Proteases

TA 502 - 2005

Profa. Gláucia Maria Pastore

Laboratório de Bioaromas

e

Profa. Gabriela Macedo

Laboratório de Bioquímica de Alimentos

10 de Novembro de 2005

Proteases: Definição

Definição: Proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas.

E.C: Classe 3 das hidrolases, e subclasse 3.4, das peptídeo-hidrolases ou peptidases.

Classificação das proteases:

FONTE: vegetais, animais ou microbianas– Presentes no alimento– Excretadas por microrganismos presentes nos alimentos– Adicionadas como coadjuvantes de processo

AÇÃO DO SÍTIO CATALÍTICO: – Endopeptidases ou Exopeptidases– Proteólise Limitada ou Ilimitada

NATUREZA DO SÍTIO CATALÍTICO: Serina Cisteína Metaloproteases Aspartico proteases

Classificação das proteases (Hartley)

Classificação Exemplos CaracterísticasPEPSINAProteases ácidasRENINA ANIMAL

pH ótimo ácídico

PAPAÍNABROMELINA

Proteases sulfridrílicas

FICINA

Grupo SH no sítio ativo

QUIMOTRIPSINATRIPSINAELASTASE

Serina proteases

TROMBINA

Resíduo serina no sítio ativo

EXOPEPTIDASESMetalo proteasesCARBOXIPEPTIDASES

Íon metálico no sítio ativo

Proteases: Tipos catálise

 1) Proteólise limitada: a protease cliva somente uma ou um número limitado de ligações peptídicas: uma proteína alvo para ativação como a conversão de prohormônios em hormônios.

2) Proteólise Ilimitada: quando as proteínas são degradadas em amino ácidos e seus constituintes

Aplicações Tradicionais de proteases vegetais e animais

Aplicação Protease

Fabricação dequeijos

Renina (animal)

Amaciamento depeles

Tripsina

Prevenir turvaçãocervejas

Papaína

Bolachas cracker Protease fúngica

Hidrólise deproteínas

Pancreatina,tripsina, proteasebacteriana

Outras aplicações das Proteases

DetergentesCouros: substituição produtos do processo

que são poluentesProdutos farmacêuticos: pomadas

cicatrizantes, auxiliares digestivosAlimentos: amaciamento de carnesReação de plasteínaSolubilização de proteínas

Papaia:Látex do mamão papaya (Carica papaya)

frações : papaína e chimopapainaBromelina:Extração do caule da plantaFicina: Látex de figos verdes, maduro tem 125 menos atividade.

Proteases Sulfidrílicas

ATIVIDADE DEPENDE DE UM OU MAIS GRUPOS

SULFIDRILAS -SH NO SÍTIO ATIVO

PROTEASES VEGETAIS: bromelina, ficina e papainaPROTEASES MICROBINAS ALGUMAS

Ativadas por agentes redutores: cisteínaInativadas por oxidantes, íons metálicos

Mecanismo cisteína-protease

Inativação das proteases sulfidrílicas

SH : oxidado, enzima inativa Atividade inativada por agentes oxidantes

tais como Oxigênio. Atividade pode ser recuperada por agentes

redutores: cisteína.

Proteases vegetais: Cisteína Proteases

Esta família inclui as proteases vegetais tais como papaína, bromelina, ficina e também as catepsinas lisossomais de mamíferos e microbianas.

São enzimas sulfidrílicas e apresentam SH no sítio ativo.

Papaína é a mais estudada possui Cys 25 e His 159 no sítio ativo e a reação ocorre como nas serinas: em duas etapas.

pH neutro, dependente do substrato.

Características proteases vegetais

Papaina Ficina Bromelina

pH ótimo5,0 em gelatina e7,0 albumina

5,0 - 7,5 6,0 - 8,0

Temp. ótima60-70oC

62,5 oC 50- 60 oC

pH estabilidade5,0

pH est. 6,0 - 8,0

Termoestabilidade70oC por 30 min.Perde 20%

Inativada a 80oC

Especificidade:ampla peptídeos eproteina

ampla

Atividadeplastéina: síntese

não

Síntese de Plasteínas

Plasteínas são polipeptídeos obtidos por sínteseutilizando-se a capacidade da papaína de polimerizaramac.

Hidrolisado de soja def.metionina +ésteres de metionina

Plastéinametionina

incorporadaao hidrolisado

Papaína

Proteases na clarificação de cervejas

Turvação da cerveja a baixa temperatura pode ter 2 causa basicamente:

1. Contaminação microbiana2. Complexação de polipeptídeos e taninosquando a cerveja é resfriada.

Taninos são compostos fenólicos presentes no lúpuloque contribuem para o sabor amargo e adstringênciado produto.

A utilização de papaína a fim de diminuir as cadeiasde proteínas presentes e evitar a complexaçãocom taninos é prática comum em algumas cervejarias.

Produção de queijo azul:blue cheese

O papel do Penicillium roqueforti na produção do blue cheese está associado com a proteólise durante a maturação do queijo.

Penicillium roqueforti: Endopeptidase e Exopeptidase

Apesar da proteólise extensiva no blue cheese (baseada na grande quantidade de nitrogênio solubilizado) a texturae coesão ainda é retida.

Renina animal e microbiana. 1874 Christian Hansen Economicamente mais importante na indústria de alimentos

Adição de enzimas para acelerar a maturação de queijos

Tipo deQueijo

EnzimasAdicionadas

Fonte Estágioadição

Cheddar Proteaseácida,neutra,lipase,descaboxilase

Animais Coalho

Cheddar eParmesão

Lipase,protease

ovelha Leite ecoalho

Gouda protease Asp.oryzae

Leite ecoalho

Mussarela Lipase,esterase

bezerro Leite

Blue LipaseProtease

Asp. SppP. roq.

Coalhomassa

Constituintes do leite:

a lfa s1 case in a3 8 %

kap p a case in a3 6 %

b eta ,g am a e a lfa s2 case in a1 6 %

C ase ín a8 0 %

alb u m in a im u n og lob u lin a

p ro teosep ep ton a

ceru lop lasm in a

lac to fe rrin a

P ro te in as d o soro2 0 %

H 2 0 = 8 6 -8 8 %G ord u ra = 3 -6 %P ro te ín a = 3 -4 %L ac tose = 5 %

K- caseina

Propriedade especial: é única fração da caseína do leite solúvel na presença de íons Cálcio.Efeito estabilizante: estabiliza as frações da caseína em solução, pela formação de micélios coloidais.

Hidrólise da kapa caseína

O micélio coloidal formado pela kapa caseínatem PM 10000 e 100 nm. Partes hidrofílicas para fora do micélio.Partes hidrofóbicas: alfa s1 e s2 caseina para dentro.

A kapa caseína é mais facilmente hidrolisada pois está na superfície da micela. A hidrólise da kapa caseína desestabiliza o micéliocausando a coagulação do leite.

K caseína p-k caseína + glicolipídeo

Cálcio

Coagulação

Renina

A hidrólise específica entre fenilalanina-metionina da k caseina pela renina, libera um peptídeo com carga altamente negativa,que se coagula na presença do Calcio.

Renina (quimosina ou coalho animal)

Fonte: Abomasso (4O estômago do bezerro, cordeiro, cabrito)

Renina CaracterísticaspH ótimo 6,3-6,6 ação

3,8Temp. ótima 40oC

pH estabilidade 4,8 - 6,0

Especificidade Rompe ligação peptídicaentre Fenilalanina-Metionina (105-106)

Cofatores Cálcio para ppt p-caseinato

Vantagens Proteólise limitada

Síntese Zimogênio: prorenina

Aplicações Queijos e flans

Obtenção da renina Coalho

In cu b ar 7 2 h rs , 1 0 oC

A ju s te p H 4 ,6A d ic ion ar res in a sep araçã o

A ju s ta r p H 5 ,8

C oa lh o

F iltra r em tec id o e filtro

C oag u laçã o d a p ro te in a e a tiva p ro ren in a

H C l 1 8 % p H 2 ,5 , 1 0 oC , 7 2 h rses te rilizaçã o

F iltra r

1 5 0 m L N aC l 6 % e 2 ,5 % á c b ó ricop H 5 ,4

C orte em tiras

E lim in ar cam ad a g ord u ra

L avag em

4 o E s tô m ag on ovilh os

Pepsina

Pepsina-protease ácida é extraída de estômago de suínos.

Aplicações:•Nas preparações de renina comocontaminante ou substituto de renina;•Auxiliar da digestão•Preparações de cereais e alimentos infantis

Propriedades:• pH ótimo: 1,0 - 4,0•pH estabilidade máxima: 5,0 - 5,5•Especificidade: relativamente ampla hidrolisandoprincipalmente ligações peptídicas entre amac aromáticos.

Metaloproteases

ATIVIDADE DEPENDE DO GRUPO ÍON METÁLICO

SÍTIO ATIVO: Mg; Zn; Co, Fe, Hg, Cad, Cu, Ni

O metal pode estar fortemente ligado e dificilmenteser removido ou estar fracamente ligado e ser

removido por diálise contra EDTA.

A remoção do íon inativa a enzima.

São classificadas em exo e endo peptidases

Proteases: Endo e Exo peptidases

Endopeptidases : atuam nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as

regiões N e C terminal.

Exopeptidases:

Atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal.

Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido Aminopeptidases.

As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido Carboxipeptidases.

Carboxipeptidase A

Remove aa do terminal carboxilia e favorece a liberação de aa com cadeias laterais aromáticas:

• Leucina•Isoleucina

Não hidrolisa substratos aa terminal: •Arginina•Lisina•Prolina,

É adequada para remoção do sabor amargo em hidrolisados proteicos:O sabor amargo é devido ao aparecimento de peptídeos que apresentam aa hidrofóbicos no terminal carboxílico:• Leucina•Prolina•Valina•Fenilalanina

AmAc amargos

Peptídeos com cadeias laterais hidrofóbicas:

Carboxipeptidases A - exopeptidaseou Aminopeptidase

Sabor amargo desaparece

SABOR AMARGO

Serinas proteases

Serina no sítio ativo Tripsina, Quimitripsina, Elastase, Subtilisina Endoproteases Alcalinas pH 7,0 - 11,0 Inibidas por DFP (diisopropil fluorofosfato)

Tripsina

Tripsina é extraída do pâncreas de suínos e bovinos. Serina protease.

Produção de hidrolisado protéico: Aplicação. pH ótimo: 7- 9 Temperatura ótima: 50oC

Especificidade: Mais específica para as ligações peptídicas envolvendo grupos carboxilas dos aa básicos: Lisina e Arginina.

• Tripsina é muito estudada é muito estudada devido às suas propriedades de ativação de outras proteases.• E também porque alguns alimentos possuem inibidores desta enzima.

Tripsina

TripsinogênioInativo

Tripsina

Quimotripsinogenio inativo Quimotripsin

aativa

Procarbosipeptidase Ainativa

Carboxipeptidase

Tripsina

Proteases em panificação

As propriedades reológicas da massa de farinha de trigo são devidas às proteínas do Glúten.

Glúten: responsável pela força da farinha e viscoelasticidade. A força está ligada à capacidade de reter gás durante a fermentação do pão. Rede de gluten.

Agentes oxidantes: BromatoPeróxido melhoram a farinhaIodato

Redutores: pioram a farinha: cisteína e glutation

Proteases em panificação:

Proteases fúngicas de Asp. Oryzae são misturas de exo e endo peptidases.

Rompem a rede do Glúten por hidrólise das ligações peptídicas diminuindo elasticidade e viscosidade da massa. Reduzem o tempo de mistura.

Vantagens:•elasticidade e textura melhores•retenção de gás maior•Melhor simetria•Aroma•tempo de estocagem maior.

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