Laboratório de Biologia Molecular e Citogenética Rua Irmã Arminda 10-50 – Jd. Brasil – Bauru – SP

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PROTOCOLO PARA REALIZAÇÃO DE LISE DE GLÓBULOS VERMELHOS

(REALIZADO PREVIAMENTE)

Coleta do sangue

o Coletar 5 ml de sangue com um tubo a vácuo contendo EDT A como anticoagulante; o Armazenar as amostras na geladeira até o momento do uso.

Preparo da solução de Lise

o 9 ml de Cloreto de Amônia 0,144 M (NH4CI) - (geladeira)

o 1 ml de Bicarbonato de Amônia 0,01 M (NH4CO3) - (geladeira)

OBS: para cada amostra serão necessários 9 ml de solução de Lise até o final do processo.

Procedimento:

1. Retirar as amostras de sangue da geladeira e centrifugar durante 5 minutos a 3.000

rpm, a fim de obter a separação do plasma;

2. Retirar da amostra 1 mL de plasma e desprezar. Homogeneizar o restante da amostra e

transferir para um tubo Falcon 15 mL estéril já identificado;

3. Adicionar 1mL de solução de lise para cada 1mL de amostra (proporção 1:1);

4. Colocar as amostras em suporte de modo que fique na posição horizontal e deixar durante

25 minutos no shaker com velocidade lenta e temperatura ambiente;

5. Retirar as amostras do shaker e centrifugar durante 15 minutos a 3.000 rpm;

6. Desprezar o sobrenadante vertendo os tubos, deixando cerca de 1 ml de amostra.

7. Adicionar 3 mL de solução de lise, homogeneizar com uma P 1.000 e centrifugar

durante 10 minutos a 3.000 rpm;

8. Desprezar o sobrenadante vertendo os tubos e deixando cerca de 1,5 ml da amostra.

9. Homogeneizar novamente e transferir a amostra para um microtubo de 2 mL estéril e

identificado;

10. Centrifugar durante 3 minutos a 4.000 rpm e desprezar o sobrenadante;

11. Acrescentar 1 ml da solução de lise, homogeneizar levemente com a P1000 e

centrifugar durante 3 minutos a 4.000 rpm;

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12. Repetir o passo 11;

13. Desprezar o sobrenadante e acrescentar 1 ml de TKM1 (2M Tris.HCl, 0,075M KCl,1M

MgCl2), homogeneizar levemente com a P1000 e centrifugar durante 2 minutos a 3.000

rpm;

14. Desprezar o sobrenadante e guardar as amostras (pelletes de glóbulos brancos) a -20°C

até o momento da extração de DNA.

PROTOCOLO EXTRAÇÃO DE DNA DE LEUCÓTCITOS (REALIZADO EM AULA PRÁTICA)

• Antes de iniciar o procedimento, programar a temperatura do banho-maria em 55ºC;

1. Limpar a bancada de trabalho com Etanol 70%;

2. Retirar as amostras do freezer e adicionar ao “pellet” de glóbulos brancos 800 µl de TKM-2- e

50 µl de SDS 10%;

3. Dissolver o “pellet” homogeneizando com uma micropipeta P1000;

4. Incubar as amostras no banho-maria a 55ºC durante 30 minutos e vortexar a cada 10 minutos;

5. Retirar as amostras do banho-maria e adicionar 360 µl de NaCl 5M. Homogeneizar

completamente;

6. Centrifugar as amostras a 13.000 rpm durante 5 minutos;

7. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente e transferir para um tubo de hemólise estéril;

8. Adicionar 2 ml de etanol absoluto. Vedar o tubo com parafilm e inverter várias vezes até

visualizar o DNA precipitado;

9. Transferir o DNA juntamente com 500µl de etanol absoluto do tubo de hemólise para um

microtubo 1,5ml estéril. Centrifugar a 5.000 rpm durante 5 minutos;

10. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1ml de etanol 70%. Centrifugar a 12.000 rpm durante 3

minutos;

11. Desprezar o sobrenadante e deixar o DNA secar em temperatura ambiente, overnight, coberto

por uma folha de papel;

12. Adicionar a amostra, 100µl de TE. Colocar no banho-maria a 55ºC durante 10 minutos.

Armazenar a -20ºC.

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QUESTÕES - RELATÓRIO (DEVEM SER ENTREGUES POR GRUPO DE AULA PRÁTICA – 5 ALUNOS)

Disciplina: Biologia Molecular Turma: Farmácia (496977-A)

Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Data: 09 de março de 2012

Discentes: ________________________________________________________________

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1) Qual a finalidade do procedimento de lise de hemácias?

2) Porque se adiciona TKM (2M Tris.HCl, 0,075M KCl,1M MgCl2) à amostra, no procedimento

de lise de hemáceas?

3) O que é SDS e qual sua função no processo de extração de DNA?

4) Qual é o papel do sal (NaCl) neste procedimento?

5) Porque utilizamos etanol absoluto na formação do precipitado?