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Docente: Prof. Dr. Felipe S. Chambergo – [email protected] https://sites.usp.br/lbbp/ Data: Segunda-feira 14 – 16 h / Sexta-feira 9 - 12 h.
USP – 2020-1S
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular
BBM5002 - Bioquímica e Biologia Molecular
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Formação de um Nucleótido
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O N
NN
N
NH2
OHOH
CH2OP-OO
O-
HH H
Pentosa Base
NucleósidoFosfato
Nucleótido
+
+
Enlace Glicosídico
Enlace fosfodiéster
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DNA RNA Polinucleotídeos
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Associação complementar de bases (pontes de hidrogênio)
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5’
3’
3’
5’
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O-
CH2
O
PO-
O
ON
NH3C
OH
O
NN
NNN
H
O
ON
N
O
NHH
NN
NN
NH H
O
H
O
ON
N
N
N
OH
NH
H
N N
O
NH
H
O
O-
CH2
O
PO-
O
O-
CH2
O
PO-
O
O
N
N
N
N
NH
H NN
O
O
H3C
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O O
ON
N
N
N
OH
NH
H
N N
O
NH
H O
O-
CH2
O
PO-
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O-
CH2
O
PO-
O
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Cromossomo de E. coli
Cromossomos Humanos
DNA
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Ser Humano
Célula Humana
Genôma Nuclear Genôma Mitocôndrial
Por ser uma dupla fita a longitude da molécula de DNA é expressa em pares de bases (pb): 1 kb = 1000 pb 1 Mb = 1000 kb = 1 000 000 pb 1 Gb = 1000 Mb = 1 000 000 kb = 1 000 000 000 pb
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1944 - Avery, MacLeod e McCarty: Cepa de pneumococo
DNA e herança
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liso = virulento (pneumonia) rugoso = não virulento se injetar liso em camundongos = morre; liso morto pelo calor = sobrevive; se injetar rugoso = sobrevive; rugoso vivo + liso morto = morre. rugoso vivo+ liso morto + DNAse = sobrevive
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1952 - Hershey e Chase E. coli /Bacteriófago T2 (Cápsula protéica/Ác. Nucléico=DNA) Proteína marcada com S35; DNA marcado com P32. Marcando a proteína de T2, quando infecta a bactéria o radioativo fica fora da célula; marcando o DNA, quando infecta a bactéria o radioativo fica dentro da célula;
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DOGMA CENTRAL
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Replicação e reparo de DNA
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1. A composição de bases do DNA geralmente varia de uma espécie para outra.
2. Amostras de DNA isoladas de diferentes tecidos da mesma espécie possuem a mesma composição de bases.
3. A composição de bases do DNA em uma dada espécie não se altera com a idade do organismo, o estado nutricional ou a modificação ambiental.
4. Em todas as espécies à relação purinas/pirimidinas é igual a 1, é dizer :
A + G = C + T 5. Em todos os DNA estudados, a proporção molar de A é igual
à T, e G igual á C, é dizer: A = T e G = C
Regra de Chargaff (1940)
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A complementaridade de bases sugere um modelo para a replicação do mesmo, de forma que as duas moléculas filhas são idênticas ao pai:
5’-CGTTGCAATTGCGAT-3’ 3’-GCAACGTTAACGCTA-5’
5’-CGTTGCAATTGCGAT-3’ 3’-GCAACGTTAACGCTA-5’
5’-CGTTGCAATTGCGAT-3’ 3’-GCAACGTTAACGCTA-5’
Implicações genéticas do modelo de DNA
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Replicação do DNA
-Separação das duas fitas -Síntese de uma fita complementar para cada uma
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Ação da DNA polimerase (5´ → 3´)
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Replicação da dupla fita de DNA em E. coli.
Fita contínua Fita descontinua
Fita parental
Sentido da força de
replicação
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Replicon:
1. Origem + Término
2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
3. O genoma de uma célula procariótica constitui um
único replicon que é circular
4. Cada cromossomo eucariótico possui vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
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A replicação do DNA foi melhor estudada na bactéria E. coli
Replicação de DNA Procariótico
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~245 pb
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Inicio de Replicação do DNA no oriC
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DNA polimerase
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~900 kD e estrutura dimerica
α - actividade polimerase 5’-3’ ε - “ exonuclease 3’-5’ β - aumenta processividade da enzima θ- necessária à montagem de α ε τ τ- mantém estrutura do dímero e contacta com DnaB (helicase)
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Síntese do DNA na fita continua e descontinua
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Atividade da DNA ligase
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Replicação do DNA Eucariótico
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Ciclo Celular Eucariótico
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FEBS Letters Volume 586, Issue 18, 31 August 2012, Pages 2803-2812
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O fator licenciador controla a replicação do
DNA eucariótico
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Complexo origem-ORC
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Cromossomo Eucariótico
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Replicação e Nucleossomos
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DNA polymerases of humans α β γ δ ε Location nucl nucl mito nucl nucl Replication yes no yes yes (no) Repair no yes no no yes3 Functions 5’ to 3’ polymerase yes yes yes yes yes 3’ to 5’ exonuclease no no yes yes yes 5’ to 3’ exonuclease1 no no no no no Primase yes no no no no Associates with PCNA2 no no no yes no Processivity low high Strand synthesis Descont repair both Contin repair
1 activity present in associated proteins
2 Proliferating Cell Nuclear Antigen 3involved in transcription-linked DNA repair
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Polimerases de DNA Eucarióticas independentes realizam à iniciação e elongação
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Replication is catalysed by the replisome multisubunit complex, which contains replication elongation factors. The eukaryotic MCM helicase unwinds the parental duplex to allow access to the DNA polymerase alpha primase (Pol alpha–Pri). Processive elongation is catalysed by the replicative polymerases delta and epsilon (Pol delta/epsilon). This polymerase switch is mediated by the replication processivity clamp (PCNA) that is loaded by the replication factor C complex (RFC) and stabilizes DNA polymerases. During DNA synthesis in the discontinuous lagging strand, primer RNA displacement results in a flap structure that is cleaved by the Rad27 nuclease (FEN1 in humans); the resulting intermediate is processed by the DNA2 helicase, RNase H (RNH), pol delta and DNA ligase I (Lig1). Cohesins hold the two sister chromatids together until anaphase. Encountering an obstacle can cause replication-fork (RF) stalling, leading to ssDNA gaps and double-stranded breaks (DSBs). Several factors associate with the RF to prevent its collapse, including the Saccharomyces cerevisiae Rrm3 helicase, the Mrc1 checkpoint mediator in association with Tof1 and Csm3, or the nucleosome assembly factor Asf1. ssDNA gaps and DSBs are sensed by the S-phase checkpoint which is activated through Tel1 (ATM in humans) and Mec1 (ATR in humans) (see Box 1). In the case of a DSB, the checkpoint signalling spreads around the DSB site by histone H2AX phosphorylation (gammaH2AX) in humans (H2A in yeast). ATRIP/Ddc2, ATR/Mec1 interacting protein; CHK1/Chk1 and CHK2/Rad53, serine/threonine-protein kinases; MCM, replicative helicase; MR(X)N, a nuclease complex; RPA, replication protein A; Sgs1, ATP-dependant helicase.
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Telomeres and aging
Metaphase chromosome
centromere telomere
telomere structure
young
senescent
Telomeres are protective “caps” on chromosome ends consisting of short 5-8 bp tandemly repeated GC-rich DNA sequences, that prevent chromosomes from fusing and causing karyotypic rearrangements.
(TTAGGG)many
(TTAGGG)few
• telomerase (an enzyme) is required to maintain telomere length in germline cells • most differentiated somatic cells have decreased levels of telomerase and therefore their chromosomes shorten with each cell division
<1 to >12 kb
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Telômeros e Telomerase
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Replicação do DNA
mitocondrial
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Mecanismos de reparo corrigem danos no DNA
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Mecanismos de Reparo:
A) Reparo direto (ex: Fotoreativação de dimeros de pirimidinas pela fotoliase, enzima ativada por luz visível). B) Reparo por excisão de bases C) Reparao de bases pareadas incorretamente ou despareadas (mismatch repair/correção de erro) D) Reparo por sistema de resgate.
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Reparo Direto
UV 200 – 300 nm
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Reparo por Excisão de Bases
Bases de DNA modificadas por reações fisiológicas normais ou agentes ambientais
-Desaminação espontânea - Metilação não enzimática
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Reparo por excisão de nucleotideos Ativada por distorção na hélice - Luz solar
- Fumaça de cigarro
Def: Xerodermia pigmentosa
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Reparo de despareamento e Metilação
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Sistema de resgate (SOS) em E. coli
Pol IV Pol V
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Reparo de quebras de Fita dupla União de extremos
não-homólogos
- Radiação Ionizante - Radicais livres