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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
PROTEINOGRAMA DO HUMOR AQUOSO DE CÃES
(Canis familiares - LINNAEUS, 1758) CLINICAMENTE
SAUDÁVEIS.
MÁRIO SÉRGIO ALMEIDA FALCÃO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EM SAÚDE ANIMAL
BRASÍLIA-DF
DEZEMBRO/ 2008
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
PROTEINOGRAMA DO HUMOR AQUOSO DE CÃES
(Canis familiares - LINNAEUS, 1758) CLINICAMENTE
SAUDÁVEIS.
MÁRIO SÉRGIO ALMEIDA FALCÃO
ORIENTADORA: PROFa . DRa
. PAULA DINIZ GALERA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EM SAÚDE ANIMAL
PUBLICAÇÃO: 003 /2008
BRASÍLIA/DF
DEZEMBRO/2008
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REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA E CATALOGAÇÃO
FALCÃO, M.S.A. Proteinograma do humor aquoso de cães (Canis familiares -
LINNAEUS, 1758) clinicamente saudáveis. Brasília: Faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2008, 77 p. Dissertação de Mestrado.
Documento formal, autorizando reprodução desta
dissertação de mestrado, empréstimo ou
comercialização, exclusivamente para fins
acadêmicos, foi passado pelo autor a Universidade de
Brasília e acha-se arquivado na secretaria do
programa. O autor reserva para si os outros direitos
autorais, de publicação. Nenhuma parte desta
dissertação pode ser reproduzida sem a autorização
por escrito do autor. Citações são estimuladas, desde
que citada à fonte.
Falcão, Mário Sérgio Almeida
Proteinograma do Humor Aquoso de Cães Clinicamente Saudáveis./Mário Sérgio
Almeida Falcão. Brasília, 2008. Orientação Paula Diniz Galera – Brasília, 2008.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária, 2008.
1. cão. 2. proteína. 3. humor aquoso.4.olho
CDU
Agris/FAo
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
PROTEINOGRAMA DO HUMOR AQUOSO DE CÃES (Canis familiares -
LINNAEUS, 1758) CLINICAMENTE SAUDÁVEIS.
FALCÃO, MÁRIO SÉRGIO ALMEIDA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE
ANIMAL, COMO PARTE DOS REQUISITOS
NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM SAÚDE ANIMAL.
APROVADO POR:
_____________________________________________________________
Profª. Drª Paula Diniz Galera ( Universidade de Brasília-UnB)
_____________________________________________________________
Prof. Dr. Antônio Felipe Paulino Wouk (Universidade Federal do Paraná)
____________________________________________________________________
Profª. Drª. Francislete Melo (União Pioneira de Integração Social).
BRASÍLIA/DF, 05 de DEZEMBRO de 2008
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Deus, princípio e fim de tudo, meu Senhor e meu Deus, te
louvo e te agradeço por mais essa conquista, que sem Ti não seria possível.
A minha família que é tão especial para mim, aos meus pais, obrigado por esse
amor incondicional, ao meu irmão Márcio, a minha irmã Milena, ao meu cunhado
Nilson por todo amor, carinho e apoio, amo vocês. A minha sogra e meu sogro, as
minhas cunhadas e concunhado, vocês são um exemplo para mim, admiro muito
vocês, obrigado por tudo, amo vocês. Ao meu sobrinho Tiago, seu sorriso é sempre
uma esperança.
A minha Esposa, Minha vida, te amo muito linda, você foi importantíssima nessa
conquista, estar com você é maravilhoso e me faz a cada dia, uma pessoa melhor,
te amo muito.
A minha Orientadora Prof. Dra. Paula Diniz Galera, por toda confiança, paciência e
incentivo para realização deste trabalho.
Ao Meu querido amigo Levi, na lembrança o seu sorriso e as suas palavras, no
coração a saudade e eterna gratidão. Sei que está vendo tudo ai de cima.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste
trabalho, por toda a ajuda, apoio e incentivo, muito obrigado.
“Tu te tornas eternamente responsável por aquilo que cativas”
Antoine de Saint-Exupéry
A Profª. Drª. Paula Diniz Galera, por toda confiança depositada ao longo de todo
este tempo, por ter partilhado comigo todo seu conhecimento, a minha admiração a
você faz com que eu siga seus passos na cirurgia e na docência. Não tenho como
agradecê-la. Como agradecer a alguém que acreditou em quem não tinha nada a
oferecer, como agradecer todo carinho e atenção depositados e a força e o estímulo
para continuar, me faltariam palavras, você sempre será a minha “Prof.”. Te admiro
muito, estar com você nos faz melhor sempre, te adoro.
Ao Prof. Cássio Ricardo Ribeiro, por todas amizade e apoio e dicas para realização
deste trabalho, valeu Cassild’s.
Ao Prof. Richard Filgueiras, que conheci ao longo desta caminhada, por todos os
ensinamentos, amizade e confiança, te admiro muito como pessoa e como
profissional, obrigado por tudo.
A todos os professores do Hvet UnB que me ensinam muito a cada dia, com muita
dedicação e atenção.
A todos os residentes do Hvet da UnB, que ajudaram muito nesta fase da minha
vida.
A Maria Fernanda Machado e a Larissa Borges, pela ajuda direta na realização
deste trabalho, pelos dias sem almoço e pelas palavras de incentivo e carinho, adoro
vocês.
A Martha Rocha e a Ana Barbara Silva, meninas, vocês são dez, obrigado pelo
ombro amigo e pelo incentivo nas horas difíceis, adoro vocês.
A Anahi Silva e a Bruna Lopes, sempre com seus “pepinos”, obrigado por tudo
meninas.
A Ana Carolina Rodarte que mesmo distante, sei que sempre posso contar com seu
apoio e amizade, você é uma grande amiga, saudades.
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Ao Prof.Dr. Túlio Cesar, sem você este trabalho não teria saído, toda a sua
dedicação e vontade de ajudar o próximo, a sua dedicação e paciência. Grande
Túlio, não tenho como agradecê-lo.
A Profa. Dra. Elida Campos, pela confiança e por ter acreditado na realização deste
trabalho.
A todo pessoal do lab. 0, ao Davi Rosa, a Greice Lucena, a Renata Timbó e a
Viviane de Souza, conviver com vocês foi maravilhoso, fez deste trabalho, menos
ardo e muito divertido.
Ao grande amigo Rômulo Vitelli, por sua amizade, dedicação e disponibilidade,
obrigado por tudo, acredito muito em você.
A todo pessoal do laboratório de patologia clínica pelo apoio neste projeto, em
especial a Roberta Rendy, que ajudou diretamente, obrigado por tudo.
A todos os estagiários que ao longo desta jornada me ensinaram muito, obrigado a
todos vocês.
A Luiza Quintão, que mesmo longe, sempre esta perto, você faz falta viu.
A equipe dos sonhos, que sempre será inesquecível.
A Laila Manftoum, obrigado por tudo, por sua amizade, carinho, apoio, sem você as
coisas não são as mesmas, torço por você.
A todos os colegas de mestrado, meu muito obrigado.
As parceiras Cecília Azevedo e Fernanda Firmino, mais uma jornada concluída,
partilhar com vocês mais este momento foi muito bom, vocês estão no coração.
Aos meus grandes amigos, Tiago Mauriz e Rodrigo torres, que souberam entender
os momentos de ausência e sempre torcem por mim e me apóiam, valeu galera.
Ao Prof. Dr. Antônio Felipe Paulino Wouk e a Profª. Drª. Francislete Melo pelas
correções e considerações para melhoria deste trabalho, meu muito obrigado.
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CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
O humor aquoso é um fluido intra-ocular, produzido no corpo ciliar por
processos ativos e passivos, importante para o suprimento e remoção de nutrientes
e metabolitos de tecidos oculares avasculares (FITT; GONZALEZ, 2006; DUAN et
al., 2008).
Contém proteínas em sua composição (BLOGG; COLES, 1971; HAZEL et al.,
1985; GUM et al., 2007) que podem desempenhar um papel importante na
patogênese de diversas doenças oftálmicas (GRUS et al., 2007; DUAN et al., 2008).
Sabe-se que os níveis de proteína se elevam em desordens do segmento anterior
(GALERA, 2002; SLATTER, 2005; GUM et al., 2007) e, através dos avanços dos
estudos moleculares (GRUS et al., 2007), tem-se demonstrado que algumas dessas
proteínas possuem correlação com mecanismos patológicos, ou mesmo quanto ao
prognóstico de algumas desordens oculares (TAKASE et al. 2006; WEINSTEIN et
al., 2007; GRUS et al., 2007; DUAN et al., 2008).
A quantidade de proteínas presentes no humor aquoso de cães é regulada
pelas barreiras hemato - oculares, como a retiniana e a aquosa, as quais controlam
o influxo de proteínas para o aquoso (COOLEY et al., 1984; TRIPATHI et al., 1992;
GUM et al., 1999; GALERA, 2002; TOWNSEND, 2008). Com a desestabilização
dessas barreiras há um aumento dos níveis de proteínas no aquoso, o qual passa a
ser denominado de aquoso secundário, ou plasmóide, cujos níveis protéicos
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assemelham-se aos do plasma (KROHNE et al., 1998; COOLINS & MOORE 1999;
SLATTER, 2005).
A análise dessas proteínas possui implicações clínicas e diagnósticas, sendo
a quantificação das proteínas totais e a eletroforese de grande aplicabilidade e
repetibilidade em animais de companhia (DIAS, 1979; HAZEL et al.,1985; GRUS et
al., 2007).
Os valores dos níveis protéicos do humor aquoso em cães saudáveis situam-
se em torno de 0,5% dos valores plasmáticos (SLATTER, 2005; TOWNSEND,
2008). Entretanto, a literatura mostra grande diversidade nos valores dos níveis
protéicos do humor aquoso de cães saudáveis (HAZEL et al., 1985; COOLINS;
MOORE, 1999; GALERA, 2002; BRITO et al.2006; RIBEIRO, 2007). Os dados
fornecidos pela literatura referem-se a uma análise da proteína total, sem que uma
descrição metodológica ou um padrão da técnica utilizada para tal mensuração
tenham sido previamente estabelecidos. Pequenas modificações da técnica
empregada, sejam decorrentes da experiência do profissional que as executa, sejam
pelas modificações permitidas pelo método (a exemplo do Método de Bradford
modificado) podem ocasionar diversidade de valores. A padronização do método
implica na possibilidade de repetibilidade e, conseqüentemente, confiabilidade dos
dados obtidos.
REFERENCIAL TEÓRICO
Os olhos são estruturas metabolicamente ativas, que apresentam alto grau de
atividade no desempenho de muitas funções e para manutenção da fisiologia ocular
(WILLIAMS, 2008).
O bulbo ocular é diferenciado anatomicamente em três câmaras e três
túnicas. A câmara anterior é delimitada pela córnea e íris, a câmara posterior, entre
a íris e cápsula anterior da lente e a câmara vítrea, localizada posterior à lente
(SLATTER, 1990; KURAL et al., 1995; GUM, 1999; SLATTER, 2005).
As túnicas são divididas em fibrosa, vascular e nervosa. Pertencem à túnica
fibrosa a córnea e a esclera, à túnica vascular a íris, corpo ciliar e coróide, e à túnica
nervosa a retina (GUM, 1999; SLATTER, 2005).
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A túnica vascular, denominada úvea, desempenha papel importante na
fisiologia oftálmica, bem como na reação imunológica ocular às mais diversas
agressões (COLLINS; MOORE, 1991; STADES et al.,1999; TAKASE et al., 2006;
SIMON, 2008).
A úvea localiza-se próxima à região escleral e é uma estrutura altamente
vascularizada (SIMON, 2008; TOWNSEND, 2008). Divide-se, ainda, em trato uveal
anterior, composta pela íris e corpo ciliar, e úvea posterior ou coróide (STADES et
al., 1999; van der WOERDT, 2001; COLITZ, 2007; SIMON, 2008; TOWNSEND,
2008).
A íris, através dos seus grupos musculares, controla a entrada da luz que
penetra no olho alterando o diâmetro pupilar (van der WOERDT, 2001; TOWNSEND,
2008). O músculo dilatador da pupila situa-se próximo ao epitélio posterior e a
pupila, o qual possui disposição radial que se insere na placa fibrosa vizinha à
pupila, estendendo-se até a raiz da íris, e é inervado por fibras simpáticas (van der
WOERDT, 2001; SLATTER, 2005; COLITZ, 2007; SIMON, 2008; TOWNSEND,
2008). O músculo constritor localiza-se no limite da separação entre o estroma e o
epitélio posterior, próximo da borda palpebral, e é inervado por fibras
parassimpáticas (BLOUIN, 1984; COLITZ, 2007; SIMON, 2008)
Em sua face anterior a íris apresenta duas regiões, a ciliar e a pupilar. A sua
margem anterior se apresenta recoberta por células estromais modificadas,
denominada camada anterior marginal. Contínuo à sua face anterior observa-se o
epitélio pigmentado e o não-pigmentado recobrindo o corpo ciliar e,
esporadicamente, a retina (BLOUIN, 1984; HAKANSON; FORRESTER, 1990;
SLATTER, 2005).
As artérias ciliares longas, temporal e nasal, penetram na íris, próxima a sua
base, e formam o círculo arterial maior (van der WOERDT, 2001; SLATTER, 2005;
SIMON, 2008).
A coróide é uma região altamente vascularizada que provê a nutrição e
termoregulação para atividade metabólica da retina. É constituída de coriocapilares,
camada de vasos médios, pelo tapetum, camada vascular calibrosa e supracoróide.
Essa estrutura é visível em animais com fundo não pigmentado e pigmentado (van
der WOERDT, 2001; COLITZ, 2007).
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O corpo ciliar em sua face posterior (SIMON, 2008) é formado pela pars
plicata (porção pregueada) e prolongada posteriormente a pars plana (porção
plana), as quais se unem à retina (van der WOERDT, 2001; SIMON, 2008).
As fibras zonulares que sustentam a lente inserem-se na pars plana e entre
os fundos ciliares. Visualizados, em um corte lateral, os corpos ciliares têm forma
triangular, com um lado apoiado contra a esclera, o outro contra o corpo vítreo e a
base dando apoio a íris e ao ângulo iridocorneal (van der WOERDT, 2001; SIMON,
2008).
O humor aquoso é um fluido intra-ocular, produzido no corpo ciliar (COLITZ,
2007) pelos mecanismos de difusão, ultrafiltração e por secreção ativa pelo
processo ciliar (KURAL et al., 1995; GUM, 1999; GONÇALVES et al., 2005;
FAUTSCH et al., 2006; BROOKS, 2008; DUAN et al., 2008).
A difusão de solutos ocorre de uma área de alta concentração para uma de
menor concentração. Componentes como os lipídeos solúveis são exemplos de
substâncias que sofrem difusão (GUM, 1999). A ultrafiltração dá-se pelo movimento
do componente através da membrana celular pelo aumento da força hidrostática
(GUM, 1999). Já o transporte ativo requer consumo de energia, fazendo com que o
material secretado vá contra um gradiente de concentração. O transporte ativo de
alguns solutos, como o sódio (Na+), é um dos fatores mais importantes para a
formação do humor aquoso (GUM, 1999).
A secreção ativa resulta de processos enzimáticos complexos, nos quais a
enzima anidrase carbônica desempenha papel fundamental (SAMUELSON et al.,
1985; SLATTER, 1990; GONÇALVES et al., 2005; BORGES et al., 2006; BROOKS,
2008). A isoenzima anidrase carbônica II (CA-II) é uma das mais relevantes na
produção do humor aquoso e está presente no epitélio pigmentar e não pigmentar
do corpo ciliar (GELATT; MACKAY, 2001; WILLIS et al., 2002; DIETRICH et al.,
2007). A anidrase carbônica age como catalizador da reação : CO2 + H2O«» HCO- 3
+ H + , importante para formação do aquoso (GUM et al., 2007).
O humor aquoso é fundamental para o suprimento e a remoção de nutrientes
e metabólitos de tecidos oculares avasculares (GONÇALVES et al., 2005; FAUTSCH
et al., 2006; DUAN, et al., 2008), como a córnea (BLOUIN, 1984; GONÇALVES et
al., 2005) e a lente (LAUS et al., 2008), além de ser determinante para a
manutenção da pressão intra-ocular (GIOFRINDO, 1995; WOUK et al.,1999;
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LLOBET et al., 2003; GONÇALVES et al., 2005; FAUTSCH et al., 2006; BROOKS,
2008).
Carboidratos, uréia e aminoácidos estão presentes no aquoso em
concentrações variadas (BLOGG; COLES, 1971; GUM et al., 1999; GUM et al.,
2007), juntamente com uma mistura complexa de eletrólitos, solutos orgânicos e
fatores de crescimento celular (FAUTSCH, et al., 2006). O humor aquoso difere do
plasma pela sua concentração muito baixa de proteínas e lipídios (BLOGG &
COLES, 1971; DIAS, 1979). Essas proteínas que o compõe são igualmente
identificadas no plasma sanguíneo. As albuminas, gama-globulinas e as
imunoglobulinas são freqüentemente isoladas, sendo a albumina encontrada em
maior proporção (DIAS, 1979; GRUS et al., 2007).
A transferrina, com peso molecular de 80 Kda, é uma proteína responsável
pelo transporte de ferro e de zinco para os sítios de absorção, estocagem e
utilização. Em combinação com outras substâncias moduladoras de crescimento, a
transferrina regula e mantém muitas células do segmento anterior do olho e seu
aumento tem sido referido na fisiopatologia do glaucoma (TRIPATHI, 1992).
O humor aquoso produzido no corpo ciliar passa pela câmara posterior e
adentra a câmara anterior (HART, 1992; KAUFMAN, 1993; WOUK et al., 1999;
SLATTER, 2005; BROOKS, 2008). Durante a passagem do humor aquoso através
da câmara anterior, produtos de excreção são eliminados dos tecidos oculares
circundantes para o humor aquoso, alterando sua composição química, e este acaba
por ser eliminado através do sistema de drenagem uveal (HAKANSON;
FORRESTER, 1990; SLATTER, 1990; GRUS et al.,2007). O equilíbrio entre a
formação e drenagem desse fluido resulta na manutenção da pressão intra-ocular
(BUSKIRK & BRETT, 1977; WOUK et al., 1999; LLOBET et al., 2003; SLATTER,
2005; BROOKS, 2008), regulada por um mecanismo circadiano (RUSSEL, 2001).
A drenagem do humor aquoso dá-se pela via convencional e pela via
uveoescleral (MARTIN, 1974; BLOUIN, 1984; STADES, 1999, WOUK et al., 1999;
GELLAT, 1999; TIAN et al.,2000; LLOBET et al., 2003; GONÇALVES et al., 2005;
FAUTSCH et al., 2006; BROOKS, 2008) (FIGURA 1).
A via convencional é formada pela malha trabecular (MT) e pelos canais de
Schlemm (PUTNEY et al., 1999). A MT pode ser descrita como um filtro composto
por matriz extracelular (colágeno), organizado em forma de rede, recoberto pelas
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células trabeculares endoteliais (TIAN et al., 2000; LLOBET et al., 2003; FAUTSCH
et al., 2006).
A via não convencional envolve a íris, corpo ciliar e coróide (BARRIE et al.,
1985; SAMUELSON et al., 1985; BILL, 1989; NILSSON, 1997; BROOKS, 2008).
Essa via é dependente do músculo do corpo ciliar que, quando contraído, diminui a
drenagem do aquoso; por outro lado, seu relaxamento resulta em maior drenagem
(BILL, 1989; NILSSON, 1997; GELATT, 1999). Tais alterações no músculo ciliar
redistribuem a drenagem do aquoso pela via convencional e não convencional
(NILSSON, 1997).
Não existe uma barreira epitelial entre a câmara anterior e o músculo ciliar, ou
seja, o humor aquoso passa livremente para os espaços supraciliares e
supracoroidal, sendo drenados na região escleral, via uveoescleral (BARRIE et al.,
1985; SAMUELSON et al.,1985; BILL, 1989; NILSSON, 1997).
Em cães hígidos, a via uveoescleral é responsável pela drenagem de até 15%
do humor aquoso. Entretanto, no glaucoma, sua funcionalidade pode estar reduzida
a uma taxa de filtração de 3% (BARRIE et al., 1985). As prostaglandinas otimizam a
drenagem dessa via, porque causam relaxamento do músculo ciliar ou mudanças na
matrix extracelular, resultando em menor resistência da rota de drenagem
uveoescleral (NILLSON, 1997).
Figura 1 - Figura ilustrativa que demonstra o fluxo do humor aquoso da câmara posterior para
a câmara anterior em direção ao ângulo de drenagem iridocorneal e malha
A
B C
D
Córnea
Íris
Lente
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trabecular. A) Câmara posterior. B) Câmara anterior. C) Ângulo iridocorneal. D) Via
uveoescleral. As setas demonstram o fluxo de humor aquoso da câmara posterior
para câmara anterior.
A matrix extracelular é um tecido especializado composto por vários
elementos da malha trabecular como a fibronectina, a laminina e diferentes tipos de
colágeno. Esses elementos são essenciais para manutenção do sistema de
drenagem do aquoso normal (ZHOU et al., 1996).
Pela presença de suas barreiras oculares, barreiras hemato - aquosa e
hemato – retiniana (OKISAKA, 1976; LEE et al., 2008), o olho é considerado um sítio
de privilégio imunológico (OHTA et al., 2000; BIROS, 2008).
Esse privilégio imunológico deve-se em parte ao desvio imune da câmara
anterior (ACAID), como resultado de uma intensa atividade do sistema imune local,
iniciando com a captura do antígeno no olho e culminando com a resposta imune
sistêmica. Este fenômeno tem sido estudado através da utilização de proteínas
solúveis, antígenos específicos, antígenos de histocompatibilidade e antígenos
tumorais. NA ACAID células intra-oculares apresentadoras de antígenos (CAAs)
capturam o aloantígeno, enviando-o diretamente para o baço, resultando na ativação
dos linfócitos T- reguladores (Treg-cells). Cabe a estas células suprimir uma resposta
inflamatória exacerbada e posterior dano aos tecidos intra-oculares (BIROS, 2008).
A barreira hemato-aquosa é formada pela tigth junctions das células do
epitélio ciliar (HAKANSON; FORRESTER, 1990; TOWNSEND, 2008), que são
responsáveis pela integridade funcional da barreira aquosa e pelo controle do fluxo
de fluido para a câmara posterior (COOLEY et al.,1984; GUM et al., 1999; COLITZ,
2007; TOWNSEND, 2008) .
A barreira hemato-retiniana, mais efetiva que a barreira aquosa quanto a sua
permeabilidade, também é constituída pelas tigth junctions entre os capilares
retinianos e as células do epitélio pigmentar da retina (COOLEY et al., 1984;
HAKANSON; FORRESTER, 1990; GUM et al., 1999; TOWNSEND, 2008).
A composição física e química do humor aquoso depende primariamente da
estabilidade dessas barreiras (TRIPATHI et al., 1992). Através delas há o controle
do influxo de proteínas (TOWNSEND, 2008) e de outras substâncias orgânicas e
inorgânicas para o seu interior (ALLERTON et al., 1962; KAUFMAN, 1993; LEE et
al., 2008). Descreve-se ser a concentração de proteína no humor aquoso duzentas
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vezes inferior à concentração da proteína plasmática (TOWNSEND, 2008), assim
como a concentração de fatores de crescimento (TRIPATHI et al., 1992; GUM et al.,
1999; SLATTER, 2005).
Em cães saudáveis, os valores protéicos no aquoso situam-se entre
36,4mg/dL, tendo sido descritas variações entre 21-65mg/dL (HAZEL et al., 1985).
Brito et al. (2006) referem valores de 25,86mg/dL e Coolins & Moore (1991),
37,4mg/100mL. Slatter (2005) e Townsend (2008) correlacionam a concentração do
aquoso a 0,5% do valor das proteínas plasmáticas totais.
Mediante desestruturação da barreira hemato - aquosa, seja decorrente de
processos inflamatórios, patológicos e farmacológicos, ou por paracentese de
câmara anterior, observa-se um aumento nos níveis protéicos no aquoso (DIAS,
1979; TRIPATHI et al., 1992; GALERA, 2002; BIAGGI et al., 2006; RIBEIRO, 2007),
mormente por albuminas, imunoglobulinas e fibrinogênio (KROHNE et al., 1998).
Essas proteínas adentram o aquoso alterando sua composição, ao que se denomina
humor aquoso secundário, ou aquoso plasmóide, clinicamente visualizadas como
fenômeno Tyndall positivo (DIAS, 1979; TRIPATHI et al., 1992; CAPRIOLI, 1992;
KROHNE et al.,1995; GALERA, 2002; BIAGGI et al., 2006; RIBEIRO, 2007; SIMON,
2008). Foram descritos níveis protéicos de 729mg/dL (COOLINS; MOORE, 1991;
SLATTER, 2005) e entre 600 a 2500mg/dL, quando a desestabilização das barreiras
oculares resultou de cirurgia intra-ocular (BLOGG; COLES, 1971).
As respostas inflamatórias oculares são inicialmente executadas e reguladas
pela interação de um mecanismo complexo, incluindo células inflamatórias e
mediadores químicos, ou fatores liberados a partir de células e tecidos (HAKANSON;
FORRESTER, 1990).
As inflamações oculares ocorrem em resposta a lesões mecânicas, químicas,
térmicas ou ainda alterações sistêmicas, endógenas, humorais e celulares de origem
secundária a infecções e causas imunomediadas (GIULIANO, 2004). Após lesão da
membrana celular as membranas de fosfolipídeos são liberadas e hidrolizadas pela
fosfolipases A2, resultando na formação do ácido aracdônico. O metabolismo do
ácido aracdônico ocorre por ação da via das cicloxigenase ( COX) e lipoxigenases. A
atividade COX resulta em tromboxano A2, prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina
F2-alfa e prostaciclina (PGI2). Quando as lipoxigenases são ativadas resultam na
formação de leucotrienos (LTs). (GALERA,2002; GIULIANO, 2004)
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As prostaglandinas são liberadas nos sítios de inflamação, onde interagem
com outros mediadores, como bradicinina e a histamina, estimulando terminações
nociceptoras, sendo uma das responsáveis da dor decorrentes do trauma ou da
cirurgia ocular (FORSYTH et al.,2000, GALERA, 2002). A liberação dessas
substâncias leva ao aumento da permeabilidade da barreira hemato-ocular e
conseqüente aumento dos níveis de proteína do aquoso (GALERA, 2002).
O estudo das proteínas presentes no humor aquoso de cães, tanto em
processos fisiológicos, quanto em processos patológicos, é fundamental para o
diagnóstico e tratamento precoce e efetivo das alterações oculares. A análise
dessas proteínas pode fornecer a identificação de biomarcadores fundamentais no
aprimoramento diagnóstico e terapêutico de doenças oculares. A identificação
desses biomarcadores em alterações autoimunes mediante análise do proteoma
pode incrementar o diagnóstico destas alterações, a exemplo da uveíte recorrente
eqüina (ZIPPLIES, et al., 2008).
Portanto, a análise desse fluido tem sido utilizada como auxílio ao diagnóstico
nas diversas afecções oculares em seres humanos (DIAS, 1979; TRIPATHI et al.,
1992; BARROS et al., 2003; YAMANE et al., 2003; RIBEIRO; 2007; WEINSTEIN et
al., 2007; ROTHOVA, 2008) e em animais (HAZEL et al., 1985; GALERA, 2002;
BRITO et al., 2006; WEINSTEIN et al., 2007). Análise citológica (HAZEL et al., 1985;
YOUNG, 2007), cultura microbiológica, quantificação da concentração das proteínas
totais, perfil bioquímico, contagem diferencial de células (HAZEL et al., 1985;
YOUNG, 2007), eletroforese uni e bi-dimensional (ROHDE et al.,1998; DUN et al.,
2008), reação de polimerase em cadeia (PCR) (BURNEY et al., 1998; ROTHOVA et
al., 2008), reação de imunoensaio (FABER, 2000; DENIS et al., 2003) e
cromatografia (TRIPATHI,1991; BARROS et al., 2003; REGNIER et al., 2003) são
alguns exames sugeridos.
Proteínas podem ser quantificadas por vários métodos espectrofotométricos
(AZEVEDO et al., 2003) e a sua quantificação na prática laboratorial requer um
método rápido e sensível (BRADFORD, 1976). A opção pelo método é dependente
da sensibilidade necessária à detecção das substâncias a serem pesquisadas. Os
mais difundidos são o de Lowry, o Bradford, o BCA. Esse último, de utilização mais
recente, é considerado uma otimização do método de Lowry (AZEVEDO et al.,
2003).
17
O método de Bradford tem sido descrito como método padrão para
quantificação de proteínas devido a sua grande sensibilidade e facilidade de
execução (BOLLAG et al., 1996; AZEVEDO et al., 2003). Consiste da utilização de
um corante de Commassie Blue com a cadeia polipeptídica (BRADFORD, 1976;
AZEVEDO et al., 2003).
A ligação da proteína a esse corante produz uma variação no comprimento de
onda que é medido na absorbância a 595nm em um espectrofotômetro. Os
resultados obtidos pelo espectrofotômetro devem ser colocados na equação de
lineralidade da curva padrão, para posterior quantificação da proteína total
(BRADFORD, 1976; BOLLAG et al.,1996; AZEVEDO et al., 2003).
O corante Vermelho de Pirogalol (Sensiprot®)1 é um corante que reage com o
molibdato de sódio, formando um complexo que, quando combinado com a proteína
em meio ácido, desenvolve um cromóforo de cor azul, com o máximo de
absorbância em 600nm. Esse reagente, dada a sua sensibilidade, pode detectar
concentrações tão pequenas quanto 2,0 mg/dL, sendo indicado para mensurações
protéicas de saliva (MARTINEZ et al., 2007), urina (GONÇALVES et al., 2007) e
líquido cérebro espinhal (GAMA, et al.,2005). Todavia, para análise direta do humor
aquoso ainda não fora testado.
A eletroforese em gel consiste em um método eficaz para separação de
macromoléculas, sendo o gel de poliacrilamida e o de agarose os mais empregados
(KUCHLE et al., 1994; VOET; VOET, 1995; ROHDE et al., 1998).
A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições
desnaturantes é um sistema de baixo custo, reprodutível e um método rápido para
quantificação e visualização do perfil protéico. Esse método separa as proteínas
conforme sua massa molecular (BOLLAG et al., 1996; GRUS et al., 2007). O seu
preparo pode dispor de concentrações variadas de acordo com a massa molecular
esperada (BOLLAG et al.1996). Após a corrida, os géis são corados com comassie
blue ou ainda nitrato de prata e depois descorados em solução de metanol 25% e
ácido acético 10%.
A leitura é realizada por densitometria para confecção dos gráficos de cada
amostra. Esse processo permite a classificação das proteínas por sua massa
molecular (AEBERSOLD; MANN, 2003).
1 Sensiprot®-Labtest
18
A citologia do humor aquoso pode ser adjutória no diagnóstico de infecções
ou de processos neoplásicos (RASKIN, 2003). Compreende a contagem de células
totais, seguida pela sedimentação do fluido para realização do esfregaço ou
preparação com fixador próprio. A celularidade esperada para o humor aquoso de
cães normais situa-se ao redor de 8,2cel/µl, mas esses valores podem variar de zero
a 37 cel/µl (RASKIN, 2003; YOUNG, 2007).
O exame citológico do humor aquoso deve revelar um padrão acelular, uma
vez que é um fluido com baixo teor protéico. Ocasionalmente podem-se observar
grânulos livres de melanina ou células que contenham melanina (RASKIN, 2003;
YOUNG, 2007). A citologia, embora seja um procedimento rápido e de fácil
execução, é pouco empregada na rotina oftálmica. Entretanto, apresenta como
vantagens ser um procedimento com invasão mínima e bons resultados práticos,
podendo auxiliar o clínico no diagnóstico e tratamento das afecções sistêmicas e
oculares.
OBJETIVOS:
Objetivou-se, com este estudo, estabelecer padrões de normalidade das
proteínas totais do humor aquoso de cães considerados clinicamente saudáveis,
mediante a padronização do método de Bradford. Ainda, objetivou-se avaliar a
sensibilidade de teste colorimétrico bioquímico direto à base do corante vermelho de
pirogalol (Sensiprot®), comparativamente ao método de Bradford, comparando-se
os valores obtidos por ambos os métodos aos valores de proteínas plasmáticas de
cães. Secundariamente, objetivou-se caracterizar o perfil protéico do humor aquoso
através do método de eletroforese unidimensional com coloração de nitrato de prata
e realizar a análise citológica desse fluido.
19
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Proteome Res. 2008 Dec 29
26
CAPÍTULO II
PERFIL PROTÉICO DO HUMOR AQUOSO DE CÃES (Canis familiares -
LINNAEUS, 1758) CLINICAMENTE SAUDÁVEIS: PADRONIZAÇÃO E
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS DE BRADFORD E SENSIPROT®,
ELETROFORESE (SDS-PAGE) COM COLORAÇÃO DE NITRATO DE PRATA E
ANÁLISE CITOLÓGICA
INTRODUÇÃO
O humor aquoso é um fluido intra-ocular produzido no corpo ciliar por
processos ativos e passivos, importante para o suprimento e a remoção de
nutrientes e metabolitos de tecidos oculares avasculares (DUN et al., 2008), como a
córnea e a lente, e é determinante para manutenção da pressão intra-ocular
(CAPRIOLI,1992; GIOFRINDO, 1995; STADES,1999; LLOBET et al., 2003). Contém
proteínas em sua composição, secretadas para os tecidos do segmento anterior, as
quais desempenham um papel importante na patogênese de diversas doenças
oculares (DUN et al., 2008).
O humor aquoso difere do plasma pela sua baixa concentração de proteínas e
lipídios (BLOGG; COLES, 1971). Carboidratos, uréia e aminoácidos estão
presentes, entretanto, em concentrações variadas (BLOGG; COLES, 1971; GUM et
al,1999; GUM et al., 2007).
27
Formado no corpo ciliar esse fluido transparente é composto por proteínas,
imunoglobulinas, enzimas e lipídeos, à similitude de um ultrafiltrado plasmático
(CAPRIOLI, 1992; KAUFMAN, 1993), preenchendo as câmaras anterior, posterior e
a pupila. Cabe ao humor aquoso o suprimento e a remoção de nutrientes e
metabolitos dos tecidos avasculares do bulbo ocular (BLOUIN, 1984; BROOKS,
2008).
As barreiras hemato-retiniana e hemato-aquosa controlam o influxo de
proteínas para o interior do humor aquoso, constituindo uma barreira funcional entre
o sangue dos capilares do estroma ciliar e o aquoso da câmara posterior
(HAKANSON; FORRESTER, 1990).
Em cães saudáveis os níveis protéicos situam-se entre 25,86 mg/dl, como
descrito por Brito et al. (2006). Outros valores médios são descritos por Coolins &
Moore (1991), em torno de 37,4 mg/dL. Mediante desestabilização das barreiras
hemato-oculares, segue-se um aumento nos níveis protéicos, principalmente por
imunoglobulinas e fibrinogênio, com níveis protéicos elevados entre 600 a
2500mg/dL, ao qual se denomina aquoso plasmóide (BLOGG; COLES, 1971;
COOLINS; MOORE 1991; SLATTER, 2005). Alguns autores consideram que
concentrações entre 21 e 65mg/dL já são referidas clinicamente como flare (HAZEL
et al., 1985).
A análise do humor aquoso tem sido utilizada como meio auxiliar de
diagnóstico em seres humanos, nas mais diversas afecções oculares. Entretanto,
seu uso rotineiro é pouco difundido na Medicina Veterinária (RASKIN, 2003).
Este trabalho tem por objetivo a padronização da técnica de análise dos
valores protéicos do humor aquoso de cães hígidos, bem como de suas
características citológicas.
ASPECTOS ÉTICOS
Este trabalho de pesquisa foi submetido à avaliação do Comitê de Ética da
Universidade de Brasília, de consoante com as normas desta instituição, sendo
aprovada a realização do mesmo (protocolo número 66064/2007).
MATERIAIS E MÉTODOS
28
2.3.1. ANIMAIS
Fizeram parte deste estudo cães domiciliados que foram submetidos à
orquiectomia e ovariosalpingohisterectomia eletivas no Hospital Veterinário da
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília (FAV-
UnB), com prévio esclarecimento e anuência dos proprietários. Utilizaram-se 23
cães, adultos, sem raça definida, sendo quinze machos e oito fêmeas, pesando
entre 10 e 35 Kg, considerados clinicamente sadios, sem histórico pregresso de
alterações oftálmicas.
Foram considerados sadios os animais que mediante avaliação clínica
completa, constituída por exame físico dos parâmetros fisiológicos, avaliação
hematológica, bioquímica sérica (ALT, FA, uréia e creatinina, proteína plasmática
total) e avaliação oftálmica, não apresentaram alterações consistentes com afecções
sistêmicas.
O exame oftálmico foi realizado mediante a utilização de teste da lágrima de
Schirmer2, biomicroscopia com lâmpada de fenda3, tonometria de aplanação4,
oftalmoscopia direta5 e teste de fluoresceína6.
2.3.2. COLETA E ACONDICIONAMENTO DAS ALIQUOTAS DE HUMOR
AQUOSO
Para a realização da anestesia, os animais foram submetidos a jejum prévio
de sólidos de doze horas e hídrico de duas horas. Foram coletados de cada animal
5mL de sangue, com seringa de cinco mililitros7 e agulha8 27x8, para realização de
hemograma e análise bioquímica mencionada anteriormente.
2 Teste de Schirmer®, Ophthalmos- São Paulo-SP 3 Portable SL 14®, Kowa- Japan 4 Tonopen XL®, Mentor O&O-Norwell
5 Oftalmoscópio direto 6 Fluoresceína Strips®, Ophthalmos- São Paulo-SP 7 PRECISON GLIDE, BD, São Paulo-SP
29
Os animais foram pré-medicados com acepromazina9 na dose de 0,04mg/Kg
e morfina10 na dose de 0,3mg/Kg, ambos por via intramuscular. Passados 15
minutos da medicação pré-anestésica, realizou-se a venopunção cefálica com
cateter11 apropriado. Por via intravenosa administrou-se, em dose única, anestésico
barbitúrico, tiopental sódico12 (dose: 12,5mg/Kg)( FANTONNI,et al., 2002; GALERA,
2002) e instilação tópica de colírio anestésico 13 .
Procedeu-se a coleta do humor aquoso de ambos os olhos com os animais
posicionados em decúbito lateral direito e esquerdo, por paracentese de câmara
anterior, com seringa14 de um mililitro acoplada a agulha hipodérmica 13 x 4,515,
posicionando-se o bulbo ocular com auxílio de conjuntiva16 pequena. A agulha
penetrou próxima ao limbo e paralela ao plano da íris. Retirou-se aproximadamente
0,5mL de humor aquoso (figura 1). Os animais receberam a numeração seqüencial
em ordem crescente, sendo cada microtubo de polipropileno identificado com o
número do animal e o olho correspondente (olho direito =OD; e olho esquerdo=OE).
Ato contínuo, confeccionou-se uma lâmina direta para avaliação do perfil celular, e o
restante do humor aquoso foi armazenado e acondicionado a -20° para posterior
processamento.
Após a coleta do humor aquoso, os cães foram submetidos à anestesia geral
inalatória com halotano17 associada à epidural com lidocaína18 e, posteriormente,
submetida à castração eletiva, conforme a técnica preconizada por Fossum (2005).
8 PRECISON GLIDE, BD, São Paulo-SP 9 UNIVET VETNIL®, Rhobioofarma, São Paulo-SP 10DIMORF®, Cristália, São Paulo-SP 11 Insyte®,BD,São Paulo-SP 12 THIOPENTAX, Cristália, São Paulo- SP 13 ALERGAN®, Alcon- São Paulo-SP 14 PLASCALP®, Plascalp, Feira de Santana-BA 15 PLASCALP®, Plascalp, Feira de Santana-BA 16 EDLO®, Edlo, São Paulo-SP 17 TANOHALO®,Cristália, São Paulo-SP 18 XYLESTESIN®,Cristália, São Paulo-SP
30
Figura 2- Imagem fotográfica de olho direito de cão submetido à paracentese
de câmara anterior, com a utilização de agulha 13x4,5mm. Agulha 13x4,5mm
penetrando em região perilímbica de olho direito (A, B). Penetração da agulha
13x4,5mm em câmara anterior de olho direito (C). Aspecto do bulbo ocular
após aspiração de 0,5mL de humor aquoso (D).
2.3.3. - ACOMPANHAMENTOS DA RECUPERAÇÃO ANESTÉSICA E
AVALIAÇÃO OFTÁLMICA
Imediatamente após a coleta do humor aquoso, instilou-se, em ambos os
olhos, uma gota de atropina19 a 1%, a fim de se evitarem transtornos oculares
referentes à paracentese de câmara anterior.
Os animais foram mantidos sob observação e recuperação anestésica e
avaliação oftálmica por um período de 6 a 8 horas e, posteriormente, receberam alta
cirúrgica.
2.3.4. QUANTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TOTAL DO HUMOR AQUOSO
PELO MÉTODO DE BRADFORD 19 ALERGAN®, Alcon- São Paulo-SP
A B
C D
31
As amostras foram submetidas à quantificação protéica pelo método de
Bradford (Bradford 1976). Utilizaram-se para preparação da solução reagente de
Bradford, álcool etílico (95%)20, ácido fosfórico (85%)21 e commassie blue G22 .
Prepararam-se microtubos de polipropileno e pipetaram-se 0,1; 2,5; 5,0; 7,5;
10; 12,5; 15; 17,5 e 20 µL de BSA( albumina sérica bovina), na concentração de
1mg/mL, acrescentando-se, respectivamente: 100; 99; 97,5; 95; 92,5; 90; 87,5; 85;
82,5 e 80 µL de água Milique e 1 (um) mL da solução de Bradford anteriormente
preparada (tabela 1).
Após dois minutos as soluções foram transferidas para cubetas23 para
posterior leitura em espectrofotômetro24 a 595 nm, e estabelecimento de suas
absorbâncias.
A partir dos valores de absorbância mensurados em triplicata (BRADFORD,
1976), confeccionou-se um gráfico de dispersão no programa Excel® (2003)25,
obtendo-se um valor de equação da reta que foi utilizada para quantificação das
proteínas totais ( Gráfico 1).
Tabela 1- Volume de BSA pipetado para a leitura de espectofotômetro, para posterior
confecção da curva padrão.
20 SYNTH®, LOTE : A 1082.01.BJ 21 MERK®, lote: 1005737003 22 COMMASSIE BRILHANT BLUE G, Sigma, lote:RK 0094. 23 CUBETA® para espectrofotômetro U-2000 24 HITACHI® U-2000, Hitachi, Tokuo-Japan 25 Excel®, 2003
32
BSA
(1mg/ml)
Volume de
BSA (µl)
H2O
Bidestilada
(µl)
Reagente
De BradFord
1 1 99 1ml
2,5 2,5 97,5 1ml
5 5 95 1ml
7,5 7,5 92,5 1ml
10 10 90 1ml
12,5 12,5 87,5 1ml
15 15 85 1ml
17,5 17,5 82,5 1ml
20 20 80 1ml
Foram pipetadas 30 µL de cada amostra, adicionada de 70 µL de água
bidestilada e 1 mL de reagente de Bradford. Em seguida, as amostras foram
transferidas para as cubetas e submetidas à leitura do espectrofotômetro.
Após as leituras, os valores obtidos das absorbâncias foram substituídos na
equação da reta da curva padrão (y = 0,0324x - 0,0043), fornecendo a quantidade
de proteína total presente no humor aquoso (valores expressos em µg/ µL).
GRÁFICO 1 - Gráfico da curva padrão realizado a partir das médias das
absorbâncias da leitura de BSA. No eixo X encontramos os valores referentes às
33
diluições do BSA; no eixo Y os valores encontrados em relação a absorbância de
cada diluição.
2.3.5. QUANTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TOTAL DO HUMOR AQUOSO
PELO MÉTODO SENSIPROT ®
Para avaliação pelo método de Sensiprot® as amostras foram processadas
segundo orientação do fabricante para a análise do líquido cefalorraquidiano, para o
qual o teste possui indicação - ou seja, imediatamente após a coleta.
Utilizaram-se três tubos de ensaio, um com a amostra, o segundo com o
“branco” (água destilada) e o terceiro com a solução padrão. Em cada tubo
acrescentou-se 50µL da amostra com água deionizada e 1 mL do reagente de cor
vermelho de pirogalol. As misturas foram levadas a banho–maria (37ºC) durante
cinco minutos. Determinou-se a absorbância do padrão através de analisador
bioquímico26 e a proteína total foi calculada pela divisão da absorbância conforme
equação abaixo (tabela 2).
26 Bioplus 2000-Bioplus, Barueri- SP
y = 0,0324x - 0,0043R2 = 0,9967
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentração BSA mg/µL
Abs
595nm
34
Proteína (mg/dL) = Absorbância do teste X 50
Absorbância do padrão
BRANCO TESTE PADRÃO
AMOSTRA ------- 50 µl ----------
ÁGUA
DEIONIZADA
50 µl ------- ----------
PADRÃO (Nº2) -------- ------- 50 µl
REAGENTE DE
COR
1,0mL 1,0mL 1,0Ml
2.3.6. – CITOLOGIA
Realizou-se citologia mediante a confecção de lâmina direta e coloração de
Panóptico27.
Para a realização do esfregaço, o humor aquoso foi centrifugado e aplicado
sobre uma lâmina devidamente limpa e desengordurada, para posterior visualização.
Após a preparação das lâminas, as mesmas foram coradas com o Panóptico
(Instant Porv®), seguindo as recomendações do fabricante. Ato contínuo à coloração,
as lâminas foram examinadas em microscopia óptica com a utilização de óleo de
imersão.
27 Instant Prov®- Newprov.
Tabela 2- Fórmula para realização da quantificação das proteínas totais pelo
método do Sensiprot®.
35
2.3.7- SOLUÇOES E REAGENTES PARA ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRILAMIDA
2.3.7.1- Reagentes:
Reagentes:
• Acrilamida
• Bis-Acrilamida
• Tris
• SDS
• TEMED
• Persulfato de amônio
• 2-mercaptoetanol
• Glicerol
• Bromofenol Blue
• Glicina
• Ácido Clorídrico(HCL)
• Ditiotreitol(DTT)
2.3.7.2- Soluções de Estoque
SOLUÇÃO DE ESTOQUE 1
• 2 M Tris-Hcl (pH8.8), 100ml
a. 24,2g Tris Base
b. Adicione 50 mL de água destilada
c. Adicione HCl lentamente até o pH atingir 8.8
d. Adicione água destilada para completar o volume final de
100mL.
36
SOLUÇÃO DE ESTOQUE 2
• 1 M Tris-Hcl (pH6.8), 100mL
e. 12,1g Tris Base
f. Adicione 50 mL de água destilada
g. Adicione Hcl lentamente até o pH atingir 8.8
( aproximadamente 8mL)
h. Adicione água destilada para completar o volume final de
100mL
SOLUÇÃO DE ESTOQUE 3
• 10% SDS (w/v), 100mL
i. 10g SDS
j. Adicione água destilada para completar o volume final de 100mL
SOLUÇÃO DE ESTOQUE 4
• 50% glicerol (v/v),100mL
k. 50mL de glicerol
l. 50mL de água destilada
SOLUÇÃO DE ESTOQUE 5
• 1 % Bromofenol Blue
• 100 mg de bromofenol blue
• Adicione água destilada para completar o volume final de
100mL e realize a filtração do conteúdo
SOLUÇÃO DE TRABALHO A
Solução A
a. 30% de acrilamida
b. 0,8% de Bis-acrilamida
Dissolver, em 100mL de água bidestilada, 29,2g de acrilamida e 0,8g
de bis-acrilamida.
A acrilamida é irritante à pele e possui ação neurotóxica.
37
SOLUÇÃO DE TRABALHO C
Solução C
f. 50mL 1M Tris Hcl ( pH6.8) _____________ 0,5M
g. 4mL de SDS 10% ____________________0,4%
h. 46mL de água
SOLUÇÃO DE PERSULFATO DE AMÔNIA
Persulfato de amônia 10%, 5mL
i. 0,5 g de persulfato de amônio dissolvido em
5mL de água
SOLUÇÃO DE TAMPÃO DE ELETROFORESE
Tampão de Eletroforese, 1litro
k. 3g de Tris
l. 14,4 g glicina
Água para completar um litro
Pode- se fazer um solução de estoque 10X
SOLUÇÃO TAMPÃO DE AMOSTRA 5X
5x Tampão de Amostra
0,6ml 1M Tris-Hcl (pH6.8)_______________________60mM
5mL 50% de Glicerol___________________________25%
2mL de SDS a 10%____________________________2%
0,5mL de 2- mercaptoetanol_____________________14,4mM
1mL 1% bromofenol blue________________________0,1%
0,9mL de Água
SOLUÇÃO DE TRABALHO B
2.3.7.2.2- Solução B
c. 75 mL 2 M Tris- Hcl (pH8.8)_______________1,5 M
d. 4mL de SDS 10 %
e. 21mL de água
38
2.3-8 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA:
As amostras foram submetidas à eletroforese, conforme descrito por BOLLAG
et al. (1996), iniciando-se pela fabricação do gel de acrilamida, composto por duas
porções, uma separadora e outra concentradora.
O gel de separação (12%) das amostras (acrilamida/ bisacrilamida na
proporção de 30:0,8) foi preparado com 5,250 mL de água de Bidestilada, 3,75 mL
de solução tampão B (Tris HCl 1 M pH8,8), 6 mL de acrilamida, 75 µL de persulfato
de sódio 10% e 15 µL de TEMED.
O gel de concentração das amostras foi aplicado sobre as placas trinta
minutos após a aplicação do gel separador e foi preparado por 2,30 mL de água de
Bidestilada, 1 mL de solução tampão C (0,5M Tris Hcl pH 6,8), 0,67 mL de
acrilamida, 30 µL de persulfato de amônio e 5 µL de TEMED.
Após polimerização do gel, as amostras foram preparadas para posterior
aplicação no mesmo. A preparação das amostras foi realizada a partir da adição de
10 µL da amostra do humor aquoso (KUCHLE, 1993), acrescido com 2 µL do
tampão 5x e 3 µL de água Bidestilada, totalizando 15µL, e centrifugação a 10.000
rpm por 15 segundos. As amostras foram aquecidas a 94°C por 10 minutos e
novamente centrifugadas a 10.000 rpm por 15 segundos para abaixar as gotículas
condensadas, sendo aplicadas no gel.
A aplicação no gel foi padronizada da esquerda para direita; no primeiro poço
colocou-se o marcador de massa molecular28 conhecido, em segundo poço
aplicação de BSA e, seguidamente, as amostras de olho direito e olho esquerdo de
cada animal (figura 2).
Realizou-se eletroforese sob voltagem constante de 100 v até que as
amostras atingissem o gel concentrador, e então mantido a 120 v no gel separador
por aproximadamente duas horas. Após a eletroforese, os géis foram armazenados
em solução fixadora (100 mL de metanol, 100 mL de ácido acético glacial e 800 mL
de água bidestilada).
28 Benchmark Pré-Stained- Protein Labber
39
GEL
SEPARADOR
VOLUMES GEL
CONCENTRADOR
VOLUMES
SOLUÇÃO A 6 mL SOLUÇÃO A 0,67 mL
SOLUÇÃO B 3,75mL SOLUÇÃO B 1,0 mL
SDS 10 % 150µL SDS 10 % 40 µL
H2O 5,1mL H²O 2,260mL
PERSULFATO DE
AMÔNIO
120 µL PERSULFATO DE
AMÔNIO
60 µL
TEMED 15 µL TEMED 5 µL
Os géis foram submetidos à coloração por nitrato de prata (BOLLOG et al.
1996). Para coloração com prata os géis foram imersos e mantidos na solução
fixadora por uma hora. Decorrido esse período foram retirados da solução,
acrescidos de 50 mL de etanol 50% e mantidos no agitador por 10 minutos. Após
este momento a solução de etanol foi substituída por uma solução sensibilizadora
(tiossulfato de sódio 20 mg/100mL), permanecendo o gel imerso nesta solução por 2
minutos. Seguiu-se uma breve lavagem em água destilada (três vezes, por 20
segundos) e imersão do gel em 50 mL de solução de nitrato de prata acrescida de
75 µL de formaldeido. O gel imerso foi levado ao agitador por 15 minutos e
submetido à rinsagem, conforme descrito anteriormente. Finalmente, foi submetido à
solução reveladora (50 mL de carbonato de sódio 6%, 2 mL de solução
sensibilizadora e 50 µL de formaldeído) até o aparecimento das bandas protéicas. A
solução reveladora foi então substituída por solução de parada para posterior
análise do gel por densitometria.
Tabela 3 – Volumes de Soluções utilizadas para a confecção de gel separador e gel
Concentrador.
40
.
Tabela 4 – Protocolo utilizado para coloração à base de Nitrato de Prata .
Solução sensibilizadora é formada por tiosulfato de sódio 20mg/mL
Solução reveladora é formada por 100mL de carbonato de sódio 6 %,
2mL de solução sensibilizadora e 50µl de formaldeído.
SOLUÇÃO CORANTE TEMPO
50 Ml de Solução Fixadora 1 hora
50mL Etanol 50% 10 minutos agitador
50 mL Solução Sensibilizadora 1 minuto
Lavar com água destilada 3x de 20 segundos
50mL de Solução de Nitrato de
Prata
15 minutos no agitador
Lavar com água destilada 3x de 20 segundos
50Ml de Solução Reveladora Até aparecer as bandas
Lavar com água destilada 3x de 20 segundos
Solução de Parada Armazenagem
41
2.4 – DENSITOMETRIA
Os géis corados em prata foram fotografados por meio foto documentador ®29
e as bandas de proteína foram posteriormente avaliadas pelo software ImageQuant
5.2.
2.5 – ANÁLISE ESTASTÍSTICAS
Procedeu-se a análise dos dados pelo software GraphPad Prism 4,
apresentados em torno dos valores médios. Os resultados foram analisados
estatisticamente mediante o teste one-way análise de variância (ANOVA), pelo
teste de Tukey’s, teste de comparação múltipla e teste T student. Os valores de P
menores que 0.05 (p<0.05) foram considerados estatisticamente significativos.
RESULTADOS
2.6.1 RESULTADO DA AVALIAÇÃO OFTÁLMICA
Os animais não apresentaram alterações oculares por ocasião da avaliação
oftálmica realizada.
2.6.2 RESULTADO DA AVALIAÇÃO HEMATOLÓGICA E BIOQUÍMICA
SÉRICA
Os valores referentes ao hemograma e a bioquímica sérica estão elencados
na tabela 5 e são condizentes com valores considerados normais
29 Filber Lourmat
42
Tabela 5 – Valores normais, médias e desvios-padrão de constituintes hematológicos e do soro sangüíneo
de cães (n=23 animais)
Parâmetros N
Média ±
Desvio Padrão
Média ±
Desvio Padrão
Valores Normais
(a)
Hemácias
(x106/ L) 6,14±0,78 5,5 - 8,5
Hemoglobina
(g/dL) 12,61±1,71 12 – 18
Volume
globular (%) 35,32±4,85 37 – 55
VCM (Fl) 57,7±6,17 66 – 77
CHCM (g/Dl) 35,58±0,8
Leucócitos
(x103/ L) 11,25±4,04 6 – 18
Bastonetes
(x103/ L)
Segmentados
(x103/ L) 7,36±2,87
Linfócitos (x103/
L) 2,16±2,27
Monócitos
(x103/ L) 0,56±0,38
Eosinófilos
(x103/ L) 1,16±1,10
Basófilos (x103/
L)
Plaquetas
(x103) 324±123 > 150
Creatinina
(mg/dL) 0,90±0,19 0,98±0,28 0,5 - 1,5
Uréia (mg/dL) 29,08±7,94 32,51±17,30 15 – 65
PPT (mg/dL) 6,92±0,68 7,33±1,22 * 5,8 - 7,9
ALT (U/L) 34,56± 8,72 43,05±15,64 10 – 88
ALP (U/L) 27,56±12,17 56,93±29,32 20 – 150
ALT (U/L) alanina aminotransferase AST (U/L) aspartato aminotransferase
ALP (U/L) fosfatase alcalina GGT (U/L) gama glutamiltransferase
PT (mg/dL) Proteínas totais (a) Fonte: Kaneko et al., 1997; Thrall, 2007
43
2.6.3-RESULTADOS DA AVALIAÇÃO PROTÉICA DO HUMOR AQUOSO
Os valores protéicos médios obtidos pelo método de Bradford foram de 33,88
mg/dL e 36,82 mg/dL, com erro padrão de ±2,55. Mediante análise com o método
Sensiprot®, os resultados médios obtidos foram 9.04 mg/dL e 7.56 mg/dL para o
olho direito (OD) e olho esquerdo (OE), respectivamente, e erro padrão de ±1,28
olho direito e ±0,84 olho esquerdo. Não foi observada diferença estatística entre os
valores protéicos obtidos dos olhos direitos, comparativamente àqueles dos olhos
esquerdos, em ambos os testes analisados individualmente (gráfico 2).
Quando os valores encontrados pelos dois testes foram confrontados,
observaram-se diferenças estatísticas significativas entre os métodos de Bradford e
o Sensiprot®, quando avaliados ODB (olho direito Bradford) x ODS (olho direito pelo
Sensiprot®) e OEB (olho esquerdo Bradford) x OES (olho esquerdo pelo Sensiprot®)
e quando comparado OD x OES e OE x ODS, com valores de p< 0.0001,
apresentados no gráfico 2.
Bradford
OD OE0
10
20
30
40
mg
/dL
Bradford
ODM OEM ODF OEF0
10
20
30
40
50
mg
/dL
Quantificação de Proteína
OD ODS OE OES0
10
20
30
40
*** ***
mg
/dL
Proteína Humor Aquoso x Proteína Esperada
OD OE PTE0
10
20
30
40
mg
/dL
A B
D C
44
Gráfico 2 – A. Quantidade de proteína total do olho direito e olho esquerdo pelo método de
Bradford. B. Comparação entre os valores de proteína total, entre os olhos de machos (ODM e
OEM) e fêmeas (ODF e OEF). C. Comparação entre os valores de proteína total pelo método
de Bradford e método Sensiprot® (*** estatisticamente significativo p< 0, 0001). D. Valores de
Proteínas médios encontrados em comparação com o valor esperado de acordo com a proteína
plasmática total.
Os valores das proteínas totais do humor aquoso dos dois olhos dos 23
animais, fornecidos pelo método de Bradford e pelo Sensiprot®, foram comparados
com os valores de proteína plasmática total (PPT). As médias obtidas pelo método
de Bradford apresentaram valor médio de 0,50% do valor das proteínas sanguíneas
totais, e aquelas obtidas pelo método do Sensiprot® o valor médio encontrado foi de
0,11%.
Observou-se, ainda, uma correlação positiva entre os valores da PPT e os
valores protéicos do humor aquoso obtidos mediante análise pelo método de
Bradford; ou seja, quando há um aumento da PPT seguiu-se um aumento da
proteína do humor aquoso, como evidenciado nos animais 19 e 20 (tabela 6). Essa
correlação não foi observada pelo método do Sensiprot® (Tabela 6).
ANIMAL
Proteína Sg.
Total em
mg/dL
Percentual de proteína do aquso em
relação a proteína plasmática (%)
1 OD M 6200--------------------------------------- 0,58
1 OE M 6200 ---------------------------------0,60
2 OD F 7000 ---------------------------------0,58
2 OE F 7000 ---------------------------------0,56
18 OE F 7200 ---------------------------------0,71
20 OD M 8800 ---------------------------------0,73
20 OE M 8800 ---------------------------------0,73
MÉDIA 6900 ----------------------------------0,50
A eletroforese e a coloração em prata permitiram a visualização de seis
bandas protéicas principais. Alguns animais apresentaram bandas complementares
Tabela 6 – Valor da porcentagem de proteína no aquoso em relação ao valor da
proteína plasmática, demonstrando a relação positiva entre o aumento da proteína
plasmática e a proteína no aquoso.
45
a essas, de forma aleatória. As bandas foram denominadas PI, PII, PIII, PIV, PV,
PVI, PVII, PVIII, PIX, PX para melhor visualização e entendimento (Figura 3).
Através da densitometria calculou-se a quantidade de µg de cada amostra a
partir do seu volume fornecido pelo programa ImageQuant 5.2, usando como
referência o valor previamente conhecido do BSA adicionado ao gel.
Mediante o valor do marcador de massa molecular (190-15 Kda) e do
conhecimento prévio da massa molecular do BSA (66 Kda), inferiu-se que as
massas moleculares das proteínas presentes no humor aquoso de cães
clinicamente saudáveis situam-se entre 120 e 25 Kda (figura 4).
Conforme os dados observados na tabela 7, vale ressaltar que a proteína
denominada PIII foi evidenciada em todas as amostras (Figura 4) e seu massa
molecular é de aproximadamente 66 Kda, valor esse referente à albumina bovina,
Tabela 7 – Proteínas presentes no humor aquoso de cães clinicamente sadios, com seu
tamanho em Kda aproximado associada a concentração de cada proteína em µg/dL de OD
,OE.
Proteínas no
Humor Aquoso
Massa
Molecular
(Kda)
OD: média
e desvio padrão
OE: média
e desvio padrão
Banda PI <120 kda>85 1,65 ± 0,43µg/dL 1,66 ± 0,65µg/dL
Banda PII >80Kda<120 1,87 ± 0,49 µg/dL 1,90 ± 0,61µg/dL
Banda PIII 66 Kda 2,12 ± 0,67µg/dL 2,24 ± 0,67µg/dL
Banda PIV >60Kda<66 1,44±0,62 µg/dL 1,53 ± 0,63 µg/dL
Banda PV >60Kda<66 1,65 ± 0,63 µg/dL 1,70 ± 0,53 µg/dL
Banda PVI >50Kda< 60 1,55 ± 0,89 µg/dL 1,80± 1,18 µg/dL
Banda PVII >40 Kda < 50 2,59 ± 0,89 µg/dL 3,18± 1,58 µg/dL
Banda PVIII >40 Kda < 50 3,60 ± 0,48 µg/dL 2,92
Banda PIX >40 Kda < 50 4,11 µg/dL 4,56 µg/dL
Banda PX >30 Kda< 40 3,37 µg/dL 3,39 µg/dL
46
que em cães apresenta valor semelhante (ALLERTON, et. al., 1962). A albumina
apresentou maior concentração em relação às outras cinco proteínas presentes
como proteínas padrões, com 2,12 ± 0,67µg/dL OD e 2,24 ± 0,67µg/dL OE. As
proteínas PVIII, PIX e X estão presentes em apenas uma amostra, no animal 2
(Figura 5).
PII
PIII
PIV
PV
PVI
FIGURA 3 - Eletroforese em gel SDS-PAGE, corado em prata, evidenciando-se as
seis bandas de proteínas presentes no Humor aquoso.
Albumina
BSA
Bandas
adicionais VIII
47
FIGURA 5- Eletroforese em gel SDS-PAGE, corado em prata, visualizado pelo foto
documentador através programa Imagequant 5.2. A) Presença das seis bandas principais,
demonstrando a diferença de contraste entre elas determinada pela sua concentração. B)
Visualização da banda X no animal de número 2.
MM - marcador de massa molecular; BSA- Albumina de soro bovino; OD- olho direito; OE –
olho esquerdo.
FIGURA 4- Eletroforese em gel SDS-PAGE, corado em prata, visualizado pelo foto
documentador através programa Imagequant 5.2. Observa – se a localização das proteínas
em relação ao marcador de massa molecular, fornecendo a amplitude da massa molecular
das proteínas presentes no humor aquoso de cães hígidos.
10
120
B
A
48
DISCUSSÃO
A motivação deste estudo foi estabelecer o perfil protéico do humor aquoso
por meio de um método que permitisse a repetibilidade, a fim de que os mesmos
passos sejam seguidos a posteriori, quando se pretende analisar este fluido em cães
que apresentem alterações oculares. Deparando-se com pequenas variações ou
mesmo omissões na descrição do método de Bradford, sabidamente sensível ao
escopo deste trabalho, preconizou-se detalhar o processo. Ainda, tendo disponível o
método Sensiprot para análise de proteínas do líquor, fluido igualmente proveniente
de um sítio de privilégio imunológico (GAMA, 2005), e de praticidade clínica,
pretendeu-se avaliar sua sensibilidade às proteínas do aquoso.
A coleta das amostras foi realizada mediante paracentese de câmara anterior,
seguido o protocolo descrito por Galera (2002). A paracentese de câmara anterior
pode ser utilizada para coleta do aquoso sem provocar alterações significativas nas
barreiras oculares (OKISAKA, 1976), ou ainda como modelo experimental induzindo
inflamações intra-oculares (GALERA, 2002). Por via intravenosa administrou-se, em
dose única, anestésico barbitúrico, tiopental sódico30 (dose: 12,5mg/Kg) (FANTONNI
et al., 2002; GALERA, 2002). A opção pela utilização do tiopental sódico a outro
anestésico geral decorreu do resultado de menor variação da pressão intra - ocular
provocado por esse fármaco quando comparado, por exemplo, com o propofol, que
promove um aumento da pressão intra-ocular de até 26%, como descrito por
HOFMEISTER et al. (2008). Optou-se nesse estudo pela coleta de um volume alto
de aquoso (em torno de 0,5mL de amostra) por olho, uma vez que não se tinha
conhecimento prévio da alíquota precisa para padronização do estudo. Apesar do
grande volume removido, o máximo descrito em literatura (GALERA, 2002;
RIBEIRO, 2007), não se observou transtornos oculares provenientes da coleta,
conforme descrito por Blogg e Coles (1971) e Regnier e et al.,1984, quanto a
influência do volume sobre os níveis protéicos . A paracentese de câmara anterior é
tida como um procedimento invasivo e utilizado como modelo experimental de
aquoso plasmóide (GALERA, 2002). A partir dessa padronização, o volume a ser
30 THIOPENTAX, Cristália, São Paulo- SP
49
aspirado se torna baixo, minimizando a invasão do processo de coleta, podendo ser
aplicado em animais com alterações oculares sem a intensificação direta do
processo inflamatório.
Inicialmente estabeleceram-se os valores protéicos do humor aquoso, cujas
médias obtidas foram de 33,88 mg/dL olho direito com amplitude de 16,14 - 54,72 e
36,82 mg/dL olho esquerdo com amplitude de 15,52 - 53,79. Os valores encontrados
divergem dos valores médios descritos por Brito et al. (2006) (25,86mg/dL) e dos
valores referidos por Galera (2002) (15,98 e 11,46 para olhos direito e esquerdo,
respectivamente) e Ribeiro (2007) e 10,25 sem diferenciação entre o olho direito e
esquerdo, todos obtidos pelo método de Bradford. Entretanto, são valores
semelhantes aos encontrados por Hazel et al. (1985), que apresentaram amplitude
de 21 - 65 mg/dL, mediante o método de fenol.
Diferenças quanto aos resultados obtidos podem ser justificadas pela
variação metodológica empregada, ou seja, há um padrão metodológico para
preparação da solução de Bradford, porém não existe uma padronização para o
processamento das amostras, já que o volume empregado das amostras pode
interferir com a quantidade e perfil protéico encontrado (GRUS et al.,2007). Galera
(2002) refere a centrifugação das amostras antes da realização da curva padrão
pelo método de Bradford. Ribeiro (2007), além da centrifugação, preconiza a diluição
das amostras em 1:5 e 1:10. Alguns autores optam pela centrifugação e ou diluição
do aquoso antes da sua quantificação a fim de concentrar as proteínas presentes
nesse fluído. Esses processos podem implicar também na quebra e na perda de
algumas proteínas, resultando em valores protéicos inferiores (BOLLAG, 1996).
Como não há na literatura consenso entre a centrifugação ou não das amostras,
optou-se, neste estudo, por não fazê-la. Outro fator referente à confiabilidade dos
dados é relacionado à curva padrão e o seu r² (superior a 0,96), o que demonstra a
linearidade da curva. Esses valores não foram apresentados pelos autores supra
mencionados. Em nosso estudo realizou-se a confecção da curva padrão em
triplicata, objetivando-se maior confiabilidade de resultados, e o r² da curva obtido foi
de 0,99.
Em cães saudáveis os níveis protéicos no aquoso situam-se ao redor de 37,4
mg/dL, com amplitude entre 21-65 mg/dL (HAZEL et al.,1985). Brito et al. (2006)
referem como média valores de 25,86 mg/dL, e Coolins & Moore (1991), 37,4
mg/100mL. Slatter (2005) e Townsend (2008) relacionam o valor das proteínas do
50
humor aquoso a 0,5% do valor das proteínas plasmáticas totais. Grus et al. (2007),
em trabalhos realizados em seres humanos, referem valores de 0,20-0,50 mg/mL em
relação aos valores do plasma sanguíneo.
Os dados obtidos pelo método do Bradford situam-se dentro dos padrões
referidos por Hazel et al. (1985), que quantificaram a proteína total do aquoso pelo
método de fenol.
A média dos valores protéicos encontrados representou o valor de 0,5% em
relação à proteína plasmática total, coadunando com a literatura (SLATTER, 2005;
GRUS, et al., 2007; TOWNSEND, 2008), correlação que credencia os resultados
encontrados. A mesma proporção não foi observada pelo método de Sensiprot®,
cujos valores representaram 0,11% dos valores médios referentes à proteína
plasmática total. O Sensiprot® é um método descrito por grande sensibilidade para
albuminas e globulinas, o que nos faz inferir que apenas essas frações presentes no
aquoso tenham sido captadas.
Observou-se, ainda, uma correlação positiva entre as proteínas do humor
aquoso e as proteínas plasmáticas. Mediante aumento ou decréscimo das primeiras,
o mesmo foi verificado no plasma, pelo método de Bradford. Esse fato não foi
apresentado pelo método do Sensiprot®.
Descrevem-se a albumina (66 Kda), globulinas e a transferrina (80 Kda) como
proteínas presentes no humor aquoso em humanos (GRUS et al., 2007). Dentre as
proteínas isoladas a partir do gel de eletroforese SDS-PAGE, marcador de massa
molecular e mediante a comparação com a amostra de albumina bovina utilizada,
pode-se confirmar a presença dessa proteína em todas as amostras testadas,
definida como PIII. Proteínas plasmáticas são descritas e possuem massa molecular
determinados, podendo as mesmas estar presentes no humor aquoso de cães,
como as ceruloplasmina (115Kda), transferrina (80Kda), albumina (66 Kda),
imunoglobulina G (55 Kda), haptoglobina (45Kda) (RIBEIRO, 2007), glicoproteína
alfa-1 (42 Kda) (YUKI, 2008), a anidrase carbônica (30Kda), alfa-lactalbumina
(14,4Kda), fosforilase B (94Kda) (KUCHLE et al.,1993). Entretanto, faz-se
necessário o seqüenciamento dessas proteínas para que se possa afirmar qual
delas se faz presente no aquoso de cães hígidos e quais se apresentam
aumentadas ou estão relacionadas a determinadas afecções oculares. É o que se
observa, por exemplo, nos casos de glaucoma, com aumento das metaloproteinases
(WEINSTEIN et al., 2007). Ainda, a identificação de proteínas específicas a raças
51
predispostas a afecções oculares e que proporcionem um diagnóstico precoce, é um
desafio que se impõe.
A eletroforese por SDS-PAGE é um método amplamente empregado para
avaliação do perfil protéico, podendo ser utilizado para avaliação do humor aquoso
(KUCHLE et. al., 1993; DUAN et.al., 2008). Ela fornece a separação das proteínas
através da sua massa molecular. A porcentagem utilizada do gel deve ser
diretamente proporcional à separação molecular obtida, captando proteínas com
massa molecular de 10 a 74 Kda (BOLLAG, 1996). A massa molecular das amostras
apresentou amplitude de 40 a 120 Kda, mas não podemos afirmar a massa
molecular de cada banda protéica, apenas estimar os valores por comparação
àqueles já descritos, pela utilização do marcador de massa molecular. As proteínas
anteriormente citadas se enquadram no padrão protéico encontrado, mas o devido
seqüenciamento das cadeias de aminoácidos e a utilização de gel de acrilamida
bidimensional são necessários.
A proteína PI, cujo tamanho encontra-se entre 85-120 Kda, tem massa
compatível com a β-galactamase (116kDa). A proteína PII apresenta tamanho
aproximado entre 80 e 120 Kda, compatível com fosforilase (97kDa) e com a
transferrina (80kDa) ( RIBEIRO, 2007). A transferrina atua de forma indireta,
juntamente com outras proteínas, na manutenção da pressão intra-ocular (TRIPATHI
et. al., 1992). A proteína denominada P III, verificada em todas as amostras e com
massa molecular de 66 Kda, tem valor referente à albumina (ALLERTON et. al.,
1962; ROHDE et al., 1998). A proteína PIV apresenta massa molecular entre 60 e
66KDa, e a PV entre 60 e 66 kDa, ambas compatíveis com a miocilina, cuja massa
situa-se entre 55 a 65kDa e é referida presente em olhos humanos, de macacos e
de bovinos pelo SDS-PAGE (RUSSEL et al., 2001). A proteína PVI apresenta
valores compatíveis com a desidrogenase (55Kda) ou imunoglobulina G (55 Kda). A
proteína PVIII apresenta tamanho aproximado maior que 40Kda e menor que 50Kda
compatível com haptoglobina (45Kda) (RIBEIRO, 2007) e glicoproteína alfa-1 (42
Kda) (YUKI, 2008). A proteína PIX com massa molecular entre 30 e 40 KDa pode se
tratar da anidrase carbônica.
As bandas adicionais presentes em alguns animais foram avaliadas
isoladamente; preparou-se novo gel para aplicação de amostras com a presença
das mesmas. Observou-se, através da mensuração da massa molecular das
amostras, que as que apresentavam bandas adicionais possuíam concentração
52
maior. Na realização do novo gel aplicaram-se alíquotas das amostras de forma
proporcional à sua quantidade de proteína total pelo método de Bradford. Os
resultados demonstraram o aparecimento de bandas anteriormente não
visualizadas, o que é justificado pelo ajuste dos volumes das amostras aplicadas, ou
seja, a presença dessas bandas não caracterizou uma proteína de expressão
individual ou ainda relacionada a alguma afecção ocular. Esse é um dado importante
quando se deseja estudar afecções oculares. O diferencial quanto ao volume de
proteína total e o aparecimento de uma banda específica podem estar relacionados
ao volume aplicado e não necessariamente a uma doença ocular ou sistêmica.
Outro fator importante para realização da densitometria é a escolha da
coloração a ser empregada. Neste trabalho optou-se pela coloração de nitrato de
prata, devido a sua maior sensibilidade quando comparada à coloração de
Comassie blue (CARVALHO et al., 2005; CHIEFFI; MINUCCI, 2004). A coloração
empregada possibilitou a visualização e quantificação das proteínas presentes no
aquoso de forma nítida.
CONCLUSÃO
Nas condições em que foi realizado este estudo pode-se concluir que:
� o método de Bradford é um método reprodutível e confiável para
quantificação da proteína total do humor aquoso, levando em
consideração a curva padrão e a metodologia utilizada;
� o método do Sensiprot®, apesar da facilidade e rapidez de execução,
não se apresentou adequado na analise deste fluido, quanto a sua
confiabilidade.
� evidenciou-se correlação positiva entre alterações dos níveis de
concentração de proteínas do humor aquoso com proteínas
plasmáticas;
� o humor aquoso de olhos de cães clinicamente sadios é acelular;
� propõe-se o estudo das proteínas do humor aquoso de cães
clinicamente saudáveis a partir de gel bidimensional, bem como o
53
seqüenciamento das mesmas, para que sejam estabelecidos padrões
de referência para tais proteínas.
� o volume de amostra aplicado e a concentração das proteínas devem
ser levados em consideração na análise das bandas protéicas.
54
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58
CAPÍTULO III
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A análise do proteoma surge como uma abordagem relevante para o exame
de mecanismos múltiplos e complexos de doenças oculares. As proteínas presentes
no humor aquoso desempenham papel importante na homeostase do olho, e
mudanças ou degradações dessas proteínas refletem na saúde ocular.
Esclarecimentos sobre o padrão da expressão protéica e suas modificações
mediante diversas patologias podem revelar o mecanismo de doenças oculares
ainda pouco compreendidas, auxiliando em diagnósticos e tratamentos.
O estabelecimento dos padrões de normalidade do humor aquoso de cães é
de grande importância para o conhecimento da fisiologia desse fluido. De destaque
para a manutenção da integridade das estruturas oculares, processos mórbidos
desencadeados no bulbo ocular ou resultantes de afecções sistêmicas que
desestabilizem a integridade das barreiras oculares implicam diretamente em
alterações do humor aquoso. Acredita-se que a padronização de técnicas que
permitam repetibilidade e confiabilidade dos dados seja o ponto de partida para que
se prossigam com as investigações nesta área. O conhecimento desse complexo
mecanismo trará soluções eficazes no tratamento de algumas afecções oculares,
mormente aquelas que resultem em inflamação ocular, doenças auto-imunes e o
59
glaucoma. Ainda, outras espécies poderão ser objeto de estudos similares, que trará
benefícios à oftalmologia comparada.
Os resultados obtidos nesta pesquisa abrem uma nova perspectiva na
investigação deste fluido e das alterações patológicas às quais ele está sujeito.
60
ANEXOS I
Análise Citológica e Protéica do Humor Aquoso de Cães Clinicamente
Saudáveis.
Protein and Cytologic Analysis of Aqueous Humor of Clinically Healthy Dogs.
FALCÃO, M.S ¹, GALERA, P.D²; ROCHA, R.V. ³,FERREIRA ,T.C.4,CAMPOS,E.G4. 1 Mestrando Saúde Animal FAV/ UnB – [email protected] , 2 Professor Adjunto
II Cirurgia de Pequenos Animais FAV/ UnB, 3 Graduando em Medicina Veterinária
FAV/ UnB, 4Laboratório de Biologia Molecular/UnB.
Objetivou-se padronizar a concentração de proteína no humor aquoso pelos
métodos de Bradford e Sensiprot®, estabelecer relação entre a concentração de
proteínas plasmáticas e do humor aquoso, bem como determinar valores de
referência para este fluido em cães clinicamente saudáveis e seus aspectos
citológicos. Coletaram-se amostras de 22 cães adultos, machos ou fêmeas, sem
raça definida. Previamente aprovado pelo Comitê de Ética da instituição de origem
(protocolo 66064/2007). As amostras do humor aquoso foram obtidas por
paracentese da câmara anterior, e as plasmáticas, por venopunção cefálica. A
análise do humor aquoso foi realizada através do teste colorimétrico de Bradford em
comparação ao teste Sensiprot® (colorimétrico direto). A média da concentração
protéica obtida pelo método de Bradford foi de 32,48 mg/dL (amplitude: 16,14 –
54,72) com erro padrão de ± 2,55 para o olho direito e 35,55 mg/dL (amplitude:
15,52 – 53,79) com erro padrão de ± 2,55 no olho esquerdo, não sendo observada
diferença estatisticamente significativa entre os olhos. O método do Sensiprot®
apresentou valores de 9,04 mg/dL no olho direito (amplitude de 0,4 – 27,8) e
7,56mg/dL no olho esquerdo (1 – 18,9), não demonstrando diferença estatística
significativa entre os olhos. Quando ambos os testes são comparados observa-se
uma diferença estatística significativa (p<0,001). A análise estatística foi realizada
pela análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey. Valores de P
inferiores a 0,05 (p <0,05) foram consideradas estatisticamente significativos. Os
valores protéicos obtidos do humor aquoso foram, ainda, comparados à quantidade
de proteína sanguínea plasmática total. Resultados obtidos pelo método de Bradford
representaram 0,5% do valor das proteínas plasmáticas, demonstrando linearidade
dos dados. Mediante aumento da proteína plasmática, segue-se aumento da
61
proteína no aquoso; o mesmo não foi observado pelo método do Sensiprot®. Os
valores obtidos por este método representaram 0,11% do valor das proteínas
plasmáticas totais. A análise citológica do humor aquoso resultou em ausência
celular em todas as amostras. Conclui-se que o teste de Bradford é preciso para a
análise da concentração protéica do humor aquoso de cães, contrariamente ao
método Sensiprot®, idealizado para mensuração de proteínas do líquor. Os dados
obtidos mediante análise citológica ressaltam a higidez dos animais examinados,
corroborando com a literatura.
PALAVRAS-CHAVE: cães, humor aquoso, proteínas.
KEY WORDS: dogs, aqueous humor, proteins.
62
Mensuração protéica do humor aquoso de cães clinicamente sadios através de Gel de Eletroforese Unidimensional (SDS-PAGE) com
Coloração em Prata e Densitometria. Protein Measurement of aqueous humor of dogs clinically healthy through Gel
Electrophoresis of Unidimensional (SDS-PAGE) with Colour in Silver and densitometry.
FALCÃO, M.S ¹, GALERA, P.D²; ROCHA, R.V. ³,FERREIRA ,T.C.,CAMPOS,E.G.
1 Mestrando Saúde Animal FAV/ UnB – [email protected] , 2 Professor Adjunto
II Cirurgia de pequenos animais Hospital Mestrando Saúde Animal FAV/ UnB, 3 Graduando em Medicina Veterinária FAV/ UnB.Laboratório De Biologia
Molecular/UnB
Este estudo objetivou padronizar a técnica para mensuração do perfil protéico do humor aquoso de cães clinicamente saudáveis, através da diferenciação das proteínas pela massa molecular por gel de eletroforese unidimensional (SDS-PAGE), tendo sido previamente aprovado pelo Comitê de Ética da instituição de origem (protocolo 66064/2007). Empregaram-se 23 cães, machos ou fêmeas, adultos e sem raça definida que, mediante semiotécnica de rotina e análise laboratorial foram classificados como clinicamente sadios. Obteve-se uma amostra de 0,3 mL do humor aquoso de cada olho através de paracentese da câmara anterior. Seguiu-se adição de 2 µL do tampão 5x e 3 µL de água Bidestilada em 10 µL da amostra, totalizando 15µL. O material foi centrifugado a 10000 rpm por 15 segundos, aquecido a 94°C por 10 minutos e, novamente, centrifugado a 10000 rpm por 15 segundos. As amostras foram aplicadas no gel de eletroforese e coradas com de nitrato de prata. Esta técnica permitiu a visualização de seis bandas repetidas em todos os animais e algumas bandas adicionais foram observadas de forma aleatória nos demais géis. Através do marcador de massa molecular (190-15 Kda), infere-se que as massas moleculares das proteínas presentes no humor aquoso de cães clinicamente saudáveis estão entre 120 e 25 Kda. Uma das bandas protéicas, presente em todas as amostras, tem massa molecular equivalente à massa molecular do BSA, inferindo tratar-se da albumina canina. Esta proteína foi a que apresentou maior massa molecular entre as proteínas, conforme relata a literatura. Concluímos que a padronização da técnica de separação por gel de eletroforese unidimensional (SDS-PAGE) seguida da densitometria é essencial para que estudos comparativos sejam conduzidos, e que os valores obtidos neste estudo possam ser usados como referência para a análise de um proteinograma do aquoso de animais que cursem com oculares.
PALAVRAS-CHAVE: humor aquoso, proteínas, densitometria
KEY WORDS: dogs, aqueous humor, proteins, densitometry.
64
A1 OD % OE % A2 OD % OE %
PI 2,18 23,1 1,44 17,5 PI 1,31 6,5 1,63 11,08
PII 1,52 16,11 1,27 15,43 PII 1,34 6,65 1,07 7,27
PIII 1,86 19,7 1,96 23,82 PIII 2,34 11,63 2,35 15,97
PIV 1,44 15,25 1,57 19,07 PIV 1,13 5,62 1,17 7,95
PV 1,22 12,92 1,22 14,83 PV 1,03 5,12 1,22 8,3
PVI 1,22 12,92 0,77 9,35 PVI 0,94 4,68 1,05 7,13
PVII PVII 1,48 7,35 1,66 11,3
PVIII PVIII 3,08 15,3
PIX PIX 4,11 20,41 4,56 31
PX PX 3,37 16,74
TOTAL 9,44 100 8,23 100 20,13 100 14,71 100
Tabela 8 – Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 1 e 2.
65
Tabela 9 – Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 3 e 4.
A3 OD % OE % A4 OD % OE %
PI 1,15 15,23 1,45 15,85 PI 2,23 20,15 2,04 21,94
PII 1,49 19,73 1,86 20,33 PII 2,66 24,03 1,42 15,26
PIII 1,29 17,1 2,18 23,82 PIII 2,31 20,86 2,44 26,25
PIV 1,48 19,6 1,64 18 PIV 1,4 12,65 1,26 13,55
PV 1,04 13,77 1,1 12 PV 1,29 11,65 0,87 9,35
PVI 1,1 14,57 0,92 10 PVI 1,18 10,66 1,27 13,65
PVII PVII
PVIII PVIII
PIX PIX
PX PX
7,55 100 9,15 100 11,07 100 9,3 100
66
Tabela 10 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 5 e 6.
A5 OD % OE % A6 OD % OE %
PI 1,17 8,63 1,21 8,26 PI 1,87 15,87 1,81 15,13
PII 2,52 18,57 2,14 14,61 PII 2,22 18,85 2,89 24,16
PIII 1,7 12,53 1,91 13,03 PIII 1,39 11,8 1,53 12,8
PIV 2,01 14,81 2,26 15,45 PIV 1,67 14,18 1,35 11,3
PV 2,65 19,53 1,85 12,65 PV 1,77 15,02 1,45 12,11
PVI 3,52 25,93 5,27 36 PVI 2,86 24,28 2,93 24,5
TOTAL 13,57 100 14,64 100 11,78 100 11,96 100
67
Tabela 11 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 7 e 8 .
A 7 OD % OE % A 8 OD % OE %
PI 1,73 25,03 2,11 25,72 PI 1,85 23,03 1,96 18,13
PII 2,02 29,23 2,27 27,7 PII 2,05 25,53 3,3 30,52
PIII 1,81 26,2 2,5 30,48 PIII 1,29 16,06 2,34 21,65
PIV PIV 1,71 21,31 1,72 15,92
PV 1,35 19,54 1,32 16,1 PV 1,13 14,07 1,49 13,78
PVI PVI
6,91 100 8,2 100 8,03 100 10,81 100
68
Tabela 12 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 09 e 22.
A9 OD % OE % A22 OD % OE %
PI 1,4 15,71 1,8 16,27 PI 1,96 18,31 1,24 12,75
PII 1,51 16,95 1,95 17,63 PII 2,38 22,25 1,87 19,22
PIII 1,34 15,03 1,76 15,92 PIII 1,78 16,64 1,58 16,24
PIV 1,31 14,7 1,59 14,37 PIV 1,63 15,24 1,15 11,81
PV 1,05 11,8 1,27 11,48 PV 0,94 8,78 1,45 14,9
PVI 2,3 25,81 2,69 24,33 PVI 2,01 18,78 2,44 25,08
TOTAL 8,91 100 11,06 100 10,7 100 9,73 100
69
Tabela 13 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 10 e 11.
A10 OD % OE % A11 OD % OE %
PI 1,65 10,68 1,06 9,68 PI 0,83 7,89 1,41 12,9
PII 1,07 6,92 1,1 10,05 PII 1,04 9,88 1,17 10,7
PIII 2,41 15,6 2,54 23,21 PIII 2,27 21,58 2,42 22,15
PIV 1,4 9,07 1,24 11,32 PIV 1,17 11,12 1,16 10,61
PV 1,05 6,8 1,19 10,86 PV 1,21 11,5 1,35 12,35
PVI 1,1 7,12 1,1 10,04 PVI 1,24 11,79 1,34 12,26
PVII 2,55 16,5 2,72 24,84 PVII 2,76 26,24 2,08 19,03
PVIII 4,22 27,31 PVIII
TOTAL 15,45 100 10,95 100 10,52 100 10,93 100
70
Tabela 14 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 12 e 13.
A12 OD % OE % A13 OD % OE %
PI 1,32 14,53 0,88 8,52 PI 1,2 14,72 1,09 12,92
PII 1,27 13,98 1,47 14,23 PII 1,56 19,14 1,15 13,62
PIII 1,534 16,85 2,04 19,75 PIII 2,35 28,83 1,14 13,5
PIV 1,12 12,33 1,46 14,13 PIV
PV 2,47 27,21 2,49 24,11 PV 1,89 23,2 2,32 27,5
PVI 1,37 15,1 1,99 19,26 PVI 1,15 14,11 2,74 32,46
PVII PVII
PVIII PVIII
9,084 100 10,33 100 8,15 100 8,44 100
71
Tabela 15 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 14 e 15.
A14 OD % OE % A15 OD % OE %
PI 2,1 12,4 2,21 13,13 PI 1,39 6,9 1,79 12,15
PII 1,51 8,91 1,6 9,5 PII 2,51 12,47 1,53 10,4
PIII 2,83 16,7 2,12 12,59 PIII 3,46 17,19 2,7 18,34
PIV 1,98 11,7 1,81 10,75 PIV 2,9 14,41 2,78 18,89
PV 1,95 11,51 2,16 12,82 PV 2,85 14,16 2,22 15,08
PVI 1,61 9,5 1,92 11,4 PVI 1,81 8,99 1,27 8,63
PVII 1,59 9,38 2,1 12,47 PVII 1,53 7,6 2,43 16,51
PVIII 3,37 19,9 2,92 17,34 PVIII 3,68 18,28
TOTAL 16,94 100 16,84 100 20,13 100 14,72 100
72
Tabela 16 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 16 e 17.
A16 OD % OE % A17 OD % OE %
PI 2,41 15,75 2,73 16,21 PI 2,4 16,87
PII 2,39 15,6 2,54 15,09 PII 2,3 16,16 2,84 20,27
PIII 2,38 15,5 3,51 20,85 PIII 3,85 27,05 4,28 30,55
PIV 1,69 11,02 2,22 13,18 PIV 1,5 10,55 1,98 14,14
PV 2,57 16,7 2 11,87 PV 2,73 19,18 2,94 20,98
PVI 1,5 9,8 1,52 9,02 PVI 1,45 10,19 1,97 14,06
74
Tabela 17 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 18 e 19.
A 18 OD % OE % A19 OD % OE %
PI 1,51 10,75 2,3 14,59 PI 1,78 15,93 1,89 14,53
PII 1,92 13,7 1,86 11,78 PII 1,48 13,25 2,36 18,15
PIII 2,35 16,75 2,3 14,59 PIII 2,42 21,66 2,21 17
PIV 0,94 6,7 1,52 9,64 PIV 1,51 13,52 2,29 17,62
PV 1,78 12,69 1,53 9,7 PV 1,3 11,65 1,6 12,3
PVI 1,73 12,33 2,53 16,05 PVI 2,68 23,99 2,65 20,4
PVII 3,8 27,08 3,72 23,65 PVII
TOTAL 14,03 100 15,76 100 TOTAL 11,17 100 13 100
75
Tabela 18 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE dos animais 20 e 21.
A20 OD % OE % A21 OD % OE %
PI 1,33 15,51 3,16 28,5 PI 1,99 11,78 1,87 10,5
PII 2,28 26,6 2,11 19,02 PII 2,21 13,1 2,04 11,44
PIII 1,76 20,54 1,31 11,81 PIII 2,24 13,28 2,02 11,32
PIV 1,61 18,8 2,19 19,75 PIV 2,34 13,86 2,1 11,77
PV 1,59 18,55 2,32 20,92 PV 1,85 10,96 2,14 11,99
PVI PVI 2,05 12,14 1,1 6,16
PVII PVII 4,2 24,88 6,57 36,82
TOTAL 8,57 100 11,09 100 TOTAL 16,88 100 17,84 100
76
Tabela 19 - Valores das concentrações das proteínas e as suas respectivas porcentagens, do OD e OE do animal 23.
A23 OD % OE %
PI 1,4 15,3 1,26 13,68
PII 1,84 20,11 1,49 16,18
PIII 1,18 12,89 1,66 18,02
PIV 1,34 14,65 1,11 12,05
PV 0,84 9,18 1,4 15,21
PVI 2,55 27,87 2,29 24,86
9,15 100 9,21 100
77
Tabela 20 - Valores de Proteína total de OD e OE pelo método de Tabela 21- Valores de Proteína total de OD e OE pelo método de
Sensiprot®. Bradford.
ANIMAL SENSIPROT OD (mg/dl) SENSIPROT OE (mg/dl) 1 8,1 10 2 7,6 10,6 4 27,8 9,9 5 2,6 3,4 6 9,9 1 7 0,8 1,4 9 0,4 3,2 10 17,6 5,9 11 2 1,6 12 8,4 8,4 13 10,2 9,3 14 5,4 5,7 15 7,9 7,3 16 8,4 7 17 11,5 10,7 18 8,2 7,9 19 13,6 11,8 20 19,5 18,9 21 12,8 11,5 22 7,6 6,9 23 8,8 7,2 24 7,6 7,8 25 9,9 10,5
MÉDIA 9,42 7,73
ANIMAL OD(mg/dl) OE(mg/dl) 1 36,2 37,12 2 41,14 39,59 3 43,3 33,42 4 35,27 35,89 5 30,64 32,19 6 25,09 25,4 7 16,14 15,52 8 52,25 53,79 9 23,85 36,82 10 27,56 31,88 11 29,72 48,85 12 16,14 21,08 13 34,35 29,41 14 26,32 49,16 15 30,33 27,25 16 31,57 51,32 17 49,78 46,08 18 64,59 64,59 19 54,72 52,87 20 28,17 26,32 21 29,72 27,25 22 21,38 24,78 23 30,95 36,2
MÉDIA 33,8773913 36,81652174