Laboratório de Desenvolvimentode Processos Biotecnológicos

Aluno: Leandro Junqueira Benedini Orientadora: Profa Dra. Maria Helena Andrade Santana

Influência de Peptonas Vegetais no Cultivo de Streptococcus zooepidemicus para a

Produção de Ácido Hialurônico

Defesa de dissertação de mestrado

Área de concentração: Desenvolvimento de Processos BiotecnológicosÁrea de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos

Sumário

Introdução

Artigo 1: Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico.

Artigo 2: Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de Placas Petri e Produção de Ácido Hialurônico.

Ácido HialurônicoÁcido Hialurônico

- Face hidrofóbicaH

Ácidos D-Glicurônico e N-acetilglicosamina

Estrutura altamente hidratada

Moléculas pequenas difundem no domínio aquoso

Moléculas grandes são excluídas

Propriedades Físico-Químicas

Propriedades viscoelásticas

Fonte Massa molar (Da)

Fluido sinovial 1,0 - 8,0 × 106

Cordão umbilical 3,6 - 4,5 × 106

Crista de galo 12 - 14 × 106

Humor vítreo bovino 0,38-2,08 × 106

(Adam e Ghosh, 2001; Iqbal et al., 1997.)

(Kogan et al., 2007 e Pires, 2009)

Ácido HialurônicoÁcido HialurônicoFontes de obtenção

Azari et. Al (2011),

Ácido HialurônicoÁcido HialurônicoAplicações

Oftalmologia;

Ortopedia;

Proteses;

Cura de feridas;

Dermatologia.

Liberação controlada de fármacos

Complexo processo de purificação

Riscos de infecções virais Riscos de reações alérgicas

Recursos animais

Ácido HialurônicoÁcido HialurônicoOs recursos animais e microbianos

Produção microbiana Início em 1980 Microorganismos do gênero Streptococcus Mesma estrutura química Massa molar: 2,4-3,4 × 106 Da Melhor qualidade do produto

Microorganismos gram-positivos e anaeróbicos

Bactérias láticas nutricionalmente fastidiosas

Requerem meio de cultivo rico para crescimento

Produção de AHAH sintasesCápsula de proteçãoOcultação de sistemas

imunológicos

Streptococcus Streptococcus zooepidemicuszooepidemicus

Chong et. al (2005)

HAS,hyaluronate synthase; NOX, NADH oxidase; LDH, lactate dehydrogenase; PFL,pyruvate formate lyase; PDH, pyruvate dehydrogenase; ADH, alcohol dehydrogenase; AK, acetate kinase

Caminhos metabólicos deStreptococcus zooepidemicus: De

glicose a AH

(a) Metabolismos homolático e (b) misto

(a)

(b)

BiopolímeroExtracelular

Condições operacionaisCondições operacionaispH

Entre 6,5 e 7,5 (Akasaka, 1998)Choques de pH: Maior produção de

células e AH (Pires, 2009)

AeraçãoMaior crescimento (Chong e Nielsen,

2003)AH com maior massa molar (Akasaka et

al., 1989)Maior concentração de AH (Chong &

Nielsen, 2003)

c

AgitaçãoRelação com

transferência de oxigênioTensão mecânica: Danos à

cadeia polimérica

c

Fontes de energiaFontes de energiaFontes de carbono

Produção dependente de AH (Pires, 2009)Maior produção de AH (1,21 g.L-1) em cultivo

com 25 g.L-1 glicose (Pires, 2009)

Fontes de nitrogênioHidrolisados de caseína, aminoácidos, peptonas

e extrato de leveduras (Batistote, 2006 e Pires, 2009)

Responsáveis por crescimento microbiano e produção de metabólitos de interesse

Preparação de inóculosPreparação de inóculos

Adição de células

Inó

culo

líqu

ido

, 12 h

Inó

culo

líqu

ido

, 12 h

I II

III

Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC 39920,.

Remoção de células

Componentes das placas Petri: BHI (Brain Heart Infusion) Sangue de carneiro

Fermentações em bateladaFermentações em batelada

- Fontes de carbono

- Fontes de nitrogênio

- Controle de pH

- Alimentação de oxigênio

- Maior turbulência

-Fontes de carbono

- Fontes de nitrogênio

- Sem controle de pH

- Sem alimentação de oxigênio

- Menor turbulência

Recuperação de Ácido Recuperação de Ácido HialurônicoHialurônico

Extrato de leveduras (EL)Fonte microbianaGrande quantidade de

aminoácidos essenciaisMeio com muitas

proteínas

Peptonas vegetais (PVs)Fonte vegetalQuantidade relevante de

aminoácidos essenciaisMuitos peptídeos

As impurezas no AH recuperadoAs impurezas no AH recuperado

Fonte: Organotechnie

Table 1 – Total and free amino acids contents in soy (SP) wheat (WP) and potato (PP) peptones. Data from the manufacturer Organotechnie (France). Pg 34.

Table 1 – Total and free amino acids contents in soy (SP) wheat (WP) and potato (PP) peptones. Data from the manufacturer Organotechnie (France). Pg 34.

Substituição de extrat0 de leveduras por PVs em fermentaçõesProdução de AHProteínas ou peptídeosassociados

Substitução de BHI e sangue de carneiro por PS em placas Petri.Adaptação celularProdução de AH

Objetivos:Objetivos:

Artigo 1

Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico.

ObjetivosSubstituição de extrato de leveduras por

peptonas vegetaisPeptona de soja (SP)Peptona de batata (PP)Peptona de trigo (WP)Mistura de PVs (MPV)

Quantificação de proteínas ou peptídeos retidos em AH produzido

Estudo cinético de fermentações.

Procedimento experimentalQuantificação de nitrogênio e glicose nas peptonas:

Método de KjeldahlKit de determinação de glicose Laborlab.

Table 2 - Total nitrogen (TN), total protein and peptides (TPP) and glucose (G) in the vegetable peptones and in the yeast extract in the fermentation media at the starting of the fermentations

Table 2 - Total nitrogen (TN), total protein and peptides (TPP) and glucose (G) in the vegetable peptones and in the yeast extract in the fermentation media at the starting of the fermentations

Métodos e AnálisesCrescimento celular

Método gravimétrico

Purificação de AHPrecipitação com

etanolRessuspensão em

NaCl

Quantificação de AHMétodo do carbazol

modificado

Quantificação de proteínas ou petídeosMétodo de Lowry

Ácidos orgânicosHPLC

Massa molarHPLC

Table 3 - Performance of the vegetable peptones and yeast extract on the production of HA from Streptococcus zooepidemicus (ATCC 39920) during 24h fermentation and its purity after three precipitations with ethanol.

Table 3 - Performance of the vegetable peptones and yeast extract on the production of HA from Streptococcus zooepidemicus (ATCC 39920) during 24h fermentation and its purity after three precipitations with ethanol.

HA – Hyaluronic acid; YP/X - HA production per cell growth; YP/S - HA production per glucose consumption; YX/S - Cell growth per glucose consumption; YLactate/S - Lactate production per glucose consumption; YAcetate/S - Acetate production per glucose consumption; FE – Free essential amino acids; TE – Total essential amino acids; TPP - Total proteins and peptides; MW – Average molecular weight.

Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■) media.

Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■) media.

ConclusõesSP é a peptona vegetal mais promissora

Fermentação com SP: 0,28 g.L-1 de AHFermentação com YE: 0,21 g.L-1 de AH

Fermentações com SP produzem AH com menor quantidade de proteínas e peptídeos (TPP) e com mesma massa molarFermentação com SP: 1,4 g.g-1

Fermentação com YE: 4,1 g.g-1

Tempo recomendável para fermentação: 5 horas.

Artigo 2

Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de Placas Petri e Produção de

Ácido Hialurônico.

Objetivos

Utilização de SP em placas Petri

Definição de composição mais apropriada.

Validação com fermentações

Procedimento experimentalPreparação de placas Petri

BHI e sangue de carneiroSP e sangue de carneiroSP

Meios de cultivo SP e glicoseRelação glicose/N = 7.8

Métodos e AnálisesCrescimento celular

Método gravimétrico

Purificação de AHPrecipitação com

etanolRessuspensão em

NaCl

Quantificação de AHMétodo do carbazol

modificado

Ácidos orgânicosHPLC

Massa molarHPLC

Table 1 - Performance of the fermentations with substitutions of the animal nutrient sources, Brain Heart Infusion and sheep blood, by soy protein in the first seed culture medium Streptococus zooepidemicus (ATCC 39920) in Petri plates.

Table 1 - Performance of the fermentations with substitutions of the animal nutrient sources, Brain Heart Infusion and sheep blood, by soy protein in the first seed culture medium Streptococus zooepidemicus (ATCC 39920) in Petri plates.

Conclusões

A substituição de sangue de carneiro e BHI por SP em inóculos sólidos levou a produção similar de AHSem substituição: 0,29 g.L-1

Com substituição: 0,30 g.L-1

A utilização de SP em inóculos sólidos levou a produção de AH com massas molares semelhantes

SugestõesPlanejamento experimental para estimativa da

ótima relação C6H12O6/N.

Planejamento experimental em reatores, para estimar a ótima rotação e vazão de alimentação de oxigênio do fermentador.

Utilização de peptona de soja em fermentações com choque ácido.

Desenvolvimento de novos métodos para purificação do AH.

Bibliografia ARMSTRONG, D.C. The molecular weight properties of hyaluronic acid produced Streptococcus

zooepidemicus. Queensland: University of Queensland, 1997. (PhD. Thesis).

BLANK, L.M., MCLAUGHLIN, R.L., NIELSEN, L.K. Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus chemostats operated at high dilution rate. Biotechnol. Bioeng., v.90

CHONG, B.F.; BLANK, L.M.; MCLAUGHLIN, R.; NIELSEN, L.K. Microbial hyaluronic acid production. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.66, n.4, p.341-351, 2005.

HELDIN, P. (2003) Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumor formation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. Brasil, pp. 967-973.

  IZAWA, N.; HANAMIZU, T.; SONE, T.; CHIBA, K. (2010) Effects of fermentation conditions and soybean

peptide supplementation on hyaluronic acid production by Streptococcus thermophilus strain YIT 2084 in milk. Journal of Bioscience and Bioengineering. Pp. 356-360.

JOHNS, M.R.; GOH, L.T.; OEGGERLI, A. Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus. Biotechnol. Lett., v.16, n.5, p.507-512, 1994.

  PIRES, A., MACEDO, A.C., EGUCHI, S.Y., SANTANA, M.H.A. Microbial production of hyaluronic acid from

agricultural resource derivatives. Bioresource Technology 101, 6506-6509, 2010.  PIRES, A., SANTANA, M.H.A. Metabolic Effects of the Initial Glucose Concentration on Microbial Production

of Hyaluronic Acid. Appl Biochem Biotechnol (2010) 162, 1751–1761, 2010.

ZISU, B.; SHAH, N. (2003) Effects of PH, temperature, suplementation with whey protein concentrate, and adjunct cultures on the production of Exopolysacharides by Streptococcus thermophylus 1275. Journal of Dairy Science. Pp 3405-3415.