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Procedimentos Analíticos Gerais em ToxicologiaGerais em Toxicologia

Profa. Verônica Rodrigues• FARMACÊUTICA INDUSTRIAL - UFRJ• MESTRE EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - UFRJ• EX-DOCENTE - UNIPLI• EX-PERITA LEGISTA - TOXICOLOGISTA - PCERJ• PESQUISADORA EM PROPRIEDADE INDUSTRIAL - INPI

Procedimentos Analíticos em Toxicologia

CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

Análises Toxicológicas Forenses:

• Cadeia de custódia :

• Quem manuseou a amostra ou aliquota?• Quando tal manuseio ocorreu?• Onde a amostra ou a aliquota foi obtida?

• Considerações sobre a amostra:� Aspecto da amostra (odor, cor, aparência)

� O que coletar?

- Seleção da matriz biológica adequada:

� conhecimentos da toxicocinética do analito

CONSIDERAÇÕES SOBRE A AMOSTRA NA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

� conhecimentos da toxicocinética do analito

� concentração média do analito no material

amostrado

Ex.: Intoxicação por paraquat → pulmão

Identificação de heroína / 6-MAM → urina

Metabolismo de alguns Fármacos

� Quanto coletar?

- representatividade da amostra → técnica analítica

- quantidades de alíquotas: prova e contra-prova

Coleta e Preparo da Amostra

(toxicologia forense, exames de doping)

� Onde coletar?

- uso de recipientes adequados que não contaminem asamostras

Coleta e Preparo da Amostra

Fonte: Society of Forensic Toxicology, AAFS, 2002

(Fonte: Toxicologia Analítica. Moreaau & Siqueira. 2008. )

� Ao abrigo:

- luz (fotodegradação)

- calor (degradação térmica)

Estocagem e Conservação da Amostra

- calor (degradação térmica)

• refrigeração (~ 4 ºC)

• congelamento

- umidade (degradação microbiana)

� Adição de conservantes

- antimicrobianos (fluoreto de sódio)

- anticoagulantes (heparina)

Estocagem e Conservação da Amostra

- antioxidantes (ácido ascórbico)

� Inviolabilidade da amostra

- Autenticidade da amostra (laudo pericial)

- Adulteração intencional ou acidental

Seleção de Amostras BiológicasSeleção de Amostras Biológicas

Cuidados Gerais

1. Autenticidade

� Garantia de que uma amostra de material biológicopertence a uma dado indivíduo depende de fatorescomo:

Seleção de Amostras Biológicas

como:- processo de coleta- identificação da amostra- adoção de critérios de inviolabilidade- transporte e armazenamento adequados

� Algumas amostras precisam de cuidados especiaispara que a autenticidade da mesma possa sergarantida, como no caso da urina.

Garantia de cadeia de custódia segura

Cuidados Gerais

2. Amostra de Tempo Anterior ao Uso

� Importante garantir que o indivíduo não trará consigouma amostra autêntica (por exemplo, de urina)previamente coletada, mas em momento anterior ao usoda droga.


da droga.

3. Adulteração

� Representada pela adição de produtos químicos àamostra coletada.

� Qualquer produto adicionado à amostra pode interferirna análise enzimática e/ou cromatográfica.

� Produtos de limpeza em geral degradam as drogas.

Cuidados Gerais

4. Seleção Adequada da Amostra

� Importante selecionar a amostra em função do localonde o analito poderá ser encontrado

� Amostras como sangue, urina, e tecidos são bastante


� Amostras como sangue, urina, e tecidos são bastanteusadas em análises toxicológicas.

� Atualmente, amostras alternativas estão sendoutilizadas em análises toxicológicas.

� Exemplos incluem a saliva, para análise de drogas nolocal de trabalho e em casos de suspeita de delitosao volante; o cabelo, que pode ser usado para avaliaro histórico de uso de drogas.

Cuidados Gerais

5. Critérios de Conformidade da Amostra

� Todos os critérios de conformidade da amostra para examedevem ser satisfeitos de modo a garantir a autenticidade daamostra e dar maior probabilidade de detecção ao teste.


amostra e dar maior probabilidade de detecção ao teste.

� Amostras coletadas sem supervisão, com indícios de adiçãode produtos químicos e que não foram aprovadas pelostestes de conformidade (pH, aspecto, densidade, creatinina,uréia, etc para urina, por exemplo) devem receber o laudode “NÃO CONFORMIDADE”, independente da análise tersido ou não realizada, ou de resultado positivo ou negativo.

� Informar no laudo o limite de detecção do método.

Amostras Biológicas Convencionais

�� UrinaUrina

� A coleta da urina requer cuidados em função doconstrangimento que a coleta pode causar ao periciado.

� A privacidade requerida para a coleta da urina →


� A privacidade requerida para a coleta da urina →

risco para garantia da autenticidade da amostra.

Coleta de UrinaColeta de UrinaColeta de UrinaColeta de Urina

� Critérios de Segurança

� Atenção no momento da coleta

� Avaliação da temperatura da amostra imediatamente após a coleta


Obs.: esse critério pode ser falho.

� Análise de uréia e creatinina (SAMSHA – Substance Abuse and

Mental Health Administration)- Creatinina ≥ 5mg/mL- Densidade da urina entre 1001 ≤ d ≤ 1020

Importante: a adição de cloreto de sódio aumenta a densidade daamostra e pode interferir na triagem por ensaio enzimático.

Coleta de Urina


Cuidados Gerais

� Diluição da Amostra

� Adição intencional x ingestão de grandesquantidades de água

� O excesso de água provoca uma queda na


� O excesso de água provoca uma queda naconcentração da urina e pode afetar a detecção nafase de triagem.

� Como contornar o problema da diluição? Avaliação dacreatinina urinária e densidade.

Valores médios: - creatinina: 20-40 mg/dL- densidade: 1003 - 1010

(varia entre os autores)

(Fonte: Vigilância Toxicológica. Eliani Spinelli. 2004. )

Cuidados Gerais

Diluição da Amostra - continuação

� SAMSHA – amostras diluídas

- creatinina: < 20 mg/dL


- creatinina: < 20 mg/dL- densidade: < 1003

� Em casos de não conformidade com os parâmetrosestabelecidos, recomenda-se a coleta de umasegunda amostra para exame (se possível)


Table 1

Common Adulterants

ADULTERANTS ASSAYS AFFECTED DETECTION MEANS

Water (DILUTION) All Creatinine, Specific Gravity

Adulterantes e Ensaios para Detecção dos Mesmos em Urina


Ammonia All Odor, pH

Bleach All, esp. THC Odor

Glutaraldehyde (URINEAID) All, esp. THC Bizarre data

Soap/Detergent All, esp. THC Bizarre data, foams, odor

Nitrite (KLEAR) THC Specific Test

Chromate (URINE LUCK) THC Specific Test

Peroxidase (STEALTH) THC Test under consideration

Comment: There are dipsticks available which allow for adulterant testing at the collection site.

This has advantage of early detection of unstable adulterants like bleach and STEALTH which

can degrade and are harder to detect in the lab.

(Fonte: http://www.wardelab.com/12-1.html)

�� SangueSangue

� Sangue e seus derivados são amostras de especialimportância nas análises toxicológicas

� Dentre os derivados do sangue, o soro possui como


� Dentre os derivados do sangue, o soro possui comovantagem o fato de que nenhum aditivo (anticoagulante) foiadicionado à amostra, mantendo sua composição inalterada.

� Em indivíduos vivos, os efeitos fisiológicos da maioria dosfármacos possuem correlação direta com suasconcentrações sanguíneas.

� Atenção em sangue coletados post-mortem


�� Sangue Sangue PostPost--MortemMortem

� A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva aalterações na concentração sérica de drogas. após a morte.Isso é chamado de redistribuição post-mortem


� Ocorre principalmente por difusão da droga do sangue parasítios vizinhos, (tecidos e órgãos), como de conteúdo doestômago.

� Este processo é particularmente importante para fármacoscom alta em liposolubilidade.

� O sangue coletado do fundo do coração e outros sítiostorácica e abdominal deve ser evitado sempre que possível.

� Sangue post-mortem - observações:

- punção das veias subclávia (braço) e/ou femoral

(perna)


(perna)

- cuidados com a viscosidade do sangue

- cuidado com a descontaminação do local

- atenção no transporte e manuseio – lise das

hemácias

- uso de conservantes para preservar a amostra

� A desigual distribuição de drogas nos tecidos leva aalterações na concentração sérica de drogas. após amorte. Isso é chamado de redistribuição post-mortem

� Exemplos de fármacos particularmente sujeitos à


�

redistribuição post-mortem:

• fenotiazinas• dextropropoxifeno• propranolol• metadona• antidepressivos tricíclicos.

• amfetamines• barbitúricos• cocaína• cloroquina• digoxina

� Coleta de sangue post-mortem


Amostras Biológicas Não-Convencionais

�� CabeloCabelo

� Um Breve Histórico

� Os primeiros trabalhos sobre a utilização de cabelocomo amostra para exame toxicológico surgiram apartir de 1857 – indivíduo morto há 11 anos, vítima de


partir de 1857 – indivíduo morto há 11 anos, vítima deintoxicação por arsênico.

� Cerca de 100 mais tarde ocorreu a detecção dofenobarbital em pêlos de cobaia após exposição oral aomedicamento.

� Na década de 1960 e 1970, a análise do cabelo foiimpulsionada pelo desenvolvimento da espectroscopiade absorção atômica (análise de metais pesados).



� 1979 – Primeiro trabalho publicado sobre detecção dedrogas em cabelo humano

Técnica de radioimunoensaio para detecção de opiáceos em


� Na década de 1980 – o desenvolvimento da CG/EMpermitiu um crescimento nas pesquisas de substânciasorgânicas em cabelos.

para detecção de opiáceos em amostras de usuários de heroína

Pesquisa envolvendo cocaína, canabinóides e anfetaminas


� Vantagens da Técnica

� Maior janela de detecção (semanas ou meses), contra2-4 dias para a maioria das drogas na urina e sangue.

� Para fins práticos, os dois testes se complementam.


� Para fins práticos, os dois testes se complementam.

� Urina e sangue: fornecem informações a curto prazosobre o uso de drogas por parte de um indivíduo,enquanto histórias de longo prazo são acessíveisatravés da análise do cabelo.

� A análise do cabelo pode fazer a distinção entre o usocrônico ou única exposição à drogas.

� Biologia do Cabelo

� Cabelo é um produto de órgãos diferenciados na pele dosmamíferos. Ela difere em indivíduos apenas em quantidade,cor e textura.

�


� O cabelo é basicamente proteínas (65-95%, basicamentede queratina), juntamente com a água (15-35%) e lipídios (1-9%). O conteúdo mineral do cabelo varia de 0,25% a 0,95%.

� O número total de folículos pilosos em adultos é estimadaem cerca de 5 milhões, com um milhão encontrado nacabeça. Os folículos pilosos são implantados no epitélio daepiderme da pele, aproximadamente 3-4 mm abaixo dasuperfície da pele.

(Fonte: Jickells, Clarke’s Analytical Forensic Toxicology. 2008. )

Secção longitudinal do folículo piloso



� Crescimento capilar

� Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos,alternando períodos de crescimento e de quiescência.

� 1 - Fase anágena: o cabelo é produzido durante 4 a 8 anos(cabelos da cabeça) e 12 meses (cabelo não-cabeça) com


(cabelos da cabeça) e 12 meses (cabelo não-cabeça) comuma taxa de aproximadamente 0.22–0.52 mm / dia ou 0.6–1.42 cem / mês para cabelos da cabeça (taxa de crescimentodepende do tipo de cabelo e localização anatômica).

� 2 - Fase catágena: o folículo entra em um período detransição de cerca de duas semanas, durante o qual deixa dedivisão celular e do folículo começa a degenerar.

� Crescimento capilar

� 3 - Fase telógena: período de descanso ou repouso,de cerca de 10 semanas, durante o qual o eixo docabelo pára de crescer completamente e crescimentodo cabelo começa a desligar.


do cabelo começa a desligar.

� No couro cabeludo de um adulto, aproximadamente85% dos cabelos está na fase de crescimento e osrestantes 15% estão em uma fase de descansando.


Fases do Crescimento Capilar


� Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo

� Cabelo não cresce continuamente, mas em ciclos,alternando períodos de crescimento e de quiescência.

� As drogas podem ser incorporadas no cabelo através de3 mecanismos:


3 mecanismos:• a partir do sangue, durante a formação do cabelo• a partir de suor e sebo• a partir do ambiente externo

� O cabelo é muito poroso e pode aumentar sua massa ematé 18% a partir da absorção de líquidos. Assim,medicamentos podem ser transferidas facilmente para ocabelo através do suor.

Mecanismos de Incorporação de Drogas em Cabelo



� Estabilidade de Drogas em Cabelo

� O mecanismo exato pelo qual os produtos químicos estãoligados no cabelo não é totalmente conhecido.

1 - Ligação à melanina2 - Ligação de drogas com os grupos sulfidrilas dos


2 - Ligação de drogas com os grupos sulfidrilas dosaminoácidos presentes no cabelo.

� Estudos in vitro demonstraram que fármacos podempermanecer quimicamente estáveis por vários meses.

� A meia vida da cocaína no cabelo foi determinda emexperimento e foi achado ser igual a 6 meses.

� Procedimentos para Coleta de Amostras

� Procedimentos de coleta para a análise do cabelo paraas drogas não foram padronizados.

� Na maioria dos estudos publicados, as amostras são


obtidas a partir de locais aleatórios no couro cabeludo.

� O cabelo é melhor coletadas de área na parte de trásda cabeça, chamado de vértice posterior.

vértice posterior

da cabeça

� Procedimentos para Coleta de Amostras

� Fios de cabelo são cortados o mais próximo possíveldo couro cabeludo, e sua localização no couro cabeludoé anotado.

� Depois de coletados, amostras de cabelo podem ser


� Depois de coletados, amostras de cabelo podem serarmazenadas à temperatura ambiente em papel dealumínio, um envelope ou um tubo de plástico.

� O tamanho da amostra varia consideravelmente entreos laboratórios e depende da droga para ser analisado eda metodologia de teste a ser aplicada.

Exemplo: 100 mg de cabelo são recomendados para análise do fentanil ou buprenorfina.

� Análise Toxicológica

1 - Processo inicial de descontaminação (lavagem) paraa maioria dos métodos

Soluções ácidas diluídas, soluções alcoólicas, detergentes


2 – Pulverização da amostra e digestão

soluções alcoólicas, detergentes ou mesmos solventes orgânicos

Condições variáveis de tempo e temperatura

química ácidaquímica alcalinaenzimática


� Análise Toxicológica

3 – Extração com solvente orgânico (ex: metanol)

4 – Análise por CG/EM

� Imunoensaios podem ser utilizados


� Imunoensaios podem ser utilizados

� Considerações importantes: - método deve ser sensível- detecção da forma

inalterada(na urina, são os

metabólitos)

1- Análise dos resíduos de extração

2- Suspensão do resíduo com solução tampão

Análise Toxicológica de Drogas em Cabelo



�� SalivaSaliva

� Definições

� A saliva é o produto da secreção das glândulassalivares presentes na boca.


salivares presentes na boca.

� No entanto, os fluidos encontrados na cavidade oralsão uma mistura de saliva, predominantemente, compequenas quantidades de fluido gengival, restoscelulares e de sangue.


�� SalivaSaliva

� Definições

� Em 1993, o encontro do New York Academy of

Sciences definiu:


Sciences definiu:

- saliva: palavra por secreções glandulares coletadosdiretamente as glândulas salivares (geralmente asparótidas);

- fluido oral: o fluido recolhido na cavidade bucal oupela expectoração.



� A passagem de fármacos da corrente sanguínea para asaliva já havia sido sugerida desde a segunda metadeda década de 1960.

� A utilização da matriz biológica só veio a aumentar


significativamente na última década:

- estudos farmacocinéticos- monitorização terapêutica- verificação do uso de substâncias ilícitas


Importante na vigilância de motoristas sobre o uso de

psicoativos

� Anatomia e Fisiologia da Saliva

� As glândulas salivares humanas produzem entre 0,5 e1,5 L de saliva por dia.

� Durante o repouso, mais saliva misturada é fornecido


� Durante o repouso, mais saliva misturada é fornecidopelas glândulas submandibular (70%), com uma menorquantidade das glândulas parótidas (25%) e o restantedas glândulas sublinguais (5%)

� A saliva é composta por 99% de água, 0,3% deproteína (principalmente amilase) e 0,3% mucinas.

Anatomia das Glândulas Salivares


� Vantagens e Desvantagens

� Vantagens:

- facilidade de obtenção

- coleta assistida (dificulta adulterações)


- coleta sem constrangimentos

- coleta não-invasiva

- É possível traçar paralelos com a concentraçãosanguínea!

Útil em estudos farmacocinéticos e análises

forenses

� Vantagens e Desvantagens

� Desvantagens:

- detecção do fármaco livre no plasma

curta janela de detecção!


- amostras em pequenas quantidades

- estados patológicos e emocionais podem inibir a

secreção salivar, diminuindo ainda mais a

disponibilidade do material

- solubilidade adequada e forma não-ionizada no

plasma.

detecção!

� Aspectos Farmacocinéticos

� A maioria dos xenobióticos chega à saliva por difusãosimples através das membranas celulares que compõemos túbulos salivares.


� Para que os xenobióticos cheguem à saliva énecessário:

- que estejam na forma livre

- que estejam na forma não-ionizada

- que possuam solubilidade adequada


� Aspectos Farmacocinéticos

� pH da saliva mais ácido que pH do sangue


Acúmulo na saliva de bases fracas

Compostos ionizados não retornam ao plasma

� Coleta de Amostra

� A maior vantagem da saliva é a possibilidade de que aamostra pode ser coletada do doador em observação.

� A amostra pode ser coletada logo após o momento do


� A amostra pode ser coletada logo após o momento doincidente.

� Coleta não invasiva e pode ser feito pelos própriosdoadores na maioria das situações.

� Uma série de dispositivos estão disponíveis para acoleta de saliva e de fluido oral.

Coleta de Amostra

O coletor emprega um rolo dealgodão dental (poliéster), queé mastigado pelo doador por30-45 segundos, com ou sem


30-45 segundos, com ou semestimulação do ácido cítrico.Após ser embebido com fluidooral, o rolo de algodão écolocado em um recipiente quese encaixa em um tubo decentrífuga. O algodão absorve1-1,5 mL de fluido oral.

Coleta de Amostra

Dispositivos de coleta mais

modernos geralmente usam um

material absorvente em uma

haste semelhante ao utilizado

para testes de álcool na saliva.

O dispositivo ao lado consiste


O dispositivo ao lado consiste

em um bloco de papel de filtro

impregnado com sais de

tampão em uma haste de

plástico. O bloco é colocado na

boca por 2-5 minutos. Após a

coleta, o papel é colocado em

um tubo com líquido

conservante e enviadas ao

laboratório para análise.

Absorção de cerca de 0,4 mL

de fluido oral.

Coleta de Amostra


O coletor Cozart Rapiscan usa uma almofada de algodãoabsorvente destacável em um indicador de punho. Depois que oindicador passou de branco para azul, que indica que 1 mL desaliva foram coletadas, a almofada pode ser destacada e mantidaem um tubo de ensaio que contém conservante tampão até aanálise.

Coleta de Amostra

O coletor Finger (utiliza umapropriedade odontológicoabsorvente (espuma


absorvente (espumaAccuSorb), que absorve asaliva, quando colocado naboca por alguns minutos. Asaliva é extraída a partir dapressão do dedo sobre omaterial absorvente.

Coleta de Amostra

O teste de salivaDrugWipe tenta limpar alíngua com um pino delimpeza e transferir osfluidos orais recolhidos


fluidos orais recolhidospor lavá-lo em uma tira deteste.

O DrugWipe testasubstâncias comomaconha, cocaína e crack,opiáceos como a heroína,morfina e metadona Todosos medicamentos daclasse das anfetaminas eecstasy, bem como osbenzodiazepínicos.

DrugWipeDrugWipe


� Testes de Confirmação

� Quando os imunoensaios são utilizados como testes detriagem para drogas na saliva, testes cromatográficosdeve ser utilizada para confirmação.


� Eles devem ser capazes para detectar os níveis dedrogas que aparecem na saliva.

� Métodos CG/EM foram relatadas para a confirmaçãode opiáceos, cocaína, canabinóides e benzodiazepínicos.

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