios han encontrado que las formulaciones del Roundup son más

tóxicas para los organismos acuáticos que el g lifosato por s i solo (Folmar et al., 1979; Mann & Bidwell, 1999; Serv izi et al., 1987; Tsui & Chu, 2003; Tsui & Chu, 2004) debido a la presencia de los surfactantes.

COSMOF LUX 411F

Del Cosmoflux 411F no se sabe casi nada debido a que su utilización como surfactante es relativ amente nueva y es un producto que hasta ahora sólo se ha aplicado en Colombia. Se

trata de un ady uvante agrícola que se agrega al g lifosato en el momento de su aspersión. Este contiene surfactantes no iónicos (una mezcla de polietoxilatos lineal y aril –17% peso/volumen) e isoparafinas (83% v/v) (Cosmoagro, 2004).

Los aceites básicos, ta les como las isoparafinas del Cosmo-Flux®, son otra clase de ady uvantes utilizados en las formulaciones de los plaguicidas. Se usan primordialmente para ay udar a la


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absorción foliar del plaguicida al romper la cutícula de cera de la superficie externa del follaje, lo cual aumenta la permeabilidad de la membrana celular (Manthey y Nalewaja, 1992). Los surfactantes como los polietoxilatos en el Cosmo-F lux® aumentan la eficacia del glifosato al incrementar la superficie de adherencia del blanco, promuev en una mejor diseminación de las gotas, una mejor dispersión y el aumento de la penetración de los herbicidas en los tejidos de la planta objetivo por medio de la reducción de la tensión superficial de las plantas (S olomon, 2005).

Es muy importante resaltar que la información suministrada sobre el CosmoFlux no es muy confiable ya que, en su may oría proviene del artículo de Solomon (2005), promovido por la OEA que ha sido sujeto a muchas críticas por un gran número de autores, como se mencionó anteriormente. Esto se puede demostrar al ver la afirmación del párrafo anterior, donde se

hace referencia a la efectiv idad del CosmoFlux en la planta objetivo. Ninguno de los ingredientes del RoundUp es selectiv o, no hay tal cosa como planta objetivo, la formulación actúa sobre todas las plantas de la misma forma, con ciertas pero muy pocas excepciones: Hasta el momento solo se ha reportado la existencia de 11 especies de plantas (todas maleza) tolerantes al glifosato (Perez-Jones et al., 2006). Elsa Nivia, Ingeniera agrónoma y Directora Ejecutiv a de Rapalmira (Colombia) realizó un informe para la Conferencia “Las Guerras en Colombia: Drogas, Armas y Petróleo” de la Universidad de California en el 2001, titulado “Las fumigaciones aéreas sobre cultiv os ilícitos sí son peligrosas – Algunas aproximaciones”. En este informe hay una gran cantidad de información sobre el Cosmo-Flux 411F. Aunque no indica de donde obtuvo la información, esta se resume a continuación.

El Cosmo-F lux 411, coadyuvante estereoespecífico de carácter no-iónico constituido por la

combinación de aceite parafinado más un tensoactivo adyuvante estereoespecífico, mejora la

adherencia y uniformidad de las preparaciones de agroquímicos, controlando la evaporación e

hidrólisis del activo con cubrimiento total, garantizando concentración homogénea del activo

por unidad de área y extendiendo el espectro de actividad biológica de los agroquímicos. Se afirma además que se trata de un líquido amarillento a 25ºC; gravedad específica de 0, 89; viscosidad 60 mPa a 25ºC; pH en solución a l 1% en agua destilada entre 6,3 y 6,8 y concentración de aceite 80 – 85 (% w/w) (Niv ia E., 2006) De acuerdo con el Concepto Toxicológico LP-0593-93 del Ministerio de Salud de Colombia es un producto de Categoría Toxicológica IV ( ligeramente tóxico). La biodegradabilidad se

considera may or del 98% según el método de la OECD para tensoactivos no-iónicos (Niv ia E., 2006).

El POEA

El POEA es una mezcla de cadenas largas de a lkilaminas polietoxiladas s intetizadas de ácidos grasos de origen animal (Williams et al., 2000). El POEA promuev e la eficiencia herbicida (Franz, 1985). Su fórmula química es R - (OCH2CH2)n – NH, donde ‘n’ representa el número de

grupos oxietilenos. S egún Diamond & Durk in (1997), este surfactante es aproximadamente tres veces más tóxico que el glifosato. Según Perkins et al. (2000) y Tsui & Chu (2003), la relativ amente alta toxicidad del Roundup en el agua, se debe principalmente a la presencia de este surfactante. Igualmente, el POEA es más tóxico en agua a lcalina, sugiriendo que su efecto

sobre el ecosistema acuático es dependiente del pH (Diamond & Durk in, 1997).


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Algunos s íntomas asociados a la toxicidad del POEA incluyen dolor gastrointestinal, vómito, neumonía, reducción de la presión sanguínea y destrucción de las células rojas sanguíneas. La muerte se da por la ingestión del producto s in diluir (S awada et al., 1988). Otros estudios rev elan que el POEA se ha encontrado contaminado con 1-4 dioxano (Ubier, 2007). Según Riechers et al., (1994), otra función de los surfactantes en el caso del g lifosato, es el de aumentar el flujo del herbicida a través de la membrana plasmática pues atrav esar esta membrana constituye una barrera fuerte para el caso específico de este herbicida. Haderlie et

al., (1977) encontraron que menos del 1% del glifosato presente en el medio extracelular

entraba a las células de la zanahoria después de un periodo de absorción de 96 horas. Estos resultados han sido apoyados por otras investigaciones (Richard & S life, 1979; Jachetta et al., 1986)

Fusarium oxysporum

Según denuncias de agricultores, en las aspersiones se observan dos tipos de líquidos, uno de coloración blanca y otro café. Según Bigwood et al. (2007), hay fuertes razones para sospechar que estos cambios de coloración pueden deberse a la inclusión del hongo Fusarium oxysporum

en las aspersiones. Esta sospecha tiene su base en la ev idencia de que científicos norteamericanos han estado investigando, en bosque amazónicos ecuatorianos, la efectividad de este hongo en la fumigación de cultivos (Bigwood et al., 2007), y en las denuncias de Álv aro Salas, representante del gobernador del Departamento del Putumayo, quien afirma que este hongo fue rociado por primera vez en el 99 (Rodas León S. et al., 2003). Adicionalmente Estados Unidos propuso el uso de este agente como micoherbicida en la lucha contra los cultivos de coca que fue autorizada en el año 2000 como parte del Plan Colombia. A pesar de que la propuesta fue rechazada por el Comité Andino de Autoridades Ambientales (CAAAM), y por el mismo gobierno en vista de que uso podía ser percibido en el mundo como un tipo de Guerra Biológ ica (Bigwood et al., 2007), el gobierno del presidente Bush s igue insistiendo en su uso (Sicard et al., 2005) y en el 2006 Estados Unidos ordenó el desarrollo de pruebas en campos de ensay o con Fusarium oxysporum o Pleospora papaveracea en territorio colombiano. (Bigwood et al., 2007)

Las consecuencias de este hecho son impensables: Fusarium oxysporum es un hongo mutagénico y no selectiv o presente en suelos, cuyo crecimiento es naturalmente controlado por otros microorganismos. Este produce unas toxinas persistentes como la v omitoxina y compuestos más letales (i.e. la fumonisina), que puede causar cáncer y defectos de nacimiento; la fusariotoxina (toxina T 2”59) conocida como el mortífero agente de guerra

química ha sido la responsable de miles de muertes en el mundo (Marassas P.E. et al., 1984). Una epidemia de este hongo ocurrió durante los últimos años de la S egunda Guerra Mundial en la Unión S oviética, donde cientos de miles de personas murieron después de ingerir cereales infectados con el hongo (Marassas P.E. et al., 1984). En 1931 en Texas (USA), 31 niños nacieron con anencefalia (sin cerebro); sus madres habían consumido comida contaminada con el hongo durante el embarazo (Beil L., 2001; Gelineau-van W., 2005). Adicionalmente, las

micotoxinas conocidas ‘T2’ de Fusarium spp. han sido utilizadas como armas biológ icas. Su sólo contacto, sea en la parte del cuerpo que sea, causa necrosis en mamíferos (US Department of Defense, 1990; Federation of American Scientists Biologica l Weapons List3).

3 Federation of American Scientists Biological Weapons List:

http://www.f as.org/nuke/intro/bw/agent.htm#b16.


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Los soviéticos fueron acusados de utilizar este agente bajo el nombre de "Lluv ia amarilla", y se presume que causó 6300 muertes en Laos, Camboya y Afganistán entre 1975 y 1981 (Bigwood, 2006; World Health Oganization, 1999) A pesar de toda la potencia de este micoherbicida, expertos en el tema dicen que la utilización de este hongo no sería efectiva en la erradicación de cultiv os de coca debido a que éste raramente mata a todas las plantas con las que entra en contacto y las que sobreviven la infección ganan rápidamente inmunidad. Además se cree que plantas de coca resistentes al primer brote de Fusarium spp. han s ido ampliamente cultivadas en Colombia (Bigwood et al.,

2007).

Toxicidad del Roundup y sus constituyentes Uno de los principales problemas que se enfrentan al investigar el efecto toxicológico del Roundup, es que la mayoría de estudios se basan en el glifosato solo en v ez de la formulación completa en la cual el glifosato solo está presente en un 40%. Según las importantes agencias de regulación, la Organización Mundial de Salud (WHO, 1994) y la Agencia de Protección Ambiental (EPA, 1993), el g lifosato tiene una toxicidad aguda oral baja en mamíferos (DL50> 5000mg/kg) y no es mutagénico, cancerígeno, teratogénico ni tóxico en la reproducción o desarrollo. Estos resultados han s ido soportados por otros estudios (Smith & Oehme, 1992; W illiams, Kroes & Munro, 2000). El estudio de Williams, Kroes & Munro (2000) afirma que:

• La absorción oral de g lifosato y AMPA es baja y ambos materia les son eliminados

esencia lmente sin ser metabolizados.

• La penetración dérmica del Roundup muestra una absorción muy baja.

• Ni el glifosato ni el AMPA se bioacumulan en ningún tejido animal. • No se observ ó una toxicidad s ignificativa en estudios agudos, sub-crónicos o crónicos. • La exposición ocular directa a la formulación concentrada de Roundup puede resultar

en una leve irritación.

• No hay ev idencia conv incente de daño al ADN in vitro o in vivo. • El Roundup y sus componentes no presentan un riesgo sobre la producción de

mutaciones somáticas o hereditarias en los humanos. • Ningún estudio de ingestión ha logrado mostrar efectos tumorigénicos del g lifosato,

por lo cual se concluye que no es cancerígeno.

• El glifosato, AMPA y el POEA no son teratogénicos ni tóxicos en el desarrollo. • No hubo efecto en fertilidad o parámetros reproductiv os en estudios multi-

gerenacionales. • No hubo efectos adversos en los tejidos reproductivos de animales tratados con

glifosato, AMPA y POEA.

• No se vieron efectos en la modulación endocrina. • Se concluy e que el uso del Roundup no resulta en efectos adversos sobre el desarrollo,

reproducción en s istemas endocrinos de humanos u otros mamíferos. El informe termina agradeciendo muy comedidamente a Monsanto por permitirles utilizar su información y sus estudios científ icos…


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A continuación se mostrará como todas y cada una de las conclusiones citadas son desacreditadas por otros estudios:

Efectos sobre los organismos

Estudios I nternacionales

Inicialmente se creyó que, debido a que el modo de acción del glifosato era específico para una enzima ausente en mamíferos, éste no podría presentar un riesgo para humanos. Sin embargo, desde hace poco se han reportado efectos genotóxicos, hormonales y enzimáticos en mamíferos (Bolognesi et al. 1997; Daruich et al. 2001; El Demerdash et al. 2001; Hietanen et al. 1983; Lioi et al. 1998a, 1998b; Olorunsogo et al. 1979; Peluso et al. 1998; Walsh et al. 2000; Yousef et al. 1995; Cikalo M.G. et al., 1996; Lu F.C., 1995; Materia l Safety Data S heet, 1995). Algunos estudios han mostrado que este herbicida tiene el potencia l para generar efectos adversos en la reproducción de los animales. Tal es la conclusión que obtuvieron inv estigadores de la Univers ité de Caen F rancesa al intentar encontrar una explicación a un estudio realizado en Ontario, Canadá, donde se encontró que la exposición de campesinos de género masculino al Roundup, estuv o asociada con un aumento en casos de aborto y

nacimientos prematuros (Bonn, 2005 - En Prensa). El estudio investigó los efectos del Roundup y del glifosato en células placentarias humanas en concentraciones hasta del 2%. La concentración del 2% mató al 90% de las células cultiv adas después de 18 horas de incubación. La dosis media leta l del Roundup (0.7%) resultó ser casi la mitad de la del g lifosato solo, lo cual

implica que el Roundup es al menos dos veces más tóxico (Richard S. et al., 2005; Bonn, 2005 - En Prensa). Para v er si el Roundup interfiere en la reproducción, también se probó s i este podía bloquear la activ idad de la enzima aromatasa (la que regula la s íntesis de estrógenos) en las células placentarias. Después de una hora de incubación con Roundup, la síntesis de estrógenos aumentó en un 40%; a las 18 horas la s íntesis se inhibió (Richard S. et al., 2005). En conclusión el estudio mostró que los efectos del Roundup aumentaban con el tiempo y se obtenían con concentraciones diez veces menores a las recomendadas para uso agrícola. También se concluyó que el Roundup inhibe la actividad de la enzima aromatasa a una concentración 100 veces menor que la recomendada para uso agrícola (Richard S. et al., 2005). Los investigadores sospechan que los surfactantes utilizados en el Roundup promueven la biodisponibilidad y/o

bioacumulación del glifosato (Richard S. et al., 2005; Bonn, 2005 – En Prensa). La exposición a l Roundup afecta la expresión de la proteína ‘StAR’ (Walsh L.P. et al., 2000) que regula la s íntesis inicia l de las hormonas esteroides. Entre las hormonas esteroides está el colesterol y los andrógenos como la testosterona. Específicamente se vio que el Roundup reducía los niv eles de la proteína StAR en un 90% que implica que en el ciclo completo inhibe la esteroidogénesis en un 97%. A partir de esto, Walsh y colaboradores invitan a l uso de la proteína S tAR como un buen biomarcador para evaluar el funcionamiento del sistema endocrino en especies sa lvajes y así determinar la presencia del Roundup. Los autores también aseguran que las consecuencias de la inhibición de la proteína no sólo tiene efectos a nivel de fertilidad, también afecta el metabolismo de carbohidratos, las funciones del sistema inmune y el balance de agua. Otro dato importante del estudio es que también evaluaron el efecto del

glifosato por s i solo y concluy eron que éste no alteraba la producción de esteroides (Walsh L.P. et al., 2000).


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Otro efecto de la reducción de actividad de la enzima aromatasa (Richard et al., 2005) es que ésta participa en la aromatización de andrógenos para producir estrógenos los cuales coordinan, entre otros, los dúctulos eferentes que regulan las funciones reproductivas de animales de sexo masculino (Oliveira C.A. et al., 2001; Oliveira C.A. et al., 2002; Hess R.A. et al.,

1997; Hess R.A. et al., 2000). Basados en esto, O liv eira et al., (2007) evaluaron el efecto in vivo del Roundup (formulación: 360 g/l de glifosato, 480 g/l de sal isopropilamina y 684 g/l de ingredientes inertes) sobre la reg ión epididimal y sobre los testículos del pato Anas platyrhynchos. La exposición al herbicida

resultó en alteraciones en la estructura de la región epididimal y testículos al igual que alteraciones en los niv eles de suero, testosterona y estradiol, con cambios en la expresión de receptores andrógenos restringidos a los testículos. Los efectos sug ieren que el Roundup puede causar desórdenes en la morfofisiolog ía del s istema genital masculino de los animales

(Oliveira A.G. et al., 2007) Acquavella et al., (2004) encontraron niv eles bajos pero muy frecuentes (60%) de glifosato en la orina de trabajadores de granjas poco después de una aplicación de g lifosato. Adicionalmente, el 4% de las esposas y el 12% de los niños de estos granjeros presentaron concentraciones detectables de glifosato. Thibaut & Porte, 2004 y Richard et al., 2005 clasificaron a l Roundup como un disruptor del s istema endocrino. Relyea R.A., (2005) evaluó el efecto del Roundup sobre seis especies de renacuajos de Norte América (Rana sylvatica, R. pipiens, R. clamitans, R. catesbeiana, Bufo americanus, e Hyla

versicolor) durante 16 días. En el estudio se sugiere que la drástica disminución en las poblaciones de anfibios puede estar relacionada con el uso de pesticidas (Dav idson et a l. 2002;

Bishop et al. 1999; LeNoir et al. 1999; Sparling et al. 2001). La LC50 (concentración media leta l) estimada varió entre 0. 55 y 2.52 mg/L del ingrediente activo (i.a.) lo cual implica que el Roundup está entre moderadamente tóxico (1-10 mg (i.a.) /L) y altamente tóxico (0.1-1 mg (i.a.) /L) para estos anfibios (Relyea R.A., 2005). Los resultados de estudios genotóxicos son confusos, en un gran número de ensay os no se detectó activ idad genotóxica del g lifosato (Garry et al. 2000; Grisolia, 2002; Li & Long, 1988; Wildeman & Nazar, 1982). Otros estudios encontraron que el tratamiento in vitro de linfocitos humanos mostró un incremento en la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas (Bolognesi et al. 1997) y se encontró que el Roundup incrementa la frecuencia de mutaciones letales recesivas ligadas al sexo en Drosophilla sp. (mosca de la fruta). También se demostraron aberraciones cromosómicas (Lioi et al. 1998b), e indicadores de estrés oxidativ o (Lioi et al.

1998b). Algunos estudios encontraron una may or toxicidad del Roundup comparado con el glifosato en términos de toxicidad aguda (Folmar et al. 1979; Martinez et al. 1990; Mitchell et

al. 1987) y genotoxicidad (Bolognesi et al. 1997; V igfusson & Vyse 1980).

El potencial cancerígeno del glifosato radica en que éste al entrar en contacto con nitrato en el ambiente (presente en la sa liva humana y en fertilizantes) puede formar el contaminante cancerígeno N-nitroso g lifosato (NNG). El formaldehido, otro carcinógeno conocido, es también otro producto de descomposición del glifosato (glifosato � AMPA � Metilamina � Formaldehido) (Cox, 1995; Dinham, 1999; Williams et. al., 2000). Igualmente, se asoció el Roundup con un aumento en el número de aductos en el ADN de ratones (Peluso et al. 1998; Cox, 1995) y un efecto mutagénico débil en la bacteria Salmonella spp. (Kale et al. 1995; Moriya et al. 1983; Rank et al. 1993), mientras que el glifosato por sí solo no mostró estos efectos.


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De Roos y colaboradores (2005) estudiaron la asociación entre la presencia de cáncer y la exposición a l Roundup en un gran número de granjeros. Aunque no encontraron una asociación s ignificativa con los tipos de cáncer evaluados, s í se sug irió una asociación consistente entre la exposición al g lifosato y mieloma múltiple (aunque se basó en un número pequeño de casos). El documento fue inmediatamente criticado por científicos de Monsanto (Farmer et al., 2005) a legando que el documento presentaba un análisis genotóxico incompleto cuyas conclusiones eran inconsistentes con las conclusiones obtenidas por agencias

regulatorias como la EPA y WHO. Sin embargo, De Roos y colaboradores contestaron

rápidamente que si bien agencias de regulación como la EPA y WHO concluyeron que el glifosato no es mutagénico, ésta conclusión se basó en el ingrediente activo y no en las formulaciones comerciales del glifosato. Así mismo citaron una gran cantidad de estudios que demuestran que el Roundup tiene efectos potencialmente más tóxicos que el g lifosato (De

Roos et al., 2005). Garry et al., (2002) demostraron prev iamente (1989-1991) que la frecuencia de defectos de nacimiento entre niños residentes de una prov incia de Minnesota (US A), era significativ amente may or que en otras regiones agrícolas del estado, siendo además los niños hijos de aplicadores de pesticidas los más afectados. El estudio publicado en el 2002 se llev ó a cabo durante 1997 y 1998 y se estudiaron 695 familias y 1,532 niños. En este trabajo examinaron los resultados de salud reproductiva de padres cuyos defectos de nacimiento se habían reportado en el estudio prev io. Se encontró que en el primer año de vida, la tasa de defectos de nacimiento fue de 31.3 nacimientos de 1000. También se encontró que el uso del herbicida Roundup estaba sobre-representado en el g rupo con defectos de nacimiento. Ningún otro pesticida estuvo asociado con defectos de nacimiento o efectos en el desarrollo

(Garry et al., 2002). En lo que respecta a a limentos existen investigaciones que demuestran que el glifosato puede ser tomado por las plantas y mov ido a las partes que se usan como alimento (Positive List System in Japan Maximum Residue Limits of Agricultural Chemicals in F oods, 2006). Por ejemplo, se ha encontrado glifosato en fresas, moras azules, frambuesas, lechugas, zanahoria y cebada. Además se encontraron residuos de g lifosato en lechuga, zanahoria y cebada las cuales habían sido sembradas un año después de la aplicación de glifosato (Kaczewer, 2002).

Situación en Ecuador y Colombia

En Colombia y Ecuador, las consecuencias de las fumigaciones trascienden por mucho los acercamientos científicos sobre los efectos del glifosato. Se podría decir que lo efectos que se han descrito son casi insignificantes frente a los efectos que se observan sobre la población y el medio ambiente en estos países. Y era de esperarse, pues como se ha dicho, el problema no radica sólo en que el Roundup es mucho más tóxico que el glifosato solo; también está la contribución del CosmoF lux, la posible inclusión de F usarium oxysporum, las altas concentraciones suministradas, las aspersiones sobre fuentes de agua, bosques naturales, población humana y cultiv os lícitos y la fumigación repetitiva sobre un mismo sitio.

Por otro lado, pruebas de laboratorio hechas sobre 22 personas muestran que la población expuesta a las fumigaciones tiene un 30% mayor riesgo de cáncer, un 20% mayor riesgo de aborto y 10% may or riesgo de hijos con malformaciones (César Paz y Miño, 2007). Casos de alteraciones genéticas también han s ido informados en estudios de universidades colombianas

(Groot, 2005; Lacera-Rua, 2000; Monroy, 2005).


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Los estudios ecuatorianos han permitido determinar que a cinco kilómetros de los lugares colombianos que son asperjados, entre el 80 y el 100% de los campesinos que se encuentran en territorio ecuatoriano sufren signos de intoxicación aguda por organofosforados. Los signos y síntomas disminuyen conforme se supera la distancia de cinco k ilómetros de las zonas fumigadas, lo cual demuestra que esas señales no son la consecuencia de enfermedades naturales (S. Rodas León, 2003) El AMICUS CURIAE (Amigos de la Corte), un documento desarrollado por organizaciones ecuatorianas de ecolog ía, derechos humanos y cultura de paz que se presentó ante el Consejo

de Estado de Colombia, puso en evidencia diferentes denuncias reportadas a la defensoría del pueblo donde se hace referencia a los daños de cultiv os lícitos. S ólo en el 2001, en una zona fronteriza con Ecuador (Lago Agrio), 188 campesinos reportan la pérdida de 2560 hectáreas de cultiv os de productos comestibles (Yuca, cacao, maíz, arroz y café entre otros) y 11828

animales muertos incluidos peces, ga llinas, vacas y caballos, entre otros. (CODHES, 2004) En el “Informe de Seguimiento a la S ituación de la F rontera” realizado a lo largo del 2003 (Rodas León S. et al., 2003) se muestran las declaraciones de campesinos que relatan los diferentes efectos que han tenido las fumigaciones sobre sus animales y personas cercanas: “Durante las fumigaciones un gran número de gallinas y pavos sufrieron una especie de peste,

con “sensación de ahogo”, “granos con mal olor”, quedando ciegas y muriendo finalmente (los estadísticos muestran que el 80% de aves domésticas murieron durante las fumigaciones). Las vacas, caballos, perros “comenzaron a orinar sangre y murieron”. El informe también pone en manifiesto el hambre generada por la destrucción de cultiv os y de las economías de subsistencia; los impactos ambientales por la presencia masiva del hongo F usarium

oxysporium, (aunque no se sabe de donde obtienen esta afirmación) y la destrucción de las

fuentes de agua y los daños a la cultura de la población indígena por la destrucción de su hábitat y de sus prácticas culturales. El AMICUS CURIAE declara que en Colombia 2 de cada 5 desplazados cuyas declaraciones son

rechazadas y no ingresan al s istema de registro único del gobierno, son rechazadas porque

mencionan fumigaciones como causal redesplazamiento, ya que el gobierno insiste hasta hoy, bajo el argumento del estudio mencionado de la OEA, que el glifosato no tiene efectos sobre la salud (CODHES, 2004) Además, según CODHES (Consultoría para los Derechos Humanos y el Desplazamiento), cultiv os de desarrollo alternativ o han s ido fumigados hasta 4 y 5 v eces: En Putumayo, se

fumigaron 700 hectáreas de pactos PI LDAET (de erradicación temprana) de los cuales se

beneficiaban 750 familias. También se exponen otros tres casos de fumigación de cultivos de desarrollo alternativo, incluida la fumigación de zonas protegidas, reservas naturales y de resguardo indígena (CODHES, 2004).

Según el Departamento Administrativ o de Salud del Putumay o, habitantes del departamento han manifestado un incremento preocupante de reacciones alérgicas de piel como: dermatitis,

impétigo, abscesos, dolor abdominal, diarreas, infección respiratoria aguda, presentados a

partir de la realización de fumigaciones en la zona (…) de las 100 veredas que existen en el

Valle del Guamuéz, municipio con e l mayor número de habitantes en el departamento, después

de Puerto Asís y Orito, con 35.288 habitantes; res identes de 67 de ellas, se consideraron

afectados por la fumigación en su estado de salud, cultivos y medio ambiente (Calderón D.R., 2001).


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Resultados s imilares se observan en el informe “I mpacto de las F umigaciones Aéreas en las Bananeras de Las Ramas-Salitre-Guayas”, donde se pone en evidencia la alta incidencia de enfermedades en las poblaciones fumigadas, con casos de cáncer en una gran proporción y un número de muertes bastante alto. Adicionalmente los efectos a la salud se agravan con la frecuencia de las aspersiones que, según los habitantes es de 26 semanas al año (Maldonado A. & Martínez A.L., 2007) Maldonado A. & Martínez A.L., (2007) también evidenciaron que de las mujeres a las que les realizaron pruebas que fueron expuestas a fumigaciones, todas sin excepción tenían s íntomas

de intoxicación y daños genéticos en el 33.3% de las células sanguíneas; este daño genético es de un 800% por encima del grupo control. En otro caso se recolectaron muestras aleatorias de sangre de personas afectadas por las fumigaciones y se encontró que el número de aberraciones cromodsómicas era 17 veces más a lto que en la población control (Comisión

Científica Ecuatoriana, 2007) Según el Dr. Marco Álvarez del Ministerio de Salud Pública de Ecuador, el solo exponerse al glifosato (s in surfactantes) causa irritación de las mucosas, alteración de la sangre, disminuye

el contenido de oxígeno en sangre y produce cambios neurológicos que impiden la contracción

de los músculos. El doctor también asegura que el glifosato tiene la capacidad de aumentar la

concentración de CO2 en el suelo, lo que a su vez, origina el aumento descontrolado de las

bacterias nitrificantes que transforman los nitritos a nitratos. Esos nitratos generan

nitrosaminas, sustancias cancerígenas que tienen la primera probabilidad de producir cáncer

gástrico (CODHES, 2004). Adicionalmente el doctor afirma que las enfermedades observadas no se relacionan con enfermedades tropica les o comunes y que los s íntomas van disminuy endo conforme aumenta la distancia de los sitios donde se llevan a cabo las

fumigaciones: Los síntomas más frecuentes son los mismos de la intoxicación aguda, f iebre, cefaleas, irritación de conjuntivas, diarreas, vómitos, etc. con una may or presencia de enfermedades de la piel. (Rodas León S. et al., 2003)

Efectos sobre las relaciones ecológicas Varios estudios han demostrado a lteraciones en el equilibrio ecológico de diferentes tipos de comunidades sujetas a l herbicida. Así mismo, se ha analizado el efecto cascada que generarían o que están generando estos cambios, como por ejemplo, la relación entre herbívoros y plantas, estando estas últimas expuestas al contaminante. Se ha demostrado que el glifosato tiene un efecto deletéreo sobre las poblaciones de bacteria nitrificantes (Bezbaruah et al, 1995). Las bacterias nitrificantes y simbiontes de las plantas leguminosas (Fabaceae), Bradyrhizobium japonicum, poseen una enzima sensible al glifosato que al entrar en contacto con el herbicida acumula ácido chiquímico y ácidos hidroxibenzoicos, que producen la inhibición de su crecimiento (Zablotowicz & Reddy, 2004; Hutchinson, 1995; Forlani et al., 1995).

Div ersos estudios también han demostrado que el glifosato tiene efectos devastadores sobre las poblaciones de micorrizas (Junior & Zambolin, 1994; Dodd & Jeffries, 1989; Santos et al.,

2005). Adicionalmente, el glifosato tiene efectos negativ os en nemátodos y otras lombrices e inv ertebrados (Dejar et al., 2000).


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Según muchas inv estigaciones, el g lifosato aumenta el crecimiento de hongos patógenos, que al liberar sus toxinas resultan perjudiciales para muchas de las otras formas de vida, incluy endo mamíferos. Uno de los géneros que tiende a aumentarse en presencia de glifosato es el género Fusarium sp., un hongo cuy a presencia en los alimentos puede tener efectos nociv os para la salud humana, llegando a ser mortal en concentraciones elevadas (Kremer & Donald, 2003; Sanogo, Yang, Scherm, 2000; Wan, 1989; Delcalzo et al., 1996; Johal & Rahe, 1984; Levesque et al., 1992; Levesque et al., 1993; Rahe et al., 1990; W an et al., 1998).

Destino en el suelo Muchos autores parecen estar de acuerdo en lo que respecta a l importante papel que ejercen los óxidos de hierro y aluminio, así como el pH del suelo en los procesos de adsorción de

glifosato en el sustrato (de Jonge & de Jonge, 1999; de Jonge et al. 2001; Gimsing et al. 2004, Calderón et al. 2005). Se sabe que el glifosato se adsorbe fuertemente a los componentes del suelo, como la materia orgánica (Roy et al., 1989), los minerales de la arcilla (Bowmer et al., 1986), hidróxidos de hierro, aluminio y óxidos férricos (Morillo et al., 2000; Gimsing et al., 2004; Piccolo et al., 1994; Day et al., 1997). Según Wauchope et al. (1992), el glifosato es moderadamente persistente en el suelo con valores de vida media que varían de 1 a 174 días. Torstensson, (1985) y Mallat & Barceló, (1998) afirman que la degradación del glifosato en el suelo se da principalmente a partir de la actividad de microorganismos, y, en un menor papel a través de la descomposición química y la fotólisis.

Según la EPA (Agencia de Protección Ambiental) y otras fuentes (i.e. Sprankle et al., 1975), la fuerte adsorción del g lifosato en el suelo hace que el potencial del mismo para que sea lixiviado y llegue a l agua subterránea es mínimo. Así mismo, la EPA (1993) afirma que los microorganismos en el suelo lo degradan rápida y completamente aun en condiciones de temperaturas bajas y que al ser liberado en el agua se adhiere rápido a los sedimentos, así, no tiende a acumularse en la vida acuática. S egún la etiqueta del Roundup, el glifosato es inactiv ado inmediatamente mediante una reacción química que ocurre con las arcillas sin dejar residuos. Sin embargo, varios estudios afirman que el g lifosato puede perder su adsorsión y movilizarse. En un tipo de suelo, el 80% del g lifosato adicionado des-adsorbió en un período de dos horas. (Cox, 1995) Muchos estudios han sugerido que la movilidad del glifosato depende del tipo de suelo, siendo más estático en suelos arenosos (Dousset et al., 2004) donde los componentes de la matriz tenderán a retenerlos en las capas más superficia les (Sørensen et al., 2006). Esta poca mov ilidad en el suelo, donde el g lifosato se fija en los primeros centímetros del perfil, hace que la toma por parte de las ra íces de las plantas sea complicada, haciendo difícil la

fitorremediación. Sin embargo, desde la perspectiva ambiental es mejor, pues implica que s i se quiere remover el glifosato de un suelo arenoso, bastaría con remov er las primeras capas del mismo. Por otro lado, los suelos arcillosos proporcionan un rápido transporte de flujo vertical (Mortensen et al., 2004) haciendo que el g lifosato sea más móvil, y por lo tanto sea más posible encontrarlo a profundidades mayores en el perfil del suelo (Sørensen et al., 2006). Esto sug iere mayor riesgo de lixiviación del glifosato, con una may or probabilidad de que el mismo llegue a las aguas subterráneas.


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Adicionalmente, el glifosato puede unirse a substancias hidrosolubles del humus. Las sustancias húmicas son las principales responsables de la movilidad de los pesticidas en el suelo. El g lifosato transportado por las substancias húmicas, puede también entrar en los niv eles más profundos del suelo (Piccolo & Celano, 1994). De acuerdo con diversos estudios, altos niveles de fósforo favorecen la precipitación del hierro y aluminio en el suelo, disminuy endo la adsorción de glifosato, lo que aumenta la absorción por las plantas, con el consecuente riesgo de daño (S ouza, 1982).

Otra afirmación que se hace en relación al glifosato es que este herbicida se inactiva y degrada rápidamente en el suelo. La EPA (Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos) ha reportado que la vida media del glifosato en el suelo puede ser de hasta 60 días (EPA, 1999). Sin embargo, otras inv estigaciones han obtenido resultados menos satisfactorios. Por ejemplo,

según Cox (1995) la persistencia del glifosato es de 249 días en suelos agrícolas de F inlandia, entre 259 y 296 días en 8 sitios foresta les en Finlandia, entre 1 y 3 años en 11 sitios forestales en Suecia, 335 días en un s itio forestal en Canadá y 360 días en 3 sitios forestales de Canadá. En Colombia, el profesor Jairo Leonardo Cuerv o de la Univ ersidad Nacional (2007), determinó que los valores de la vida media del herbicida en el suelo son de 94, 526 y 11365 días para los suelos de bosque, pasto y arroz, respectivamente. S egún el estudio, estos valores tan altos pueden explicarse en parte por la a lta adsorción del herbicida en el suelo. La degradación del glofosato adsorbido es mucho más lenta que la del glifosato libre (Rueppel et al., 1977; Zaranyika & Nyandoro, 1993; Newton et al., 1994); entonces el proceso de adsorsión hace que el herbicida sea más persistente en el suelo (Veiga F. et al., 2001).

Entonces, como se puede ver, ninguno de los dos panoramas es fav orable; por un lado, si el glifosato es fuertemente adsorbido hay menos probabilidad de que a lcance el niv el freático y contamine las fuentes de agua subterránea, pero por el otro lado, esta fuerte adsorsión implica que v a a permanecer en el suelo un mayor tiempo y la resiliencia del sistema va a ser más complicada. El estudio de Salazar & Appleby, (1982) reporta que el g lifosato adsorbido en el suelo puede presentar activ idad residual en algunas especies de plantas. Como se dijo anteriormente, la habilidad del glifosato para formar complejos con la may oría de los metales de transición es de gran importancia ya que la persistencia del herbicida en el medio puede ser incrementada debido a la fácil producción de especies estables. En el caso del

cobre, Cu[II], se v io que la adsorción del mismo decrece con el aumento en la concentración del g lifosato y por otro lado, la presencia del cobre en el tratamiento, promovía la adsorsión del g lifosato en el suelo (Morillo et al., 2000). Maqueda y colaboradores (2002) estudiaron la co-adsorsión del g lifosato y Cu(II) en goetita y encontraron que la adsorsión del Cu(II) sobre la

goetita en presencia del glifosato aumenta y en el g lifosato también se aumentaba la adsorsión sobre la goetita en presencia del Cu(II). En el caso del Cadmio (Cd), éste experimenta una menor adsorsión en el suelo en presencia del glifosato debido a cambios en el pH y la formación de complejos entre las dos sustancias. Este aumento en la movilidad del Cd puede ser una amenza potencia l para el agua subterránea (Zhou et al., 2004). También se vio que la adsorsión del glifosato a l suelo alcalino es muy baja, lo cual aumenta el riesgo de que llegue a aguas subterráneas (Zhou et al., 2004).


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Hay otros factores que pueden afectar la adsorsión del g lifosato al suelo, pero los estudios realizados al respecto son contradictorios. Según Torstensson, (1985) y Carlis le S.M. & Trev ors J.T, (1988), la adsorción del glifosato en el suelo está fuertemente influenciada por los cationes asociados a las partículas del suelo y es relativamente independiente del pH. Por otro lado, Gerritse et al. (1996) encuentran que la materia orgánica del suelo tiene un bajo efecto sobre la adsorción del glifosato, y esta adsorsión generalmente disminuye a medida que el pH del sistema aumenta, lo cual se contradice con lo que se ha encontrado sobre la unión a sustancias húmicas (McConnell J.S. & Hossner L. R., 1985; Morillo et al., 1997). Sin embargo, Morillo et al.,

(2000) y Yu & Zhou, (2005) afirman que la interacción entre el glifosato y el suelo está

fuertemente relacionada con el contenido de materia orgánica. Veiga F. et al., (2001) evaluaron la degradación del g lifosato en suelo y agua del bosque de Galicia. En el estudio observaron que la concentración del glifosato mostró una tendencia a

disminuir aunque fue muy lenta en el primer mes en las dos matrices. A pesar de su adsorsión a los componentes del suelo, el glifosato y AMPA alcanzaron rápidamente una profundidad de 30 cms. donde la degradación se hizo más lenta que en la capa superficial (0-20 cms. ) como consecuencia de menor activ idad biológica. El suelo utilizado era ácido, moderadamente profundo, rico en materia orgánica y pobre en nutrientes; en teoría estas características promuev en la adsorción del glifosato y reducen el riesgo de que se mov ilice (Veiga F. et al.,

2001).

Destino en el Agua El proveedor de glifosato en Colombia, Dow AgroSciences, adv ierte que el Roundup puede generar efectos adversos en organismos acuáticos, y no debería ser aplicado en áreas montañosas ni lluviosas ni en la presencia de otras plantas deseables. Esto es importante s i se tiene en cuenta que todas las zonas de Colombia donde hay cultiv os ilícitos, son áreas lluv iosas con pendientes elevadas (Joy ce S, 1999). Según la EPA (1993), el glifosato puede entrar a ecosistemas acuáticos por aspersión accidental, por deriv as o por escorrentía superficia l. Debido a su estado iónico y su baja

presión de vapor se espera que no se v olatilice de aguas ni de suelos (Landry D. et al., 2005). La EPA también añade que en estudios de campo los residuos se encuentran a menudo a l año siguiente. (Dinham, 1998; Cox 1995)

El glifosato en el agua permanece en estado iónico y se adhiere muy rápidamente a partículas orgánicas (Sørensen et al., 2006). Según dos estudios canadienses, su tiempo de vida media es de 12 a 60 días en aguas de estanques (S ørensen et al., 2006). Sin embargo, al adsorberse es más estable y la vida media en sedimentos puede ser de hasta de 120 días (Conferencia Angulo N.Y., Toxicóloga Clínica). Ahrens (1994) reportó un tiempo de vida media de 47 días y de 25 días en laboratorio. Una gran cantidad de estudios han reportado la importancia de la actividad de microorganismos en el metabolismo del g lifosato (Grossbard E. & Atkinson D., 1985). También se han identificado la degradación química y la fotodescomposición como rutas secundarias del rompimiento de la molécula. Winfield T.W. y colaboradores (1990), encontraron que el glifosato se degrada rápidamente en aguas con cloro. Mallat & Barceló, (1998) evaluaron la

influencia de la temperatura, exposición al sol, pH, presencia de sustancias húmicas, microorganismos y el efecto de la matriz en la degradación del glifosato (sin surfactantes) utilizando una concentración inicial de 20 ppb. Con respecto al pH observaron que las condiciones ácidas favorecen la estabilidad del glifosato debido a la disminución de la actividad


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microbiológica. En lo que respecta a la temperatura, valores más altos favorecen la degradación especialmente debido a los microorganismos. Aunque encontraron que el efecto de la fotólisis era insignificante, algunos autores han reportado su ocurrencia en un grado significativ o en el agua (Grossbard E. & Atkinson D., 1985). En el agua subterránea se observ ó mucha más interferencia en los cromatogramas, que en el agua de río debido a la gran cantidad de sales presentes. La presencia de sustancias húmicas promueven la tasa de degradación del g lifosato. Mallat & Barceló, (1998) también encontraron tiempos de vida media muy cortos para aguas subterráneas (60 horas) y superficiales (100 horas) en condiciones naturales. También encontraron que los tiempos de vida media del glifosato en

aguas subterráneas variaba de 60 horas (con exposición a la luz) y 770 horas o 32 días (en condiciones oscuras). El glifosato se ha encontrado contaminando aguas superficia les y subterráneas, sin embargo,

hay muy pocos estudios que evalúan la presencia del glifosato en aguas naturales. Newton et

al. (1994) encontraron residuos en lagos en concentraciones cerca del límite del detección; Skark et al. (1998) encontraron glifosato en el agua superficial de ríos en una concentración máxima de 0.6 ppb. Hay pocos estudios enfocados en la lixiviación del glifosato y AMPA y sin embargo, muchos estudios han evidenciado la movilidad de ambas moléculas y su riesgo de lixiviación (Veiga et al., 2001; Dousset et al., 2004; de Jonge et al., 2000; S trange-Hansen et al., 2004; Landry D. et al., 2005). Aun así, el g lifosato y el AMPA se han detectado en aguas subterráneas en Dinamarca, Estados Unidos, Canadá, el Reino Unido y Francia (Landry D. et al.,

2005; Diren et al., 2004; S ørensen et al., 2006; Kolpin et al., 2006; Ghanem A. et al., 2007) En el caso de Dinamarca, se descubrió que el glifosato se lixiv ió alcanzando aguas subterráneas en una tasa de cinco veces mayor al nivel permitido para agua potable (Kjær, J. et al., 2005). A

partir de estos resultados se prohibió la utilización de g lifosato en dicho país. En Estados Unidos se detectó glifosato y AMPA en el 67.5% de las 40 muestras colectadas, con AMPA siendo detectado en una proporción mucho más alta sugiriendo que su movilidad es mayor (Koplin D.W. et al., 2006). Aunque por lo general las concentraciones fueron bajas, nueve detecciones de AMPA (concentración máxima: 3.9 ppb) y tres detecciones de glifosato (concentración máxima: 2. 2 ppb) excedieron 1 ppb (Koplin D.W. et al., 2006). La conclusión general del estudio sug iere que las dos moléculas son más móv iles y persistentes en ambientes acuáticos de lo que estudios prev ios han indicado (Giesy et al., 2000). En el Reino Unido, la Welsh Water Company ha detectado niveles de g lifosato en aguas desde 1993, por encima de los límites permisibles fijados por la Unión Europea (DWI, 1997). Igualmente, un informe de la OMS reporta que en Estados Unidos se han encontrado fuentes

de agua que contenían entre 90 y 1700 ppb de g lifosato. En aguas corrientes se ha reportado contenidos de 35 y 1237 ppb (WHO, 2005). En Canadá se encontraron residuos de glifosato de hasta 5153 ppb, después de una aplicación aérea sobre lagos. Se reportó que la degradación de estas concentraciones estuv o en manos de las plantas presentes (W HO, 2005).

La Comisión Europea, a través de div ersos estudios realizados por la ONG francesa Eaux et Riv ières de Bretagne (ERB), mostró la presencia masiv a del g lifosato y el AMPA en el 55% y 35% (respectivamente) de las aguas superficiales francesas (Amorín C, 2007) y clasificó al

glifosato como tóxico para los organismos acuáticos” y capaz de “provocar efectos nefastos

para el ambiente a largo plazo. Esto ocurrió en la misma época en que Monsanto realizaba una enorme campaña publicitaria en televisión para el Roundup, donde recomendaba su uso permanente y aseguraba que éste era un producto 100 por ciento biodegradable que respeta

el medioambiente y que utilizado según las indicaciones del fabricante, no presenta riesgos

particulares para el ser humano o los animales domésticos. El tribunal de Ly on, una vez


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presentado el informe de la ONG, señaló que Monsanto y S cotts F rance conocían las características ecotóxicas del producto, y a pesar de ello difundieron mensajes publicitarios engañosos conteniendo argumentos ecológicos erróneos con e l objetivo de hacer creer

falsamente en la existencia de una inocuidad total e inmediata para el ambiente de sus

productos (Gonzalez, 2007).

Tsui M.T.K. et al., (2005) evaluaron la toxicidad combinada del Roundup y otros contaminantes de aguas superficiales (metales pesados). Para esto utilizaron el crustáceo de agua dulce Ceriodaphnia dubia (pulga de agua), como el organismo modelo debido a su a lta sensibilidad a la toxicidad del glifosato y Roundup (Tsui & Chu, 2003, 2004) y a los metales (Schubauerberigan et al., 1993). Así mismo, esta especie es empleada frecuentemente en experimentos de toxicidad combinada (i.e. Bailey et al., 2002). La biodisponibilidad del glifosato se redujo por la presencia de cationes poliva lentes en aguas duras (Hall et al., 2000), debido a la formación de complejos de metales insolubles (S ubramaniam & Hoggard, 1988). Seguramente el mismo mecanismo quelante fue el responsable de la reducción en toxicidad de metales como Ag, Cd, Cu, Cr, Pb, Ni y Zn por la presencia del glifosato. Es posible que el glifosato formara un complejo con estos iones impidiendo su acumulación y toxicidad en

Ceriodaphnia dubia. S in embargo, el g lifosato es zwitterionico (bipolar) en la naturaleza con carga positiva o negativ a dependiendo del pH del medio, lo cual podría conferirle variabilidad a los resultados.

Los únicos resultados negativos fueron los del mercurio (Hg) y selenio (Se), pues la adición de glifosato promovió s ignificativamente su acumulación en Ceriodaphnia dubia. En general, el producto de solubilidad (Ksp) de los complejos formados determinaba el grado de libertad del ión glifosato en el agua (S undaram & Sundaram, 1997). Wang y colaboradores (1994) indicaron que el glifosato no es bioacumulable en los peces. Por otro lado, el estudio de Tsui M.T.K. y colaboradores, (2005) demuestra que la biodisponibilidad de complejos metal-glifosato puede ser muy baja o muy a lta dependiendo del metal. Aunque los resultados son inesperados y parcia lmente fav orables para la mayoría de metales evaluados, el estudio demostró que el complejo g lifosato-Hg es bioacumulable en organismos acuáticos (Tsui M.T.K. et al., 2005) Hasta el momento, ni en Colombia ni en Ecuador se han publicado estudios enfocados en identificar la presencia de glifosato en el agua, sin embargo hay suficientes razones para creer

en la posibilidad de encontrar concentraciones muy altas de este contaminante.

Fitorremediación de Pesticidas La bioremediación y f itorremediación son tecnolog ías innovadoras que tienen el potencia l de aliv iar un gran número de problemas por contaminación por pesticidas. Muchos de los pesticidas que se utilizan hoy y los que se utilizaron a lo largo de muchos años antes de que se probara su efecto adverso sobre el medio ambiente, son tóxicos y muchos de ellos son persistentes en la naturaleza. Estos químicos permanecen en el suelo y pueden, fácilmente, entrar en la cadena alimenticia o llegar a fuentes de agua. Estos químicos también pueden llegar a la atmósfera a trav és de diferentes procesos. Una de las principales preocupaciones es su habilidad para bioacumularse en el tejido adiposo de los animales (F razar, 2000). Hay dos razones principales por las que estos compuestos persisten en la naturaleza: Primero, debido a que las condiciones necesarias para su deg radación no están presentes, como por ejemplo que los microorganismos que son capaces de biodegradarlos no se encuentren en el


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sitio contaminado. Si el microorganismo está presente, es posible que haya un factor limitante (falta de nutrientes), que genere condiciones desfav orables para la degradación del contaminante. La segunda posibilidad es que el compuesto sea resistente a la biodegradación (Frazar, 2000). La fitorremediación es una tecnología que está ganando reconocimiento como un método costo-efectiv o en la remediación de sitios contaminados (Schnoor, et al., 1995). Debido a que los herbicidas están diseñados para matar plantas, la utilización de fitorremediación para remediarlos puede ser una tarea complicada. Muchos estudios se han realizado para

determinar la efectiv idad de remediación de contaminantes persistentes en varias especies de planta. Las plantas son, por lo general, capaces de tomar y almacenar concentraciones significativ as de metales pesados y otros compuestos en sus raíces, tallos y hojas, lo cual se conoce como fitoextracción (Burk en, Schnoor, 1998; Briggs et al., 1982). Una vez esto ocurre,

las plantas son cosechadas y dispuestas de una forma aprobada, como en un sitio de disposición de desechos peligrosos. Las plantas que realizan este tipo de remediación, son conocidas como hiperacumuladoras. (Frazar, 2000) La fitotransformación ocurre cuando las plantas transforman los contaminantes orgánicos en formas menos tóxicas, menos móviles y más estables (Newman et al., 1997; Schalk, Pierrel et

al., 1997; Ohkawa et al., 1999; Werck -Reichhart, Hehn, Didierjean, 2000; Kolb, Harms, 2000). Este proceso incluye fitodegradación, que es el metabolismo del contamínate orgánico por medio de las enzimas de la planta, y fitov olatización que es la volatilización de contaminantes orgánicos a medida que pasan por las hojas de la planta. La liberación de estos contaminantes a través del aire, resulta en el intercambio de una forma de un contaminante a otra (F razar, 2000).

La fitoestabilización inmoviliza los contaminantes y reduce su migración a trav és del suelo absorbiendo y uniendo constituyentes lixiviantes a la estructura de la planta. El proceso reduce efectivamente la biodisponibilidad de los contaminantes dañinos. Prácticamente cualquier planta que esté presente en un sitio contaminado contribuirá con la fitoestabilización del compuesto (Arthur & Cotas, 1998). En la interfase suelo-raíz, conocida como la rizósfera, hay una gran cantidad de población microbiana activa. Por lo general, las poblaciones microbianas y vegetales se proporcionan los compuestos orgánicos e inorgánicos necesarios entre ellas. Generalmente, la planta no está inv olucrada directamente en el proceso de biodegradación. S u función primordia lmente es la de catalizar el crecimiento de la población microbiana y su actividad, que incrementa

subsecuentemente el potencial de biodegradación (Frazar, 2000). De acuerdo con estudios preliminares, se ha visto una degradación más eficaz de los pesticidas antrazina, metoachlor y trifluralin en los sitios contaminados donde las plantas del género

Kochia sp. (Familia Chenopodiaceae) han sido plantadas. La degradación ocurre en la rizósfera de esta planta tolerante a los herbicidas (Coats & Anderson, 1997). En estudios de laboratorio, el crecimiento rápido y profundo de las ra íces del árbol poplar (Populus sp., Familia Sa licaceae) ha mostrado un gran éxito en la remediación de agua subterránea. S u rápido crecimiento requiere de altos volúmenes de agua. El agua contaminada es absorbida por la planta y los contaminantes son subsecuentemente transformados en moléculas orgánicas útiles para el crecimiento de la planta (Burlen, 1998).


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Entre las limitaciones de la f itorremediación está que generalmente las plantas tan solo pueden remediar en los primeros tres metros del suelo debido a la longitud de sus ra íces. Igualmente en el agua se encuentran limitadas a esta misma profundidad. Otro problema es que las plantas que absorben contaminantes y los acumulan en sus tallos u hojas sin biodegradarlos, pueden causar problemas serios en los herbívoros (Arthur & Cotas, 1998). Existe un gran interés actual en el uso de cuerpos de agua artif iciales con cultiv os de plantas para el tratamiento agua de drenaje agrícola, aguas residuales y efluentes industriales (Reddy K.R., 1983; Reddy K. R. et al., 1982; Rogers H. H & Davis D.E., 1972; Boyd C.E., 1976; Wooten

J.W. & Dodd J.D., 1976). El tratamiento a base de plantas ha probado su efectividad y economía en el mejoramiento de la calidad de aguas contaminadas (Brix H., 1987; Gersberg R.M. et al., 1986; Nicols D.S., 1983; Wolverton B.C. & McDonald R. C.J., 1979).

Plantas acuáticas sumerg idas y emergentes incluyendo a Eichornia crassipes, Egeria densa,

Lemna sp., Spirodela sp., Hydrocotyle umbellata, Sagittaria latifolia, Phragmites australis y

Pontederia cordata reducen los niveles de Sólidos Suspendidos Totales (SST) y nutrientes (N, P) en aguas residuales a trav és de filtración de sólidos, asimilación de nutrientes y transformación microbiológica (Reddy K. R., 1983; Reddy K. R. et al., 1982; Rogers H.H & Davis D.E., 1972; Boy d C.E., 1976; Wooten J.W. & Dodd J.D., 1976; Brix H., 1987; Gersberg R.M. et al., 1986; Nicols D.S., 1983; Wolverton B. C. & McDonald R.C. J., 1979; Oron G. et al., 1986). También se ha demostrado la contribución de plantas acuáticas y sus microorganismos asociados en la remediación de compuestos xenobióticos presentes en aguas contaminadas y sedimentos. Se ha visto una aceleración en la biodegradación de surfactantes en las ra íces de Thypha latifolia y en las partes aéreas de Lemna minor. También se ha visto que plantas

acuáticas como Lemna sp. y S pirodela sp. pueden acumular metales pesados como Aluminio, Cadmio, Cubre, Plomo y Mercurio en el agua (Mo S.C. et al., 1989; Charpentier S. et al., 1987; Pignatello J.J. et al., 1985) Adicionalmente Rice, Anderson & Cotas (1996) probaron que plantas acuáticas tolerantes a herbicidas pueden remediar aguas contaminadas con herbicidas. En el estudio se utilizaron las plantas acuáticas Ceratophyllum demersum, Elodea canadensis y Lemna minor y se probó que estas planta podían degradar s ignificativamente (p≤0.01) el Metolachlor y las dos plantas Ceratophyllum demersum y E lodea canadensis degradaron significativamente (p≤0. 01) la atrazina.

Biorremediación del Glifosato

Se ha demostrado la habilidad de microorganismos y en especia l bacterias para utilizar compuestos organofosforados como fuente de nutrientes para su crecimiento (Balthazor T.M. & Hallas L. E., 1986; Av ila L.Z. et al., 1987; Bencini D. A. et al., 1983). Igualmente, se encontró que a lgunas cepas de hongos mineralizaban los organofosforados (Chen et al., 1990; Jacob G. S. et al., 1988). Liu C.M. et al. (1991), demostraron que las siete cepas probadas en su experimento pertenecientes a la familia Rhizobiaceae podían degradar el glifosato (i.a.) creciendo en este como la única fuente de fósforo en la presencia de aminoácidos aromáticos. Se descubrió además que la sarcosina era el producto inmediato de una de las especies utilizadas (Rizobium meliloti), indicando que el primer clivaje se daba en el enlace C-P lo cual

implica que la degradación del glifosato se da a partir de actividad C-P liasa (Liu C.M. et al., 1991).


27

Figura 3. Diagrama de las rutas de degradación del g lifosato observadas hasta el momento en bacterias. F igura obtenida del estudio de Strans S., (año no publicado). La misma ruta de degradación se descubrió en 34 cepas de Pseudomonas pseudomallei que fueron aisladas del suelo. Una de las cepas mostró una degradación del 50% del glifosato en 40 horas (Peñaloza-Vazquez et al., 1995). También fue este el caso de Streptomycete S tC y su producto inmediato era, igualmente, la sarcosina (Z eleznick et a l. 1963). Varios microorganismos a is lados de v arios ambientes metabolizan fosfonatos por la acción de la C-P liasa, que seguramente es un complejo enzimático asociado a membrana inducible sólo a partir de la ausencia de fosfatos (Wackett et al., 1987; Wanner, 1996).

Otro género capaz de degradar el glifosato es la cianobacteria Spirulina spp., ésta, además de utilizar el fosfato, también utilizaba el nitrógeno como única fuente de crecimiento. (Lipok J. et

al., 2007) En cepas de Arthobacter spp., solo una de 9 cepas probadas (A. atrocyaneus ATCC 13752) mostró ser capaz de utilizar el g lifosato ( ingrediente activ o) como fuente de fósforo. La diferencia con los demás estudios ( incluída la cepa de Arthrobacter GLP-1), es que el producto inmediato en la degradación del herbicida no fue la sarcosina. El glifosato fue directamente metabolizado a AMPA; el carbón del AM PA fue completamente conv ertido en CO2 (Pipk e & Amrheint, 1988). Esta misma ruta se observó en una especie de F lavobacterium sp. El reporte informa que el producto de AMPA es mineralizado a PO4

3- (Balthazor T.M. & Hallas L.E., 1986),

entonces la ruta queda así: Glifosato � AMPA � (PO43-+NH4+CO2+H2O).

Un estudio interesante fue el de Hallas y colaboradores, (1992) en el que se desarrollaron una planta piloto (con capacidad de 45 L/min) como birreactor. El lodo activado fue enriquecido

inicia lmente con microorganismos con Actividad-Degradadora de-Glifosato (GDA) y se dejó por un periodo de activación de 3 semanas. El efluente de aguas residuales fue rociado con glifosato y NH4Cl. La GDA fue promovida manteniendo el pH < 8 y añadiendo extracto de levadura (<10 mg/litro). La concentración de glifosato fue de 50 ppm (mg/L). Se obtuvo una GDA >90% en un tiempo de residencia de 10 minutos (144 revoluciones hidráulicas por día). Los resultados sugirieron la posibilidad de generar un sistema a escala real para el


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biotratamiento de aguas residuales industriales, como una a lternativa eficiente y económica (Hallas et al., 1992)

Fitorremediación del Glifosato

Hasta el momento no existen estudios sobre la f itorremediación del glifosato. Aún así, s í hay dos estudio sobre la fitorremediación de compuestos organofosforados de estructura muy parecida al glifosato (Gao et al., 2000). Ciertos estudios que tratan el tema de compuestos organofosforados y en particular del glifosato afirman que la degradación por parte de plantas es imposible debido a que, para que se degrade el glifosato es indispensable clivar su enlace C-P, y sólo los microorganismos tienen activ idad C-P liasa (Kertesz, 1991; Zayed et al., 1998). Sin embargo, el estudio mencionado de Gao y colaboradores., (2000) afirma que muchas plantas acuáticas han evolucionado mecanismos de adquisición del fósforo soluble presente en aguas naturales en forma de fosfatos orgánicos lixiv iados de plantas y materia l animal. Para lograr que los fosfatos orgánicos puedan ser absorbidos, deben ser hidrolizados en fosfato inorgánico (Pi) por fosfatasas ácidas o a lcalinas (Gao et al., 2000). Así mismo, no es raro que se induzca una síntesis de fosfatasa en plantas que crecen bajo condiciones limitadas de fósforo. El estudio de Gao y colaboradores (2000), es el primero en ev idenciar la degradación de compuestos organofosforados (OP) por parte de plantas sin la ay uda de microorganismos. En el estudio se utilizaron cultiv os axénicos de las plantas Myriophyllum aquaticum, Spirodela

oligorrhiza y Elodea canacensis y se investigó su habilidad de transformar los compuestos organofosforados Malathión, Demetón-s-Metil y Rueleno in vitro. También se analizó la

actividad enzimática de un extracto enzimático de Spirodela oligorrhiza. En todas las plantas del estudio se observ ó una eficiente degradación del glifosato, al igual que en los extractos enzimáticos, los cuales fueron más eficientes. Poco se sabe del mecanismo enzimático responsable de la degradación de compuestos OP. Sin embargo el estudio de Gao y OP con los enlaces P-O, P-S, P-CN y P-F (Gao et al., 2000). Las OPH están presentes en las plantas acuáticas y se ha demostrado que tienen especificidad de sustrato variable (Morita et al., 1996).

Bielesk i R.L. & Jonson P.N. (1972), entre otros, han colaboradores propone a la organofosforo hidrolasa (OPH, EC 3.1.8. 1) como la responsable de esta degradación. La OPH es una familia de enzimas involucradas en la transformación de compuestos documentado con lujo de detalle la

síntesis de fosfatasas inducida en la planta S pirodela oligorrhiza (conocida en ing lés como duckweed) creciendo en un ambiente deficiente en Pi. Se demostró que bajo estas condiciones el contenido de fosfatasas de las ra íces y partes aéreas de Spirodela oligorrhiza aumenta de 10 a 50 veces en un periodo de varios días. La activ idad fosfatasa se localiza mayoritariamente

cerca de la superficie de estos tejidos y una porción de esta activ idad enzimática es liberada al medio (Bielesk i R. L. & Jonson P. N., 1972). Una de las enzimas fosfatasas más comunes de S. oligorrhiza es la fosfatasa a lcalina (FA). Esta enzima se parece en muchos aspectos a la F A común y altamente dispersada en el tejido animal (W ong Y.W. & Low M.G., 1992). La FA también se ha detectado en especies de algas (Rhee G.Y., 1973; Kuenzler E.J. & Perras J.P., 1965; Guerrini, A.M. et al., 1971) y plantas superiores (Kieleczawa J. et al., 1991; Ballal S. K., 1990), especialmente en aquellas que crecen

en un medio deficiente en fosfato (Morita et al., 1995). Otra posibilidad de degradación del g lifosato podría existir en las plantas tolerantes al glifosato, pues se sabe que estas lo absorben aunque aún no se sabe si lo degradan o se


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limitan a extraerlo del medio. Actualmente se ha reportado la existencia de 11 especies que lo toleran en 8 países diferentes: L. rigidum en Australia (Powles et al., 1998; Pratley et al., 1999) y en Estados Unidos (Simarmata et al., 2003), Eleusine indica en Malasia (Tran et al., 1999; Lee & Ngim, 2000), Conyza canadensis en Estados Unidos (VanGessel, 2001; Koger et al., 2004; Main et al., 2004), L. multiflorum en Chile (Perez & Kogan, 2003), Estados Unidos (Perez-Jones et al., 2005) y Brasil (Heap, 2006), C. bonariensis en S ur África (Heap, 2006) y España (Urbano et al., 2005), Plantago lanceolata en S ur África (Heap, 2006), Euphorbia heterophylla en Brasil (Heap, 2006), Sorghum halepense en Argentina (Heap, 2006), y Ambrosia artemisiifolia (S ellers et al., 2005), Amaranthus rudis (Zelay a & Owen, 2005), y A. palmeri (Culpepper et al., 2006) en

Estados Unidos. (Perez-Jones A. et al., 2007).

Egeria densa La planta acuática Egeria densa es conocida comúnmente como la ‘Elodea brasilera’ o solo ‘Elodea’. Debido a esto es común confundirse creyendo que pertenece a l género Elodea, que además se le parece bastante. Esta especie pertenece a la familia de hierbas acuáticas Hy drocharitaceae (Orden Alismatales) (Cook, 1990). Hy drocharitaceae es una de las familias más grandes de angiospermas acuáticas, comprendiendo 15 géneros y 80 especies reportadas. Basados en el gen rbcL (del cloroplasto), Les et al., (1993) y Les & Hay nes, (1995), mostraron que Najadaceae es la familia más cercanamente emparentada con Hydrocharitaceae.

La familia Hy drocharitaceae tiene una gran diversidad morfológ ica y ecológ ica. Por ejemplo cuenta con cuatro mecanismos de polinización:

1. Entomofilia: las flores aparecen en la superficie y son polinizadas por insectos (Blyxa,

Hydrocharis, Egeria, O ttelia, Stratiotes y Apalanthe);

2. Epihidrofilia: Polinización por agua por flotación donde la f lor masculina se suelta (Vallisneria, Enhalus, Lagarosiphon y Nechamandra), o la f lor masculina libera granos de polen que flotan a l agua (Elodea), o los granos de polen son liberados a l aire (Hydrilla).

3. Hipohidrofilia: Polinización debajo del agua: las flores florecen debajo del agua y los granos de polen son liberados al agua (Halophila, Thalassia)

4. Anemofilia: Aunque no está comprobado, se cree que el mecanismo de polinización de Limnobium es por v iento (Cook 1990).

En el estudio de Tanak a et al. (1997), se utilizaron dos genes: rbcL y matk (ambos pertenecientes al cloroplasto) por separado y combinados. En los 3 árboles filogenéticos resultantes, los géneros Egeria y Elodea aparecen como grupos hermanos con valores de bootstrap de 100%. Egeria densa se caracteriza por ser una hierba perennal, dioica y sumergida que puede crecer a

profundidades hasta de 6 m. Los tallos de esta planta son delgados, débiles y redondos, con ramificaciones frecuentes y longitud de 3 a 5 m. Una v ez que los tallos alcanzan la superficie, forman una ag lomeración densa. Las hojas se encuentran organizadas en verticilos de 4 hojas a lrededor del tallo, aunque también se pueden ver verticilos de 3 y 8 hojas. Las hojas son de oblicuas a lineales, finamente aserradas y con una long itud menor a 2, 54 cms. Las hojas que se encuentran en la base del


30

tallo son opuestas mientras que las superiores se encuentran agrupadas en verticilos. Los ta llos y las hojas son de coloración verde v ivo. Las flores son unisexuales y se producen en ta llos delgados que flotan en la superficie, tienen 3 péta los y son blancas. Los estambres son amarillos y están dispuestos en dos verticilos opuestos. Las semillas tienen una longitud de 1.3 mm. (Aulbach-Smith 1990, Blackburn et al. 1969) Algo interesante de esta especie y que se debe tener en cuenta al trabajar con ella es que su reproducción también se puede dar por crecimiento vegetativo y cada individuo cuenta con reg iones que son como nódulos dobles que se presentan en interv alos de 6 a 12 internodos a

lo largo del ta llo. Estos nódulos dobles consisten en dos nodos independientes separados por un internodo grueso y muy corto. De estos nódulos se producen yemas latera les, ramas y ra íces adv enticias. Sólo los fragmentos de tallo que contienen esta región pueden desarrollar nuevas plantas. Los fragmentos de ra íces también pueden desarrollar un nódulo doble en un

tallo v iejo (Aulbach-Smith 1990, Black burn et al. 1969). Debido a su crecimiento vegetativ o, rápido desarrollo, pocos requerimientos bióticos y abióticos y su formación de densas agrupaciones monotípicas, Egeria densa es una planta agresiva que invade rápidamente los cuerpos de agua y excluye competitivamente otras especies reduciendo la biodiv ersidad de los lugares que coloniza. Adicionalmente, restringe el movimiento de agua y atrapa sedimentos. Igualmente sus densas agrupaciones tienen efectos sobre la ca lidad del agua reduciendo el oxígeno disuelto y contribuy endo a la eutrofización (Feijoó et al., 2004). La ‘Elodea brasilera’ es nativa del sudeste de Brasil y se reportó en Estados Unidos por primera vez en el año 1893. La planta puede encontrarse en cuerpos de agua fríos o ca lientes, quietos

o en movimiento. Sin embargo es más común verla en aguas poco profundas, algo ácidas y con poca turbulencia. Egeria densa generalmente pasa el invierno en un estado dormante en el fondo del cuerpo de agua. S u crecimiento comienza cuando aumenta la temperatura y se acelera durante el verano (Yeo, 1966). Las tres especies Elodea canadensis, Hydrilla verticillata y Egeria densa son muy parecidas y difíciles de diferenciar. Elodea canadensis se distingue de Hydrilla verticillata por el número de hojas en los verticilos: E. canadensis tiene 3 por lo general e Hydrilla tiene de 4 a 6. Además, Hydrilla no tiene margen finamente aserrado ni lámina rasposa (en Hydrilla el margen aserrado es menos fino, más v istoso). Egeria densa se distingue por tener hojas más largas que por lo general se encuentran en verticilos de 4 o 5 (y en a lgunos casos de 3 a 8). Ésta difiere de ambas, en sus flores que son más largas y atractivas con pétalos de 9 a 12 mm., que son más

largos los sépalos y pot la presencia de los mencionados nódulos dobles. (Haramoto & Ikusima 1988; Bowmer K.H. et al. 1995). Elodea canadensis al igual que Egeria densa e Hydrilla verticillata, pueden transportar y fijar

carbono (Bowes & Salvucci 1989). También se ha reportado que Egeria densa reduce los niv eles de Sólidos Suspendidos Totales (SST) y nutientes (N, P) (Dierberg et al., 2002; Reddy K.R., 1983). Adicionalmente su género hermano, Elodea canadensis probó ser efectiv o en la degradación de metolachlor y atrazina (Rice, Anderson & Cotas, 1996) y compuestos organfosforados (Gao et al., 2000).


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Materiales y métodos

Muestras Vegetal es

Las muestras vegetales pertenecientes a la especie Egeria

densa se obtuv ieron de la laguna del ‘ Parque de los novios’ ubicada en Bogotá, Colombia (4°39’15.07’’ N 74°04’53.07’’O, 2557 msnm) y se seleccionaron los individuos más similares

Reacti vos

Se utilizaron los s iguientes reactivos: • Glifosato en su forma de ácido fosfonometil amino

acético al 96% suministrado por Dow AgroChemicals

• Roundup S pectra con glifosato en su forma de sal al 74% suministrado por S alicultiv os.

• 9-fluorenilmetil cloroformiato (FMOC-Cl) marca Sigma – Aldrich

• Borato de sodio decahidratado (Na2B4O7*10H2O) grado reactiv o analítico

• K2HPO4 g rado reactiv o analítico marca J. T. Bak er • Agua bi-destilada • Agua y Acetonitrilo grado HPLC marca J.T, Baker

suministrado por Laboratorios Wacol S.A.

• Acetato de etilo grado reactiv o analítico • Filtros de membrana millipore tipo durapore

hidrofilica, 0. 22 micras de tamaño de poro suministrado por Purificación y Anális is de fluidos LTDA.

• Tris-HCl • Polyviny lpyrrolidone (PVP) • Triton X-114 • Solución Hoagland (KNO3, Ca(NO3)2 x 4H2O,

MgSO4x7H2O, FeEDTA , NH4 NO3, KH2PO4, H3BO3 , MnCl2 x 4H2O, ZnS O4 x 7H2O, CuSO4)

Montaje 1

El montaje experimental se diseñó para evaluar la degradación del glifosato en el agua en presencia de la

macrófita Egeria densa

a lo largo del tiempo. Se utilizaron dos tipos de

controles, uno sin la

macrófita para evaluar la pérdida abiótica, y otro con la macrófita pero sin glifosato para asegurar si las condiciones son propicias para la planta. Se utilizaron env ases de plástico cilíndricos y se llenaron a 2 litros con agua de la llave que fue

Figura 6 : Imagen del Montaje 1

Figura 4: Egeria d ensa

R1C1

BC2

C0 C1 C2

R1C0 R1C2

R2C0 R2C1 R2C2

BC1

R = Repetición

C = Concentración B = Blanco

Figu ra 5 : Diagrama del

Diseño Exp erimen tal


32

dejada por dos días en reposo para ev itar la presencia de cloro ya que este degrada el glifosato (APHA, 1998). Los especimenes de Egeria densa seleccionados de acuerdo a su similitud en cuanto a peso fresco, long itud y número de verticilos fueron introducidos por indiv idual en cada uno de los envases después de ser lavados con agua destilada y secados con papel absorbente. Se utilizaron 2 concentraciones de g lifosato: 20 (C1) y 60 ppm (C2) y un control (C0). Para cada concentración se realizaron tres repeticiones y un patrón sin la planta excepto para el control (Figura 4). El mismo montaje se realizó para el Roundup Spectra con las mismas concentraciones de g lifosato como ingrediente activ o, sin repetir el control teniendo así un total de 19 muestras a analizar. A cada sistema se le adicionó una solución nutritiva de

Hoag land modificada: KNO3 2M, Ca(NO3)2 x 4H2O 2M, MgSO4x7H2O 2M, FeEDTA∗ 15g/L, NH4NO3 1M, KH2PO4 1M y una solución de menores: H3BO3 46,3 mM, MnCl2 x 4H2O 9,1 mM, ZnSO4 x 7H2O 0,8 mM, CuSO4 0,3 mM (Hoagland & Arnon, 1938). El montaje se dispuso en el medio de un bosque secundario y se cubrió con plástico de inv ernadero. Se tomaron alícuotas de aproximadamente 3 mililitros a los 0, 7, 15, 30 y 37 días después de homogenizar el s istema y llevarlo de nuev o, s i era necesario, a 2 litros debido a la evaporación. Esto es v álido en el caso del glifosato, ya que este no se volatiliza o su grado de

volatización es insignificativo debido a su baja presión de vapor (Landry D. et al., 2005)

Montaje 2

Fue necesario realizar un segundo montaje debido a complicaciones con las muestras del primer montaje. Este diseño se

realizó de la misma forma que el anterior pero s in el Roundup Spectra (11 muestras a analizar). En vez de envases de

plástico se utilizaron frascos erlenmey er de v idrio que se llenaron a 1 litro. Los tubos se cubrieron por un lado con aluminio para disminuir la pérdida por fotólis is y se adicionaron aireadores de pecera a cada sistema. Se

tomaron alícuotas de aproximadamente 2 mililitros a los 0, 7, 8, 14 y 28 días después de homogenizar el sistema y llev arlo de nuev o, s i era necesario, a 1 litro debido a la evaporación.

Preparación de las muestras

El procedimiento de esta derivatización se observa en la Figura 5. Una vez derivatizadas todas las muestras ( incluidos los patrones), se diluyeron a un factor 1: 5 antes de ser analizadas por el espectrofotómetro.

Determinación de Glifosato por Espectrofotom etría UV

Se determinó la longitud de onda a la cual absorbe el glifosato-FMOC-Cl en el espectrofotómetro a partir de un barrido de una muestra conteniendo glifosato. Una vez establecida esta longitud de onda (264 nm), se realizó una curva de calibración a partir de 5 concentraciones conocidas de glifosato (10, 20, 30, 50 y 70 ppm) que se repitieron cuatro veces. La ecuación de la recta se obtuvo a partir de una regresión lineal simple.

∗ 100 ml de agua destilada + 0,7 g FeSO4 + 0,4 g EDTA

Figura 7 : Imagen del Mon taje 2


33

Una vez derivatizadas las muestras del Montaje 2, éstas fueron analizadas por medio del espectrofotómetro UV a 264 nm.

Figura 9. Diagrama de flujo del esquema general para llevar a cabo la derivatización del

glifosato. Procedimiento empleado por el laboratorio de Química de la Universidad de los

Andes4.

Análisi s de los datos

Se utilizó un modelo de primer orden (Ct/Ci = e-kt

) para estimar los parámetros cinéticos de la degradación del g lifosato. Ct es la concentración del glifosato en el tiempo t, C0 es la concentración inicial, y k es la tasa constante de primer orden. El tiempo de vida media (t1/2) está dado por t1/2=ln(2)/k. (Gao et al., 2000)

Análisi s estadí stico

Se realizó un ANOVA de Diseño de Medidas Repetitivas sin incluir los datos de los blancos (BC1, BC2) para analizar la diferencia entre los datos obtenida entre tiempos y réplicas debido a que

los blancos no tienen el mismo número de réplicas (Ver Figura 4). Finalmente se realizó un ANOVA normal para analizar todos los datos, incluyendo los blancos.

4 Diagrama r ealizado por Manuel Méndez de la Universidad de los Andes, (Bogotá, Colombia).


34

Resultados y Discusión

Montaje 1

Para el montaje 1 no fue posible dtermnar las concentraciones del glifosfato porque el Cromatógrafo líquido de Alto Despempeño (HPLC) no estaba funcionando apropiadamente y no fue posible medir las concentraciones, pues las muestras derivatizadas no son estables por tanto tiempo (2 meses). Sin embargo, el Montaje 1 sirvió para dilucidar ciertos apectos cualitativos importantes:

• La planta acuática Egeria densa resiste altas dosis (≈20 y 60 ppm) de g lifosato en su forma de ácido fosfonometil amino acético:

Hasta el día 25 no se observaron cambios en la coloración, sin

embargo el día 30 sí se observa un cambio de algunas hojas hacia un color amarillento (Figura 6). Aún así, este cambio también ocurre en los controles, por lo que se asume que no es un efecto del glifosato.

Después de 70 días, las plantas sujetas a las concentraciones de glifosato (20 y 60 ppm) no mostraron diferencias en cuanto a su coloración y aspecto general con respecto a los controles (Co), s in embargo, ya para este momento s í se observa que en todas las plantas hay un aumento de hojas con coloración café (Figura 11). Seguramente esto se debió a que ya para estos últimos días las muestras no se mezclaron lo cual pudo disminuir el oxígeno disuelto del medio. Esta disminución del oxígeno disuelto se hace más probable en el día 80 pues se observa que todas las muestras, incluyendo los controles muestran un deterioro causado por la inv asión de algas, que cubrieron el área superficia l en algún momento entre el día 70 y 80, impidiendo la entrada de luz.

• El Roundup S pectra resultó ser mucho más tóxico para las plantas que el glifosato en su forma de ácido fosfonometil amino acético:

Las plantas sujetas a las concentraciones de Roundup (20 y 60 ppm del ingrediente activo) muestran diferencias fuertes en cuanto a su color y aspecto general con respecto al control y también con respecto a las 2 concentraciones de g lifosato en su forma de ácido fosfonometil amino acético (F igura 11), ya que se observa su pérdida de pigmentación y deterioro de las hojas a los 7 días de la aplcación del Roundup. Esto es consistente con varios estudios que han

encontrado una may or toxicidad del Roundup comparado con el g lifosato en términos de toxicidad aguda (F olmar et al. 1979; Martinez et al. 1990; Mitchell et al. 1987) y genotoxicidad (Bolognesi et al. 1997; Vigfusson & Vy se 1980). Así mismo Diamond & Durk in (1997) afirman que los surfactantes presentes en el Roundup multiplican por cuatro la potencia de su acción y

por ende, de su toxicidad (Abdelghani et al., 1997). Otros aspectos que se dilucidaron con el Montaje 1 es que los envases utlilizados presentaban un área superficial demasiado grande que hacía que la pérdida por evaporación fuera más a lta.

Figura 1 0: Foto de un s istema

del Montaje 1


35

Figura 11. Apariencia de las plantas sujetas a glifosato o Roundup en los días 7, 30 y 60. Solo se

muestran las fotos correspondientes a los sistemas nombrados en el diagrama experimental

(Figura 4) como Co, C1 y C2.

Montaje 2

En el segundo montaje se optimizaron las condiciones experimentarles como la pérdida por evaporación utilizando erlenmey ers de vidrio con un área superficial mucho menor para disminuir las pérdidas por evaporación y hacer más precisa la llevada a 1 litro antes de cada muestreo. También se optimizaron las condiciones de oxigenación utilizando fitros tipo pecera. Otra ventaja del segundo montaje es que las muestras se pasaron por el espertrofotómetro inmediatamente después de su derivatización. En el caso anterior las muestras eran almacenadas en v iales y refrigeradas para ser inyectadas más adelante, cuando el equipo

Control

C1

C2

Día 7

C1

C2

Día 30 Día 60


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estuv iera disponible. El único estudio que se encontró sobre la estabilidad de los productos de la derivatización, afirma que el complejo permanece estable al

menos 15 horas a temperatura ambiente (B. LeBot et al.,

2002), sin embargo, poco se sabe de la estabilidad del producto bajo refrigeración.

El segundo montaje se realizó en vista de que el HPLC estaba siendo reparado, y que las muestras obtenidas por el montaje anterior se habían perdido. Sin embargo, después de la reparación los resultados del cromatógrafo fueron iguales a los obtenidos previamente: no se exhibía una línea base constante lo cual dificulta el anális is de las muestras. Además la presión del equipo estaba presentando fluctuaciones demasiado altas. S eguramente el problema estuvo en que las columnas iónicas tienen una durabilidad reducida y en que el método de medición del glifosato es muy complejo.

Así, surge la alternativ a de medir las muestras derivatizadas por medio de un Espectrofotómetro UV. Las desventajas de este método son que el límite de detección es mucho mayor y cualquier sólido disuelto le puede otrogar ruido a los resultados. Además no se pueden medir por separado las moléculas del g lifosato y su metabolito AM PA sino que se miden como un todo. Así, no se puede determinar qué porcentaje del glifosato se ha convertido a AMPA, o si sólo queda AMPA, o si no está ocurriendo una conv ersión a AMPA… etc. La longitud de onda a la cual absorbe el complejo glifosato-FMOC-Cl es de 264 nm. La ecuación de la recta obtenida con la curva de ca libración (Figura 13) se obtuvo a partir de una regresión

lineal simple: Absorbancia = 0 .0195* [Concentración]. El R2 de la ecuación es de 0, 8479 (F igura 13) lo cual demuestra que el método no es muy

preciso, especialmente cuando las concentraciones son menores a 10 ppm; pues éstas se acercan mucho a las concentraciones obtenidas con los blancos. A partir de esto se podría decir que el límite de detección del método es de 10 ppm. Teniendo en cuenta esto se utilizaron concentraciones altas de glifosato.

Curva Glifosato

y = 0,0195x

R2 = 0,8479

0,000

0,300

0,600

0,900

1,200

1,500

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Concentración (ppm)

Ab

sorb

anci

a

Figura 13: Curva de Calibración del glifosato, 4 réplicas.

Figura 1 2: Foto de un s istema del Mo ntaje 2


37

Concentración de Gl ifosato en el tiempo

Co = 27,5 ppm

10

15

20

25

30

35

0 5 1 0 15 20 25 30

t iempo ( días )

Gli

fosa

to (

pp

m)

C1

BC1

Figura 14: Degradación del glifosato en e l tiempo en presencia (C1) o ausencia (BC1) de la

macrófita para la concentración inicial de 27, 5±0,07 ppm (n=4). Se muestran los promedios

obtenidos para las tres réplicas. C1 se refiere a los sistemas con la planta acuática Egeria densa

y BC1 se refere al s istema control donde la planta está ausente.

Las diferencias entre las concentraciones medidas en cada tiempo sin tener en cuenta los controles (Figuras 14 y 15) son estadística imente significativas (AOV Medidas Repetidas, P=0,00 α=0,05) lo cual implica que la degradación observada en los diferentes tiempos es significativ a (Tukey, α=0,05). Así mismo, contrario a los esperado, la variación entre réplicas no es significativa (AOV Medidas Repetidas, P=0,796 para C1 y P=0,514 para C2; α=0,05), lo cual le confiere may or confiabilidad a los datos.

Para el caso del montaje con la concentración inicial de 27,5±0, 07 ppm (n=4) (C1) se obseran diferencias significativas con respecto al control en los diferentes tiempos evaluados (AOV General, P=0,0071 α=0,05; Tukey ). Aún así, se puede observ ar que para el día 14 ya se ha obtenido una concentración muy cercana al límite de detección, razón por la cual en la medición del día 28 se observa una disminución entre la separación de ambas medidas (Figura 14). Para el caso del montaje con la concentración inicia l de 61,5±0,25 ppm (C2), se observan diferencias s ignificativ as con respecto al control en los diferentes tiempos evaluados (AOV General, P=0,0053 α=0,05; Tukey ). Teniendo en cuenta el límite de detección, se puede decir que para este caso, se observa que a los 28 días el g lifosato ha desaparecido entre un 65% y 81%, mientras que en el blanco la degradación es del 26% (Figura 15). Para el día octav o se

observa una degradación del 35-42%. Esta pérdida es menos eficiente a las obtenida por Gao et al., (2000) donde se observa que para este mismo tiempo, la especie Elodea canadensis ha reducido el 100% y 90% de los compuestos organofosforados malatión y demetón-s-metil. En el mismo estudio también se muestra la degradación a partir de las plantas Myriophyllun

aquaticum y Spirodela oligorrhiza del malatión, demetón-s-metil y rueleno en un 83%, 78%, 58% y 100%, 100%, 58% para las dos plantas respectivamente.


38

Concentración de Glifos ato en el tiempo

Co = 61,6 ppm

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

0 5 10 15 20 25 30

t iempo (días)

Gli

fosa

to (

pp

m)

C2

BC2

Figura 15: Degradación del glifosato en el tiempo en presencia o ausencia (BC1, BC2) de la

macrófita para la concentración inicial [61, 6 ppm]. Se muestran los promedios obtenidos para

las tres réplicas.

La may or degradación ocurre entre los 7 y 14 días. Se podría pensar que esto ocurre debido a la inducción de las enzimas de activ idad fosfatasa - tentativamente el complejo de enzimas organofosforo hidrolasa, OPH EC 3.1.8.1, propuesto por Gao et al., (2000) - aunque no hay suficientes evidencias para asegurarlo.

Actividad enzimática

En una inv estigación que se realizó de forma paralela con este trabajo (Gómez A., 2008a) se realizó la extracción de la enzima organofosforo hidrolasa (OPH, EC 3. 1.8.1) para reforzar más los resultados de este estudio. Estas plantas fueron introducidas en una solución de agua con una concentración patrón de glifosato para inducir la actividad enzimática y luego fueron

lavadas con alcohol e hipoclorito de sodio para inhibir la acción de microorganismos. Después de ser maceradas se pulv erizaron con nitrógeno líquido y luego se maceró de nuevo (Gómez A., 2008a).

Se realizaron 2 procedimientos de extracción diferentes, uno modificado a partir del procedimiento de Gao y colaboradores (2000) y otro modificado a partir del trabajo de Morita y colaboradores (1996). Los extractos fueron diluidos en una concentración conocida de glifosato y a intervalos de tiempo de 0, 40, 90 y 185 horas se tomaron a lícuotas de 2 ml que fueron inmediatamente derivatizadas y analizadas por espectofotometría UV. Se realizaron dos repeticiones y un control para cada caso (Gómez A., 2008a). Los resultados obtenidos con el extracto enzimático obtenidos por el trabajo mencionado (Gómez A. , 2008) muestran una degradación del glifosato mucho más acelerada y eficiente que la obtenida con el sistema de la macrófita de este trabajo (Ver tiempos de vida media). A tan solo 40 horas ya se había degradado el 93% del glifosato (Figura 16 – Enzima 1). Esta

acelerada degradación es bastante s ignificativa e interesante si se conoce la a ltís ima dosis


39

inicia l suministrada: 88±0. 00 ppm (n=2). Los resultados difieren s ignificativamente del control (AOV Medidas Repetidas, P=0,00 α=0,05) (Gómez A., 2008a)

Actividad enzimática

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

tiempo (h)

Co

nc

entr

aci

ón

Gli

fosa

to (

pp

m)

Enzima 1

Enzima 2

Control

Figura 16: Degradación del glifosato en el tiempo en presencia del extracto enzimático. ‘ Enzima

1’ corresponde al extracto obtenido bajo la metodología de Morita y colaboradores (1996).

‘Enzima 2’ corresponde al extracto obtenido bajo la metodología de Gao y colaboradores,

(2000). Se muestran los promedios obtenidos para 2 réplicas (Gómez A., 2008a) Con la inv estigación del extracto enzimático (Gómez A., 2008a) se puso en evidencia la alta actividad que puede deberse a la organofosforo hidrolasa (OPH) - enzima reportada por

Morita en la planta Spirodela oligorhiza - (Morita et al., 1996). Los resultados obtenidos apoyan la observ ación propuesta por Morita y colaboradores (1996) sobre la presencia de un amplio espectro enzimático OPH capaz de hidrolizar compuestos organofosforados. Aunque en la mayoría de los casos el cliva je ocurre en el ester fosfato de los compuestos organofosforados (P-O-C), en el g lifosato seguramente se da en el enlace C-P, debido a que éste no tiene un grupo ester (Gómez A., 2008a). Además del OPH, otras enzimas también pueden realizar la degradación de compuestos organofosforados, como mezclas de función oxidasa, monoxigenasa con flav ina, gluatión S-transferasa y carboxilesterasa (Edwards & Onen, 1998). Aunque no es posible saber específicamente qué complejo(s) enzimático(s) está(n) actuando sobre la degradación del glifosato, s i hay fuerte ev idencia de una relación de degradación directa entre la organofosforo

hidrolasa (OPH EC 3.1.8.1) o múltiples s istemas enzimáticos y el glifosato en macrofitas (Morita et al., 1996)

Tiempos de vida media

El tiempo de vida media (t1/2) obtenido para los dos casos de concentraciones diferentes de glifosato expuestos a la macrófita está entre 12 y 18 días, lo cual contrasta significativamente con el t1/2 de 1 día obtenido con el extracto enzimático (Figura 17) Por otro lado, el tiempo de vida media obtenido para el g lifosato y AMPA solos (Blancos) v aría entre 45 y 64 días, lo cual es una v ariación muy a lta (F igura 17). Esto es difícil de explicar en


40

vista de que este dato es una constante y no debería variar mucho entre métodos y mucho menos en un mismo modelo experimental. Aún así esta diferencia podría deberse a la diferencia en las concentraciones iniciales, como afirman Lund-Hoie K. & Friestad H.O., (1986), quienes v ieron que el tiempo de vida media del muestras de g lifosato en agua desionizada expuestas a luz UV variaba entre 4 días y de 3 a 4 semanas dependiendo de la concentración inicia l.

Método C0 K t1/2

[ppm] [h-1] [d] C1 27,47 0,002 12,3

BC1 27,44 0,001 44,5 C2 61,64 0,002 18,4

BC2 61,44 0,0004 64,3 Extracto enzimático 91,85 0,029 1,0

Figura 17. Tasas constantes de desaparición (k) y vida media (t1/2) de dos concentraciones de

glifosato expuesto a incubación con Egeria densa y al extracto enzimático de la misma planta.

BC1 y BC2 corresponden a los controles para las dos concentraciones iniciales analizadas. En el

caso de C1, el tanto k como t1/2 se obtuvieron con la concentración final del día 14 (Ct), debido a

que en este punto se alcanza e l límite de detección. Se incluy e el tiempo de vida media obtenido con el extracto enzimático (Gómez A., 2008a) Valores de tiempo de vida media similares a los obtenidos se han v isto pero en situaciones

muy diferentes. Para empezar, la mayoría de estudios que han analizado el tiempo de vida media del glifosato en el agua trabajan con concentraciones mil órdenes de magnitud menores (ppb). Además, la may oría utilizan muestras de agua tomadas de lagos, ríos, aguas subterráneas, aguas residuales, etc., lo cual implica presencia de microorganismos,

sedimentos, además de otros factores que le confieren al agua dureza, alcalinidad, y diferentes factores fisicoquímicos que pueden ay udar a explicar en conjunto las razones de degradación del glifosato y su cinética de desaparición. Este caso es diferente pues se utilizó agua purificada para asegurar en lo posible que se estuviera analizando específicamente la interacción entre la planta y el medio de agua con glifosato y así evitar la influencia de otros factores, que si bien podrían promover la cinética de degradación, le otorgarían ruido a los resultados y dificultarían su análisis. Sin embargo esta misma razón hace que haya una gran diferencia con lo que puede ocurrir en campo. Aún así no se puede ev itar la presencia de microorganismos, especialmente aquellos asociados a la planta, así ésta haya sido lavada dos veces y secada con papel absorbente antes de ser introducida en los erlenmeyers. Adicionalmente, la solución Hoagland suministrada al agua puede haber tenido efectos sobre la cinética de desaparición del g lifosato, especia lmente s i se tiene en cuenta que la molécula de este herbicida es bipolar dependiendo del pH del medio, que además el anión g lifosato tiene tres grupos químicos (amina, carboxilato y fosfonato) que se pueden unir fuertemente a cationes (Pearson, 1963) y que se ha comprobado su fuerte adsorción sobre gran cantidad de minerales (de Jonge et al., 2001). Sin embargo, en este experimento no se realizaron blancos que no estuv ieran bajo la presencia de la solución Hoag land lo cual habría sido interesante. Así, lo ideal habría s ido tener este otro tipo de

control sin la macrófita y sin la solución de Hoagland (es decir, solo agua esteril y una concentación conocida de glifosato) para poder dilucidar mejor el desempeño y la cinética de degradación del g lifosato bajo diferentes condiciones. Según Chen Y. y colaboradores (2007) la pérdida abiótica es una ruta importante en la disipación del glifosato en el ambiente. La hidrólisis del glifosato en un buffer estéril se puede


41

dar, aunque es muy lenta (Chen Y. et al., 2007). También puede haber fotodegradación pero el grado en que se da es incierto (Rueppel M.L. et al., 1977; Lund-Hoie K. & Friestad H.O., 1986). Así como algunos autores afirman que la degradación abiótica es casi nula o insignificativa otros difieren (Malik et al., 1989). También puede haber degradación fotoquímica cuy o efecto es transformar al glifosato en ortofosfato, el cual es responsable de la eutrofización en el agua (Chen Y. et al., 2007). En el caso de este estudio, hay una gran fuente de degradación abiótica, seguramente debido a fotodegradación, como se puede apreciar con mayor claridad en los sistemas BC1 y BC2, donde la macrófita no está presente, y por lo tanto la presencia de microorganismos es menor, teniendo en cuenta además que el agua estaba estéril, o es, al

menos mucho menor que en los otros sistemas.

Discusión general

Los resultados de este trabajo muestran la capacidad de la planta Egeria densa para fitoextraer

el glifosato del medio acuático, y los resultados del estudio paralelo realizado a partir de extractos enzimáticos (Gómez A., 2008) muestran la capacidad intrínseca de la planta para degradar el glifosato. Para ev aluar la posibilidad de utilizar esta planta en lagunas artificiales para el tratamiento de efluentes de aguas industriales, agrícolas o residuales, o en alguna fase

de una planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR); sería necesario conocer s i se trata finalmente de una fitoextracción o fitorremediación. Así mismo, no se recomienda el uso de Egeria densa en aguas naturales ni en sitios que estén cerca de cuerpos de agua debido a que, como ya se mencionó antes, se trata de una planta agresiva que invade rápidamente los sistemas acuáticos y excluye competitivamente otras especies reduciendo la biodiversidad de los lugares que coloniza, y sus densas ag lomeraciones monotípicas resultan en efectos drásticos sobre la calidad del agua. Sin embargo, su utilidad en sistemas controlados de fitorremdaición ex situ es bastante alta. Dicho lo anterior, utilizar a esta planta para procesos con fines ambientales puede llegar a terminar en un problema peor que el inicia l (algo así como fumigar con Roundup para

erradicar la coca). Por lo mismo se recomienda que se s igan haciendo estudios de este tipo con plantas menos agresivas que no comprometan la biodiversidad de los ecosistemas acuáticos, y que se utilice el Roundup y sus ady uvantes (CosmoFlux) en vez del glifosato por si solo. Por lo tanto se podrían ver los resultados de este trabajo más como un proyecto piloto que demuestra que es muy probable que las plantas acuáticas tengan los mecanismos necesarios para degradar el g lifosato, promoviendo así este tipo de investigación pero con otra especie, o mezcla de especies.

Conclusiones • La planta acuática Egeria densa resiste a ltas dosis (27 y 60 ppm) de glifosato en su

forma de ácido fosfonometil amino acético. • El Roundup S pectra resultó ser s ignificativ amente más tóxico que el glifosato en su

forma de ácido fosfonometil amino acético para la planta Egeria densa

• Los resultados obtenidos apoy an la observación propuesta por Morita y colaboradores (1996) sobre la presencia de un amplio espectro enzimático OPH capaz de hidrolizar compuestos organofosforados.

• Los resultados de este trabajo muestran la capacidad de la planta Egeria densa para desaparecer el g lifosato del medio acuático pero no se sabe s i la planta lo está acumulando o degradando.


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• Los resultados enzimáticos obtenidos en el estudio paralelo muestran la capacidad in

vitro de la planta para degradar el glifosato, pues con el extracto enzimático se observ ó una degradación del glifosato mucho más acelerada y eficiente que la obtenida con el s istema de la macrófita de este trabajo.

• No se recomienda el uso de Egeria densa en aguas naturales ni en sitios que estén cerca de cuerpos de agua debido a su activ idad como plaga.

Recomendaciones Habría sido muy interesante ver qué ocurre con la degradación del glifosato en el agua, s i en ésta se elimina la solución de fosfatos (KH2PO4) de la solución nutritiva Hoagland ya que según Gao y colaboradores, (2000) comúnmente la s íntesis de fosfatasas se induce en plantas que crecen bajo condiciones limitantes de fósforo. Si se hubiera realizado este análisis adicional y se ve en este una mayor cinética de desaparición del glifosato con respecto al s istema que contiene la solución Hoagland completa, se podría afirmar con mayor soporte que la

degradación s í está siendo realizada por la planta, posiblemente bajo la inducción de actividad enzimática fosfatasa. Otro paso que se quería realizar en este trabajo pero no se pudo por problemas técnicos con el HPLC, era sacar extractos de las plantas utilizadas en los montajes al final del experimento y ver si efectivamente el glifosato está siendo degradado, o si simplemente la planta lo está acumulando. Sin embargo, es necesario hacer énfasis en el carácter invasiv o de la planta Egeria densa, por lo cual se recomienda que se s igan haciendo estudios de este tipo con plantas menos agresivas que no comprometan la biodiv ersidad de los ecosistemas acuáticos, y que se utilice el Roundup y sus adyuv antes (CosmoFlux) en vez del glifosato por si solo.

Así mismo para el caso del Roundup sería interesante observar el desempeño de esta planta en conjunto con plantas que remedian surfactantes como Thypha latifolia y Lemna minor (Mo S.C. et al., 1989; Charpentier S. et al., 1987; Pignatello J.J. et al., 1985).

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