7/25/2019 Protocolo de Extrao de RNA

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Extrao de RNA

ATENO: Todo protocolo de extrao de RNA deve ser realizado o tempo todo no gelo!

TRITURACAO/HOMOGEINIZACAO

Triturar o tecido em nitrognio liquido no cadinho Add 1mL de TrizolReagent (para placas de 10mL)

Aspirar o volume com a seringa cuidadosamente Poe 3X

Recolher o volume de TrizolReagent do cadinho e acondicionar em eppendorf estril

EXTRACAO/SEPARACAO

Incubar por 510 minutos a temperatura ambiente em rotador (ou com agitao manual

por inverso)

Add 0,2mL de clorofrmio (para cada 1mL de TrizolReagent)

Homogeneizar por inverso Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente em rotador (ou com agitao manual por

inverso)

Centrifugar a 13.000 rpm a 4C por 15 minutos

Recolher o sobrenadante (fase aquosa incolor)em eppendorf estril

PRECIPITACAO

Add 1uL de glicgenio ao sobrenadante recolhido

Homogeneizar por inverso

Add 0,5mL de isopropanol (=lcool isoproplico)

Homogeneizar por inverso

Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente em rotador (ou com agitao manual por

inverso)

Centrifugar a 13.000 rpm a 4C por 2030 minutos

Desprezar o sobrenadante (OBS: guardar o sobrenadante da precipitao por precauo)

LAVGEM

Lavar o pellet add 1mL de etanol 7590% gelado (o etanol tem que ser gelado para evitar que

o pellet se solte, no necessrio ressuspender o pellet de RNA, mas apenas solt-lo da parede do

eppendorf)

Centrifugar a 13.000 rpm e 4C por 20 30 minutos

Desprezar o sobrenadante

Deixar o pellet secar ao ar (eppendorf invertido sobre papel absorvente, TC ambiente, no pode

secar demais seno ele no ressuspende depois, mas tambm no pode deixar ficar etanol)RESSUSPENSAO

Ressuspender o pellet em 50uL de H2O DEPC

Armazenar no -80C

2X

2X

7/25/2019 Protocolo de Extrao de RNA

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Antes da Extrao de RNA:

* It is therefore important that tissue samples are immediately frozen in liquid nitrogen and

stored at70C, or immediately immersed in RNAlater RNA Stabilization Reagent.

* The procedures for tissue harvesting and RNA protection should be carried out as quickly as

possible. Frozen tissue samples should not be allowed to thaw during handling or weighing.After disruption and homogenization in Buffer RLT (lysis buffer), samples can be stored at

70C for months.

* After storage in RNAlater RNA Stabilization Reagent, tissues become slightly harder thanfresh or thawed tissues. Disruption and homogenization of these tissues, however, is usuallynot a problem.

* Usar Tissue Lyser ou Rotor-Stator homogenizer

* Disruption and homogenization using rotorstator homogenizers: Rotorstatorhomogenizers thoroughly disrupt and simultaneously homogenize, in the presence of lysisbuffer, single samples of animal tissues in 1590 seconds dependingon the toughness and sizeof the sample.