Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidas BIO10-329 Biofísica de Proteínas...
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Proteínas: estrutura tridimensional e Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidasforças envolvidas
BIO10-329 Biofísica de ProteínasRegente: Célia R. Carlini
Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações
Os assuntos abordados nessa aula são:
- Modelos de estrutura proteica
- Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas
- Métodos de estudo da estrutura de proteínas
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Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de níveis organizacionais da estrutura de uma proteína, como visto na aula anterior:
A Hemoglobina é um heterotetrâmero formada por 2 tipos de cadeias polipeptídicas
Subunidades alfa
Subunidades betaHeme
(grupo prostético)
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Estrutura quaternária:• Associação de mais de uma
cadeia polipeptídica • No modelo, um tetrâmero
composto de 4 cadeias polipeptídicas
x 4
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:
Estrutura terciária:• Enovelamento de uma cadeia
polipeptídica como um todo.• Ocorrem ligações entre os
átomos dos radicais R de todos os aminoácidos da molécula
.
Estrutura secundária:• Enovelamento de partes da
cadeia polipeptídica• Formada somente pelos
átomos da ligação peptídica, através de pontes de H.
• Ex: alfa-hélices e folhas beta.
Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica; mantida por ligações peptídicas
aminoácido
É o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqüência dos átomos (-N-C-C-)n na proteína.
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:
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O primeiro passo para se estudar a estrutura de uma proteína é obtê-la de forma purificada.
Geralmente a proteína que se deseja estudar é um componente minoritário (0,01 a 1%) em uma complexa mistura de outras proteínas
que estão presentes em qualquer tipo de tecido ou célula.
Purificar uma proteína significa separar a proteína de interesse das outras presentes na fonte de origem, de modo a ter somente ela no meio.
Muitas vezes purificar uma proteína é a etapa limitante no estudo de suas características estruturais e propriedades biológicas.
Em uma próxima aula estudaremos os métodos disponíveis para purificação de uma proteína
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Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.aminoácido
Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos.
A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. A área do pico quantifica o aminoácido.
A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar
(hidrólise) as ligações peptídicas.
A mistura resultante é submetida a métodos cromatográficos (fase reversa, troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min)
fluor
escê
ncia
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Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados:
a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com
fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.
b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos
correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e
proteômica.
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Método de Edman - sequenciamento de proteínas com
PITCPITC (fenil-isotiocianato)
ciclo 1
ciclo 2
hidrólise com ácido trifluoroacético
hidrólise ácida
vai para novo ciclo
análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)
(1)
(2)
(3)
acoplamento
acoplamento
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
1. Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
2. Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);
3. Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína.
Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade
para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína.
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Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.
ProteínaTotal 150 a.a
sequência obtida a partir da proteína intacta
30 aa
Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.
proteína inteira
peptídeos método A
peptídeos método B
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Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína.
Na queratina (proteína da lã de carneiro), Pauling viu um padrão repetitivo de zonas claras (eletrondensas) e escuras na difração de raios X.
-hélice
Filmefotográfico
Raio XPara explicar esse padrão, foi proposto o modelo da -hélice, com as seguintes caracterísiticas:
• esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da proteína assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com um espaçamento de 3,6 resíduos de aminoácido por volta;
• o enovelamento é estabilizado por pontes de hidrogênio entre átomos das ligações peptídicas de qualquer aminoácido, exceto prolina;
• as cadeias laterais dos aminoácidos voltam-se para fora da hélice.
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Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura para explicar o padrão de difração de raios X pela -queratina, proteína presente na unha, chifres e cascos de animais.
Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem
pontes de H entre os átomos da ligação peptídica.
As cadeias laterais R dos aminoácidos voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha
Vista lateral
Folha anti-paralela
-N C
-C NFolha paralela
-C N
-C N
Pontes de H
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Folhas paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através de pequenas torções da cadeia polipeptídica.
antiparalela
Paralela, torção à direita
Paralela, torção à esquerda
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Dobra
A -hélice e a folha são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica.
Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do C
Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra ou “alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+.
tipo 1 tipo 2
hélice-dobra-hélice“Zinc-finger”
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Beta-alfa-beta Só beta Só alfa
Barril betaBarril alfa-beta
Alguns modelos de organização estrutural, como os barris e , aparecem em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas.
A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula,
chamadas de “domínios” ou “motivos” proteicos.
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Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente
(pontes dissulfeto) ou não.
Subunidade (uma cadeia polipeptídica)
Proteína (biológicamente ativa; dímero não covalente )
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Algumas definições importantes:
- Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural.
- Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de sua sequência de aminoácidos.
- Os termos conformação e configuração não são sinônimos. Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula
determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas L- e D- de um aminoácido.
Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes.
Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais.
Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua atividade biológica.
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FORÇAS NÃO COVALENTES
Pontes de H-Aminoácidos polares
Ligações iônicas- Aminoácidos carregados
Interações hidrofóbicas-Aminoácidos apolares
Forças de Van der Waals-Qualquer aminoácido
ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
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ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Pontes de H ocorrem:
- entre os átomos da ligação peptídica (por exemplo, a -hélice e a folha );
- entre cadeias laterais de aminoácidos polares, carregados ou não;
- para os grupos –NH3+ e
–COO- dos aminoácidos N- e C-terminal, respectivamente.
Ponte de Hidrogênio
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Ligações iônicas:
- ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos com cargas contrárias;
- dependem do estado de ionização dos aminoácidos e do pH do meio;
- são menos frequentes do que as pontes de H.
ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Ligação Iônica
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ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
-Interações hidrofóbicas:
- ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos apolares;
- radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns dos outros;
- não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela água;
- como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas globulares é hidrofóbico.
Interações hidrofóbicas
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ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Forças de Van der Waals
- é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários;
- dipolos temporários (duração de nanosegundos) são criados devido à órbita errática dos elétrons;
- pode envolver qualquer tipo de aminoácido;
- geralmente coincidem com as regiões da proteína onde ocorrem as interações hidrofóbicas, pois a aproximação dos radicais apolares facilita a interação entre os dipolos.
e Forças de van der Waals
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O hormônio insulina é composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia
A
B
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Além dos laços não covelentes, uma proteína pode ter pontes dissulfeto formada a partir de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína).
Pontes dissulfeto são covalentes e só podem ser rompidas por agentes redutores, como 2-mercapto-etanol.
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* O valor indicado para cada ligação refere- se à quantidade
de energia necessária para rompê-la.
Tipo deligação
Energia *(Kcal/mol )
Tipo deligação
Energia *(Kcal/mol )
LIGAÇÃO SIMPLES LIGAÇÃO DUPLA
O — H 110 C O 170H — O 104 C N 147P — O 100 C C 146
C — H 99 P O 120N — H 93 LIGAÇÃO TRIPLA
C — O 84
C — C 83S — H 81 PONTE DE HIDROGÊNIOC — N 70 NH ...OC — S 62 OH ... NN — O 53 NH ... N S — S 51 OH ... O
4 - 5
C C 195
A ligação peptídica é muito forte e só se rompe em condições químicas drásticas, como 6N HCl a 100ºC.
A tabela mostra que a força das ligações entre os átomos do esqueleto covalente de uma proteína C-C-N-C-C-N é da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (Não esquecer que a ligação C-N tem
carácter parcial de dupla ligação C=N, por causa da ressonância da ligação peptídica.)
A conformação proteica depende basicamente de forças fracas, como a ponte de H e interações hidrofóbicas.
A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativa- mente rara entre as proteínas. Por ser um laço covalente, não se rompe quando uma proteína desnatura em meio ácido ou por calor.
Proteínas são moléculas frágeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biológicas, por pequenas variações do pH ou da temperatura do meio. A ponte de H é uma das principais forças envolvidas na estabilidade da conformação nativa.
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As interações que as proteínas estabelecem com o meio são importantes na determinação de sua conformação.
A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de -hélices apolares, que delimitam um canal interno de natureza polar.
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O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias laterais têm para interagir com o meio aquoso.
Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido.
O perfil hidropático de uma proteína é calculado como a soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica.
Permite prever regiões da proteína que interagem com a membrana plasmática ou com os meios interno/externo.
O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.
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A bacteriorhodopsina (bR) da arqueobactéria
Halobacterium salinarum, é o sistema
fotossintético mais simples conhecido,
permitindo a sobrevivência do organismo
em situações de baixo O2, ao converter luz
solar em energia química. Quando a
molécula de bR absorve um fóton, ela se
torna uma bomba de prótons, bombeando H+
do meio intracelular para o exterior da
célula. A energia do gradiente eletroquímico
formado é então utilizada para síntese de
ATP por uma ATP sintase. citoplasma
meio externo
canal de H+
Bacteriorhodopsina inserida em uma porção da membrana
Para ter esse tipo de estrutura, a proteína apresenta as cadeias laterais de seus aminoácidos apolares voltadas para “fora”, em contacto com os lipídeos da membrana da célula. Aminoácidos polares estão voltados para “dentro”, delimitando o canal de prótons da molécula.
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O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e recebeu o Prêmio Nobel (1972) por suas descobertas.Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), proteína com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto.
Ele demonstrou que era possível fazer uma desnaturação reversível da proteína, adicionando uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica, mostrando que voltou à sua conformação nativa.
Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades, de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma.
A conclusão de Anfisen foi a de que a sequência dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o que determina a estrutura 3D das proteínas.
Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ?
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A conformação nativa de uma proteína representa o estado de menor energia do sistema.
A energia que estabiliza a estrutura 3D de uma proteína vem do aumento da entropia da água, representando “desorganização” da água à medida que interagem com a proteína.
In vivo conformações intermediárias das proteínas são estabilizadas por chaperonas durante o processo de síntese proteica.
Como é possível termodinamicamente que as proteínas tenham estruturas tão altamente organizadas ?
De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ?
entropia
ener
gia
Estrutura nativa
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Utilize o programa RasMol para explorar a estrutura tridimensional de proteínas:
1. Clique aqui para fazer o download do arquivo rw32b2a.exe. Salve-o numa pasta em seu computador.
2. Faça o download dos arquivos .pdb da quimotripsina e da pepsina.
3. Execute o RasMol (clique 2X no arquivo rw32b2a.exe) e abra os arquivos .pdb
4. Explore as várias formas de visualização das proteínas.
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Encerramos aqui a segunda aula da disciplina Biofísica de Proteínas.
No ED 2 aplicaremos vários dos conceitos aprendidos hoje.
• Níveis de organização estrutural das proteínas
• Modelos de estrutura proteica
• Métodos de estudo da estrutura primária de proteínas
• Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas