CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE QUÍMICAUNIDADE RIO DE JANEIRO

COORDENAÇÃO DE BIOTECNOLOGIA

BIOQUÍMICA (Laboratório 318)

PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS

Material por grupo:

12- Tubos de ensaio que caibam na centrífuga clínica !!!2- Pipetas de 2 mL3 -Pipetas de 5 mL1- Pipeta de 10mL2- Pró-pipetes1- Banho maria (100o C)15 mL de Solução de (NH4)2SO4 60% p/v em um becker10mL de Solução de uréia 8M em um becker50mL de Solução tampão fosfato (PBS) pH 7,4 em um beckerAmostras de proteínas:

20mL de Ovoalbumina (clara de ovo diluída em PBS 1:25 v/v) em um becker20 ml de Caseína (diluída em PBS 1 mg/mL) em um becker

Material na capela: Acetona na Capela com 1 pipeta de 5 mL e 1 pró-pipete.Solução de TCA (ácido tri-cloro-acético) 12,5 % p/v com 1 pipeta de 5 mL e 1 pró-pipete.

Método:

1. Transfira, com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções de proteína para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo:

Tubo no Ovoalbumina caseína ensaio

1 4 mL Efeito da temperatura

2 4 mL Efeito da temperatura

3 2 mL Efeito de solventes orgânicos

4 2 mL Efeito de solventes orgânicos

5 1 mL Efeito de altas concentrações salinas

6 1 mL Efeito de altas concentrações salinas

7 2 mL Efeito de ácidos fortes

8 2 mL Efeito de ácidos fortes

9 2 mL Efeito de agentes caotrópicos

10 2 mL Efeito de agentes caotrópicos

Obs.: Anote o aspecto de cada amostra antes e depois da realização de cada um dos ensaios!

2. Efeito da temperatura: leve os tubos 1 e 2 ao banho-maria fervente por 10 minutos; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

3. Efeito de solventes orgânicos: utilizando a capela, transfira 2 mL de acetona para os tubos 3 e 4, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

4. Efeito de altas concentrações salinas: transfira 4 mL da solução de (NH4)2SO4 para os tubos 5 e 6, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

5. Efeito de ácidos fortes: utilizando a capela, transfira 2 mL da solução de TCA para os tubos 7 e 8, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

6. Efeito de agentes caotrópicos: transfira 2 mL da solução de uréia para os tubos 9 e 10, homogeneizando-os; observe os resultados (aspecto da amostra) e reserve o material.

7. Após a conclusão dos ensaios, separe os tubos que sofreram alterações. Esses tubos deverão ser tarados (use a balança), e posteriormente centrifugados a 3000 RPM por 5 minutos em uma centrífuga clínica.

8. Oberve os resultados. Separe os tubos onde houve formação de um precipitado (“pellet”), descartando o seu sobrenadante cuidadosamente para que não haja ressuspensão do “pellet”.

9. Adicione 6 mL da solução tampão fosfato (PBS) aos precipitados, com auxílio do vortex, homogeize-os procurando ressolubilizar o “pellet”.

Relatório:Deve ser feito seguindo-se o roteiro de confecção de relatórios vigente.Organize seus resultados em uma tabela.Não esqueça de discutir o motivo das diferenças entre os resultados obtidos com a

amostra de caseína e de ovoalbumina, qual o mecanismo de ação de cada um dos agentes físico-químicos utilizados e por que houve a ressolubilização do “pellet” em alguns ensaios e noutros não