Prof. Adriane Martins Dias

Muitas técnicas de laboratório baseiam-se no uso de anticorpos.

O método laboratorial que utiliza anticorpos têm grande importância por ser possível produzir anticorpos contra qualquer tipo de molécula e composto químico.

Principais técnicas que utilizam anticorpos para identificação clínica:

A) Imunoensaios◦ Radioimunoensaios e Ensaio de imunoabsorção

por Ligação Enzimática. B)Purificação e Identificação de Proteínas

◦ Imunoprecipitação e Cromatografia por afinidade.◦ Western Blot

C) Marcação e Detecção de Antígenos em células/tecido◦ Citometria de Fluxo◦ Imunoflorescência e Imuno-histoquímica

D) Medição de Interação Antígeno/Anticorpo E) Técnicas que fazem análise da estrutura

e da expressão gênica.◦ PCR

Imunofluorescência: Primeira técnica utilizada foi a

Imunofluorescência Direta. Nesta técnica se pesquisa um antígeno em uma reação com anticorpo preparado com fluorocromo.

São utilizados anticorpos purificados específicos para um determinado antígeno ou grupo de antígenos conjugados com um fluorocromo.

Imunofluorescência Direta

É chamada de técnica de camada simples. Imunofluorescência Indireta (dupla

camada): Antígenos são fixados em uma lâmina, onde

se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente e por isso coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno.

Nesta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários para diferentes tipos de antígenos.

Nesta técnica o antígeno fica entre dois anticorpos.

Técnica é aplicada para estudar tecidos linfoides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido.

Imunofluorescência Indireta

Imunoenzimático: ELISA Se baseia na identificação de anticorpos e

ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima. Essa enzima irá agir sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor.

Produto da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir no local da formação.

ELISA

Reação é desenvolvida, frequentemente, em microplacas contendo vários poços onde são depositados os reagentes.

Método competitivo (Antígenos/Anticorpos)

Primeiro se adsorve o anticorpo no poço da microplaca.

Após a adsorção do anticorpo, uma solução que contenha o antígeno é adicionada sobre os anticorpos.

Próximo passo, adiciona-se o antígeno marcado com uma enzima.

Os poços que não possuem o antígeno primário (da solução problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poços que possuem antígenos aderidos aos anticorpos não mudam de cor.

ELISA (Método Indireto) – Utilizado para detecção de anticorpos.

O antígeno fica aderido aos poços da microplaca.

Em seguida, coloca-se o soro problema e posteriormente um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor.

A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor confirma a ausência do anticorpo em questão.

ELISA ( Método Indireto)

ELISA

Radioimunoensaio: Pequenas quantidades de anticorpos ou

antígenos podem ser detectadas depois de marcadas com isótopos radioativos.

É uma reação de imunológica onde temos um aumento da especificidade.

Não ocorre perda de características físicas, químicas e biológicas das moléculas marcadas com os compostos radioativos.

Citometria de Fluxo: É uma técnica que tem como

particularidade a análise rápida, quantitativa e multiparamétrica de uma célula individual (viva ou morta), entre diversas células de uma população.

É frequentemente empregado para investigar a expressão de certas moléculas intracelulares ou moléculas de membrana.

São utilizados anticorpos marcados com fluorocromo e a análise dos parâmetros é mensurada por meio da intensidade de fluorescência produzida por esses marcadores.

Citômetro