Cromatografia Líquida Acoplada àEspectrometria de Massas (Sequencial)

Técnicas de Ionização eAnalisadores de Massas

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química Campus da UFSM 97105-900 Santa Maria - RSProf. Dr. Renato Zanella e-mail: rzanella@base.ufsm.br

2011

Mass Spectrometry

2

LiquidChromatography Ionization Mass Analyzer

Detector/Data

Collection

•ESI•APCI•APPI

•Triple Quadrapoles•Ion-Traps•Hybrids

•Very important!•Many columns•Many solvent systems

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Em LCMS/MS (MRM) a intensidade do pico do analito é baixa se comparada a uma análise LCMS realizada no modo SIM (Single Ion Monitoring). No entanto, o LCMS/MS fornece maior sensibilidade que o LCMS devido à melhora significativa dos níveis de ruído com consequente aumento da relação sinal/ruído.

4

Mass Analyzers• Double Focusing Magnetic Sector• Quadrupole Mass Filter• Quadrupole Ion Trap• Linear Time-of-Flight (TOF)• Reflectron TOF• Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance

(FT-ICR-MS)

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Main Components of the LC-MS

Ion Optics Detector

Spray Chamber

⊕⊕⊕ ⊕⊕⊕

Mass Filter

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Triple Quadrupole ConfigurationQ1 Q2 Q3Q0

RF only Collision Cell

Scanning RF/DC

ScanningRF/DC

RF only

• Q1 and Q3 are standard mass filter quadrupoles.– The can scan masses sequentially (e.g. 50 to 500 amu)– The can be used to select a single mass.

• Q2 is an RF only quadrupole that is in a gas filled chamber. – Q2 is the “collision cell” where mass fragmentation occurs. – Q2 does not filter ions. It accepts all ion sent to it by Q1 and

passes all ions formed by collision to Q3 to be sorted.

QqQ

7

Ao realizar medidas dos íons (MS/MS automático ou íons específicos) no modo MRM, espectros de massa do íon precursor podem ser obtidos durante uma transição MRM. A estrutura do composto pode ser simultaneamente confirmada pelo espectro do produto resultante do íon devido à alta seletividade durante o MRM e sem a interferência de coeluição com outras substâncias.

Cromatograma de padrões de 226 pesticidas obtidos em 2 minutos.

8

500 transições MRM em um segundo

Medida simultânea de íons produzidos no modo MRM.

9

MRM = monitoramento de múltiplas reações(Multiple Reaction Monitoring)

MRM é também chamado de SRM (Selected Reaction Monitoring)

Q1 Q2 Q3Q0

RF only Collision

Cell

Scanning RF/DC

ScanningRF/DC

RF only

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API-Electrospray

GC/MS

ParticleBeam

APCI1000

100,000

10,000

Nonpolar Very polar

FABThermospray

Mol

ecul

ar W

eigh

t

Mass Spectrometry

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Mass Spectrometry

Terms and Definitions

Molecular ion / precursor ionIon formed by ionization of the analyte species

Fragment ions / product ionsIons formed by the gas-phase dissociation of the molecular ion

Relative AbundanceRelative Abundance is a measure of the relative amount of ion signal recorded by the detector

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13

Ionization Techniques

Gas-Phase Methods• Electron Impact (EI)• Chemical Ionization (CI)

Desorption Methods• Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)• Fast Atom Bombardment (FAB)

Spray Methods• Electrospray (ESI)• Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)• Atmospheric Pressure Photo-Ionization (APPI)• New dual sources (ESI/APCI) or (APCI/APPI)

GC

14

Electron Impact GC

15

Electron Impact

Advantages• Well-Established• Fragmentation Libraries• No Supression• Insoluble Samples• Interface to GC• Non-Polar Samples

Disadvantages• Parent Identification• Need Volatile Sample• Need Thermal Stability• No Interface to LC• Low Mass Compounds

(<1000 amu)• Solids Probe Requires

Skilled Operator

(low picomole)

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Chemical IonizationGC

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Chemical Ionization

Advantages• Parent Ion• Interface to GC• Insoluble Samples

Disadvantages• No Fragment Library• Need Volatile Sample• Need Thermal Stability• Quantitation Difficult• Low Mass Compounds

(<1000 amu)• Solids Probe Requires

Skilled Operator

(low picomole)

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Electrospray Ionization (ESI)

(Eletronebulização)

(up to 6 kV)

19

Electrospray

Ionization (ESI)

Typical ions produced by electrospray ionisation:

Positive mode:[M+H]+ protonated molecule[M+Na] +, [M+K] + … adducts[M+CH3CN+H] + protonated, + solvent adducts

Negative mode:[M-H] - deprotonated molecule[M+HCOO -] -, … adducts 20

Electrospray: Types of Ions Formed

• ESI can operate in either + or - mode.

Positive mode:– Best suited to basic drugs that form a stable HCl salt.

• [M+H]+ is the primary ion formed• [M+nH]n+ and [M+Na+]+ can also be formed.

Negative mode:– Best suited to acidic drugs that form stable Na salts.

• [M-H]-, [M-nH]n- and [M+I-]-

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++

Heated nitrogen dryinggas

Dielectric capillary entrance

Nebulizer (gas shown in red)

Solvent spray

Electrospray Ions

-4000 V

⊕⊕

⊕⊕ ⊕

⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕ ⊕ ⊕⊕ ⊕ ⊕

Evaporation RayleighLimit

CoulombExplosion

Evaporation Analyte Ion

API-Electrospray IonizationAtmospheric Pressure Ionization

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Increasing fragmentation with increasing cone voltage. The fragmentation obtained by in source fragmentation is useful for confirming a peak identity, getting structure information, improving selectivity, building libraries…

23

ESI = Ionização por eletronebulização à pressão atmosférica

1º) Bombeamento da amostra através de uma agulha nebulizadora;

2º) Aplicação de uma voltagem entre a agulha e o cone que a rodeia;

3º) Formação de uma nuvem de gotículas carregadas;

4º) Evaporação do solvente devido à presença de um dispositivo aquecido;

5º) Aumento da densidade de cargas na superfície das gotículas;

6º) Repulsão entre as cargas até os íons evaporarem das gotículas.

Electrospray Ionization (ESI)

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ESI

Advantages• Parent Ion• High Mass Compounds

(>100,000 amu)• Thermally Labile

Compounds (<0º C)• Easy to Operate• Interface to HPLC• Zeptomole sensitivity

with nanospray

Disadvantages• No Fragmentation• Need Polar Sample• Need Solubility in Polar

Solvent (MeOH, ACN, H2O, Acetone are best)

• Sensitive to Salts• Supression

(low femtomole to zeptomole)

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Atmospheric PressureChemical Ionization (APCI)

Solvent molecules (S) being protonated by the corona (SH+), thenreacting with the analyte molecule (M) to give the protonated form MH+.

Atmospheric Pressure Ionization

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Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

APCI = Ionização Química à Pressão Atmosférica

1º) Bombeamento da amostra através de um capilar;

2º) Vaporização do solvente e da amostra, por um dispositivo aquecido;

3º) Ocorre “descarga elétrica em coroa”;

4º) Ionização do solvente da fase móvel;

5º) Os íons formados reagem com as moléculas do analito.

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APCI

Advantages• Parent Ion• Insensitive to Salts• Interface to HPLC• Can use Normal Phase

Solvents• Handles High Flow Rates

Disadvantages• Need Volatile Sample• Need Thermal Stability

(high femtomole)

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Seleção da fonte:• Experiência do laboratório e o tipo de instrumento;

• ESI é mais frequentemente utilizada;• Facilidade do uso;• Robustez;• Seletividade para mais compostos

• APCI: • Máxima sensibilidade no modo íon positivo para compostos neutros;

• Para compostos de íon negativo que requer captura de elétron para ionização (nitratos)

APCI : N-metilcarbamatos, compostos neutros

ESI : • técnica preferida e menos propensa a degradação térmica• trabalha numa faixa mais ampla de compostos

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Principais Diferenças entre APCI e ESI• Mecanismo de Ionização:– Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kV) é aplicada a uma agulha de metal na saída do spray.– A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H]+ ou [MH]-

• Vazão da FM:– APCI tolera vazões na ordem de 0,2 a 2,0 mL/min, enquanto que ESI opera no máximo até1,0 mL/min.– ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos quanto 5 μL/min, compatível com acoplamentos capilares (μLC ou CZE).

• Fragmentação:– Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudo-moleculares.– APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta MM.

• Sensibilidade:– Sem ser uma regra, APCI tende a render melhor sensibilidade para solutos menos polares.

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ESI characteristicsSoft ionization method, provides molecular weight information.

Suitable for analyzing large bio- or synthetic polymers.

Suitable for analyzing polar and even ionic compounds.

Less fragmentation. APCI characteristics

Provides molecular weight information.

Suitable for analyzing less polar compounds compared to ESI.

Increased fragmentation compared to ESI.

MALDI characteristicsSoft ionization method, provides molecular weight information.

Suitable for analyzing very large bio- or synthetic polymers.

Suitable for analyzing polar and even ionic compounds.

Less fragmentation.

Ionisation Techniques

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ESI e APCI

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Priority pollutant PAHs in surface and drinking water by LC/APPI/MS-MS

Two specific transitions per compound were selected for simultaneous monitoring in SRM mode.

LC-MS/MS SRM chromatograms of a standard solution (100 μg L-1; 1000 μg L-1 for Naphth, Fluor)

The photoionization mechanism is simplified under vacuum conditions: photon absorption by the analyte molecule, leading to electron ejection, forming a molecular radical cation M.+

Atmospheric pressure photoionization (APPI)

Photoionization

Benefits of Photoionization� Ionizes wide range of compounds (e.g.,

non-polars, electronegative cpds, etc.)� Predominantly parent ion signal� Minimum fragmentation� Minimum solvent signal� Minimum ion suppression� Signal linear with concentration

H2O, CO2, O2, N2

Ionization potential

Drugs

Chemicalweapons

Aromatics

MeOH, AcCN, chloro-solvents

Solvent (S) Analyte (A)

Ener

gy [e

V]

IP

IP

AA++

SS

[A[A--m]m]++ + m+ m

Fragmentation

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APPI Source

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Direct APPI vs. Dopant-assisted APPIDirect APPI

M + hv → M+ + e-

M+ + S → MH+ + S[-H]

Dopant APPI

D + hv → D+ + e-

D+ + M → MH+ + D[-H]D+ + M → M+ + D

Analyte molecule M is ionized to a molecular radical ion M+. (If analyte ionization potential is below photon energy)

In the presence of protic solvents, M+ may abstract a hydrogen atom to form MH+.

A photoionizable dopant is delivered in large concentration to yield many D+ ions.

D+ ionizes analyte M by proton or electron transfer.

This is PI-initiated APCI35 36

Which is Best ionization source?

• It depends on the exact application.• Increasing polarity and molecular weight and thermal

instability favors ESI.• Most drugs of abuse are highly polar and are easily

analyzed using ESI.• High molecular weight proteins also require ESI• Lower polarity and molecular weight favors APCI or APPI.• Lower background, but compounds must be more

thermally stable.

37

Fast Atom Bombardment (FAB)

38

FAB

Advantages• Parent Ion• High Mass Compounds

(10,000 amu)• Thermally Labile

Compounds (R.T.)

Disadvantages• No Fragment Library• Solubility in Matrix (MNBA,

Glycerol)• Quantitation Difficult• Needs Highly Skilled

Operator• Relatively Low Sensitivity

(nanomole)

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Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

http://www.noble.org/PlantBio/MS/ion_tech_main.html 40

MALDI

Advantages• Parent Ion• High Mass Compounds

(>100,000 amu)• Thermally Labile

Compounds (R.T.)• Easy to Operate

Disadvantages• No Fragment Library• Wide variety of matrices• Quantitation Difficult

(low femtomole)

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Data Acquisition ModesSIM vs SRM

Ø Selected-Ion MonitoringIf the analysis aims at detecting target compounds of known

spectral characteristics with maximum sensitivity

Ø Selected-Reaction MonitoringDetection of selected reactions, based on the decomposition

reactions of ions that are characteristic of the compounds to be analysed

Three Acquisition Modes:

Ø ScanningComplete spectra are repeatedly measured between two

extreme masses

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Double-Focusing Magnetic Sector

http://www.asms.org

Advantages• Very High Resolution (60,000)• High Accuracy (<5 ppm)• 10,000 Mass Range

Disadvantages• Very Expensive• Requires Skilled Operator• Difficult to Interface to ESI• Low resolution MS/MS without

multiple analyzers

Analisadores

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Analisador Quadrupolar (Q)• Analisador de varredura• Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqüência entrepares, permitindo que apenas um íon atinja o detector de cada vez

Analisadores

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*

*Negative Rods

Positive Rods

Positive Rods

Filtering High Mass

Filtering Selected Mass

Filtering Low Mass

M+

M+

M+

How Does a Quadrupole Mass Filter Work?

Filters out all m/z values except the one it is set to passObtains a mass spectrum by sweeping across the entire mass range

Analisadores

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MS/MS with Triple QuadrupolesThe analyser of a “triple quad” instrument consists in two quadrupoles, separated by a collision cell. Such a configuration is often referred as a "tandem in space" instrument. Precursor ions and product ions are created and analysed in different physical spaces.

A triple quad instrument can be used in various ways, which are represented on the next figure. The firsts two experiments are in fact using the triple quad in a single quadrupole mode

Analisadores

46

MS/MS with Triple Quadrupoles

- The first quad (Q1) is set to pass one ion of interest- The second quad (q2) is set to pass all ions and is flooded with a collision gas to fragment the

parent ion present (collision induced dissociation or CID)- The third quad (Q3) obtains a daughter ion spectrum by sweeping across the desired mass range

Analisadores

47

• Os íons são acelerados para aumentar a energia cinética e passar em uma câmara com o gás de colisão.

Usa-se, geralmente: Ar para o Triplo Quadrupolo

He para a Ion Trap

• o uso da fonte CID tem desvantagens importantes, como a dificuldade prática de funcionamento na voltagem ótima de fragmentação para todos compostos em um método multirresíduo.

• As desvantagens podem ser resolvidas trabalhando com MS/MS Sequencial pelo uso do Triplo Quadrupolo ou sistemas Íon Trap porque a voltagem usada pode ser mais baixa ou semelhante para todos os compostos e o número de fragmentos produzidos pode ser controlado por um bom ajuste do MS/MS para especificar a fragmentação e produzir espectros simples.

CID = Dissociação induzida por colisão Analisadores

48

Analisadores

49

Analisadores

50

Advantages• Inexpensive• Easily Interfaced to

Many Ionization Methods

Disadvantages• Low Resolution (<4000)• Low Accuracy (>100 ppm)• MS/MS requires multiple

analyzers• Low Mass Range (<4000)• Slow Scanning

Quadrupole Mass Analyzer/FilterAnalisadores

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Ion-Trap Analyzer

• Acúmulo de íons no interior de um campo quadrupolar 3D;

• Liberação controlada de íons de diferentes massas;

• Permite realizar MSn

Analisadores

52

Ion-Trap Analyzer

MS

MS/MS

53

Advantages• Inexpensive• Easily Interfaced to

Many Ionization Methods

• MS/MS in one analyzer

Disadvantages• Low Resolution (<4000)• Low Accuracy

(>100ppm)• Space Charging

Causes Mass Shifts• Low Mass Range

(<4000)• Slow Scanning

Quadrupole Ion TrapAnalisadores

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Espectrômetros de Massas em Sequência (MS/MS)

• Podem ser de dois modos:

• Consecutivos no espaço usando dois espectrometros separados;

• Sucessivos no tempo usando a mesma massa no sistema mais de uma vez (ion trap)

• A técnica permite a medida de fragmentação de um pico selecionado em um espectro de massa que produz o espectro de massas do íon precursor;

• A informação é aumentada com a combinação de dois MS;

Analisadores

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Linear Time-of-Flight (TOF)

Advantages• Extremely High Mass Range (>1 MDa)• Fast Scanning

Disadvantages• Low Resolution (4000)• Low Accuracy (>200 ppm)• MS/MS not possible

• íons são produzidos em pulsos e acelerados em alta velocidade por um campo elétrico num tubo de deslocamento.• a distância da origem até o detector é fixa,

• o tempo que o íon leva para atravessar o analisador é inversamente proporcional a sua velocidade

Analisadores

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Reflectron Time-of-Flight (TOF)

Advantages• High Resolution (>20,000 in some models)• High Accuracy (<5ppm)• 10,000 Mass Range• Fast Scanning

Disadvantages• Low Resolution for MS/MS

Analisadores

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Z-sprayíon souce

Hexapoleíon bridge

Quadrupole Hexapolecollision cell

MS-MS

Reflectron

QUADRUPOLE MS TOF MS

Sistema Q-TOF/MSCombinação de um MS Quadrupolo com um analisador TOF

• Espectros de massas contínuos “full-scan” tornam o MS/MS Q TOF mais sensível (10 - 100 vezes) que os Quadrupolos em sequência;

• TOF e o MS/MS Q TOF tem a mesma sensibilidade no modo scan e no modo de seleção do íon;

• A maior capacidade do MS/MS Q TOF comparado com instrumentos Triplo Quadrupolo e MS/MS Íon Trap está na sua habilidade para determinar massas precisas nos fragmentos de íons gerados na cela de colisão.

Algumas características do Q-TOF/MS

Analisadores

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O ESPECTRO DE MASSAS

• Espectro de massas = diagrama da intensidade relativa dos picos em função das razões massa-carga.

9Pico base = pico com a intensidade mais alta, arbitrariamente assinalada em 100. Em LC-MS o pico base geralmente é a molécula protonada e corresponde ao íon positivo mais estável;

5Íon molecular = é o pico de maior razão massa-carga e representa o peso molecular do composto.

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The API Mass SpectrumElectrospray (ESI) and APCI are both API (atmospheric pressure ionisation) techniques and produce a soft ionisation. Thus, the MS spectra obtained with API ionisation will consist mainly of the "molecular" ions, unless fragmentation techniques are applied. The possible fragmentation techniques are in source CID (collision induced dissociation), CID in the collision cell of a tandem type instrument, fragmentation in an ion trap. This is very different from the spectra obtained with EI (electron impact ionisation).

sulfamethazine spectrum Negative ESI mass spectrum for glucose, with chloride adducts. 60

Operating conditionsEluent: the mobile phase must be suitable for ionisation. If it is not the case, a small amount of modifier can be added, in order to generate the solvent gas phase ions.

Buffers: buffers must be volatile.

• Tampões voláteis (ex. Formiato de amônio)concentração do tampão, ácido ou base usado para ajustar o pH deveriam ser o mais baixa possível (0,1%);

Substitute phosphates, sulfates, and borates with ammonium acetate or formate, trifluoroacetic acid (TFA), heptafluorobutric acid (HFBA), tetrabutylammonium hydroxide (TBAH)

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Choosing Between Ionization TechniquesGeneral rules can be given to chose between ESI, APCI, or EI.ESI is preferred for compounds which are ionic or very polar or thermo labile, or with masses higher than 1000…APCI is preferred for compounds which are not very polar.If we take the example of pesticides, we can rule out that: polar pesticides will be in ESI, less polar in APCI, volatiles in APCI, non polar better done with GC/EI

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Mass DefinitionThe mass spectrometer measures the exact mass. Looking at the below mass spectra, the most abundant peak is at 221.95 (top) and 219.81 (bottom). These spectra are obtained with positive ionisation (top) and negative ionisation (bottom). The peaks correspond to the protonated or deprotonated molecule.

If we look for the molecular mass of the chloridazon pesticide, we can find various values in the spectra1.221.6379: this is the average mass. It is based on the average atomic masses. 2.221: this is the nominal mass, calculated on the nominal mass of the most abundant isotopes 3.221.0278: this is the exact (or monoisotopic) mass, based on the exact mass of the most abundant natural isotopesThe value is slightly different from the expected 222.0278 and 219.0278 because these spectra were obtained with a quadrupole instrument, which does not provide sufficient mass resolution and mass accuracy for obtaining the exact mass.The next smaller peaks correspond to the C13 and Cl37 isotopes.

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Benzoylurea pesticides ESI -

64

Organophosphorus ESI +

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Carbamate analysis by LC/MSColumn: Ultra Carbamate, 100 x 4.6 mm, 3 µm Conc.: 100 µg/L eachMobile Phase: A: 90:10 water:methanol + 10 mM ammonium formate

B: 10:90 acetonitrile:methanol + 10 mM ammonium formateGradient: 90:10 A:B to 10:90 A:B from 0-15 min.Flow-rate: 0.25mL/minMode: ESI+

66mass/charge

abundance

Base Peak: most abundant ion in spectrum

[M + H]+

Psuedomolecular ionor Quasi-molecular ion

A + 1A + 2

from naturally occurring isotopes{

Mass Spectra

67

Comparação entre instrumentos MS/MSInstrumento Sensibilidade

em full scanSeletividade Exatidão Faixa

dinamicaCaracterísticas

Triplo quadrupolo baixa alta baixa alta Perda Neutra

MS/MS Ion trap alta alta baixa média MSn

LC/TOF/MS alta média alta média Massa exta e sensibilidade

LC/QTOF/MS média alta alta média Massa exata dos fragmentos

Instrumento Características Vantagens Desvantagens

Q-TOF MS/MS Massa exata dos fragmentos de íons

Muito sensível em MS/MS para quase todos íons precursores selecionados

Full scan do íon precursor

Muito caroNão é possível perda neutra

Triplo Quadrupolo MS/MS

Perda Neutra Sensível para quantificação no modo MRM Não dá a massa exata

Quadrupolo Ion Trap MSn Sensível no scan de fragmentos facilmente deduziveis

Não é possível Perda Neutra e

MRM

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Seletividade superior em LC-MS comparada com LC-UV

Será a técnica LC-TOF-MS a melhor solução?

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Figures of Merit for Mass Analyzers

Type m/z range Resolving Power CostDouble Focusing 2-5000 20,000 $$$$Single Focusing 1-1400 1500 $$$

Quadrupole 1-4000 1000 $$Ion trap 10-4000 1000 $$Time of flight 1-100,000 30,000

$$$Fourier Transform 18-10,000 >100,000 $$$$

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Development of Methods for the determination of cyanotoxins in surface and drinking water by using SPE and LC/MS-MS

LC/MS/MS SRM chromatograms of a standard solution of MC-RR, MC-YR, MC-LR, MC-LA and NOD (20 mg/L)T. Triantis et al., Toxicon, 2010, 55, 979-989

71

LC–MS/MS analyses of strigolactones in root exudates

Yoneyama K et al. Plant Cell Physiol 2010;51:1095-110372

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Water soluble vitaminsLC-MS/MS

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Sistemas de LC-MS