producao de antibioticos - 2
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Produção de Antibióticos
� Produtos do metabolismo secundário� Inibem processo de crescimento de outros
� Importância Económica� 2000 toneladas/ano� 600 milhões de € (preço corrente a granel)
Apontamento Histórico
� 1929 – descoberta da Penicilina� 1961 – 513 antibióticos� Actualmente – cerca de 8000� Líquenes, algas, animais, plantas
(+3000 substâncias com actividade antibiótica)
� 123 são produzidos por fermentação� + 50 são produzidos como compostos semisintéticos
� 3 são completamente sintéticos (cloranfenicol)
Porque razão ocorre a produção destas substâncias?
� Significado ecológico?
� Papel regulador durante a diferenciação?
(funcionando como agentes inibidores temporários)
Grupos microbianos que produzem antibióticos
1600Fungos
4600Actinomicetas
950Bactérias diferentes de Actinomicetas
Nº de antibióticosGrupo taxonómico
Ex: Bacillus sp.
Streptomyces
Classificação de antibióticos
� Segundo:
- espectro antimicrobiano- mecanismos de acção- estirpe produtora- forma de biossintese- estrutura química
Classificação de acordo com estrutura química
FosfomicinaAlifáticos
CloranfenicolAromáticos
CiclohexamideDerivados aliciclícos
MonensinaHeterociclicos com oxigénio
PolioxinasHeterociclicos com azoto
Penicilinaa.a. e peptidos
TetraciclinaQuinonas
EritromicinaLactonas macrocíclicas
EstreptomicinaContém carbohidratos
Aplicações:
� Agentes terapêuticos� Antitumorais (citoestáticos)� Contra doenças das plantas� Preservantes de alimentos (ex:nisina contra
os clostridios)
� Estimulantes do crescimento animal� Ferramentas na bioquímica e biologia molecular
Antibioticos β-lactâmicos
� Penicilina� Descrita por Fleming 1929
� Estudos em 1940
� Aplicação clínica 1941
� Produzida por fungos (Penicillium, Aspergillus)
Antibioticos β-lactâmicos� Lábeis em meio ácido
� Inactivados pela hidrólise do anel β-lactâmico com penicilinase
� Baixa toxicidade
� Só 0,5 -2% dos pacientes desenvolve alergia
� Inibidores específicos da sintese de parede celular bacteriana (peptidoglucano)
Estrutura Química
O
6 5
N4
s
2
3
1 CH3
CH3
COO-]Na+,K+
RCON
N
Radical acile
Anel β-lactamico
Anel tiazolidinico
Acido 6-aminopenicilânico (6-APA)
� Se na fermentação não se adicionar precursores (os ácidos) da cadeia lateral � Penicilinas naturais
� Destes só a benzilpenicilina é útil terapeuticamente. As outras devem ser removidas durante a etapa de recuperação do produto
Processo comercial
� Penicilina G �actua contra Gram +Streptococcus pyogenes, Bacillusanthracis, Treponema pallidum
� Penicilina V �menos activa
Penicilinas semi sintéticas
� > estabilidade� > resistência à β-lactamase� > actividade antimicrobiana
Biossintese e regulação
� L- cisteína� L- valina
A sintese de Penicilina é afectada pela [fosfato] e sofre repressão catabólicapor glucose
β-lactamico-tiazolidinico
Biossintese e regulação
� L- cisteína� L- valina� Ácido α-aminoadípico
Condensação num tripéptidoδ- (L- α- aminoadipil)cisteinilvalina
O tripéptido é ciclizado e forma-se a isopenicilina-Nprimeiro composto com actividade microbiana
Desenvolvimento de EstirpesObjectivos: �rendimento� Eficiência na recuperação do produto
� Original – P. notatum� 1943 – P. chrysogenum NRRL 1951� Por mutagenese – estirpe WisQ176
Linha de culturas Wisconsin(adoptada pela maior parte dos fabricantes)
� Screening de mutantes� Agentes mutagénicos
� Utilização da tecnologia do DNA recombinante
+ recentementeNitritosAgentes alquilantes
Até anos 60 Raios xRadiações de λ curto
Método de Produção
� Método aeróbio com velocidade de absorção volumétrica de Oxigénio de 0,4-0,8 mM/L.min
� Faixa de temperatura 25-27ºC
� Reactores agitados, com arejamento operados em “Fed-batch”(alimentação continua de várias substâncias a uma fermentação descontinua)
Vantagens da operação “Fed-Batch”
� Condições de fermentação em estado quase estacionário
� Cultura em estado viável
� 1) operar o fermentador evitando repressão catabólica
� 2) operar abaixo dos níveis de inibição/toxicidade por substâncias essenciais à biossintese (fonte de N e precursor)
� 3) � duração da fase de crescimento
� 4) Prolongar a duração da fermentação (manter biomassa viável + tempo)
� 5) Operar a [biomassa] elevada e constante
� 6) Repor água evaporada com o arejamento da cultura
Inóculo Fase de crescimento40hTd=6 h
Fase real de produçãoDe Penicilina
Alimentando o meio com diferentes componentesA fase de produção podeEstender-se até120-160h
Esporos liofilizados(óptimo 5x103/ml)Formação de agregados“pellets”
Produção de Penicilina
Produção de Penicilina
� Meio de cultivo típico –MelaçoGorduras animaisÁgua de milhoFarinha de sojaExtracto de leveduraSoro de leiteLactose
Fonte de azoto
Fonte de azoto adicional
Fonte de carbono
� Vários tampões� pH constante = 6,5� Ác. fenil-acético é adicionado como precursor (Penicilina G)
� Ác. fenoxi-acético e adicionado como precursor (Penicilina V)
� Fermentação continua � problemas devido à instabilidade das estirpes
� Enzimas imobilizadas � para produção das penicilinas semi sintéticas.
� Método enzimático melhor que o químico + barato, - poluente.
Isolamento da Penicilina do caldo fermentadoExtracção
Caldo fermentado Arrefecido abaixo de 10ºC
+ 0,5-1% de formol
Inactivação dos microrganismosPrevenção da degradação porβ-lactamases
Obtenção de solvente rico do qual seExtrai o antibiótico
1
2
3
1 - Filtro rotativo (extractor continuo)
� O caldo é filtrado, o filtrado é lavado, � a extracção faz-se com solventes imiscíveis (acetato de butilo)
� Extracção feita em contracorrente� Extractores contínuos de vários andares
2- Extractor Decantador
� Extracção directa do caldo fermentado para o solvente (acetato de butilo)
� Como há turvação é necessário um clarificador (tipo separador liquido-liquido)
3- Combinação sistema de membranas com extractor continuo
� É o mais usado
Cristalização
� O acetato de butilo é descorado com carvão activado � (removido por filtração)
� Adiciona-se bicarbonato de potássio� Formação de 2 fases (orgânica e aquosa)� Adição de butanol à fase aquosa� Destilação� Os cristais de Penicilina potássica retidos no evaporador-cristalizador seguem uma via de filtração, lavagem e secagem.
Produção de Estreptomicina