Técnicas imunológicasTécnicas imunológicasValdirene Leão

Interações Ag-Ac secundárias

PRINCÍPIOS BÁSICOS

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO –Í ÁPRINCÍPIOS BÁSICOS

• As reações de aglutinação baseiam-se na formação de agregados/ aglomerados resultantes da interação Ag-g g g ç gAc, que ocorre em zona de equivalência, quando pelo menos um desses componentes está na forma particuladaparticulada.

• Pode ocorrer tanto com partículas que apresentam Pode ocorrer tanto com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (ex.: hemácias, bactérias, vírus), como em partículas i t ( lát f lá ti ) él l inertes (ex.: látex, esferas plásticas ) ou células que são recobertas com uma das moléculas, mais comumente o Ag.m m g

Tipos de Reações de AglutinaçãoTipos de Reações de Aglutinação

l i ã Di Ti í i • Aglutinação Direta: Tipagem sanguínea e sorotipagem bacteriana;

• Teste de Inibição da Aglutinação Direta: Rubéola, Influenza Enterovírus Influenza, Enterovírus ...

• Aglutinação Indireta ou Passiva: • Aglutinação Indireta ou Passiva: Hemácias: Toxoplasmose, Chagas ...Lát x: F t um tóidLátex: Fator reumatóideMicropartículas de Gelatina: Anti-HTLV

Teste de Aglutinação PassivaTeste de Aglutinação Passiva

HemaglutinaçãoHemaglutinação

Uso comum da aglutinação:Uso comum da aglutinação:

Tipagem sanguínea por aglutinaçãoTipagem sanguínea por aglutinação

Aglutinação do látex (Prot C Reativa)Aglutinação do látex (Prot. C Reativa),

Diagnósticos indiretos de infecçãog ç

Detecção de componentesVDRL - Venereal Disease Research Laboratory - usada para detectar Ac reativo no teste de sifilis . “False positive test -- such as HIV, Lyme disease, mycoplasma pneumonia, malaria, and systemic lupus erythematosus. Therefore, thispneumonia, malaria, and systemic lupus erythematosus. Therefore, this screening test if found to be positive must be confirmed by a more specific test for syphilis such as FTA-ABS.”

Floculação – Antígenos cardiolipínicos – suspensão de cristais de Colesterol-cardiolipina.RPR – Antígenos cardiolipínicos adsorvidos em partículas de carvão.

http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/std/vdrl.html

Detecção de componentesTPPA (Treponema Pallidum Particle-Agglutination) test,

Particulas de gelatina com antigenos treponêmicos são aglutinados por anticorpos em soros positivos. p p p

http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/std/tpha.html

Reações de Precipitação

10

• Complexos moleculares gerados a partir da interação de Ag solúveis com Ac específicos tendem a precipitar em um determinado meio.

• Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se• Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se observa a formação do precipitado, o que só é possível se o Ac e o Ag interagirem.

• Técnicas utilizando a precipitação em meio líquido são raramente utilizadas (e somente em pesquisa) para verificação da resposta deutilizadas (e somente em pesquisa), para verificação da resposta de um animal a um dado antígeno solúvel.

• Algumas técnicas foram desenvolvidas a partir da observação de que Ag - Ac precipitam em meio semi-sólido, tipo gel (em geral de

)agarose).Ex: - Imunodifusão dupla

- Imunodifusão radial11

Imunodifusão radial - Imunoeletroforese

Curva de EquivalênciaÉ importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac

em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo:

+ - -Anticorpo livre ++- -

Anticorpo livre

Antígeno livre

100%--

Percentual delcomplexo

imuneprecipitado

Zona de excessode anticorpo

Zona de equivalência

Zona de excessode antígeno

12Quantidade de antígeno adicionado

Imunodifusão simples radialImunodifusão simples radial

• O Ac é incorporado ao págar e colocado em uma placa deem uma placa de Petry.

é f• No centro é feito um orifício e nele é colocado o Ag a ser testado.a ser testado.

I dif ã i l di lImunodifusão simples radial

Imunodifusão radialImunodifusão radial

Um exemplo de sua utilização: dosagem de imunoglobulinas numa placa disponível nomercado.

Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados

Halo de precipitaçãoIgG – anti-IgGIgG – anti-IgG

Agarose contendo anticorposanti IgG humana PLACA PARA DOSAGEM DE I G HUMANAanti-IgG humana PLACA PARA DOSAGEM DE IgG HUMANA

NefelometriaNefelometria

É d d d d d l d f• É uma medida da dispersão de luz de uma fon-te luminosa. Em soluções diluídas, a reação de

ã í precipitação entre antígeno e anticorpo pro-duz um aumento da reflexão que pode ser me-d d l d ã d l ddido pela dispersão de uma luz incidente.

• Ex: Igs Complemento proteínas séricasEx: Igs, Complemento, proteínas séricas...

NefelometriaNefelometriaRaios de uma fonte de luz de alta intensidade são dirigidos por lentessão dirigidos por lentes focalizadoras.Passam através da amostra contendo o complexo Ag-Ac. Raios que emergem numque emergem num ângulo de 70° são dirigidos por outra lente para o detectorpara o detector eletrônico e o sinal pode ser matematicamente relacionado com arelacionado com a concentração de Ac ou Ag da amostra.

Nefelometria/TurbidimetriaNefelometria/Turbidimetria

I õ A A Interações Ag-Ac

primáriasprimárias

Í ÁPRINCÍPIOS BÁSICOS

Imunofluorescência

IMUNOFLUORESCÊNCIAIMUNOFLUORESCÊNCIA

Detecção de componentesç pImunofluorescencia - usada para detectar Ac reativo no teste de sifilis

FTA ABS Fl t T l A tib d Ab ti T tFTA-ABS = Fluorescent Treponemal Antibody Absorption Test

(Treponema pallidum)http://www.dasit.it/DISEASE/autoimmunita/others.html

Radioimunoensaio

ELISA – PRINCÍPIOS BÁSICOSELISA PRINCÍPIOS BÁSICOS• O ELISA é um teste para identificação e quantificaçãode Ag ou Ac presentes em amostras e fluidos biológicos(como soro ou saliva).

• Seu princípio está baseado numa interação primária Ag-Ac visualizada através de uma reação enzimáticaAc, visualizada através de uma reação enzimática.

•A reação ocorre em meio líquido e a atividade enzimáticaé proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra.

A enzima converte um substrato incolor em produto• A enzima converte um substrato incolor em produtocolorido ou o substrato alterado pela enzima induzirámudança de cor de uma substância indicadora. A leituramudança de cor de uma substância indicadora. A leituraé realizada num fotocolorímetro.

ELISA PRINCÍPIOS BÁSICOSELISA – PRINCÍPIOS BÁSICOS

• O teste é, geralmente, realizado em placas plásticas demicrotitulação de fundo chato, com 96 poços, dispostosem 12 colunas de 8 poços, marcadas lateralmente e naparte s perior da placaparte superior da placa.

Cont. negativoCut-off

Nos poços são colocadas concentrações adequadas de

Cut offCont. positivo

• Nos poços são colocadas concentrações adequadas deAg ou de Ac no suporte sólido. Adiciona-se a amostra aser testada e reagentes, Ag ou Ac, conjugados comser testada e reagentes, Ag ou Ac, conjugados comenzimas.

ELISA “SANDWICH”

Outros componentes do soro

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Anticorpo conjugado

TMB

Enzima Peroxidase

ELISA DE CAPTURA

Anticorpo anti-IgM

IgM a ser detectada

IgM inespecífica

Antígeno biotinilado

TMB

ST-AV- Peroxidase

ELISA INDIRETA

Antígeno purificado IgM a ser detectada

IgM inespecífica

Anticorpo conjugado

TMB

ELISA

Quantificação de Ag/Ac em ELISA:

ELISA por competição1. Placa de Elisa revestida com Ac específico

2. Adição de Ag-teste:

Adição de Ag-marcado:

Competição para ligar Ac

3. Lavagem para retirada de excesso de Ag

4. Quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida

Equipamento automátco para realização de “ELISA” modelo “Eti-star” da “Diasorin”

Equipamento automático paraEquipamento automático para realização de “ELISA”, modelo “

Magia”, da “Merck”

E a quimioluminescência?E a quimioluminescência?

• Quais são os elementos mais utilizados?

Quimioluminescência

http://www.chm.uri.edu/chempeople/ebotonjicdir/luminol.html

Na quimioluminescência

O substrato quimioluminescente sofrehidrólise na presença da enzima,p ç ,produzindo substâncias instáveis queculminam com emissão de luzculminam com emissão de luz.

Inicio como no Ensaio Imunoenzimático Convencional

IMUNOQUIMIOLUMINESCENCIA

Lavagem para retirada de Ag não

Inicio como no Ensaio Imunoenzimático Convencional

fixado:

Adição de Ac monoclonal, anti-Ag i d j d à ipesquisado, conjugado à enzima .

O conjunto é incubado

Lavagem para retirada de Ac conjugado à enzima, não fixado

Adição de substrato da enzima

O substrato quimioluminescente sofrehidrólise na presença da enzimahidrólise na presença da enzima,produzindo substâncias instáveis queculminam com emissão de luz

O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente (p.ex.:AMPPD).A substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança dopH e da concentração do meio (éster de acridina) ou ainda um elemento, comopor exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica nofinal da reação, culminando com a emissão de luz. A imunoluminescência podeatingir uma sensibilidade de 10-15 a 10-16g.

Quimioluminescência

http://www.chm.uri.edu/chempeople/ebotonjicdir/luminol.html

Imunocromatografia g

http://webdb dmsc moph go th/ifc nih/a nih 2 003c asp?info id=438http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/a_nih_2_003c.asp?info_id=438

Padronização de DOT-ELISABruceloseBrucelose

“Western Blotting”O desenvolvimento do teste (como exemplo: detecção de anticorpos anti – HIV em soro):

Vírus HIVsoro):

As proteínas do vírus HIV são dissociadas em SDS

Separação dos Ag por - +

35 68 45 12

eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

- +

Os Ag são eletrotrasnferidos para o papel de nitrocelulose, onde reagirão com os Ac do soro do pacientep

O SDS (dodecil sulfato de sódio) é um detergente!

Ac anti-Ig humana, ligado a enzima, detecta as proteínas produzindo um produto final que reagirá com o cromógeno

95 45 24

que reagirá com o cromógeno adicionado !

Os equipamentos necessários:Os equipamentos necessários:Resultado de um testepara HIV:para HIV:

160

PM(KDa)

41

fontes de corrente contínua e cubas uti-

(KDa)24

fontes de corrente contínua e cubas utilizadas para a transferência eletroforética Análises ---------- CP CN Teste

Mini “bloter”Mini bloter

http://www.immunetics.com/products/miniblotters/minijpeg%20copy.jpg

http://myhome.naver.com/biologian/western_blot.jpg

htt // bi / i t/U l dFil /200408/20040803130738478 if

p y g _ jpg

http://www.fermentas.com/techinfo/electrophoresis/img/blotting.gif

http://www.bioon.com/experiment/UploadFiles/200408/20040803130738478.gif

Fundamento e técnica do Southern Blot

http://www.bio.miami.edu/dana/250/southern.jpg

O QUE ACONTECE COM O Európio?O QUE ACONTECE COM O Európio?

Elemento muito utilizado na imunofluorimetriaElemento muito utilizado na imunofluorimetria ...

Referências • Antonio Walter Ferreira - Sandra Lago Moraes de Ávila DIAGNÓSTICO• Antonio Walter Ferreira - Sandra Lago Moraes de Ávila DIAGNÓSTICO

LABORATORIAL DAS PRINCIPAIS DOENÇAS INFECCIOSAS E AUTO-IMUNES Edição/Ano: 2/2001 nº págs: B/443 .( ultima edição )

• Vaz, A. J.; Takei, K.; Bueno, E.C. Imunoensaios: Fundamentos eVaz, A. J.; Takei, K.; Bueno, E.C. Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações. 1 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007

• Janeway, C. and Travers, P. Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença 4a ed Porto Alegre: Artes Médicas ultima ediçãoe na Doença. 4a ed. Porto Alegre: Artes Médicas, - ultima edição .(VEM COM CD ROM)

• Peakman, M. and Vergani, D. Imunologia Básica e Clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999 .( ultima edição )Janeiro: Guanabara Koogan, 1999 .( ultima edição )

• Roitt, I.; Brostoff, J. and Male, D. Imunologia. 1a ed. São Paulo:Manole, 1999. . ultima edição )

• Stites, D.P., Tem, A.I. and Parslow, T.G. Imunologia Básica e Clínica, 9aStites, D.P., Tem, A.I. and Parslow, T.G. Imunologia Básica e Clínica, 9a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. .( ultima edição )

• Manual de equipamento Abbot• Site www.labimuno.org.brSite www.labimuno.org.br• http://quimica_basica.sites.uol.com.br/tabelap.htm