UFMS/CCBS - DEPARTAMENTO DE MORFOFISIOLOGIA AULA PRTICA 3 REAES DE COLORAO E PRECIPITAO DE PROTENAS Prof Dr Fabiana Fonseca Zanoelo Reao de precipitao A solubilidade de uma protena muito varivel e depende da distribuio e da proporo dos grupos polares (hidroflicos) e de apolares (hidrofbicos) na molcula. Muitas protenas so solveis em gua ou solues salinas. Como uma protena possui muitos grupos carregados positivo ou negativamente provenientes das cadeias laterais dos aminocidos, as molculas iro interagir uma com as outras, com pequenos ons de cargas opostas e com a gua. Assim, ocorrem interaes protena-protena, protena-pequenos ons e protena-gua. Se a interao protenagua pequena, a protena tender a ser insolvel. Por outro lado, se a interao protena-gua alta, a protena tender a ser solvel. Qualquer condio que aumente a interao protena-gua, aumentar a solubilidade e vice-versa. A desnaturao, geralmente, diminui a solubilidade das protenas. As protenas possuem uma estrutura tridimensional especfica que est relacionada com suas propriedades fsicas e biolgicas. A modificao na estrutura tridimensional nativa de uma protena conhecida como desnaturao. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas secundria, terciria e quaternria mas no da primria. Existem vrios agentes desnaturantes de protenas, tais como: calor, alclis, solventes orgnicos, uria, detergentes, sais de metais pesados, etc. A diminuio da solubilidade pode ser explicada pela exposio de radicais hidrofbicos que prejudicam a interao protena-gua e favorece a interao protena-protena. A floculao e a coagulao so manifestaes visveis das alteraes estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. As reaes de precipitao com desnaturao, alm de serem utilizadas para caracterizar a presena de protenas em soluo, tambm so teis para promover a desproteinizao de lquidos biolgicos para anlise de componentes no proticos. Reativos Soluo de protena cido tricloroactico (TCA) a 10% (ou cido sulfossaliclico) Acetato de chumbo a 5%

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1) Precipitao pelo calor O calor pode desnaturar a maioria das protenas, pois a agitao trmica afeta as interaes que estabilizam a estrutura tridimensional das protenas, como, por exemplo, as pontes de hidrognio. Tcnica (2 tubos- 1 para leite e outro para a clara de ovo) Em um tubo de ensaio colocar 2mL da soluo de protenas e aquecer diretamente na chama. Observar e explicar. 2) Precipitao por reagentes para alcalides Os reagentes para alcalides so cidos que alm de precipitarem alcalides tambm podem combinar-se com as protenas que possuem cargas positivas e quando pH da soluo estiver igual ao ponto isoeltrico da protena, forma-se complexos insolveis. Exemplos destes compostos so: cido pcrico, cido sulfossaliclico, cido tricloroactico, etc. Por exemplo, a reao de protenas com tricloroactico leva formao de um tricloroacetato de protena, que insolvel. Tcnica (2 tubos- 1 para leite e outro para a clara de ovo) Em um tubo de ensaio colocar 1mL da soluo de protenas e 1mL de TCA 10% (ou cido sulfossaliclico). Observar a formao de um precipitado branco. Explicar. 3) Precipitao por sais de metais pesados Em pH situado no lado alcalino do seu pI, algumas protenas combinam-se com ctions de metais pesados, formando proteinatos insolveis. Tcnica (2 tubos- 1 para leite e outro para a clara de ovo) Em um tubo de ensaio colocar 1mL da soluo de protenas e 1mL de acetato de chumbo a 5%. Observar a formao de um precipitado. Explicar. 4) Reaes de precipitao sem desnaturao As protenas podem ser precipitadas sem desnaturao por ao de solventes orgnicos, variaes do pH e por alteraes da fora inica do meio. Efeito da fora inica sobre a solubilidade das protenas A capacidade de sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas uma funo da fora inica que tanto depende de sua concentrao como da valncia de ctions e nions que formam o sal.

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Em concentrao reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas protenas, um fenmeno denominado salting-in . Provavelmente isto ocorre devido interao da protena com os sais, causando diminuio da interao protena protena e, portanto, aumentando a solubilidade. Em altas foras inicas, conseguidas pela adio de grandes quantidades de um sal muito solvel, como por exemplo, o sulfato de amnio a uma soluo de protenas, pode ocorrer a remoo da gua de hidratao das molculas, o que leva a predominncia da interao protena protena, resultando em precipitao. Esse efeito denominado salting-out . Misturas complexas de protenas podem ser separadas por este processo uma vez que a concentrao de sal necessria para precipitar diferentes protenas varivel. Exemplo: Efeito da fora inica sobre a solubilidade da albumina. Reativos Clara de ovo in natura Cloreto de sdio 1N Soluo saturada de sulfato de amnio. Tcnica a) SOLUBILIZAO (salting-in) Pipetar 2 mL de clara de ovo em um bquer. Diluir com gua destilada, mexendo com basto de vidro, at notar o aparecimento de um precipitado (globulinas). Adicionar, em seguida, soluo de cloreto de sdio, de 2 em 2mL, at a redissoluo do precipitado. Essa redissoluo se deve restaurao da fora inica original e corresponde ao fenmeno de salting-in. b) PRECIPITAO (salting-out) Pipetar 2mL da soluo obtida na experincia anterior em um tubo de ensaio. Adicionar, a seguir, 5mL de soluo saturada de sulfato de amnio e observar a formao de precipitado de protenas (globulinas), o que corresponde ao fenmeno de salting-out. Juntar a seguir 5 a 10mL de gua destilada a fim de recompor a fora inica anterior e em consequncia redissolver o precipitado.

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