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CARLA ALVES LARA PRODUÇÃO DA AGUARDENTE DE BANANA: EMPREGO DE ENZIMAS PECTINOLÍTICAS E EFEITO DE FONTES DE NITROGÊNIO E QUANTIDADE DE INÓCULO NA FORMAÇÃO DE ÁLCOOIS SUPERIORES Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG 2007
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CARLA ALVES LARA
PRODUÇÃO DA AGUARDENTE DE BANANA:
EMPREGO DE ENZIMAS PECTINOLÍTICAS E
EFEITO DE FONTES DE NITROGÊNIO E
QUANTIDADE DE INÓCULO NA FORMAÇÃO DE
ÁLCOOIS SUPERIORES
Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG
2007
Livros Grátis
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2
CARLA ALVES LARA
PRODUÇÃO DA AGUARDENTE DE BANANA:
EMPREGO DE ENZIMAS PECTINOLÍTICAS E
EFEITO DE FONTES DE NITROGÊNIO E
QUANTIDADE DE INÓCULO NA FORMAÇÃO DE
ÁLCOOIS SUPERIORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência de Alimentos da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal
de Minas Gerais, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciência de
Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Evelyn de Souza Oliveira Co-orientadora: Dra. Amazile Biagioni Maia
Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG
2007
3
Lara, Carla Alves
L318p
Produção da aguardente de banana : emprego de enzimas pectinolíticas e efeito de fontes de nitrogênio e quantidade de inóculo na formação de álcoois superiores / Carla Alves Lara. – 2007.
74 f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Evelyn de Souza Oliveira Co-orientadora: Dra. Amazile Biagioni Maia Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais,
Faculdade de Farmácia.
1. Aguardente de frutas – Teses. 2. Banana – Teses. 3. Enzimas – Teses. 4. Fermentação – Teses. 5. Álcoois – Teses. I. Oliveira, Evelyn de Souza. II. Maia, Amazile Biagioni. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia..
CDD 663.59
4
AGRADECIMENTOS
À Deus pela oportunidade tão almejada e alcançada. Aos meus pais que sempre me incentivaram e me deram muita força, nos momentos bons e ruins sempre me acolheram com muito amor e carinho. À Professora Doutora Evelyn de Souza Oliveira que me acolheu em seu laboratório, obrigada pela força e orientação neste trabalho. À Doutora Amazile Biagioni Maia pelas idéias, pelo carinho e pela orientação. Ao meu irmão Sandro meu anjo da guarda, meu xodó, obrigado pelas conversas científicas, pela ajuda no laboratório, pelo seu amor e dedicação, eu lhe admiro muito. Ao meu amor Rubinho, pela paciência, incentivo, ajuda técnica, compreensão e dedicação, obrigada por você existir. À minha amiga Luciana Faleiro que me incentivou desde o início, obrigada pela sua amizade, seu carinho e sua sabedoria. À minha amiga Andréa, companheira de laboratório, você foi muito importante nessa caminhada, obrigada pela sua amizade, seus conselhos e por sua alegria. Aos meus amiguinhos, Felipinho e Humbertinho, pelas brincadeiras e por me ajudarem no transporte das bananas. À Professora Doutora Maria Eliza M. Daí de Carvalho pelos conselhos, atenção e incentivo. Ao Tiago Lucas que me incentivou e apoiou no início do mestrado. Aos meus colegas de laboratório, Flávia, Tiago, Graciele, Lorena Simão e Isabella. À Ana Diolinda pela amizade e por me ajudar na execução do trabalho laboratorial. À Raimunda, funcionária do laboratório, pela presença. Aos professores Roberto Junqueira, Virgílio Guimarães e David Lee Nelson, tanto pelos seus conhecimentos, quanto pela receptividade. À professora Beatriz pelos seus conselhos e incentivo. Às professoras Accácia Júlia e Silvana Mota pelo uso do laboratório de Tecnologia de Alimentos. Ao Laboratório LABM e toda sua equipe, que sempre me receberam bem. À Professora Maria Isabel Rodrigues por seu conhecimento e seus conselhos. À Fernanda Colengui minha companheira de estatística, pela sua atenção. Ao professor Zapico por seu carinho e esclarecimentos. À Rita de Cássia, pela atenção, carinho e incentivo. Às minhas grandes amigas, Aline, Elisângela, Eliane, Sheila, Juliana, Zayran, Magda e Maria Lúcia que sempre me deram força e carinho. Aos meus avós Antônio e Carmelita, aos meus primos, a Tia Maria, Tia Helena, meu sogro Isac e minha sogra Claudina, pelo carinho e reconhecimento. Aos meus colegas do Marconi pela compreensão e incentivo. Às médicas Patrícia Amorim, Rita de Cássia e Marilene Gonçalves e minha terapeuta Graça por cuidarem de mim. A banca examinadora, pela revisão e sugestões finais que aprimoraram este trabalho. A Novozymes pelo fornecimento de enzimas pectinolíticas. A todos que participaram deste meu aprendizado, muito obrigada.
5
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .............................................................................................................................. 8
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................... 9
RESUMO .......................................................................................................................... 10
ABSTRACT........................................................................................................................ 11
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 12
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 14
2.1 BANANA...................................................................................................................... 14
2.1.1 Composição química................................................................................................ 14
2.1.2 Cultivar...................................................................................................................... 14
2.1.3 Colheita.................................................................................................................... 14
2.1.4 Armazenamento....................................................................................................... 15
2.1.5 Amadurecimento....................................................................................................... 16
2.1.6 Pectina...................................................................................................................... 17
2.2 AGUARDENTE DE FRUTA........................................................................................ 18
2.3 AGUARDENTE DE BANANA...................................................................................... 19
2.3.1 Matéria - prima.......................................................................................................... 19
2.3.2 Hidrólise enzimática ................................................................................................ 20
2.3.3 Fermentação............................................................................................................. 22
2.3.4 Destilação................................................................................................................. 23
2.4 QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICA DAS AGUARDENTES ............................................. 23
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 27
3.1 Preparo do caldo......................................................................................................... 27
3.2 Hidrólise enzimática..................................................................................................... 27
3.2.1 Viscosidade ............................................................................................................. 29
3.2.2 Densidade................................................................................................................. 30
3.2.3 Modelo experimental e análise estatística............................................................... 30
6
3.3 Fermentação: Efeito da adição de diferentes fontes de nitrogênio e da quantidade de inóculo na formação de álcoois superiores no vinho de banana ................................
31
3.3.1 Análise Estatística dos ensaios de fermentação...................................................... 32
3.4 Processo de produção da aguardente de banana....................................................... 32
3.4.1 Preparação do mosto............................................................................................... 33
3.4.2 Hidrólise enzimática.................................................................................................. 34
3.4.3 Fermentação............................................................................................................. 34
3.4.4 Destilação................................................................................................................. 34
3.4.5 Métodos analíticos.................................................................................................... 35
3.4.5.1 Determinação dos açúcares redutores totais (ART) no caldo de banana e no vinho.................................................................................................................................
35
3.4.5.2 Acidez total do caldo de banana e do vinho......................................................... 35
3.4.5.3 Dosagem de etanol .............................................................................................. 36
3.4.6 Análise Físico-Química da Aguardente.................................................................... 36
3.4.7 Rendimento em etanol (%)....................................................................................... 37
4 RESULTADO E DISCUSSÃO........................................................................................ 38
4.1 Caracterização físico-química da polpa de banana.................................................... 38
4.2 Hidrólise enzimática..................................................................................................... 38
4.2.1 Análise Estatística.................................................................................................... 38
4.2.2 Efeito da concentração de enzima, temperatura e tempo na viscosidade............. 42
4.2.3 Otimização............................................................................................................... 44
4.3 Fermentação: Efeito da adição de diferentes fontes de nitrogênio e da quantidade de inoculo na formação de álcoois superiores no vinho de banana..................................
46
4.4 Produção da Aguardente de banana........................................................................... 48
4.4.1 Metabólitos analisados no vinho............................................................................... 49
4.4.2 Rendimento em etanol da aguardente..................................................................... 49
4.4.3 Alcoois Superiores.................................................................................................... 49
4.4.4 Compostos secundários determinados.................................................................... 50
4.4.4.1 Teor Alcoólico........................................................................................................ 51
4.4.4.2 Metanol.................................................................................................................. 51
4.4.4.3 Acetaldeído............................................................................................................ 51
7
4.4.4.4 Acetato de Etila..................................................................................................... 52
4.4.4.5 Acido Acético......................................................................................................... 52
5 CONCLUSÃO................................................................................................................. 53
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................... 54
7 APÊNDICES................................................................................................................... 60
APÊNDICE A 60
A1 - Teste de normalidade para o modelo estatístico de 2ª.ordem................................... 60
A2 - Delineamento Composto Central Rotacional final sem observações 8, 9 e 27......... 60
A3 - Histograma de residuos………………………………………………………….............. 61
A4 - Densidade do caldo de banana................................................................................. 61
A5 - Cálculo da viscosidade do caldo de banana........................................................ 63
APÊNDICE B 63
B1-Fermentação: Efeito da adição de diferentes fontes de nitrogênio e da quantidade de inoculo na formação de álcoois superiores no vinho de banana..................................
66
B2 - Análise ANOVA e Teste de Duncan.................................................................... 67 C1- Cálculo do rendimento em extração de volume do suco de banana..........................Apêndice D........................................................................................................................
73 74
........................................................................................................................
8
LISTA DE TABELAS
1 Composição química da banana in natura, em 100 g............................................... 15
2 Escala de maturação da banana, segundo aspecto, teores de açúcar e amido....... 19
3 Valores utilizados no DCC para três fatores............................................................. 28
4 Valores utilizados no DCCR para três fatores........................................................... 29
5 Planejamento Composto Central Rotacional............................................................ 29
6 Fontes de nitrogênio adicionadas aos meios de fermentação e concentração do inoculo.......................................................................................................................
32
7 Caracterização do caldo de banana.......................................................................... 38
8 Delineamento composto central e viscosidade....................................................... 39
9 DCCR para a hidrólise enzimática e viscosidade..................................................... 40
10 Coeficiente de regressão para a resposta Y............................................................. 41
11 ANOVA para resposta Y........................................................................................... 41
12 Alcoois superiores formados por fermento preensado úmido a 30°C e inoculo 40 g.L.-1....................................................................................................................
46
13 Alcoois superiores formados por fermento preensado úmido, a 30°C e inóculo de 20 g.L.1. ............
47
14 Média das análises das aguardentes de banana produzida..................................... 50
A1 Cálculo de densidade................................................................................................ 61
B1 Formação de álcool propílico.................................................................................... 66
B2 Formação de álcool isobutílico................................................................................. 66
B3 Formação de álcool isoamílico................................................................................. 66
D1 Delineamento composto central............................................................................... 74
9
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas
ANOVA – Análise de Variância
ART – Açúcares redutores totais
CEASA - Centrais de Abastecimento de Minas Gerais
DCC – Delineamento Composto Rotacional
DCCR – Delineamento Composto Central Rotacional
DNS – ácido dinitrossalicílico
FAFAR – Faculdade de Farmácia
LABM – Laboratório Amazile Biagioni Maia
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
1 Estrutura primária das substâncias pécticas....................................................................... 172 Mecanismo de ação da enzima pectinesterase................................................................... 203 Mecanismo de ação da enzima poligalacturonase.............................................................. 214 Formação de álcoois superiores.......................................................................................... 245 Fluxograma do processamento da aguardente de banana................................................. 336 Valores experimentais versus valores preditos pela resposta y.......................................... 427 Viscosidade da polpa em função do tempo......................................................................... 438 Superfície de resposta para viscosidade em função da concentração de enzima e
tempo....................................................................................................................................44
9 Curva de contorno para a viscosidade (cP) em função da concentração de enzima e tempo...................................................................................................................................
45
A1 Distribuição dos resíduos em torno da reta que indica normalidade para resposta y .........................................................................................................................................
60
A2 Histograma de residuos…………………………………………………………………………... 61
10
RESUMO No Brasil o processo de produção de aguardentes de frutas não é padronizado,
portanto, há necessidade de estudar os parâmetros de produção para se obter uma
bebida de boa qualidade. No processo de produção da aguardente de banana o
tratamento com enzimas pectinolíticas permite a obtenção de um maior rendimento em
extração do suco e uma diminuição da viscosidade do caldo, portanto, maior
rendimento em etanol. Para a otimização das condições de hidrólise enzimática
utilizou-se a metodologia de superfície de resposta. A polpa de banana foi tratada com
uma preparação comercial de pectinases em várias concentrações (0,0 a 0,03%),
temperaturas (20 a 40°C) e tempo (20 a 120 min) de hidrólise. O efeito do tratamento
enzimático na viscosidade do suco foi estudado pelo emprego do modelo de
composição central de segunda ordem. O coeficiente de determinação, R2 para a
viscosidade foi próximo de 0,900. A análise estatística mostrou que a viscosidade foi
correlacionada significativamente (p< 0,05) com a concentração de enzima e o tempo
de incubação. A temperatura não foi significativa neste modelo. Um aumento no tempo
de hidrólise e/ou concentração de enzimas no tratamento foi associado com uma
diminuição na viscosidade. Baseando-se nos resultados da superfície de resposta e
nos gráficos de contorno, as condições ótimas para o tratamento enzimático do suco de
banana foram: 0,022% de concentração de enzima e 78 min de tempo de hidrólise. No
processo fermentativo foram testados duas quantidades de inóculo (20 g L-1 e 40 g L-1)
e duas fontes de nitrogênio (farelo de arroz na concentração de 1 g L-1 e sulfato de
amônio a 0,1 g L-1 e 0,4 g L-1) com a finalidade de verificar a diminuição da formação
de álcoois superiores durante a fermentação. O ajuste da quantidade de inóculo
(20 g L-1) e a adição de uma fonte de nitrogênio amoniacal permitiram reduzir a
formação de álcoois superiores no vinho de banana. A aguardente produzida atendeu
aos parâmetros definidos pela legislação brasileira com exceção dos álcoois superiores
e da acidez total.
Palavras-chave: banana, enzimas pectinolíticas, metodologia de superfície de resposta,
álcoois superiores, inóculo e aguardente.
11
ABSTRACT In Brasil, the process of fruit brandy production is not standardized, hence it follows that
there is the necessity of a selection of parameters to obtain a good quality beverage. In
the process of banana brandy production, the treatment with pectolytic enzymes allows
an increase in juice extraction and a fall of viscosity, hence it follows, an increase
alcohol yield. The optimization of the banana-plant pulp hydrolysis process using the
response surface methodology. The banana-plant pulp was treat with pectolytic
enzymes in different concentrations (0,0 to 0,03%), temperatures (20 to 40° C) and the
duration (20 to 120 minutes). The enzymatic effect of the treatment at the viscosity of
the juice was studied by the use of the central composition model of the second order.
The coefficient of determination, R² in relation to the viscosity was near to 0,900. The
statistical analysis was significantly linked (p< 0,05) with the enzymatic concentration
and the incubation time. The temperature was not significant in this model. An increase
of the incubation time and/or the enzymatic concentration at the treatment was
associated with a decrease in the viscosity. Based on the response surface
methodology and on the contour plots, the excellent condition for the enzymatic
banana-plant juice treatment was: 0,022% of the enzymes concentration and 78
minutes of hydrolysis. In the fermentation process was tested two quantity
inoculum (20 g L-1 e 40 g L-1) and two sources the nitrogen (rise the bran in
concentration the 1 g L-1 and ammonium sulfate the 0,1 g L-1 e 0,4 g L-1) with aim
decrease higher alcohol in the fermentation.The adjustment of the quantity inoculum
(20 g.L-1) and the addition of an ammonium nitrogen source allowed to reduce contents
of superior alcohol on the banana-plant wine. The brandy obtained is in accordance with
the Brazilian Legislation pattern, excet higher alcohol and acidity.
Key words: banana, pectolytic enzymes, response surface methodology hitgher alcohol
inoculun and brandy.
12
1 - INTRODUÇÃO
As bananas, frutos comestíveis do gênero Musa ssp., são cultivadas na maioria dos países tropicais (ALVES, 1999). A produção brasileira (IBGE, 2001) é da ordem de seis milhões de toneladas anuais, sendo a maior parte destinada ao consumo in natura. A banana é uma fruta frágil, que exige grandes cuidados na colheita e no manejo pós-colheita. As perdas, que podem chegar a 40% da produção, ocorrem desde a fase de cultivo até o manuseio da fruta na residência do consumidor (LICHTEMBERG, 1999). Boa parte poderia ser aproveitada na produção de doces, geléias, sucos, vinho e aguardente. O consumo de aguardente de frutas é difundido internacionalmente. Para o Brasil, a produção de aguardente de banana é uma perspectiva promissora, que ainda depende de aporte tecnológico para assegurar a qualidade do produto e segurança dos consumidores. A banana, verde ou madura, pode ser utilizada para a produção dessa bebida, visto que, quando verde, possui carboidratos armazenados na forma de amido, sendo estes convertidos por hidrólise enzimática natural a açúcares prontamente fermentescíveis, durante o amadurecimento. Na utilização direta da banana verde, o amido deverá sofrer quebra por meio de métodos como químico, enzimático ou calor e pressão. Então, com o uso da banana madura não seria necessário o uso de enzimas amilases, portanto, diminuiria o custo do processo. Na produção da aguardente de banana permite-se aproveitar a fruta em seu último estágio de maturação e com injúrias. Portanto, a elaboração desta bebida pode contribuir bastante para a redução das perdas (GUIMARÃES FILHO, 2003). A produção da aguardente de banana requer instalações semelhantes às utilizadas por produtores da cachaça (aguardente de cana). Como as fábricas de cachaça funcionam apenas seis meses por ano, a produção de aguardente de banana pode ser implementada utilizando instalações pré-existentes. No Brasil já existe produção comercial da aguardente de banana. Entretanto, o processo ainda não é padronizado, o que acarreta dificuldades no controle da qualidade da bebida. O objetivo deste trabalho foi estudar parâmetros de hidrólise enzimática e de fermentação para a elaboração da aguardente de banana.
Os objetivos específicos foram: (i) Estudar o efeito da concentração de enzima, temperatura e tempo de
hidrólise enzimática sobre a viscosidade do suco;
(ii) Verificar o efeito da hidrólise enzimática no rendimento do suco;
13
(iii) otimizar a hidrólise enzimática do suco de banana usando a metodologia
de superfície de resposta;
(iv) estudar o efeito da adição de diferentes fontes de nitrogênio e da
quantidade de inóculo na formação de álcoois superiores;
(v) produzir a aguardente de banana e determinar os compostos secundários
exigidos pela legislação brasileira.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 BANANA A banana é a fruta fresca de maior consumo no mundo. Suas características
sensoriais, o valor nutricional e a ampla disponibilidade em diversos países do mundo,
durante o ano todo, contribuem para sua popularidade (LICHTEMBERG, 1999).
Pertence ao gênero Musa ssp, que ocupa lugar de destaque no universo de
vegetais úteis ao homem (MEDINA, 1978).
2.1.1 Composição Química Entre os componentes químicos mais importantes da banana estão cerca de 25
% de carboidratos totais (TAB. 1). Lipídeos e proteínas correspondem a menos de 1%
cada; os principais minerais são o potássio, magnésio e fósforo. As vitaminas mais
importantes são a tiamina (vitamina B1) e a riboflavina (vitamina B2).
2.1.2 Cultivar Existe um grande número de cultivares de banana no Brasil. Do ponto de vista
comercial, as variedades Prata, Pacovan, Maçã, Ouro, Nanica, Nanicão e Da terra
dominam o mercado interno. No estado de Minas Gerais a produção da cultivar Prata é
predominante (BAHIA, 1996).
2.1.3 Colheita
A banana é colhida antes do início do amadurecimento, que é atingido após o
pico respiratório climatérico (CHITARRA & CHITARRA, 1999). O critério para a colheita
da banana leva em conta o número de dias do lançamento da inflorescência até o
desenvolvimento fisiológico dos frutos. O cultivar plantado, a forma de cultivo, o tipo de
solo, clima e práticas culturais determinam à evolução fisiológica da planta. A colheita
requer cuidados especiais para não provocar danos que possam prejudicar a aparência
e a qualidade da fruta (LICHTEMBERG, 1999).
15
Para a produção de aguardente, as principais características a serem
consideradas são: o estágio de maturação e as condições de sanidade (MEDINA,
1985).
É desejável que os frutos estejam com o máximo possível do amido já
convertido em açúcares fermentáveis (GUIMARÃES FILHO, 2003). MACEDO (1993,
citado por GUIMARÃES FILHO, 2003) sugere a utilização de bananas com a casca
apresentando coloração escura, sendo neste ponto maiores seus teores de açúcares
fermentáveis.
TABELA 1 – Composição química da banana in natura, em 100 g.
Componentes Unidade Teor Umidade
g
74 Carboidratos totais 26
Carboidratos disponíveis 24 Proteína 0,9
Lipídios totais 0,5 Fibras totais 1,8
Cinzas 0,6 Potássio
mg
370 Magnésio 35 Fósforo 26 Cálcio 15 Sódio 1 Ferro 0,2
Manganês 0,6 Zinco 0,2
Vitamina C 17 Vitamina B6 0,6
Selênio μg
1,1 Vitamina A 81
Tiamina 92 Riboflavina 103
Niacina 0,8 Valor calórico kJ 434,72 Fontes: FRANCO (1999), USDA (2003), USP (2005).
2.1.4 Armazenamento A perecibilidade da banana está associada às altas taxas respiratórias, sua
longevidade mesmo sob refrigeração, não vai além de três semanas, tanto para frutos
maduros como verde-maduros (ALVES, 1997). Portanto, dependendo do seu destino,
16
consumo in natura ou como matéria-prima para produtos industrializados, o tempo de
armazenamento será distinto. A maturação da banana pode ser retardada por várias semanas sob atmosfera
controlada. Para isso, utiliza-se local fechado com baixo teor de oxigênio e alto de
dióxido de carbono (MANICA, 1997). Ao retirar esta atmosfera, os frutos amadurecem
normalmente (ALVES, 1997).
A longevidade dos frutos pode ser aumentada selando os frutos em sacos de
polietileno. Apesar da variabilidade nas concentrações de gás carbônico no interior dos
sacos, os níveis detectados são toleráveis pelos frutos (ALVES, 1997).
2.1.5 Amadurecimento As bananas são colhidas verdes para manter a resistência dos frutos durante o
transporte e manuseio pós-colheita. O conhecimento das transformações físicas e
químicas que ocorrem na banana durante o armazenamento permite adotar as
medidas adequadas para assegurar frutos maduros e de boa qualidade (MANICA,
1997).
Durante o amadurecimento, o teor de sólidos solúveis aumenta atingindo valores
de 27% p/p. A acidez se eleva até atingir um máximo quando a casca está totalmente
amarela, e depois decresce. O ácido predominante é o málico. O amido representa
entre 20 e 25% do peso da polpa da banana verde, sendo hidrolisado rapidamente no
processo de amadurecimento (BLEINROTH, 1993). A concentração de sacarose na
fruta madura é baixa em comparação a outras frutas (RIBEIRO, 2004).
A adstringência associada à presença de tanino decresce à medida que a fruta
vai amadurecendo, podendo variar com a época da colheita da fruta. Há uma mudança
na coloração da casca e da polpa devido à hidrólise da clorofila e à síntese de
carotenóides. O aroma característico da banana varia e se intensifica com o
amadurecimento, aumentando os teores de ésteres, sobretudo o acetato de isopentila.
O conteúdo de umidade da polpa da banana verde situa-se em torno de 70%,
elevando-se para 75% quando completamente madura. O aumento é atribuído à
transferência de água da casca para a polpa (MEDINA, 1978).
Durante o amadurecimento, ocorrem diversas alterações na composição química
da banana relacionadas à atividade de grande variedade de enzimas. Segundo
BLEINROTH (1993) estão presentes na banana as seguintes enzimas: peroxidase,
17
fenolase, catalase, amilase, invertase, oxidase do ácido ascórbico, fosfatase,
carboxilases e oxigenases.
A catalase é altamente ativa na banana verde. A atividade da amilase na polpa
de banana cresce continuamente até a completa maturação, decrescendo em seguida.
O pH ótimo da amilase da banana situa-se entre 6,0 e 7,0; enzima sofre desnaturação
em temperaturas acima de 62°C (MAO & KINSELLA, 1981).
O escurecimento enzimático da polpa da banana é atribuído à oxidação da
dopamina pela enzima polifenoloxidase. GALLEAZZI et al. (1981) mostraram que esta
enzima mantém-se estável até 55°C, só perdendo sua atividade quando submetida a
temperatura superior a 85°C.
2.1.6 Pectina As substâncias pécticas são complexos coloidais de polissacarídeos ácidos, com
ramificações de ácidos galacturônicos unidos por ligações glicosídicas α-1-4. A cadeia
lateral da pectina consiste em L-ramnose, arabinose, galactose e xilose. Os grupos
carboxil de ácidos galacturônicos são parcialmente esterificados pelo grupo metil
(KASHYAP, 2001).
Em sua forma nativa, a pectina está localizada na parede celular e interligada
com outras estruturas como polissacarídeos e proteínas, formando estruturas
insolúveis como as protopectinas (FIG.1).
Figura 1 - Estrutura primária de substâncias pécticas.
18
Segundo JAYANI et al. (2005), as substâncias pécticas são responsáveis por
0,5 – 4,0% do peso úmido de frutas e vegetais. A composição em tecido úmido de
substâncias pécticas em bananas equivale a 0,7-1,2%.
No complexo polimérico da pectina, pelo menos 75% dos grupos carboxílicos
das unidades galacturonatos estão esterificadas com o metanol (JAYANI et al., 2005).
Isto confere rigidez em frutas verdes, quando a pectina está ligada à celulose da
parede celular. Contudo, durante o amadurecimento a estrutura da pectina é alterada
naturalmente por enzimas da fruta, deixando o tecido da parede celular mais macio
(KASHYAP, 2001).
2.2 AGUARDENTES DE FRUTAS Segundo a legislação brasileira (BRASIL, 1997), aguardente de fruta é a bebida
com graduação alcoólica de 36 a 54% em volume, a 20ºC, obtida de destilado alcoólico
simples de fruta, ou pela destilação de mosto fermentado de fruta. A destilação deve
ser efetuada de forma que o destilado preserve o aroma e o sabor dos elementos
naturais voláteis contidos no mosto fermentado, derivados dos processos de
fermentação ou formados durante a destilação. O coeficiente de congêneres não pode
ser inferior a 200 nem superior a 650 mg/100 mL de etanol anidro.
HERNÁNDEZ-GÓMEZ et al. (2003) estudaram a fermentação de melão para
produção de aguardente. Segundo os autores, o melão em pasta apresentou melhor
rendimento. Entretanto, o processo fermentativo foi lento e o produto final apresentou
alta concentração de metanol, álcool indesejável, por ser nocivo à saúde. O metanol é
formado a partir de enzimas pectinolíticas que liberam o grupo metoxil da pectina
presente na fruta. No mesmo trabalho, os autores citam a influência da destilação no
perfil químico da bebida, salientando que o uso do alambique de cobre é mais
apropriado para o perfil sensorial da bebida.
No destilado de Mouro, aguardente de amora, SOUFLEROS et al., (2003)
destacam a importância de controlar a concentração de metanol e outros compostos
secundários como álcoois superiores, principais responsáveis pelo sabor da bebida, no
processamento das aguardentes. Os componentes voláteis podem apresentar um
padrão de qualidade que dependerá de uma padronização do processo de produção o
que inclui boas condições fermentativas e uma destilação apropriada.
Aguardentes de fruta ou Brandy portugueses, da região de Lourinhã foram
armazenadas em barris de diferentes madeiras para o acompanhamento do perfil
19
sensorial, durante a maturação da bebida. CALDEIRA et al. (2006), verificaram
mudanças em vários atributos sensoriais ao longo de cinco anos nas aguardentes.
Atributos como baunilha, madeira, complexidade e persistência do sabor aumentaram
sua intensidade com o tempo, melhorando a qualidade da bebida. Enquanto, atributos
como teor alcoólico, adstringência, amargo e fruta diminuíram com o tempo.
2.3 AGUARDENTE DE BANANA
2.3.1 Matéria-prima Para produção da aguardente, a banana deve apresentar um estágio de
maturação avançado, que corresponde a alto teor de açúcares fermentescíveis. Em
relação ao estádio de maturação da banana, HAENDLER (1996) desenvolveu uma
escala de maturação segundo o aspecto, teores de açúcar e amido, a qual é
apresentada na TAB. 2. Segundo GUIMARÃES FILHO (2003), o estádio de cor 6
corresponde à banana com excelente qualidade de consumo, mas para a produção da
aguardente, o mais indicado deverá ser o estádio 8.
Para que ocorra uma boa fermentação da polpa da fruta é necessário que se
tenha um caldo com baixa viscosidade. O tratamento enzimático com pectinase, além
de aumentar o rendimento do suco extraído da fruta, proporciona a diminuição de
viscosidade do caldo. É preciso também que seja feita a correção de sólidos solúveis,
uma vez que o teor ideal destes para que se inicie a fermentação é de 15˚ Brix.
TABELA 2 - Escala de maturação da banana, segundo aspecto, teores de açúcar e amido
Aspecto da fruta Amido (%) Açúcar (%) 1. Verde 21,5 a 19,5 0,1 a 2,0
2. Verde com traços amarelos 19,5 a 16,5 2,0 a 5,0
3. Mais verde que amarela 18,0 a 14,5 3,5 a 7,0
4. Mais amarela que verde 15,0 a 9,0 6,0 a 12,0
5. Amarela com extremidade verde 10,5 a 2,5 10,0 a 18,0
6. Inteiramente amarela 4,0 a 1,0 16,5 a 19,5
7. Amarela com pequenas manchas pardas 2,5 a 1,0 17,5 a 19,0
8. Amarela com grandes manchas pardas 1,5 a 1,0 18,5 a 19,0 Fonte: HAENDLER, 1996
20
2.3.2 Hidrólise Enzimática Enzimas pectinolíticas ou pectinases compõem um grupo heterogêneo de
enzimas que hidrolisam substâncias pécticas. Estas enzimas são produzidas
principalmente por plantas superiores, fungos filamentosos e bactérias, que têm sido
exploradas comercialmente há alguns anos. As preparações comerciais de pectinases
são de origem fúngica, sendo o Aspergillus niger, a espécie mais comum (JAYANI,
2005).
As preparações de pectinases contêm pelo menos seis enzimas que hidrolisam
a pectina em diferentes sítios da molécula. As pectinases são classificadas de acordo
com o ponto de ataque na molécula de pectina (OLIVEIRA, 2000). As enzimas se
dividem em dois grupos: pectinesterase e despolimerases, estas últimas subdivididas
em hidrolases e liases.
A pectinesterase (PE) catalisa a desesterificação do grupo metoxil da pectina,
formando ácido pécticos (FIG.2). A enzima age preferencialmente no grupo metil éster
das unidades galacturonatos próximos de unidades galacturonatos não esterificados
(KASHYAP, 2000).
Figura 2 - Mecanismo de ação da enzima pectinesterase.
As enzimas despolimerases catalisam a quebra da cadeia de pectina, pelo
rompimento das ligações glicosídicas α-1-4, sendo as hidrolases poligalacturonases
(PG) responsáveis pela hidrólise destas ligações, enquanto as liases (pectina-liases e
pectato-liases) atuam por β-eliminação (FIG.3). As liases degradam o substrato pelo
mecanismo de trans-eliminação, sendo os produtos finais o ácido galacturônico
insaturado e saturado com extremidade redutora. As pectina-liases atuam sobre as
pectinas de elevado conteúdo éster-metílico e as pectato-liases agem sobre as
substâncias pécticas com baixo grau de esterificação (VALLE, 2000; JAYANI, 2005).
21
Figura 3 – Mecanismo de ação da enzima poligalacturonase.
A alta viscosidade e turbidez da polpa da banana são causadas principalmente pela
pectina e pelo amido. Estes polissacarídeos dificultam o processo de filtração
necessário para clarificar o suco. Somente com tratamento enzimático é possível
diminuir a viscosidade e viabilizar a filtração (LEE et al., 2005). Devido ao elevado
custo das enzimas pectinolíticas, torna-se indispensável otimizar o processo,
alcançando o máximo de rendimento da hidrólise com a menor quantidade das
enzimas (RODRÍGUEZ-NOGALES et al., 2006).
PHEENTAVEERAT & AMPRUNG (1993) observaram sinergismo nas atividades
de celulases e pectinases com relação à diminuição da viscosidade do suco de banana
madura. As amilases não mostraram atividade na redução da viscosidade. Com efeito,
as amilases atuam no amido, polissacarídeo ausente, ou presente em teor muito baixo
(< 2%) na fruta madura.
NOGUEIRA & TORREZAN (1999) citam a utilização da enzima pectinolítica
comercial na proporção de 0,05% p/p, para clarificar o vinho de banana e também para
aumentar o rendimento da fermentação alcoólica destinada à produção de vinagre.
TOCCHINI & LARA (1977) testando a eficiência de quatro enzimas pectinolíticas
visando redução da viscosidade para a produção do suco de banana do grupo
Cavendish, concluíram que a enzima pectinolítica Ultrazym 100 Special® da Ciba-
Geisy Química S.A; foi a que propiciou os melhores rendimentos, reduzindo a
viscosidade em 92%. A concentração adotada da enzima foi de 0,05% por 10 minutos
de atuação a 30°C e a pH 4,7.
A partir de purê de banana do subgrupo Cavendish, CARDOSO et al. (1999)
observaram 61,1% v/p de rendimento de suco utilizando a enzima pectinolítica Clarex®
contra 50,31% v/p para a enzima pectinolítica CECI-CTAA® . Ambas as enzimas foram
utilizadas na concentração de 0,03% a 40°C por um período de 15 minutos e,
posteriormente, centrifugadas a 4.000 rpm a 30°C por 1,5 minutos.
22
2.3.3 Fermentação A fermentação consiste na transformação dos açúcares existentes em álcool
etílico, ocorrendo formação intensa de gás carbônico (GUIMARÃES FILHO, 2003). A
habilidade de converter açúcares em etanol é característica de um pequeno grupo de
microrganismos, no qual se destacam as leveduras Saccharomyces cerevisiae e
Kluyveromyces maxianus e da bactéria Zymomonas mobilis (CARDOSO, 2001).
A fermentação é iniciada pela adição do inóculo ao suco (GUIMARÃES FILHO,
2003). O inóculo é uma suspensão de células de leveduras em concentração suficiente
para garantir a fermentação de um determinado volume de mosto. Esta concentração
deve estar por volta de 106 a 107 células por mililitro no início da fermentação e cerca
de 108 células por mililitro no final (NOGUEIRA, 2005).
A busca de padrões operacionais adequados para assegurar a qualidade da
aguardente deve considerar ajustes nos níveis dos nutrientes disponíveis para a
levedura, de modo a equilibrar seus efeitos benéficos sobre a viabilidade celular e o
metabolismo fermentativo com níveis adequados de compostos secundários da
fermentação (DOMÍNGUEZ et al., 1997).
Em relação ao nitrogênio, a forma mais utilizada pela levedura na fermentação é
a amoniacal. Na sua ausência, a levedura utiliza outras fontes de nitrogênio como os
aminoácidos, o que proporciona um aumento nos níveis dos álcoois superiores
(RIBEIRO et al., 1987). VIDRIH (1999) sugeriu a adição de nitrogênio assimilável ao
meio para diminuir a síntese de álcoois superiores durante a fermentação.
RAMSAY & BERRY (1984) verificaram que a formação de álcoois superiores em
uísques pode ser regulada ajustando o teor de inóculo na fermentação. Segundo os
autores, a quantidade total de álcoois superiores aumenta com o aumento do inóculo.
Os álcoois superiores são produzidos tanto pela conversão catabólica de
aminoácidos quanto pela formação anabólica desses aminoácidos durante o
metabolismo do açúcar (BELTRAN et al., 2005).
TORREA (2003) encontrou que leveduras com menor demanda de nitrogênio
assimilável do que as de maior demanda resultaram em concentrações mais altas de
álcoois superiores no meio fermentativo. Esta diferença seria devido ao fato do
nitrogênio atuar como precursor na síntese de álcoois superiores.
GUIDICI et al. (1993) propõem que os álcoois superiores são produzidos a partir
de aminoácidos correspondentes, presentes no meio, e que a quantidade formada é
influenciada pela composição do meio (concentração de açúcar, pH, concentração e
23
tipo de nitrogênio), pela temperatura, pelo grau de aeração durante a fermentação e
linhagem da levedura.
2.3.4 Destilação A destilação atua nas características sensoriais das bebidas alcoólicas, uma vez
que as quantidades de compostos voláteis absolutas e relativas são influenciadas pela
mesma (COLE &NOBLE, 1995).
Na destilação em alambique simples, tal como efetuada na fabricação artesanal
de aguardente, distinguem-se usualmente três frações (MAIA, 1994):
a) O “destilado de cabeça”, que corresponde às primeiras frações recolhidas na saída
do alambique;
b) O “destilado de coração”, que é a porção destilada que corresponde à aguardente;
c) O “destilado de cauda”, é a última porção destilada, obtida quando a destilação não
é interrompida após obtenção da aguardente.
A separação entre as três frações do destilado é feita através de cortes, sendo
10% do total teórico para a cabeça, e o teor alcoólico de 42°G.L. do destilado para
encerrar a retirada do destilado do coração. Acrescenta ainda, que nesta etapa, a
qualidade da aguardente depende fundamentalmente da composição do vinho
encaminhado à destilação; da geometria do alambique, para assegurar um nível de
refluxo que permita a separação adequada dos componentes secundários e da
habilidade do operador para efetuar os cortes nos momentos adequados.
Uma correta separação durante a destilação das frações cabeça, coração e
cauda, contribui para melhorar a qualidade do produto, minimizando os metabólitos
tóxicos.
2.4 QUALIDADE FISICO-QUÍMICA DAS AGUARDENTES Os procedimentos adotados desde a colheita dos frutos, o transporte o
armazenamento, a fermentação, a destilação e o armazenamento criterioso do produto
são fundamentais na qualidade da bebida final (GUIMARÃES FILHO, 2003).
Durante a destilação, a maioria dos componentes secundários se concentra no
destilado da cabeça. Um procedimento inicial para abaixar o teor de componentes
secundários consiste em avaliar a eficiência do refluxo na coluna do alambique e
ajustar o tamanho do destilado de cabeça (MAIA & CAMPELO, 2006).
24
A formação de álcoois superiores varia acentuadamente conforme as cepas de
leveduras predominantes. A formação é atribuída, em parte, ao metabolismo do próprio
açúcar (MAIA & CAMPELO, 2006). E sua produção também está relacionada com o
metabolismo do nitrogênio. Depois da desaminação de aminoácidos há a formação de
cetoácidos que são descarboxilados e reduzidos a forma de álcoois superiores
correspondente ao aminoácido, (FIG.4).
Figura 4 - Formação de álcoois superiores
A produção de álcoois superiores parece ser uma característica das leveduras
em geral. As quantidades produzidas variam com as condições de fermentação e
também com o gênero, espécie e provavelmente com a linhagem utilizada (GIUDICI et
al., 1990). Examinando a capacidade de produção de álcoois superiores de cem
linhagens de Saccharomyces cerevisiae, GIUDICI et al. (1990) constataram que a
produção de álcool superior é uma característica individual da linhagem. Os resultados
foram corroborados por OLIVEIRA (2001).
Concentrações de álcoois superiores acima de 400 mg L-1 contribuem para um
flavor indesejável e um gosto residual forte. GUIMARÃES FILHO (2003) produziu
aguardente de banana e verificou que os teores de álcoois superiores se encontravam
25
acima do permitido na legislação brasileira (360 mg L-1). Sugeriu a adição de farelo de
arroz como fonte de nitrogênio para a diminuição de álcoois superiores na bebida.
Em aguardentes de fruta a possibilidade de ocorrência de metanol precisa ser
cuidadosamente examinada. Vários estudos indicam que a adição de enzimas
pectinolíticas induz a um aumento de metanol em produtos fermentados como as
sidras e vinhos (MASSIOT et. al, 1994). Essas enzimas, porém, acham-se presentes
naturalmente nas frutas.
As enzimas pectinolíticas possuem um importante papel no processo de
fabricação de vinho, devido ao fato que elas melhoram a extração de componentes
aromáticos e de cor, facilitam a clarificação e filtração necessária ao vinho. Contudo a
acumulação de metanol durante a fermentação é um grave problema, pois o metanol é
um álcool tóxico para o ser humano. O metabolismo do metanol ocorre no fígado onde
é oxidado. A acidose láctica é uma doença causada pelo aumento de ácido lático no
sangue (MIN CHANG WU, 2005).
É importante controlar a evolução do metanol em aguardentes e outras bebidas
durante o processamento, evitando a necessidade de uma redestilação, que
modificaria as características aromáticas do destilado (ZOCCA et al. 2006).
Para minimizar a concentração de metanol, CLETO (2000) propôs operações
como a filtração e a centrifugação do suco, impedindo o arraste de pectinas para a
fermentação.
Os aldeídos, principalmente o aldeído acético (acetaldeído), são co-produtos
normais da fermentação alcoólica. A produção de acetaldeído pelas leveduras ocorre,
principalmente, durante os estágios preliminares da fermentação, tendendo a
desaparecer no estágio final, desde que não ocorra aeração. A presença de oxigênio
favorece também a formação de outros aldeídos, provenientes da oxidação de álcoois
superiores que, por sua vez são gerados pela degradação parcial de aminoácidos
(MAIA & CAMPELO, 2006).
Os ésteres são produzidos principalmente por atividade metabólica de
microrganismos e, secundariamente, por esterificação química. Devido a maior
quantidade de álcool etílico, tanto nos meios de fermentação quanto na bebida
destilada, o éster formado em maior quantidade é o acetato de etila (SUOMALAINEN,
1971).
Os ésteres contribuem para um aroma de frutas no “bouquet” da bebida (COLE
& NOBLE, 1995). O acetato de isobutila é o responsável pelo aroma de banana.
26
O ácido acético é o ácido orgânico predominante em bebidas fermento-
destiladas. É produzido pelas próprias leveduras durante a fermentação, ou pelas
bactérias acéticas através da oxidação do etanol.
27
3. MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no laboratório de Microbiologia Industrial e Biocatálise
da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais e as análises
físico-químicas das aguardentes no laboratório da empresa LABM Pesquisa e
Consultoria Ltda.
Foram utilizadas bananas da cultivar prata adquiridas na CEASA de Contagem,
provenientes de municípios do Norte do Estado de Minas Gerais.
A enzima usada foi Pectinex Ultra SP-L, originada do Aspergillus aculeatus, e
fornecida pela Novozymes. Sua atividade enzimática é igual a 26000 PG mL-1. A
enzima comercial contém principalmente poligalacturonases, pectinesterase e
hemicelulase.
Nas fermentações utilizou-se como inóculo fermento prensado úmido da marca
Itaiquara.
3.1 Preparo do caldo de banana As frutas escolhidas apresentavam-se em estágio de amadurecimento 6 e eram
excedentes de oferta, mas com boas condições para o preparo da aguardente. Os
frutos selecionados foram embalados para evitar contaminações e para controle de
amadurecimento. O caldo de banana foi obtido com as frutas em último estádio de
amadurecimento (estádio 8).
Após a retirada manual das cascas, a polpa foi triturada em liquidificador (tipo
doméstico) e, em seguida, passada por tela fina para retenção de fibras maiores. A
polpa retida foi lavada com água destilada para extrair açúcares solúveis retidos e
baixar o teor de sólidos solúveis (° Brix) do caldo.
3.2 Hidrólise enzimática Foram realizados testes preliminares com o objetivo de avaliar os níveis a serem
estudados das variáveis independentes, concentração de enzima, temperatura e tempo
de incubação para e também para definir a variável dependente. As variáveis
dependentes avaliadas foram a viscosidade, filtrabilildade.e a clarificação do caldo de
banana.
28
Foi feito um primeiro planejamento experimental (fatorial 23) com três repetições
no ponto central, totalizando onze ensaios. Na TAB. 3 apresentam-se os valores
utilizados no planejamento, enquanto que os valores programados estão na TAB. D1 no Apêndice D.
TABELA 3 - Valores utilizados no Delineamento Composto Central para três fatores
Variáveis -1 0 +1
Concentração de enzimas (% v/p) X1 0,025 0,0625 0,1
Temperatura (°C) X2 30 40 50
Tempo (min) X3 30 75 120
No final desta etapa, realizou-se um Delineamento Composto Central Rotacional
(DCCR) para elaborar o modelo preditivo. Este modelo também chamado de 2° ordem
avalia a influência da concentração de enzima, temperatura e tempo de incubação
sobre a variável resposta definida no ensaio anterior – viscosidade. Na TAB. 4 apresentam-se os valores utilizados no planejamento 23, com quatro repetições do
ponto central. Foram realizados 18 experimentos no total, os quais foram executados
em duplicatas, conforme matriz do planejamento fatorial mostrada na TAB. 5. Os
resultados foram avaliados de acordo com os efeitos de cada variável de entrada e
suas interações verificando a validade da equação quadrática obtida tanto em termos
de coeficiente de determinação quanto de falta de adequação.
Após a seleção da concentração da enzima e da temperatura de hidrólise, essas
variáveis foram mantidas constantes, efetuando-se um estudo cinético, com
acompanhamento da evolução da viscosidade, no intervalo de 20 a 120 minutos.
Todos os ensaios foram realizados em frascos de Erlenmeyer contendo 200 g de
suco de banana, os quais foram mantidos em uma incubadora com temperatura
controlável MA 830 da marca Marconi. Ao final do tempo de hidrólise, as enzimas
presentes nas amostras foram inativadas por aquecimento a 90°C por 5 min, usando
um sistema banho-maria (LEE et al., 2006), e em seguida foram resfriadas em banho
de gelo.
O suco hidrolisado foi centrifugado a 2683 g por 15 min utilizando uma centrífuga
da marca T23 Janetzki.
29
TABELA – 4 Valores utilizados no DCCR para três fatores
Variáveis -1,68 -1 0 +1 +1,68
Conc. de enzimas (% v/p) X1 0,000 0,006 0,015 0,024 0,030
Temperatura (°C) X2 20 24 30 36 40
Tempo (min) X3 20 40 70 100 120
TABELA 5- Delineamento Composto Central Rotacional
* Preparado enzimático contendo pectinases
3.2.1 Viscosidade A viscosidade do suco de banana hidrolisado foi determinada usando um
viscosímetro AVS 350 da marca “Schott”, capilar número 300, tipo 520 23 de 1,26 mm
de diâmetro, com o princípio de funcionamento baseado no tempo de escoamento.
Sendo N2 a viscosidade do líquido de referência, a água, a viscosidade absoluta do
líquido da amostra pode ser calculada pela equação 1:
Ensaios Variáveis codificadas Variáveis Reais
X1 X2 X3 E* % (v/p) T (°C) t (min)
1 1 1 1 0,024 36 100
2 -1 1 1 0,006 36 100
3 1 -1 1 0,024 24 100
4 -1 -1 1 0,006 24 100
5 1 1 -1 0,024 36 40
6 -1 1 -1 0,006 36 40
7 1 -1 -1 0,024 24 40
8 -1 -1 -1 0,006 24 40
9 -1,68 0 0 0 30 70
10 1,68 0 0 0,03 30 70
11 0 -1,68 0 0,015 20 70
12 0 1,68 0 0,015 40 70
13 0 0 -1,68 0,015 30 20
14 0 0 1,68 0,015 30 120
15 0 0 0 0,015 30 70
16 0 0 0 0,015 30 70
17 0 0 0 0,015 30 70
18 0 0 0 0,015 30 70
30
1 1 1
2 2 2
N t dN t d
= (1)
Sendo: N1 – viscosidade da amostra; N2 – viscosidade do líquido de referência t1 – tempo de escoamento da amostra no capilar de Ostwald; t2 – tempo de escoamento da água no capilar de Ostwald; d1 – densidade da amostra; d2 – densidade da água.
O tempo de escoamento no capilar de Ostwald foi determinado submergindo as
amostras em banho de água a 25°C. Empregando a água como padrão, calculou-se a
viscosidade de suco clarificado de banana utilizando a referência da viscosidade da
água a 25°C que é 8,9 x10-4 N m-2.s equivalente a 0,890 cP (FARMACOPÉIA, 1996).
3.2.2 Densidade A densidade das amostras foi determinada pela média dos valores de volume e
massa medidos a uma temperatura de 25°C. Foram tomados seis volumes de 5mL,
10mL, 15mL, 20mL, 25mL e 30mL de amostras que foram sendo adicionados e em
seguida tiveram sua massa medida em balança analítica. A densidade média das
amostras foi calculada por meio da equação 2:
mv
ρ =
(2)
Sendo: ρ = densidade, m = massa, v = volume. 3.2.3 Modelo experimental e análise estatística Os dados obtidos com o planejamento experimental foram analisados com o
programa MINITAB para o cálculo do modelo matemático e análise de variância. O
programa Maple 9 e o programa de estatística R foram utilizados para construção do
gráfico em curva de nível e superfície de resposta. O modelo de composição central
rotacional foi empregado para estudar a combinação de três variáveis independentes –
31
concentração de enzima, temperatura e tempo de incubação – codificadas como 1x ,
2x e 3x , respectivamente. Cada variável experimental possui níveis 1, 0, -1, -1,68 e
+1,68. Um total de 18 combinações incluindo quatro replicatas do ponto central (0) e
seis dos pontos axiais (+1,68 e -1,68). A função resposta ( y ) medida foi viscosidade
do suco de banana. As variáveis de cada fator estimado foram divididas em linear,
quadrático e interação entre os componentes, como representado na equação 3:
2333
2222
211132233113211232222211 xbxbxbxxbxxbxxbxbxbxbxbby o ++++++++++= (3)
Os coeficientes do polinômio foram representados por bo (termo constante), b1,
b2 e b3 (efeitos lineares), b11, b22 e b33 (efeito quadrático), b12, b13 e b23 (efeitos de
interação). A tabela de análise de variância (ANOVA) gerou os coeficientes de
regressão e os termos individuais lineares, quadráticos e de interação foram
determinados. A significância de todos os termos polinomiais foi julgada
estatisticamente considerando o valor de F e a probabilidade p = (0,05). Os
coeficientes de regressão também foram usados para fazer os cálculos estatísticos e
gerar os mapas de contornos a partir do modelo de regressão.
3.3 Fermentação: Efeito de diferentes fontes de N e da quantidade de inóculo na formação de álcoois superiores
Foram avalia dos oito meios de fermentação, com diferentes fontes de nitrogênio
e concentração de inóculo. Foram testadas duas concentrações de fermento prensado
úmido (Saccharomyces cerevisiae): 40 g L-1 e 20 g L-1. As fontes de nitrogênio testadas
foram o farelo de arroz, a 1,0 g L-1 e o sulfato de amônio a 0,1 g L-1 e a 0,4 g L-1
(GUTIERREZ, 1993) (TAB. 6). O farelo de arroz possui uma concentração de proteína
em média igual a 13,70% em matéria seca (AMISSAH et al., 2003).
Antes da fermentação, o caldo de banana sofreu um tratamento enzimático nas
condições (0,03% v/p de enzimas, 30°C e 70 min).
As fermentações foram conduzidas em frascos de Erlenmeyer de 250 mL
contendo 100 mL de caldo de banana. Os frascos foram incubados em estufa à
temperatura de 30°C, sob agitação de 150 rpm por 24 horas.
32
Ao final da fermentação as amostras foram centrifugadas, armazenadas em
frascos e congeladas (-10°C) para análises posteriores. Foi determinado no caldo
fermentado o teor de etanol e o teor de álcoois superiores (n-propanol, isobutílico e
isoamílico).. Os álcoois superiores foram determinados em cromatógrafo a gás, modelo
CG-37, com detector de ionização de chama.
TABELA 6 –Fontes de nitrogênio adicionadas aos meios de fermentação e concentração do inóculo
Amostras Fonte de Nitrogênio g L-1
Inóculo g L-1
1 Farelo de arroz 1,0
40 2 (NH4)2SO4 0,1
3 Controle -
4 Farelo de arroz 1,0
20 5 (NH4)2SO4 0,1
6 (NH4)2SO4 0,4
7 Controle -
3.3.1 Análise estatística dos ensaios de fermentação Foi feita a análise de variância (ANOVA) e a comparação entre as médias pelo
teste de Duncan a 5% de probabilidade com os resultados obtidos nos ensaios de
fermentação (PIMENTEL- GOMES, 2000).
3.4 Processo de produção da aguardente de banana O processo de elaboração da aguardente de banana está apresentado no
fluxograma da FIG.5.
A hidrólise enzimática e a fermentação foram efetuadas considerando as
melhores condições encontradas no processo de otimização da hidrólise do suco de
banana e no estudo da concentração de inóculo e fonte de nitrogênio mais adequada
para a de fermentação.
33
Seleção
Limpeza
Descascamento
Água
Cascas
Banana
Trituração
Ajuste do Brix
Centrifugação Polpa da Centrifugação
Fermentação
Fermento DecantadoDecantação
Destilação
Aguardente
Fermento eNutrientes
Água
Caldo
Hidrólise Enzimática
Vinhoto, cabeça e cauda
FIGURA 5 - Fluxograma da produção de aguardente de banana.
3.4.1 Preparo do mosto As bananas utilizadas do cultivar prata apresentavam-se em último estágio de
amadurecimento, portanto, com uma maior quantidade de açúcares fermentescíveis.
Para a obtenção da aguardente de banana aproximadamente 30,0 kg da fruta com uma
média de sólidos solúveis de 23° Brix foi triturada em liquidificador doméstico. Em
seguida a polpa foi diluída com água destilada até atingir 15°Brix. A massa do caldo
diluído foi de 33,7 kg. A medida de sólidos solúveis do caldo de banana foi realizada
em um refratômetro manual com escala de 0 a 32 °Brix. O valor 15° Brix está de
34
acordo com a recomendação de GUIMARÃES FILHO (2003), para a fermentação do
suco de banana.
3.4.2 Hidrólise Enzimática Para a hidrólise enzimática do suco de banana utilizou-se a enzima Pectinex
Ultra SP-L. Foram aplicadas as melhores condições de concentração de enzima,
temperatura e tempo de incubação definidas no processo de otimização da hidrólise. A
concentração de enzima utilizada foi de 0,025% v/p à temperatura ambiente por 70
min.
3.4.3 Fermentação A fonte e a concentração de nitrogênio, assim como a quantidade de inóculo
adicionada ao meio de fermentação foi escolhida com base nos ensaios realizados
anteriormente visando uma menor produção de álcoois superiores pelas leveduras
durante a fermentação.
O suco foi inoculado com fermento comercial prensado úmido a uma
concentração de 20 g L-1. Ao suco foi adicionado sulfato de amônio a uma
concentração de 0,01 g 100 mL-1 de amostra.
A fermentação foi conduzida em dornas de aço de aproximadamente
30 litros de capacidade, as quais foram cobertas com gaze, à temperatura ambiente. O
término da fermentação foi determinado pela estabilização da leitura do ° Brix, isto é,
com a leitura de dois valores iguais e consecutivos, em um período de 2 horas entre as
leituras.
O volume do suco fermentado foi de 16,8 L. Foram determinados no vinho de
banana (suco fermentado) os teores de sólidos solúveis (° Brix), açúcares redutores
totais (ART), acidez total titulável, etanol, pH, acidez, álcoois superiores (álcool
isoamílico, propílico, isobutílico) e metanol.
3.4.4.Destilação Depois de completada a fermentação alcoólica, o vinho foi centrifugado e
destilado em alambique de cobre de um corpo de 20 L de capacidade. Foram
separadas as frações de cabeça (10%), coração (80%) e cauda (10%).
35
A fração do coração (correspondente à aguardente) foi coletada até se obter um grau
alcoólico de 42 % v/v a 20 ºC. A aguardente foi armazenada por 15 dias à temperatura
ambiente em garrafas de vidro transparente com tampas metálicas, vedadas com
parafilme. Posteriormente foram feitas as análises dos compostos secundários da
aguardente exigidos pela legislação brasileira
3.4.5 Métodos analíticos O pH do caldo de banana foi determinado em potenciômetro digital, marca
quimis.
3.4.5.1 Determinação dos açúcares redutores totais (ART) no caldo de banana e no vinho Para a determinação dos açúcares redutores totais no mosto e no vinho de
banana foi utilizada a metodologia do DNS (ácido 3,5 – dinitrossalicílico) desenvolvida
por MILLER (1959). Como o suco de banana contém açúcares redutores (glicose e
frutose) e açúcares não redutores como a sacarose, esta determinação foi precedida
de uma hidrólise ácida, para conversão da sacarose em açúcares redutores. Uma
alíquota de 2 mL da amostra foi transferida para frasco de Erlenmeyer de 25 mL e
adicionou-se 5 mL de ácido clorídrico 2 mol L-1. O frasco foi colocado em banho-maria
a 70º C durante 30 minutos. Em seguida foi resfriado e seu conteúdo neutralizado com
5 mL de hidróxido de sódio 2 mol L -1. Transferiu-se a amostra para um balão
volumétrico de 100 mL e o volume completado com água destilada. Quando
necessárias outras diluições foram feitas nas amostras, para que a concentração das
mesmas estivesse dentro da faixa de linearidade da curva de calibração.
3.4.5.2 Acidez total do caldo de banana e do vinho Foi determinada por titulometria, com hidróxido de sódio 0,025 mol L-1, segundo
ABNT (1997). O método de determinação de acidez titulável total consiste na
neutralização dos ácidos totais presentes na amostra, pela base. Para o cálculo de
acidez titulável utilizou-se a equação 4:
10Vt fc C MMA
Va× × ×
=×
(4)
36
Sendo: A = acidez expressa em g de ácido acético por 100 mL de amostra; Vt = volume gasto em mL de solução de NaOH 0,025 mol.L -1; fc = fator de correção da solução de NaOH 0,025 mol.L -1; C= concentração da solução de NaOH 0,025 mol.L -1; MM= massa molar do ácido acético (60,0 g mol -1); Va = volume em mL da alíquota da amostra. 3.4.5.3 Dosagem de etanol Para a determinação do etanol, as amostras foram previamente destiladas por
arraste de vapor, em microdestilador de álcool (Modelo Te-012). A concentração de
etanol foi determinada espectrofotometricamente pelo método do dicromato de
potássio modificado (SALIK & POVOH, 1993). Nesta reação, em meio ácido, o etanol é
oxidado a ácido acético e a solução adquire tonalidade verde proporcional á
concentração de etanol na amostra. O íon dicromato de cor amarela é reduzido a íon
cromoso, de cor verde, que absorve a 600 nm. A intensidade da absorção é
proporcional á concentração de íon cromoso formado e do etanol oxidado (CROWELL,
1961).
3.4.5.4 Análises físico-químicas da aguardente
As análises físico-químicas da aguardente foram realizadas no Laboratório
LABM, em Belo Horizonte. As amostras da aguardente de banana foram submetidas às
análises para a determinação do grau alcoólico e de seus compostos secundários. A
determinação do grau alcoólico, a acidez volátil e a dos ésteres em acetato de etila
foram realizadas de acordo com as normas da ABNT (1997). A determinação do
acetaldeído foi feita de acordo com a norma ABNT (1998). Os álcoois superiores (n-
propanol, álcool isobutílico e álcool isoamílico) e o metanol foram determinados por
cromatografia gasosa. O cromatógrafo utilizado de Modelo CG-37, com detector de
ionização de chama. As condições de análise foram as seguintes: Coluna 15%
Hallcomid M18 sobre chromosorb WHP 100 a 120 mesh; fluxo de ar: 300 mL/min (3 a 4
s); Fluxo do hidrogênio: 30 mL / min (38 a 40 s); fluxo de nitrogênio: 30 mL / min.;
temperatura da coluna: 82 ºC; temperatura do injetor: 130-150 ºC; temperatura do
detector: 170 ºC; tempo de varredura: 70 min.
37
3.4.6 Rendimento em etanol (%)
O rendimento em etanol é determinado pela quantidade de etanol formada em
relação ao teor de açúcar redutor total no mosto. E expresso em porcentagem. A
quantidade de etanol esperado é calculada considerando-se que 1 g de açúcares
redutores produz 0,511 g de etanol, segundo a equação estequiométrica de Gay-
Lussac.
Rendimento (%) = Etanol produzido x 100 = Etanol produzido (g L-1) x 100
Etanol esperado ART inicial x 0,511
38
4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização físico-química do caldo de banana Os resultados da caracterização do caldo de banana do cultivar prata são
apresentados na TAB. 7.
O teor de sólidos solúveis totais na polpa in natura variou de 23,0 a 24,0 °Brix,
faixa semelhante à encontrada por GUIMARÃES FILHO (2003), para a banana
Nanicão, que foi de 23,2 a 24,0°Brix. A densidade do caldo a 15° Brix foi em média
1,062 g mL-1, valor similar ao obtido por ALMEIDA (1935), que foi de 1,02 a 1,06 e
similar (0,999 g mL-1) ao obtido por LOPES (2005) em suco de banana nanicão. O valor
de acidez titulável para o caldo de banana foi 0,28 g de ácido acético por 100 mL de
suco, valor similar a 0,31 g de ácido acético por 100 mL de suco encontrado por
LOPES (2005) e GUIMARÃES FILHO (2003).
O valor de pH da polpa de banana antes da adição de nutrientes e do inóculo
variou de 4,6 a 4,4. Esta diminuição do pH pode ser devido a liberaçao de unidades de
ácidos galacturônicos provenientes da hidrólise enzimática.
TABELA 7 – Caracterização do caldo de banana Parâmetro Unidade Média
Densidade a15°Brix g mL-1 1,062 ± 0,007
Acidez titulável g 100 mL -1 amostra 0,279 ± 0,003
Concentração ART g L-1 150,8 ± 1,1
pH - 4,6
4.2 Hidrólise enzimática 4.2.1 Análise Estatística
Os experimentos preliminares foram válidos para definição dos níveis das
variáveis - concentração de enzimas, tempo e temperatura de hidrólise. As variáveis
dependentes avaliadas - filtrabilidade e clarificação não foram relevantes para este
estudo, portanto, a viscosidade foi avaliada e escolhida como resposta dos
experimentos de hidrólise enzimática do suco de banana (TAB. 8).
39
TABELA 8 –. Delineamento composto central e viscosidade
Ensaio X1a X2b X3c Yd
1 -1 -1 -1 1,25
2 1 -1 -1 1,22
3 -1 1 -1 1,24
4 1 1 -1 1,21
5 -1 -1 1 1,25
6 1 -1 1 1,20
7 -1 1 1 1,22
8 1 1 1 1,19
9 0 0 0 1,23
10 0 0 0 1,24
11 0 0 0 1,22 a concentração de enzima (% v/p) b temperatura (°C) c tempo (min) d viscosidade (cP)
Os níveis da concentração de enzimas (0,025-0,1%v/p), temperatura
(30-50°C) e tempo (30-120 min) não foram adequados, pois, as respostas para a
viscosidade foram muito próximas. E ao se tentar ajustar um modelo os coeficientes
das variáveis explicativas não foram significativos. Além disso, o R2 foi muito baixo.
Sendo assim, foi necessário testar outros valores para os níveis de concentração de
enzimas, temperatura e tempo de incubação.
Os valores experimentais para a viscosidade sob diferentes condições de
concentração de enzimas e tempo de hidrólise estão apresentados na TAB. 9. Os
cálculos realizados para a determinação da viscosidade encontram-se no Apêndice A5. Com os resultados obtidos foi possível determinar os coeficientes de regressão
que estão apresentados na TAB. 10. Com exceção do termo linear da temperatura
( 2x ), das interações da concentração de enzima e da temperatura ( 1x 2x ), e das
interações tempo e temperatura ( 2x 3x ), todos os parâmetros do modelo foram
altamente significativos a 5% de probabilidade. O modelo matemático empírico,
codificado de 2ª ordem encontrado, está apresentado na Equação 5. Este modelo foi
obtido a partir da regressão linear múltipla (modelo quadrático) dos dados
experimentais. Para que o modelo fosse adequado foi sugerido pelo programa
MINITAB que o ensaio 8 e 9 fossem abandonados, pois, uma análise inicial verificou
40
ensaios com valores de respostas discrepantes, outliers, e o ajuste feito foi ruim,
obtendo-se um R2 fraco, 51,9%. Além disso, a única variável significativa do modelo foi
1x .
3123
2131 486,0000073,035540222,019618,4 xxxxxxy +++−−= (5)
TABELA 9 – DCCR para a hidrólise enzimática e viscosidade.
Ensaio 1x a 2x b 3x c 1y 2y y d
1 1 1 1 1,209 1,199 1,204
2 -1 1 1 1,686 1,736 1,711
3 1 -1 1 1,243 1,441 1,342
4 -1 -1 1 2,303 2,137 2,220
5 1 1 -1 1,219 1,214 1,217
6 -1 1 -1 2,59 2,402 2,496
7 1 -1 -1 1,28 1,31 1,295
8 -1 -1 -1 1,968 2,43 2,199
9 -1,68 0 0 5,26 4,84 5,050
10 1,68 0 0 1,189 1,193 1,191
11 0 -1,68 0 1,243 1,22 1,232
12 0 1,68 0 1,238 1,362 1,300
13 0 0 -1,68 1,737 1,738 1,738
14 0 0 1,68 1,209 1,201 1,205
15 0 0 0 1,27 1,303 1,287
16 0 0 0 1,269 1,382 1,326
17 0 0 0 1,352 1,286 1,319
18 0 0 0 1,528 1,525 1,527 a concentração de enzima (% v/p) b temperatura (°C) c tempo (min) d média para a viscosidade (cP)
41
TABELA 10 - Coeficiente de regressão para a resposta ( y )
Interações Coeficiente de regressão
Erro padrão p – valor*
Constante 4,176 0,250 0,000
1x - 196,48 19,06 0,000
3x - 0,022 0,005 0,000
2
1x 35554,1 459,8 0,000
2
3x 0,00007 0,00003 0,029
1x 3x 0,486 0,137 0,001
* Teste t
Na TAB. 11 estão apresentados os resultados da Análise de Variância (ANOVA).
TABELA 11 – ANOVA para a resposta y .
Fonte de variação
Graus de liberdade
Quadrado Médio
F calc p-valor
Regressão 5 0,977 0,000
Resíduos 27 0,020 47,93
Falta de ajuste 2 0,045 0,105
Erro Puro 25 0,018
Total 32
Como F calculado para a regressão é significativo e a porcentagem de
variação (R2) pelo modelo foi boa, cerca de 90%, então, o modelo se ajusta bem aos
dados experimentais. O coeficiente de determinação R2 é uma medida da proporção da
variação explicada pela equação de regressão em relação à variação total das
respostas (RODRIGUES, 2005).
42
Na FIG. 6, observa-se boa concordância entre os valores preditos e os valores
experimentais, há uma distribuição praticamente aleatória entre os resíduos dos ensaios,
sugerindo resíduos independentes.
FIGURA 6 - Valores experimentais versus valores preditos para a resposta y .
4.2.2 Efeito da concentração de enzima, temperatura e tempo na viscosidade O termo linear, concentração de enzimas, tem um efeito negativo na
viscosidade (p< 0,001). A viscosidade foi reduzida com o aumento da concentração de
enzima. Com um tempo de incubação próximo de 70 min e concentração de enzima
0,020% v/p obteve-se valores menores de viscosidade (aproximadamente 1,0 cP). As
substâncias pectináceas possuem alta capacidade de reterem água, devido a uma
estrutura de rede bastante coesa. A degradação da pectina pelas enzimas reduz esta
capacidade e, portanto, a água liberada no sistema irá reduzir a viscosidade (YUSOF,
2006; LEE, 2005). O tempo de hidrólise, termo linear, também afetou a viscosidade,
possuindo um efeito negativo (p<0,001).
O tempo mínimo de hidrólise é inversamente proporcional à concentração da enzima. A
menor viscosidade do caldo foi obtida usando 0,03% v/p de enzima durante 30 min;
com a metade da concentração (0,015%) foram necessários 120 min para atingir a
mesma viscosidade na concentração de 0,03%. Na concentração de 0,03%, o emprego
da enzima onera o custo do litro de suco de banana em R$ 0,02.
43
Com uma concentração de 0,025% de enzimas Pectinex Ultra-SP e uma
temperatura de hidrólise igual a 30°C os valores obtidos de viscosidade em função dos
tempos utilizados nos testes de cinética para o suco de banana encontram-se na FIG.7. Há uma relação inversa entre a viscosidade e o tempo de hidrólise. Se
aumentarmos o tempo de hidrólise a viscosidade do suco de banana diminui até atingir
um patamar mínimo.
FIGURA 7 – Viscosidade da polpa em função tempo
Com os efeitos quadráticos de concentração de enzima (p<0,05) e tempo
(p<0,05), a viscosidade relaciona-se positivamente. O efeito de interação entre a
concentração de enzimas e tempo de incubação foi positivo (p<0,05) para a
viscosidade.
No tratamento enzimático, não se observou variação do valor obtido na
viscosidade variando a temperatura entre 30 e 50°C. Portanto, a hidrólise pode ser
realizada em temperatura ambiente, o que elimina despesas com energia para
aquecimento do caldo. Conforme as condições utilizadas no processamento de hidrólise enzimática, a
viscosidade variou de 1,19 a 5,05 cP. Houve uma redução da viscosidade de 76,4 %
com o tratamento enzimático (Apêndice C).
PHEENTAVEERAT & AMPRUNG (1993) observaram sinergismo de atividade
enzimática na diminuição da viscosidade do suco de banana madura, após incubação
com 0,06% p/p de celulases e 0,05% p/p de pectinase a 45°C, por 2 horas.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (min)
visc
osid
ade
(cP)
44
Considerando que o modelo quadrático foi válido para a variável resposta, o
mesmo foi usado para gerar a superfície de resposta e encontrar as faixas das
variáveis em estudo que minimizem a viscosidade no suco de banana
(FIG. 8).
FIGURA 8 - Superfície de resposta para viscosidade em função da concentração de enzima e do tempo
4.2.3 Otimização
As condições ótimas para minimizar a viscosidade foram 0,022% v/p de enzimas
Pectinex Ultra Sp e tempo de incubação igual á 78 minutos. Valores próximos foram
testados sem haver resultados com diferenças significativas. O gráfico de contorno
(FIG. 9) comprova esses resultados, apresentando uma faixa ótima para a
concentração de enzimas e tempo de incubação.
LEE et al., (2006) encontrou concentração de Pectinex Ultra Sp (0,084% v/p)
maior que a deste trabalho, temperatura de 43,2°C e tempo de incubação de 80 min na
otimização da hidrólise.
YUSOF (2006) empregou a enzima Pectinex 3X L para diminuir a viscosidade do
suco de sapodilla, as condições otimizadas foram 1% v/p de enzima, 40°C e tempo de
incubação de 120 minutos.
GUIMARÃES FILHO (2003), na fabricação de aguardente de banana, empregou
a hidrólise enzimática para clarificar o suco. A concentração de enzimas Pectinex Ultra
45
Sp utilizada foi de 0,025% v/p, temperatura e o tempo de incubação foram
respectivamente, 40°C e 90 min, neste trabalho o aumento da temperatura não teve
influência significativa, a hidrólise foi realizada a temperatura ambiente.
FIGURA 9 - Curva de contorno para a viscosidade (cP) em função da
concentração de enzima e tempo
A enzima pectinolítica Pectinex Ultra Sp, na concentração de 0,03% v/p,
propiciou um rendimento médio de suco de banana centrifugado de 80,0%, valor
próximo aos 81,12% obtido por GUIMARÃES FILHO (2003) por meio de filtração e
superior aos 61,1 % obtidos por CARDOSO et al. (1999) por filtração.
Se o suco fosse obtido sem hidrólise enzimática somente por centrifugação, o
rendimento seria aproximadamente 28% em volume extraído. Portanto, o emprego do
complexo enzimático à base de poligalacturonases, pectinesterases e hemicelulases
permitiram aumentar em 52,2 % o rendimento da extração do suco da polpa da banana
(em volume), segundo cálculos apresentados no Apêndice C.
46
4.3 Fermentação: Efeito da adição de diferentes fontes de N e da
quantidade de inóculo na formação de álcoois superiores no vinho de
banana Na TAB. 12 estão apresentadas as concentrações de álcoois superiores no
vinho de banana obtido nas fermentações adicionadas de duas diferentes fontes de
nitrogênio (farelo de arroz a 1,0 g L-1, sulfato de amônio a 0,1 g L-1). Comparando as fontes de nitrogênio, a inorgânica (sulfato de amônio) propiciou
valores mais baixos para todos os álcoois superiores, corroborando o trabalho de
(VIDRIH, 1999).
Com a concentração de inoculo 40 g L-1 não foi observado diferença significativa
na concentração do álcool propílico entre a fonte de nitrogênio amoniacal e protéica.
No entanto, houve redução significativa na concentração de todos os álcoois superiores
analisados para as duas fontes de nitrogênio em relação ao ensaio controle. Houve
redução significativa da concentração do álcool isobutílico com a adição de nitrogênio
protéico e amoniacal corroborando os resultados encontrados por GUTIERREZ (1993),
quando comparou diferentes fontes de nitrogênio na produção de álcoois superiores
em meio sintético. A concentração do álcool isoamílico foi reduzida significativamente
com a adição de nitrogênio amoniacal, tanto em relação ao ensaio controle como em
relação à adição do nitrogênio protéico.
TAB. 12 - Álcoois superiores formados na fermentação a 30°C com inóculo de 40 g L-1.
Teste Fonte e concentração de
nitrogênio
Álcoois superiores (mg/100 mL de amostra)
n-propílico* Isobutílico* Isoamílico* Totais
1 Farelo de arroz, 1 g/L 7,29 ab 12,03 b 31,43 b 50,75
2 (NH4)2SO4 , 0,1g/L 3,36 b 10,58 b 26,54 c 40,48
3 Controle 8,85a 17,22 a 48,14 a 74,21
Médias em uma mesma coluna indicadas pela mesma letra não difere a 5% de probabilidade pelo teste de Duncan.
Os valores dos álcoois superiores produzidos quando o inóculo foi de 20 g L-1
estão na TAB. 13. Analisando a tabela observa-se que quando utilizou-se como fonte
de nitrogênio o sulfato de amônio na concentração de 0,4 g/L houve uma redução
47
significativa na concentração de cada um dos álcoois superiores analisados em relação
ao ensaio controle e em relação ao ensaio adicionado de farelo de arroz.
TAB. 13 – Álcoois superiores formados na fermentação a 30°C com inóculo de 20 g L-1.
Teste Fonte e teor de nitrogênio
Álcoois superiores (mg/100mL de amostra)
n-propílico* Isobutílico* Isoamílico* Totais
1 Farelo de arroz 1g/L
9,81 a 12,75 a 32,08 a 54,64
2 (NH4)2SO4 0,1g/L
4,26 b 10,79 a 30,50 a 45,55
3 (NH4)2SO4 0,4g/L
2,60 b 6,30 b 13,35b 22,25
4 Controle 9,21 a 12,42 a 31,64 a 53,27 Médias em uma mesma coluna indicadas pela mesma letra não difere a 5% de probabilidade pelo teste de Duncan.
Valores encontrados nos meios suplementados com farelo de arroz ficaram
próximos aos meios sem adição de suplementos e com concentração reduzida para
20 g L-1. (Tab.13). Comparando-se os resultados obtidos entre os ensaios adicionados
de sulfato de amônio nas duas concentrações testadas, verifica-se diminuição
significativa das concentrações dos álcoois isobutilíco e isoamílico na concentração de
0,4 g L-1. AYRAPAA (1971) também observou diminuição de álcoois superiores com o
aumento da quantidade de nitrogênio amoniacal no meio. Os álcoois superiores podem
ser produzidos pela levedura a partir de esqueletos carbonados dos aminoácidos,
assimilados durante a fermentação alcoólica. O grupamento amina dos aminoácidos é
removido por transaminação, e o ácido cetônico correspondente é descarboxilado em
aldeído que pode ser reduzido pela enzima, álcool desidrogenase, promovendo assim
a formação de álcool superior com um carbono a menos que o aminoácido de origem
(BARRE et al., 2000). Portanto, se não há nitrogênio disponível no meio, as leveduras
recorrem ao nitrogênio dos aminoácidos.
Comparando os resultados obtidos utilizando diferentes concentrações de
inóculos (tabelas 12 e 13), observa-se que a diminuição da concentração de inóculo
acarretou redução dos álcoois isobutílico e isoamílico, corroborando RAMSAY &
BERRY (1984), segundo os quais a formação de álcoois superiores em uísques pode
ser regulada por diferentes níveis de inóculo na fermentação. Portanto, embora
48
geralmente se utilize o teor de fermento de 40 g L-1 para a fermentação do caldo de
cana (destinada à produção de cachaça), esse teor é excessivo para a produção de
aguardente de banana.
GUIMARÃES FILHO (2003) encontrou concentrações maiores de álcoois
propílico, isobutílico e isoamílico, em vinho de banana, sem adição de fonte de
nitrogênio, valores respectivamente iguais a 26,96; 8,28 e 27,62 mg 100 mL-1 de
amostra. O total de álcoois superiores encontrados pelo mesmo autor (62,86 mg 100
mL-1) é superior ao valor encontrado neste trabalho no vinho com concentração de 0,4
g.L-1 e inóculo de 20 g.L-1.
GUTIERREZ (1993) concluiu em seu trabalho sobre produção de álcoois
superiores durante a fermentação em meio sintético, que as leveduras de panificação
formaram teores de álcoois superiores, estudados em diversas condições (pH,
temperatura, fonte de nitrogênio e concentração de açúcar) mais elevados que em
linhagens selecionadas.
A formação de álcoois superiores nos vinhos depende de vários fatores, entre os
quais pode ser citada a composição do mosto original (pH, concentração de açúcares,
conteúdo de nitrogênio), o tipo de levedura utilizada na fermentação, condições em que
ocorre a fermentação como a temperatura, o nível de aeração (OUGH, 1996).
4.4 Produção da aguardente de banana No suco obtido por centrifugação após o tratamento enzimático, a acidez total foi
de (0,279 + 0,003) g 100 mL-1, o valor do pH foi igual a 4,4. Houve um ligeiro
abaixamento do pH provavelmente devido a liberação de ácido galacturônico pela
hidrólise da pectina. A densidade do suco após hidrólise foi igual a 1,062 g mL-1.
As condições de concentração de enzima, temperatura e tempo utilizados foram
de acordo com a faixa mais adequada, determinada pelo modelo DCCR para obter
uma viscosidade mais baixa. A concentração de enzima, temperatura e tempo foram:
0,03%, 30°C e 70 min respectivamente.
A fermentação ocorreu até que o teor de sólidos solúveis permanecesse
constante, o que ocorreu em torno de 4° Brix. A concentração dos açúcares redutores
totais foi igual a 0,079 g L-1 no vinho. Foram obtidos 16 litros de vinho de banana, que
foram destilados em alambique de cobre de capacidade de 20 L.
Foi produzido um volume de 1800 mL de aguardente de banana, a partir de
33,7 kg de polpa de banana diluída para 15° Brix
49
4.4.1 Metabólitos analisados no vinho Por meio de cromatografia gasosa foi analisada a concentração média de quatro
metabólitos secundários (metanol, n-propanol, isobutanol e álcool isoamílico). Em
média, ao final de 24 horas de fermentação realizada nas condições otimizadas, os
valores encontrados para os compostos mencionados acima foram respectivamente,
7,09; 2,95; 8,99; 20,78 expressos em mg 100 mL-1 de mosto. Estes valores são
menores do que os encontrados por GUIMARÃES FILHO (2003), na fermentação de
suco de banana da cultivar nanica, que seguindo a mesma ordem foram: 16,25; 26,96;
8,28; 27,62. Portanto, a adição de fonte de nitrogênio, na forma de amônio contribuiu
para diminuir a concentração de álcoois superiores no vinho.
CLETO (2000), em estudos sobre o efeito da lecitina em mosto de cana-de-
açúcar, laranja e uva, nas análises das aguardentes produzidas, constatou total
ausência de metanol, o que atribuiu ao processo tecnológico empregado, qual seja:
filtração, clarificação, centrifugação, pasteurização, não permitindo a passagem de
materiais que contivessem pectina, para a fermentação.
A acidez no vinho encontrada foi (0,496 + 0,006) g 100mL-1 de álcool anidro,
valor classificado como médio por OLIVEIRA (2001) em vinhos originados de cana-de-
açúcar.
4.4.2 Rendimento em etanol da aguardente
O rendimento está relacionado á produção de etanol originada da metabolização
da glicose pela via glicolítica. Cada grama de açúcar redutor resulta na produção de
0,511 g de etanol. A polpa de banana utilizada apresentou-se com um teor de
açúcares redutores de 149,85 g L-1. Considerando a densidade do etanol a 20°C
(d = 0,78 g mL-1), o rendimento em etanol da fermentação foi de 71%. 4.4.3 Álcoois Superiores
A concentração de 410 mg de álcoois superiores totais por 100 mL de álcool
anidro está acima do limite definido na legislação vigente. No entanto, está bem abaixo
de valores já relatados na literatura, que chegam a quase 1000 mg 100 mL-1 álcool
anidro (GUIMARÃES FILHO, 2003) e 838,6 mg 100 mL-1 álcool anidro (LOPES, 2005).
Certamente a concentração poderia ser ajustada ao máximo permitido mediante uma
50
redução do volume do destilado de coração (MAIA & CAMPELO, 2006). Com efeito, o
teor alcoólico de 38º GL evidencia que o corte destilado de coração foi tardio,
relativamente ás práticas mais comuns, que resultam em teores alcoólicos mais
elevados. Se o mesmo destilado fosse recolhido com 42º GL, mesmo que não
houvesse redução na quantidade total de álcoois superiores, o teor relativo ao álcool
anidro já cairia para 370,9. Fica claro que, antecipando o corte, a quantidade total de
álcoois superiores sofreria uma redução suficiente para enquadrar seu teor nos limites
da legislação.
Em alambique de coluna, o ajuste poderia ser feito mediante aumento no
número de bandejas (CLAUS, 2004).
4.4.4 Compostos secundários determinados Os valores encontrados para os compostos secundários da aguardente de
banana produzida encontram-se na TAB. 14.
A aguardente apresentou todos os compostos secundários dentro do limite
exigido pela legislação brasileira, com exceção de álcoois superiores e acidez, em
ácido acético.
TABELA 14 - Média das análises químicas da aguardente de banana produzida.
Parâmetro Unidade Resultado Referência (*)
Teor alcoólico °GL (20°C) 38,0 36-54 Acetaldeído
mg/ 100 mL de álcool anidro
14 < 30 Ésteres em acetato de etila 20,5 < 200
Acidez total, em ácido acético 166,0 < 150
Álcoois Superiores totais 410,1 < 360 n-propanol 25,6 - Isobutílico 123,1 - isoamílico 261,3 - Metanol 76,3 < 200 Furfural 0,5 < 5
(*) MAPA, 2005.
51
4.4.4.1 Teor alcoólico O teor alcoólico foi de 38,0°GL, valor situado na parte inferior da escala definida
na legislação (36 a 54º GL). O valor é definido pelas condições da destilação,
notadamente pelo grau de refluxo dos vapores dentro da coluna do alambique e pelos
pontos de corte dos destilados de cabeça e de coração (MAIA & CAMPELO, 2006).
Valores mais elevados, da ordem de 42º GL, podem ser obtidos com facilidade para
aguardentes de frutas (ALVARENGA, 2006; LOPES, 2005; GUIMARÃES FILHO,
2003).
4.4.4.2 Metanol A quantidade de metanol encontrada, 76,3 mg/100mL de etanol, ficou bem
abaixo do valor máximo permitido pela legislação. GUIMARÃES FILHO (2003) detectou
concentração elevada, 420,67 mg 100 mL-1 de álcool anidro e LOPES (2005) de 122,3
mg 100 mL-1 de álcool anidro em aguardente de banana. ALVARENGA (2006)
encontrou 79,4 mg de metanol por 100 mL de álcool anidro em aguardente de manga.
Em aguardente de cidra MADRERA (2005), detectou um teor de 158,2 mg 100 mL-1 de
álcool anidro de metanol. Enquanto, SOUFLEROS (2003), encontrou 196 mg 100 mL-1.
BAUER – CHRISTOPH et al (1997), estudando os compostos voláteis de diferentes
aguardentes de frutas, encontraram para destilado de pêra 79,6 mg de metanol/100 mL
de álcool anidro, para destilado de ameixa 86,6 mg de metanol por 100 mL de álcool
anidro, são valores altos de metanol quando comparados aos aguardentes de cana.
Isso ocorre porque a formação do metanol é proveniente da degradação da pectina,
devido á ação das enzimas pectina metilesterase.
4.4.4.3 Acetaldeído
A concentração de acetaldeído encontrada foi 14 mg 100 mL-1 de álcool anidro
valor superior 4,48 mg de acetaldeído por 100 mL de álcool anidro) ao obtido por
SOUFLEROS et al. (2003) em aguardente de amora. ALVARENGA (2006), encontrou
12,1 mg 100 mL-1 aa, para aguardente de manga. A legislação permite um limite igual a
30 mg 100 mL-1 de álcool anidro. Valores muito elevados de acetaldeído e de outros
aldeídos indicam má separação das frações na destilação e afetam a qualidade da
bebida. GUIMARÃES FILHO (2003) encontrou para a aguardente de banana,
37 mg 100mL-1 de álcool anidro, valor que pode estar associado, segundo este mesmo
52
autor, à alta concentração de álcoois superiores produzidas na fermentação da bebida,
uma vez que os aldeídos são considerados intermediários na formação de álcoois
superiores.
4.4.4.4 Acetato de etila A concentração de acetato de etila observada para a aguardente de banana
produzida não foi alta (20,5 mg 100mL-1 de álcool anidro). MAIA et al. (1995)
destacaram que a maior parte da concentração de ésteres encontrada em
fermentações alcoólicas ocorre no meio do metabolismo intracelular, via reação entre a
acetil - CoA e o etanol e demais álcoois. Uma parte menor acha-se associada à etapa
de maturação e envelhecimento da aguardente, geralmente com duração insuficiente
para permitir reações de esterificação em níveis apreciáveis.
4.4.4.5 Acido acético O ácido acético apresenta aroma característico e efeito no palato posterior,
enquanto cada um dos homólogos de cadeia maior apresenta seus aromas
característicos desagradáveis nas bebidas (WHITING, 1976). Segundo BERRY (1995)
o ácido acético é o principal ácido orgânico excretado no meio de crescimento. O ajuste
dos cortes das frações durante a destilação resolveria o problema. Vale notar que se a
mesma quantidade de ácido fosse recolhida num destilado com 42º GL, a acidez total
cairia para 150,1 mg 100 mL-1 etanol anidro.
53
5. CONCLUSÃO
O emprego do complexo enzimático à base de poligalacturonases,
pectinesterases e hemicelulases permitiram aumentar em 52,2 % o rendimento da
extração do suco da polpa da banana (em volume). A viscosidade do suco extraído
mediante tratamento enzimático da polpa de banana foi de 1,19 cP, correspondendo a
uma redução de 76% relativamente ao suco extraído sem tratamento enzimático (5,05
cP). Tanto o aumento do volume como a redução da viscosidade evidencia que o
tratamento enzimático é uma etapa importante no preparo do caldo de banana para a
fermentação alcoólica.
No tratamento enzimático, não se observou variação da eficiência variando a
temperatura entre 30 e 50°C. O tempo mínimo é inversamente proporcional à
concentração de enzima. A menor viscosidade do caldo foi obtida usando 0,03% (m/v)
de enzima durante 30 min; com a metade da concentração (0,015%) foram necessários
120 min para atingir a mesma viscosidade na concentração de 0,03%.
Com a análise estatística de superfície de resposta foi possível estimar as
condições ótimas para o tratamento enzimático, que correspondem a 0,022% de
enzima (Pectinex - Ultra Sp) e 78 min de incubação. Valores próximos foram testados
sem haver resultados com diferenças significativas. O gráfico de contorno comprova
esses resultados, apresentando uma faixa ótima para a concentração de enzimas e
tempo de incubação.
Nos testes efetuados com fermento prensado úmido na proporção de 20 g L-1
constatou-se uma queda na formação de álcoois superiores, relativamente ao teor de
40 g L-1. Portanto, embora geralmente se utilize o teor de fermento de 40 g L-1 para a
fermentação do caldo de cana (destinada à produção de cachaça), esse teor é
excessivo para a produção de aguardente de banana.
Em testes com 40 g L-1 de inóculo, a adição de farelo de arroz resultou em uma
diminuição dos álcoois isobutólico e isoamílico.
A adição de íon amônio no teor de 0,4 g L-1, evidenciou redução significativa dos
álcoois superiores.
A aguardente de banana obtida no laboratório apresentou todos os parâmetros
de acordo com a legislação brasileira, com exceção da concentração de álcoois
superiores e acidez titulável. Isto, no entanto, seria ajustável utilizando um destilador
dotado de controle de refluxo. Para tanto, a coluna do destilador deveria possuir, por
exemplo, um deflegmador e um prato (MAIA & CAMPELO, 2006).
54
6. REFERÊNCIAS BIBLIOBRÁFICAS ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas). Acidez titulável total, volátil total e
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ZOCCA, F. et al. Detection of pectinmethylesterase actvity in presence of methanol
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WHITING, G.C. Organic acid metabolismo f yeast during fermentation of alcoholic
beverages – a review. Journal of the Institute of Brewing, v.82,p.84-92, 1976.
60
APÊNDICES
APÊNDICE A A1 – Teste de normalidade para o modelo estatístico de 2ª ordem
FIGURA A1 - Distribuição dos resíduos em torno da reta que indica
normalidade para resposta y .
A2 - Delineamento Composto Central Rotacional final sem observações 8 e 9 Regression Analysis: y versus x1; x3; x1^2; x3^2; x1*x3 The regression equation is y = 4,18 - 196 x1 - 0,0222 x3 + 3554 x1^2 + 0,000073 x3^2 + 0,486 x1*x3 Predictor Coef SE Coef T P Constant 4,1760 0,2501 16,69 0,000 x1 -196,48 19,06 -10,31 0,000 x3 -0,022175 0,005027 -4,41 0,000 x1^2 3554,1 459,8 7,73 0,000 x3^2 0,00007345 0,00003179 2,31 0,029 x1*x3 0,4864 0,1374 3,54 0,001 S = 0,142761 R-Sq = 89,9% R-Sq(adj) = 88,0% Analysis of Variance Source DF SS MS F P Regression 5 4,88474 0,97695 47,93 0,000 Residual Error 27 0,55028 0,02038 Lack of Fit 2 0,09070 0,04535 2,47 0,105 Pure Error 25 0,45958 0,01838 Total 32 5,43502
RESI1
Perc
ent
0,40,30,20,10,0-0,1-0,2-0,3
99
95
90
80
70
60504030
20
10
5
1
Mean -2,36175E-15StDev 0,1311N 33AD 0,623P-Value 0,096
Teste de normalidade para os resíduosNormal
61
A3 – Histograma de Residuos
FIGURA A2– Histograma de residuos
A4 – Cálculo de densidade do caldo de banana
TABELA A1 - Cálculo de densidade Massa (g)
Medida V(mL) 1 1’ 2 2’ 3 3’ 4 4’
1 5 5,30 5,31 5,28 5,32 5,28 5,25 5,31 5,26
2 10 10,6 10,62 10,54 10,63 10,5 10,6 10,55 10,52
3 15 15,89 15,93 15,81 15,89 15,79 15,86 15,82 15,76
4 20 21,16 21,19 21,08 21,13 21,08 21,14 21,08 21,05
d1 1,06 1,074 1,056 1,050 1,060 1,060 1,055 1,052
d2 1,06 1,078 1,054 1,057 1,056 1,056 1,062 1,052
d3 1,06 1,073 1,054 1,057 1,053 1,053 1,055 1,051
d4 1,06 1,07 1,054 1,057 1,054 1,054 1,054 1,052
d média
1,06 1,06 1,054 1,056 1,055 1,056 1,056 1,052
Residual
Freq
uenc
y
0,320,160,00-0,16
12
10
8
6
4
2
0
Histogram of the Residuals(response is y)
62
Massa (g)
Medida V(mL) 5 5’ 6 6’ 7 7’ 8 8’
1 5 5,37 5,32 5,27 5,23 5,32 5,34 5,29 5,28
2 10 10,78 10,65 10,52 10,45 10,6 10,67 10,5 10,55
3 15 16,10 15,97 15,77 15,68 15,92 15,98 15,77 15,79
4 20 21,42 21,32 21,02 20,90 21,21 21,31 20,96 21,05
d1 1,074 1,064 1,054 1,046 1,060 1,060 1,050 1,055
d2 1,078 1,065 1,052 1,045 1,064 1,064 1,058 1,056
d3 1,073 1,065 1,051 1,045 1,061 1,061 1,051 1,065
d4 1,07 1,066 1,051 1,049 1,060 1,065 1,040 1,065
d média 1,074 1,066 1,052 1,046 1,061 1,063 1,050 1,060
Massa (g)
Medida V(mL) 9 9’ 10 10’ 11 11’ 12 12’
1 5 5,27 5,29 5,31 5,30 5,29 5,25 5,31 5,27
2 10 10,54 10,59 10,65 10,63 10,59 1,52 10,63 10,59
3 15 15,84 15,84 15,96 15,93 15,89 15,79 15,93 15,87
4 20 21,14 21,12 21,23 21,20 21,18 21,14 21,20 21,10
d1 1,054 1,058 1,062 1,06 1,058 1,057 1,062 1,054
d2 1,054 1,059 1,065 1,063 1,059 1,056 1,063 1,060
d3 1,056 1,056 1,064 1,062 1,059 1,059 1,062 1,058
d4 1,057 1,056 1,066 1,060 1,059 1,059 1,060 1,057
d média 1,056 1,057 1,064 1,061 1,059 1,058 1,062 1,057
Massa (g)
Medida V(mL) 13 13’ 14 14’ 15 15’ 16 16’
1 5 5,34 5,35 5,34 5,32 5,32 5,34 5,36 5,34
2 10 10,68 10,70 10,67 10,64 10,69 10,67 10,73 10,66
3 15 16,02 16,04 16,0 15,99 16,05 15,99 16,09 16,01
4 20 21,38 21,34 21,31 21,33 21,41 21,30 21,44 21,34
d1 1,068 1,070 1,068 1,064 1,064 1,068 1,072 1,068
d2 1,068 1,070 1,067 1,064 1,069 1,067 1,073 1,066
d3 1,068 1,069 1,067 1,066 1,07 1,066 1,073 1,067
d4 1,069 1,067 1,066 1,066 1,07 1,065 1,072 1,067
d média 1,068 1,069 1,067 1,065 1,068 1,067 1,072 1,067
63
Massa (g)
Medida V (mL) 17 17’ 18 18’
1 5 5,33 5,36 5,34 5,31
2 10 10,75 10,71 10,66 10,63
3 15 16,09 16,05 15,99 15,97
4 20 21,41 21,39 21,31 21,30
d1 1,066 1,072 1,068 1,062
d2 1,075 1,071 1,066 1,063
d3 1,07 1,070 1,066 1,065
d4 1,071 1,070 1,066 1,065
d média 1,071 1,071 1,067 1,064 A5 - Cálculo da viscosidade do caldo de banana Amostra 1 e 1’
209,1143,685,7.
997,006,1890,0 ==ns 193,1
143,675,7.
997,006,1890,0 ==ns
Amostra 2 e 2’
686,1143,601,11.
997,0054,1890,0 ==ns 736,1
143,627,11.
997,006,1890,0 ==ns
Amostra 3e 3’
243,1143,611,8.
997,0055,1890,0 ==ns 441,1
143,639,9.
997,0056,1890,0 ==ns
Amostra 4 e 4’
303,2143,6
01,15.997,0056,1890,0 ==ns 137,2
143,698,13.
997,0052,1890,0 ==ns
Amostra 5 e 5’
219,1143,681,7.
997,0074,1890,0 ==ns 214,1
143,685,7.
997,0066,1890,0 ==ns
64
Amostra 6 e 6’
590,2143,694,16.
997,0052,1890,0 ==ns 402,2
143,680,15.
997,0046,1890,0 ==ns
Amostra 7 e 7’
280,1143,6
3,8.997,0061,1890,0 ==ns 310,1
143,648,8.
997,0063,1890,0 ==ns
Amostra 8 e 8’
968,1143,689,12.
997,005,1890,0 ==ns 430,2
143,677,15.
997,006,1890,0 ==ns
Amostra 9 e 9’
26,5143,6
3,34.997,0056,1890,0 ==ns 84,4
143,655,31.
997,0057,1890,0 ==ns
Amostra 10 e 10’
189,1143,669,7.
997,0064,1890,0 ==ns 193,1
143,674,7.
997,0061,1890,0 ==ns
Amostra 11 e 11’
243,1143,608,8.
997,0059,1890,0 ==ns 20,1
143,689,7.
997,0059,1890,0 ==ns
Amostra 12 e 12’
238,1143,602,8.
997,0062,1890,0 ==ns 362,1
143,687,8.
997,0057,1890,0 ==ns
Amostra 13 e 13’
737,1143,697,11.
997,0068,1890,0 ==ns 738,1
143,619,11.
997,0069,1890,0 ==ns
Amostra 14 e 14’
209,1143,680,7.
997,0067,1890,0 ==ns 201,1
143,676,7.
997,0065,1890,0 ==ns
Amostra 15 e 15’
65
270,1143,618,8.
997,0068,1890,0 ==ns 303,1
143,641,8.
997,0067,1890,0 ==ns
Amostra 16 e 16’
269,1143,615,8.
997,0072,1890,0 ==ns 382,1
143,691,8.
997,0067,1890,0 ==ns
Amostra 17 e 17’
352,1143,669,8.
997,0071,1890,0 ==ns
286,1143,626,8.
997,0071,1890,0 ==ns
Amostra 18 e 18’
528,1143,609,9.
997,0067,1890,0 ==ns 525,1
143,686,9.
997,0064,1890,0 ==ns
66
APÊNDICE B
TABELA B1 - Formação de álcool propílico Amostras Inóculo RESULTADO
1 2 3 Média
Farelo de arroz 1g/L 4,5 8,73 8,64 7,29
(NH4)2SO4 0,1g/L 40g/L 3,01 4,51 3,75 3,76
Controle 8,64 9,41 8,51 8,85
Farelo de arroz 1g/L 10,62 9,15 9,66 9,81
(NH4)2SO4 0,1g/L 20g/L 3,19 4,35 5,25 4,26
(NH4)2SO4 0,4g/L 2,27 2,62 2,90 2,60
Controle 11,47 7,45 8,72 9,21
TABELA B2 - Formação de álcool isobutílico
Amostras Inóculo RESULTADO 1 2 3 Média
Farelo de arroz 1g/L 7,68 13,57 14,84 12,03
(NH4)2SO4 0,1g/L 40g/L 8,05 12,86 10,84 10,58
Controle 17,45 17,31 16,91 17,22
Farelo de arroz 1g/L 12,48 12,48 13,30 12,75
(NH4)2SO4 0,1g/L 20g/L 7,87 12,54 11,95 10,79
(NH4)2SO4 0,4g/L 7,10 5,31 6,78 6,30
Controle 12,42 11,86 12,98 12,42
TABELA B3 - Formação de álcool isoamílico
Amostras Inóculo RESULTADO 1 2 3 Média
Farelo de arroz 1g/L 20,78 35,21 38,30 31,43
(NH4)2SO4 0,1g/L 40g/L 28,39 26,30 24,94 26,54
Controle 45,11 52,0 47,3 48,14
Farelo de arroz 1g/L 30,65 30,04 35,54 32,08
(NH4)2SO4 0,1g/L 20g/L 19,12 35,40 36,98 30,50
(NH4)2SO4 0,4g/L 9,42 14,10 16,53 13,35
Controle 31,98 30,47 32,47 31,64
67
B2 – Análise ANOVA e Teste de Duncan Teste de variância - Alcool Propilico
Repetição P1 P2 P3
1 4,50 3,01 8,64 r=3
2 8,73 4,51 9,41 k=3
3 8,64 3,75 8,51 n=9
Total 21,87 11,27 26,56
Média 7,29 3,76 8,85
G = 59,70 13,27853 =SQR
G2 = 3564,09 54,183 =SQG TOTAL
C = G2/n = 396,01 40,90447 =SQT TRATAMENTO
Somatória de X2= 450,193
∑ totais2 1310,743
∑ totais2/r - Com = 40,90447
Quadro ANOVA
F V GL SQ QM F calculado p Ftabelado5% Ftabelado1%
Tratamento 3-1=2 40,9000 20,4500 9,25 0,0147006 5,14 10,92
Residuo 8-2=6 13,27000 2,21167
total 9-1=8 54,18
Como F calc > F5% podemos concluir que as médias dos tratamentos diferem entre si a 1% de probabilidade (p<0,01).
a 5 % de probabilidade
Teste de Duncan
Tratamento Média D2 D3 DUNCAN
1 8,85 1,56 5,09 a
2 7,29 3,53 ab
3 3,76 b
Duncan z5%;n;6 3,58
Dn
68
Teste de variância - Alcool Isobutílico
Repetição P1 P2 P3
1 7,68 8,05 17,45
2 13,57 12,86 17,31
3 14,84 10,84 16,91
Total 36,09 31,75 51,67
Média 12,03 10,58 17,22
r=3
k=3
n=9
G = 119,51 41,01413 =SQR
G2 = 14282,64 114,1673 =SQG TOTAL
C = G2/n = 1586,96 73,15316 =SQT TRATAMENTO
Somatória de X2= 1701,127
∑ totais2 4980,34
∑ totais2/r - Com
= 73,15316
Quadro ANOVA
F V GL SQ QM F calculado p Ftabelado5% Ftabelado1%
Tratamento 3-1=2 73,1500 36,5750 5,35 0,0463583 5,14 10,92
Residuo 8-2=6 41,01000 6,83500
total 9-1=8 114,16
Como F calc > F5% podemos concluir que as médias dos tratamentos diferem entre si a 1% de probabilidade (p<0,01).
a 5 % de probabilidade
Teste de Duncan
Tratamento Média D2 D3 DUNCAN
1 17,22 5,19 6,64 a
2 12,03 1,45 b
3 10,58 b
Duncan z5%;n;6 3,58
Dn
69
Teste de variância - Alcool Isoamílico
Repetição P1 P2 P3
1 20,78 28,39 45,11
2 35,21 26,30 52
3 38,30 24,94 47,3
Total 94,29 79,63 144,41
Média 31,43 26,54 48,14
r=3
k=3
n=9
G = 318,33 205,7339 =SQR
G2 = 101334 974,9982 =SQG TOTAL
C = G2/n = 11259,33 769,2643 =SQT TRATAMENTO
Somatória de X2= 12234,33
∑ totais2 36085,79
∑ totais2/r - Com
= 769,2643
Quadro ANOVA
F V GL SQ QM F calculado p Ftabelado5% Ftabelado1%
Tratamento 3-1=2 769,2600 384,6300 11,22 0,0093949 5,14 10,92
Residuo 8-2=6 205,73000 34,28833
total 9-1=8 974,99
Como F calc > F1% podemos concluir que as médias dos tratamentos diferem entre si a 1% de probabilidade (p<0,01).
a 1% de probabilidade
Teste de Duncan
Tratamento Média D2 D3 DUNCAN
1 48,14 16,71 21,60 a
2 31,43 4,89 b
3 26,54 c
Duncan z5%;n;6 3,58
Dn
70
Teste de variância - Alcool Propílico 2
Repetição P1 P2 P3 P4
1 10,62 3,19 11,47 2,27
2 9,15 4,35 7,45 2,62
3 9,66 5,25 8,72 2,9
Total 29,43 12,79 27,64 7,79
Média 9,81 4,26 9,21 2,60
r=3
k=4
n=12
G = 77,65 11,8918 =SQR
G2 = 6029,523 127,5525 =SQG TOTAL
C = G2/n = 502,4602 115,6607 =SQT TRATAMENTO
Somatória de X2= 630,0127
∑ totais2 1854,363
∑ totais2/r - Com
= 115,6607
Quadro ANOVA
F V GL SQ QM F calculado p Ftabelado5% Ftabelado1%
Tratamento 4-1=3 115,6600 38,5533 25,94 0,0001788 4,07 7,59
Residuo 11-3=8 11,89000 1,48625
total 12-
1=11 127,55
Como F calc > F1% podemos concluir que as médias dos tratamentos diferem entre si a 1% de probabilidade (p<0,01).
a 1% de probabilidade
Teste de Duncan
Tratamento Média D2 D3 D4 DUNCAN
1 9,81 0,60 5,55 7,21 a
2 9,21 4,95 6,61 a
3 4,26 1,66 b
4 2,60 b
Duncan z5%;n;8 3,47
Dn
Teste de variância - Alcool Isobutílico 2
71
Repetição P1 P2 P3 P4
1 12,48 7,87 12,42 7,1
2 12,48 12,54 11,86 5,31
3 13,30 11,95 12,98 6,48
Total 38,26 32,36 37,26 18,89
Média 12,75 10,79 12,42 6,30
r=3
k=4
n=12
G = 126,77 15,6624 =SQR b
G2 = 16070,63 95,15529 =SQG TOTAL
C = G2/n = 1339,219 79,49289 =SQT TRATAMENTO
Somatória de X2= 1434,375
∑ totais2 4256,137
∑ totais2/r - Com
= 79,49289
Quadro ANOVA
F V GL SQ QM F calculado p Ftabelado5% Ftabelado1%
Tratamento 4-1=3 79,4920 26,4973 13,53 0,0016829 4,07 7,59
Residuo 11-3=8 15,66200 1,95775
total 12-
1=11 95,49
Como F calc >F1% podemos concluir que as médias dos tratamentos diferem entre si a 1% de probabilidade (p<0,01).
a 1 % de probabilidade
Teste de Duncan
Tratamento Média D2 D3 D4 DUNCAN
1 12,75 0,33 1,96 6,45 a
2 12,42 1,63 6,12 a
3 10,79 4,49 a
4 6,30 b
Duncan z5%;n;8 3,47
Dn
Teste de variância - Alcool Isoamílico 2
72
Repetição P1 P2 P3 P4
1 19,12 30,65 31,98 9,42
2 35,40 30,04 30,47 14,1
3 36,98 35,54 32,47 16,53
Total 91,50 96,23 94,92 40,05
Média 30,50 32,08 31,64 13,35
r=3
k=4
n=12
G = 322,70 241,9761 =SQR
G2 = 104135,3 979,4592 =SQG TOTAL
C = G2/n = 8677,941 737,4831 =SQT TRATAMENTO
Somatória de X2= 9657,4
∑ totais2 28246,27
∑ totais2/r - Com
= 737,4831
Quadro ANOVA
F V GL SQ QM F calculado p Ftabelado5% Ftabelado1%
Tratamento 4-1=3 737,4800 245,8267 8,13 0,0082092 4,07 7,59
Residuo 11-3=8 241,97600 30,24700
total 12-
1=11 979,46
Como F calc >F1% podemos concluir que as médias dos tratamentos diferem entre si a 1% de probabilidade (p<0,01).
a 5 % de probabilidade
Teste de Duncan
Tratamento Média D2 D3 D4 DUNCAN
1 32,08 0,44 1,58 18,73 a
2 31,64 1,14 1,14 a
3 30,5 17,15 a
4 13,35 b
Duncan z5%;n;8 3,47
73
APÊNDICE C
C1 - Cálculo do rendimento em extração de volume do suco de banana Com 720 mL de polpa de banana a 15° Brix , obtém-se 200 mL de suco sem hidrólise;
então,
720 mL____________ 200 mL
100 mL____________ X
X = 27,7% em volume de suco
Com 360 mL de polpa de banana a 15° Brix , obtém-se 288 mL de suco com hidrólise
enzimática; então,
360 mL____________ 288 mL
100 mL____________ X
X = 80,0% em volume de suco
74
APÊNDICE D
TABELA D1 - Delineamento Composto Central
Ensaio Valores codificados Valores reais
% (v/p) (°C) (min) % (v/p) (°C) (min)
1 1 1 1 0,1 50 120
2 -1 1 1 0,025 50 120
3 1 -1 1 0,1 30 120
4 -1 -1 1 0,025 30 120
5 1 1 -1 0,1 50 30
6 -1 1 -1 0,025 50 30
7 1 -1 -1 0,1 30 30
8 -1 -1 -1 0,025 30 30
9 0 0 0 0,0625 40 75
10 0 0 0 0,0625 40 75
11 0 0 0 0,0625 40 75
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