Comentario Del Contexto Cultural de La Biblia at (J.H. Walton - V.H. Matthews - M.W. Chavalas)
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de ... · Cromossomo Proteínas...
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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
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CONTROLE GENÉTICO E EPIGENÉTICO DA EXPRESSÃO NUCLEOLAR
Mestranda: Maria Cecília Perantoni FuchsOrientador: Dr. Mateus Mondin
Sumário• Nucléolo
– Função– Estrutura– Divisão celular
• rDNA 45S– Transcrição
• Controle genético• Controle epigenético
– Metilação de citosinas– Modificações de histonas
• Dominância nucleolar• Considerações finais
Estrutura X FunçãoF: Centro fibrilarD:Componente fibrilar densoG: Componente granularI: Interstício nucleolar
(Olson et al. 2000)
• Linha de produção
• Vantagem
Nucléolo X Divisão celular
• Dissociação– Maquinaria de transcrição– Dispersão componentes nucleolares
• Nucleologênese– Transcrição– Corpos pré-nucleolares (PNB)
•Dinâmica da reconstituição nucleolar no final da mitose.
•Fibrilarina-GFP transferidas para células HeLa monitoradas por microscópio de fluorescência.
(Olson e Dundr 2006)
Cromossomo
Proteínas nucleolares
PNB
(Matthews e Olson 2006)
• Dinâmica das proteínas nucleolares durante a reconstituição nucleolar
• Pré-rRNA
rDNA 45S
• Altamente conservado
• Variação nos IGSs
• Transcrito primário = Pré- rRNA → processamento → rRNAs
(Pikaard, 1999)
Controle epigenético
• Epigenética: fenômeno no qual ocorrem mudanças na expressão gênica por modificações covalentes nos nucleotídeos e histonas.
• Não há alteração na estrutura das seqüências de DNA.
• Principais modificações: metilação na citosina e metilação e acetilação de histonas.
Modificação de histonas• Nucleossomo• Domínio N-terminal livre
(Lodish et al., 2004)
• Metilação e acetilação - histonas H3 e H4
Metilação
• H3: K4, 9, 27, 36, 79 e R17.• H4:K20, 59 e R3.
• Enzimas com atividade histona metiltransferase (HMTase)
• Silenciamento ou ativação gênica
Acetilação
• H3: K4, 9, 14, 18, 23 e 27.• H4: K5, 8, 12 e 16.
• Enzimas: atividade histona acetiltransferase(HAT) e histona desacetilase (HDAC)
• Ativação gênica
Metilação de citosinas• Metiltransferases
• Contextos siméricos: CpG e CpNpG• Contexto não-simétrico: CpHpH (H = C, A, T)
• 5-aza-2-deoxicitosina
• Afeta expressão gênica por dois meios:
• Impede os fatores de transcrição de se ligarem às suas seqüências específicas.
(Attwood et al., 2002)
• Podem interagir com proteínas que causam modificações em histonas, compactando a cromatina.
(adaptado de Grafi et al., 2007)
Dominância Nucleolar• Fenômeno no qual a
expressão nucleolar de uma RON é suprimida, ou reduzida, pela presença de outra RON
• A transcrição do rDNA 45S de um cromossomo éanulada ou parcialmente prejudicada pela transcrição do rDNA 45S de outro cromossomo.(Pikaard, 1999)
• Competição entre os promotores e enhancersacessíveis aos fatores de transcrição em concentração limitada.
• A RON que possuísse um maior número de promotores ou enhancers livres, ou ainda uma maior afinidade do enhancer em se ligar ao fator de transcrição, seria dominante sobre a outra RON.
• Modificações epigenéticas – remodelamento da cromatina.
• Isolamento do DNA genômico → digestão com enzimas de restrição – TaqI e HpaII →eletroforese → southern blot.
• TaqI: Sítios em diversos locais do rDNA 45S, mas não dentro dos IGSs.
• HpaII: Cliva sítios CCGG não metilados.
• Clivagem de HpaIIpreferencialmente nos fragmentos maiores
• Proporção de fragmentos grandes/pequenos diminuiu após tratamento com TaqI + HpaII.
• Fragmentos maiores preferencialmente não-metilados.
• 3.1kb – 1B → constrição secundária maior → maioratividade gênica no rDNA 45S
• 2.8 e 2.6kb – 6B• 1.6kb – 5D
• Metilação não é ao acaso → sítios CCGG de uma repetição de 135pb situado ‘upstream’ ao sítio de início da transcrição → conservada
• Variação do comprimento do IGS → número das seqüências de 135pb
• Fatores de transcrição
• Competição
• Dominância nucleolar: modelo baseado no seqüestro diferencial de proteínas regulatórias (fatores de transcrição) em concentrações limitadas.
• Variação no número e seqüência das regiões de 135pb.
• A. thaliana
• Verificação das metilaçõesnos promotores: – Bissulfito (citosina → uracila)→ sequênciamento
• Relação com estado da cromatina– ChIP-chop-PCR
• Anticorpos: H3dimetilK9, H3trimetilK4 e RNApol I.
• McrBC (citosinas metiladas)
→ PCR
• Promotores hipometilados: H3trimetilK4 e RNApol I.• Promotores hipermetilados: H3dimetilK9.
Atividade gênica
Silenciamento gênico
• A. suecica = A. thaliana + A. arenosa• Dominância nucleolar: A. arenosa
• Tratamentos:– 5’aza-2’desoxicitidina
• Metilação do DNA
– Tricostatina• Histona desacetilase
(HDAC)
• Reativação RON de A. thaliana• Aumento expressão de A. arenosa
↓• Mesmo mecanismo de controle da
dosagem gênica
• Metilação de citosinas nos promotores → controle na dosagem de genes de rRNA ativos e dominância nucleolar → associação com H3dimetilK9.
• Não metilação - H3trimetilK4
• Controle da dosagem gênica e dominância nucleolar – mesmos mecanismos
• Dominância nucleolar – silenciamento gênico em larga escala
Considerações finais• A epigenética aparece como um mecanismo
importante na controle da dosagem dos genes de rRNA.
• O entendimento da dominância nucleolar éimportante para a compreensão de como o remodelamento da cromatina está envolvida na expressão geral dos genes.