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LICENCIATURA EM BIOQUMICA 2 ANO

LABORATRIOS DE BIOFSICA / BIOQUMICA

Trabalhos Prticos

ICBAS 2012/2013


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PLANO DE AULAS DE LABORATRIOS DE BIOQUMICA E BIOFSICA 2012 2013

TRABALHO SEMANA TTULO DO TRABALHO PRTICO (Docente)

Carnaval - 13-

14 Fev

19-20-21 Simulao do isolamento de uma protena usando o programa

ProteinLab (MRA)

26-27-28 Fev Protein Data Bank (PDB) (MS)

1 5 - 6 7 Mar Quantificao de protenas por espectrofotometria (MRA)

2 12 - 13 14

Mar

Produo de protena recombinante (MRA)

3 19 - 20 21

Mar

Separao e caracterizao de protenas por electroforese (MRA)

Frias Pscoa

4 2 3 4Abril Ensaios imunoqumicos imunoensaio enzimtico (ELISA) eimmunoblotting (MRA)

5 9 - 10 - 11

Abril

Purificao de uma protena por cromatografia de afinidade (MRA)

6 16- 17 -18

Abril

Cristalizao de protenas - Estudos de caracterizao estrutural de

protenas (MS)

7 23 - 24 25

Abril

Cristalizao de protenas (MS)

30 - 1 -2

Maio

Cristalizao de protenas (MS)

7 - 8 9 Maio Queima das Fitas

8 14 - 15-16

Maio

Fracionamento celular (MS)

9 21 22 - 23

Maio

Fracionamento celular (MS)

10 28 - 29-30

Maio

Apresentaes dos alunos

Docentes: Prof. Doutora Maria do Rosrio Almeida (MRA); Dr. Maria Strecht (MS)


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Trabalho Prtico n1

Simulao do isolamento de uma protena usando o programa

ProteinLab

Objectivos:

- Familiarizao com tcnicas de isolamento e caracterizao de protenas e anlise das

informaes obtidas em cada uma dessas tcnicas;

- Delinear a estratgia de purificao de uma protena em funo de alguns dados iniciais e

principalmente em funo dos resultados obtidos em cada uma das etapas cumpridassucessivamente.

Endereo na web:

www.tlsu.leeds.ac.uk/courses/bioc2060/proteinlab102/Protein2/html

O ProteinLab um programa de simulao do isolamento de protenas concebido pelo ProfessorAndrew G. Booth da Universidade de Leeds ProteinLab A. G. Booth, School of Biochemistryand Molecular Biology, University of Leeds, 1999.

Introduo

Neste programa -nos dado escolher uma de 20 protenas (1-20) para ser isolada. Relativamente

a cada protena so fornecidas informaes relativas temperatura ptima de actividade e ao

intervalo de pH em que a protena estvel. A partir desta informao possvel escolher uma

das variadas tcnicas disponveis e ir tomando decises sucessivas perante os resultados obtidos.

Em cada etapa de purificao pode avaliar-se a eficincia do processo e identificar a protena

pela sua actividade enzimtica. So particularmente teis para anlise dos produtos de cada

etapa de purificao as tcnicas de electroforese, immunoblotting e anlise bidimensional.

A seleco das tcnicas a utilizar implica tambm uma escolha em funo da viabilidade

econmica do processo.

No decurso do programa possvel ainda obter informaes mais detalhadas sobre as diferentestcnicas seleccionadas.


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"Protein Lab", by A.G. Booth, School of Biochemistry and Biotechnology, University of

Leeds, Leeds, United Kingdom.

Summary of program features:

(Note: The description below applies to the versions of "Protein Lab" available for download.

The on-line Java version is slightly different.)

The program follows an imagined scenario: purification of a protein in a research setting. For

background information, as well as an explanation of the concepts needed to effectively use

this program, we recommend that students start with the following HELP menu topics:

SCENARIO, GETTING STARTED and STRATEGY.

Once students understand the general layout of the program, they may begin the actual

purification. "Protein Lab" offers the student a chance to purify one of twenty different

proteins from a mixture. There is also an option to save an ongoing purification and then

later return to the stored material. All of the target proteins are enzymes whose activity may

be assayed. The student chooses BEGIN: START FROM THE BEGINNING to select a protein to

purify. The program will then provide basic information about the chosen protein, including

its pH and temperature stability range.

Next, the student chooses the first purification procedure using the SEPARATION menu.

There are numerous purification procedures available; the optimal procedure depends on

the structural and functional properties of the desired protein. Use the HELP menu to get

specific information about each of these procedures, which include Ammonium Sulfate

Precipitation, Gel Filtration Chromatography, Ion Exchange Chromatography and others. If a

chromatography technique is chosen for separation, the computer generates a

chromatogram of A280 vs. fraction number. Following the purification, using a pull-down

menu titled FRACTIONS, the fractions can then be assayed for enzyme activity and selected

fractions pooled.

At any step in the purification, the student may assess his or her progress in one of three

ways: by asking for a PROGRESS REPORT (using the HELP menu), by using the

ELECTROPHORESIS menu to run a virtual 1-dimensional or 2-dimensional PAGE gel, or by

running a PAGE gel and then requesting an IMMUNOBLOT (Western Blot). PROGRESS

REPORT includes information on yield, enrichment and efficiency (expressed in person

hours). There is no fixed end-point for a given purification, except in the case where the

student spends too much virtual money and is "fired". However, the instructor could set

some standards for the class in terms of either purity or yield.


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Sources of Background Information:

Students benefit most from this software when it is preceded by at least one lecture of

background material on protein purification. Some useful sources include:

Lisa A. Seidman and Cynthia J. Moore, Basic Laboratory Methods for Biotechnology:

Textbook and Laboratory Reference, Prentice Hall, 2000 (especially Chapters 23 and 27).

Jeanette Mowery and Lisa Seidman, Protein Purification Manual: Purification of -

galactosidase from E.coli, Madison Area Technical College. (Manuscript in preparation,

please contact Jeanette Mowery for an advance copy.)

Material from the HELP screens of "Protein Lab" itself.

Software:

"Protein Lab" by A.J. Booth may be downloaded or used on-line by visiting

http://www.booth1.demon.co.uk/archive.


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Trabalho Prtico n2

Quantificao de protenas por espectrofotometria

Objectivo

Neste trabalho pretende fazer-se um estudo comparativo de diferentes mtodos de

quantificao de protenas baseados na espectroscopia de absoro. Para isso vai proceder-se

quantificao de albumina e tripsina em soluo utilizando a absoro a 280 nm e os mtodos do

biureto, Lowry e Bradford. Pretende-se ainda, por anlise dos resultados obtidos, verificar oslimites de aplicabilidade da tcnica.

Introduo

A quantificao de protenas , talvez, uma das tcnicas mais comuns em bioqumica. Em qualquer

estudo bioqumico h sempre uma etapa em que necessrio determinar a concentrao de

protena de um modo absoluto ou relativo. Para uma quantificao absoluta o mais correcto seria

determinar a massa de protena, ou seja, o peso seco da protena na amostra. Isso exigia quefossem retiradas todas as substncias no protecas da amostra, incluindo ies e molculas de

gua. Este tipo de determinao para alm de difcil no muito sensvel. A existncia de uma

relao linear entre a absorvncia e a concentrao de uma determinada substncia (lei de

Lambert-Beer) possibilita a utilizao da espectrofotometria como mtodo de quantificao.

Assim, os mtodos mais comuns para determinar a concentrao de protenas so mtodos

espectrofotomtricos que usam cromforos intrnsecos, como os anis aromticos de alguns

resduos de aminocidos (absorvem a 280 nm) ou as ligaes peptdicas (absorvem a 215 nm), ou


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que se baseiam na reaco das protenas com um reagente originando um produto corado ou

fluorescente.

Nas determinaes espectrofotomtricas o comprimento de onda seleccionado deve

corresponder ao comprimento de onda com absorvncia mxima no sentido de aumentar a

sensibilidade e minimizar os erros nas determinaes. muito importante que as solues a

serem lidas espectrofotometricamente se encontrem lmpidas, caso contrrio devem ser

clarificadas, por exemplo por centrifugao.

A escolha de um determinado mtodo para a quantificao de uma protena deve satisfazer

alguns requisitos, nomeadamente, especificidade, sensibilidade, preciso e convenincia (isto ,

deve ser rpido e econmico). Na realidade devem avaliar-se os diferentes parmetros de modo a

escolher o mtodo mais adequado aos objectivos a atingir, principalmente no que respeita

especificidade e sensibilidade. A sensibilidade sendo um dos factores mais relevantes na

escolha do mtodo deve ser optimizada, por exemplo removendo substncias contaminantes por

precipitao, antes do doseamento. Outro factor que pode afectar a sensibilidade a

solubilidade da protena. Assim, em alguns casos necessrio um passo inicial de solubilizao da

protena.

A validao de um mtodo feita pela determinao da exactido e preciso desse mtodo. Estes

parmetros so determinados atravs da anlise estatstica dos valores obtidos para vrias

determinaes numa mesma amostra. Um ensaio exacto um ensaio em que o valor mdio obtido

muito prximo do valor real. Num ensaio preciso, a disperso de resultados pequena e o mtodo

reprodutvel, com boa resoluo. Nos ensaios bioqumicos a preciso na maior parte dos casos

mais importante do que a exactido pois so suficientes as quantificaes relativas. Isso significa

que, por exemplo, pode usar-se uma recta de calibrao de concentrao de albumina para a

quantificao de uma outra protena. No entanto, quando a determinao da concentrao

absoluta importante deve usar-se uma curva de calibrao da prpria protena.

Os ensaios devem ser calibrados usando para isso solues de concentrao conhecida, em

condies iguais s do ensaio propriamente dito. Para a calibrao usa-se, em geral, uma soluo

stock de albumina srica bovina (BSA) a uma concentrao de 10 mg/ml ou uma diluio 1/10

desta soluo. Solues mais diludas perdem protena durante o armazenamento, principalmente

por adsoro, devem por isso ser preparadas diariamente. A concentrao exacta da albumina na

soluo stock deve ser determinada por leitura de absorvncia a 280 nm usando como coeficiente

de extino o valor A2801%= 6.6. A concentrao deve ser verificada periodicamente devido ao

decrscimo da concentrao por desnaturao da protena. A calibrao deve incluir pelo menos 5


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concentraes diferentes de protena na gama de concentraes em que o mtodo apresenta

linearidade.

Como as protenas tm composies diferentes em termos de aminocidos o mesmo peso de

protena pode ter valores diferentes em diferentes ensaios. Por exemplo, um ensaio que responda

relativamente aos anis aromticos vai subestimar o peso de uma protena com poucos

aromticos. Assim, as calibraes baseadas em albumina so relativas. Tendo isto em conta um

mtodo que se baseie na reaco com as ligaes peptdicas talvez o que deve apresentar menos

variaes de protena para protena, podendo ser utilizado quase como um mtodo absoluto.

Alguns aspectos prticos

Volume de amostra: Num ensaio espectrofotomtrico uma amostra tem, em princpio, 3

componentes: a amostra propriamente dita, o solvente e o reagente de cor, em geral, em excesso

relativamente amostra. O volume de amostra deve ser sempre o mesmo, isto , o volume final de

amostra e solvente tem de ser sempre igual. O volume do reagente de cor deve ser constante

para manter a diluio e o volume final. Sendo assim a absorvncia proporcional quantidade de

protena na amostra no sendo necessrio calcular a concentrao de protena na amostra de

ensaio.

Solvente: Para manter as condies dum ensaio, deve usar-se um solvente tamponado e os

volumes de amostra no devem exceder 25% do volume de solvente. As substncias tampo e os

ies do solvente podem tambm contribuir para o desenvolvimento de cor no ensaio. Em todos os

ensaios deve testar-se a influncia do solvente da amostra no mtodo.

Ordem de adio: Embora este no seja um factor muito importante sempre mais correcto

adicionar o reagente de cor em ltimo lugar. Uma das razes que estes reagentes so menos

estveis nas misturas de amostra podendo decompor-se prematuramente.

Alguns mtodos de doseamento de protenas

Absoro de radiao ultravioleta

Os resduos de aminocidos aromticos absorvem luz no U.V. a 280 nm e as ligaes peptdicas a

215 nm. Para uma protena solvel, incolor, a medio da absorvncia a qualquer um destes

comprimentos d uma medida da concentrao da protena. A principal vantagem deste mtodo

o facto de no destruir a amostra, e por isso poder ser utilizado, por exemplo, para monitorizar a


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eluio de uma protena duma coluna de cromatografia. A sua desvantagem a falta de

especificidade muitos tampes comuns e alguns compostos biolgicos (heme, cidos nucleicos,

ATP, etc.) absorvem fortemente no U.V., principalmente a 215 nm. Este mtodo

particularmente til para determinar a concentrao de protenas puras e com contedo de

aromticos conhecido.

Mtodo do biureto

Os ies Cu2+, em soluo alcalina, complexam-se com os tomos de azoto das ligaes peptdicas

nas protenas dando origem a um complexo de cor prpura. O Cu2+ mantido em soluo alcalina

sob a forma de complexo de tartarato (fig.1).

Figura 1 Complexo de Cu2+ com tartarato em soluo alcalina.

A presena de altas concentraes de ies amnio, que complexam com os ies Cu2+, ou a

presena de agentes redutores (incluindo aucares redutores), que reduzem o Cu2+ a Cu+

(formando um precipitado cor de laranja) podem interferir no mtodo. Para remover substncias

que interferem no mtodo, pode precipitar-se a protena com cido tricloroactico (TCA) e no

caso de esta se encontrar ligada a cromforos orgnicos pode fazer-se uma extrao com etanol.

A protena precipitada pode ser solubilizada com uma soluo de desoxicolato em NaOH.

Mtodo de Lowry

Este sem dvida o mtodo mais referenciado na literatura. um mtodo muito mais sensvel

do que o mtodo do biureto, o que faz com que seja preferido relativamente ao mtodo do

biureto, apesar de apresentar maior variabilidade de protena para protena. Tal como o biureto,

o mtodo de Lowry baseia-se na complexao da protena com Cu2+

em soluo alcalina. O cobreparece catalisar a reduo, pela tirosina e pelo triptofano, dos anies


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fosfomolibdato/fosfotungstato do reagente fenlico de Folin adicionado subsequentemente. Esta

ltima reaco conduz formao de um composto de cor azul que pode ser medido a 700-750

nm.

Muitos compostos interferem com o mtodo nomeadamente, agentes redutores, tiois, fenois e

alguns tampes (trietanolamina, Hepes, etc.) conduzindo a intensas coloraes azuis na amostra

que serve de branco. Outros compostos tambm interferem aumentando o branco, mas diminuindo

a intensidade de cor das amostras (Tris, EDTA, aucares, glicerol). Alguns detergentes neutros e

bases alifticas podem causar a precipitao do reagente. Interferncias devidas precipitao

de substncias contaminantes ou da protena podem ser obviadas da mesma forma que foi

referida para o mtodo do biureto.

Mtodo de Bradford

Este ensaio baseia-se na alterao de cor que ocorre quando o Coomassie Brilliant Blue G250 (Fig.

2) em soluo cida, se liga protena.

Figura 2 Forma no protonada do Coomassie Blue G250.

A forma protonada do Coomassie Blue tem uma cor laranja plido. O corante liga-se

fortemente s protenas, atravs de interaces hidrofbicas e interaces com grupos da

protena carregados positivamente. Nestas condies a protonao suprimida e observa-se a

cor azul .

Este mtodo bastante rpido e simples no sofrendo interferncias de tampes, sais, agentes

redutores, etc. No entanto bases fortes causam falsos positivos e os detergentes aninicos (ex.

dodecil sulfato de sdio SDS, desoxicolato) tambm interferem. As protenas insolveis podem

ser solubilizadas com um detergente no inico como o Triton X-100. A amostra no se deve


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encontrar num tampo muito forte pois isso impede a protonao do corante aparecendo a cor

azul na ausncia da protena.

Parte experimental - Materiais e mtodos

1.Mtodo do biureto

Reagentes:

1) Reagente de cor (j preparado):

(Dissolver 1,5 g de Cu SO4.5H2O e 6g de tartarato de Na.4H2O em 500 ml de gua destilada. A esta soluo

adicionar 300 ml de soluo de NaOH (10%), seguida de 200 ml de gua destilada.

A soluo estvel temperatura ambiente durante meses. A decomposio do reagente indicada pela

presena de cor laranja devido ao precipitado de ies Cu+. Se necessrio pode adicionar-se iodeto de potssio

como preservativo da soluo (1g/L)).

2) Soluo stock de protena 70 mg/ml (j preparada).

Mtodo

1. A partir de uma soluo stock de protena (BSA) 70 mg/ml, prepare vrias diluies dessaprotena (em microtubos), de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (mg/ml) 70 50 30 25 20 15 10 0

Vol. Soluo stock

70 mg/ml (L)1000 714 428 357 286 214 143 0

Vol. H2O at 1 ml (L) 0 286 572 643 714 786 857 1000

2. Pipete 0.2 ml de cada uma das solues anteriores para 2 tubos de ensaio (altos). Marque ostubos.


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3. Adicione 2.3 ml de reagente de cor ( fornecido aos alunos j pronto).4. Aquea 5 min a 80C (ou deixe temperatura ambiente 2h), arrefea rapidamente e deixe

temperatura ambiente 10 min.

5. Ler a absorvncia a 540 nm.

Nota: 1 mg de protena deve dar 0.1 de absorvncia. A cor estvel durante vrios dias nassolues se estas forem conservadas no escuro.

2. Absoro no ultra-violeta

Reagentes:

1) Solues stock de protenas 1,41 mg/ml.

Mtodo:

1. Prepare 9 microtubos com 0.2 ml de H2O.2. Acerte o zero de absorvncia a 280 nm, com gua, no espectrofotmetro.3.

Leia a absorvncia da soluo stock ( use ~1 mL). Solues stock (SI (gamaglobulina) e SII(albumina))

4. Retire 800 uL da soluo que usou para ler e adicione a um dos microtubos com 200 uL deH2O . Agite e leia a OD .

5. Repita o passo anterior para as 8 diluies seguintes. (No esquea de medir a OD antesdepassar diluio seguinte.

6. Mea a OD de cada soluo antes de fazer a diluio seguinte:

Conc.final

(mg/ml)1.4 1.12 0.90 0.71 0.57 0.45 0.36 .19

Vol. Soluo

stock

1,4 mg/ml (L)

1000 800 800 800 800 800 800 800

Vol. H2O at 1

ml (L)0 200 200 200 200 200 200 200


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7. Fazer as leituras de absorvncia para as diluies de SI e para as diluies de SII. Medir aabsorvncia das amostras usando gua como branco.

( 1 mg/ml protena d A280 1 )

3.Mtodo de Bradford ensaio em microplaca

Reagentes:

Reagente de cor comercial (Bio-Rad Protein assay).

(Alternativamente pode fazer-se:

a) Dissolver 100 mg de Serva Blue G em 50 ml de etanol. Diluir a soluo a 500 ml com H2O. A concentrao do corante

numa soluo stock fresca deve ser ajustada com 10% de etanol (v/v) para dar A5501.18 na mistura a+b. Isto assegura a

consistncia dos diferentes stocks de corante. b) cido fosfrico 17% (cido comercial diludo 1/5).

As solues a e b so misturadas em partes iguais no dia da utilizao. As solues a e b so estveis durante meses

temperatura ambiente.)

Mtodo

1. A partir de uma soluo stock de albumina e de uma soluo stock de gamaglobulina comconcentrao aproximada de 1,4 mg/ml (cada) preparar uma srie de diluies (em

microtubos) para cada protena de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (g/ml) 1400 1000 750 500 250 200 150 100 50 0

Vol. Soluo stock

1.4 mg/ml (L)100 72 54 36 18 14 11 7 4 0

Vol. H2O at 0.5 ml

(L) 0 28 46 64 82 86 89 93 96 100

2. Usar o reagente de cor (Bio-Rad) 1:4 em H2O.3. Adicionar 1 mL de reagente Bio-Rad Protein Assay diludo 1:4 a cada uma das 20 cuvetes

(por protena).

4. Pipetar 20uL de cada diluio para cada uma das cuvetes (duplicados).5. Misturar e ler a absorvncia a 595 nm (A595). A cor estvel durante cerca de 30 min, aps

os quais o complexo protena-corante comea a precipitar


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4.Mtodo de Lowry

Reagentes:

1) Reagente de Cobre Alcalino (j preparado)

a) 1% CuSO4.5H2O

b) 1% NaK tartarato.4H2O

(As solues a) e b) so estveis temperatura ambiente durante meses.)

c) 2% Na2CO3 em 0.1 M NaOH.

No dia da utilizao misturam-se as solues a) e b) em partes iguais e depois dilui-se com 98 volumes de c),

para formar o solventeReagente de Cobre Alcalino.

2) Reagente de Folin-Ciocalteau (j preparado)

d) reagente comercial de Folin-Ciocalteau (tungstato de sdio, molibdato de sdio, cido fosfrico, cido

cloridrico). (A soluo d) estvel a 4C durante meses.)

Diluir d) em partes iguais com gua no dia de utilizao para formar o reagente de cor.(Reagente de Folin-Ciocalteau)

Mtodo

1. A partir de uma soluo stock de protena de concentrao 500g/ml preparar vriasdiluies (em tubos de ensaio curtos) de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (g/ml) 500 200 100 50 25 10 5 2.5 1 0

Vol. Soluo stock

500 g/ml (L)2500 1000 500 250 125 50 25 12.5 5 0

Vol. H2O at 2.5 ml

(L)0 1500 2000 2250 2375 2450 2475 2487 2495 2500

1. Pipetar 1 ml de cada uma das solues anteriores para tubos de ensaio (curtos).2. Adicionar 3ml de Reagente de cobre alcalino.3. Deixar repousar 10 min.4. Adicionar 0.3 ml de Reagente de Folin-Ciocalteau e misturar imediatamente.5. Deixar repousar temperatura ambiente 1h, protegido da luz, e ler a absorvncia a 750 nm

(ou alternativamente a 550 nm)


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Nota: A cor estvel durante vrias horas. O pico de absoro largo e a linearidade pode ser

alargada se as leituras forem efectuadas a 550 nm.

BIBLIOGRAFIA:

- D. A. Harris & C. L. Bashford: Spectrophotometry & spectrofluorimetry a pratical

approach IRL Press, 1987. (Captulo 3- Spectrophotometric assays)

- David Freifelder: Physical Biochemistry, W. H. Freeman & Company, New York, 199 .

Trabalho Prtico n3

Isolamento de transtirretina recombinante produzida em E. coli

Separao de protenas por cromatografia

Introduo

Produo de protenas recombinantes em microorganismos

A necessidade de obter grandes quantidades de protena para diferentes fins levou ao

desenvolvimento de sistemas de produo de protenas in vivo. As protenas produzidas em

sistemas heterlogos podem ser utilizadas para fins teraputicos e farmacolgicos como o caso

da hormona de crescimento, da insulina ou da vitamina da Hepatite B ou com objectivos

industriais, por exemplo enzimas usadas na produo de detergentes ou na rea alimentar para a

produo de aucar e de queijo. A escolha de um determinado sistema de produo dependeprincipalmente das caractersticas da protena e do fim a que se destina. A bactria E. coli o

sistema de produo in vivo mais comum embora as leveduras, em particular Saccharomyces

cerevisiae, Pichia pastorise Kluyveromyces lactis, sejam cada vez mais utilizadas.

A expresso em E. coli o sistema apropriado sempre que possvel obter a protena na forma

solvel, em grande quantidade e com a estrutura correcta e consequentemente protena

funcional. Quando as protenas requerem modificaes ps-traduo tais como glicosilao e

fosforilao necessrio recorrer a sistemas de expresso eucariotas.


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Em qualquer sistema a estratgia bsica passa pela clonagem do gene correspondente num vector

de expresso e a transformao das bactrias com esse vector. Quando se pretende produo de

uma grande quantidade de protena pode utilizar-se um fermentador para crescer o

microorganismo (bactria ou levedura). O vector de expresso em geral um plasmdio no qual

deve ser clonado o cDNA do gene eucariota que se pretende expressar. Os vectores de

expresso para alm da origem de replicao e de marcas de seleco (por exemplo resistncia a

antibiticos) possuem tambm promotores regulveis que quando induzidos possibilitam a

produo de uma grande quantidade de mRNA do gene clonado. Um dos sistemas mais comuns

envolve o promotor da T7 RNA polimerase. O gene especfico clonado sob o controle deste

promotor. O gene transcrio e depois traduzido por induo da expresso da T7 RNA

polimerase. O gene da polimerase por sua vez controlado pelo promotor lacque indutvel pelo

IPTG (isopropiltiogalactosido). Se por um lado se deseja uma expresso elevada da protena alvo,

por outro a sobre-expresso de protena no citoplasma pode conduzir formao de agregados

insolveis de protena designados por corpos de incluso (inclusion bodies). A protena em

corpos de incluso fcil de purificar por ser maioritria nestas partculas e por estas serem

isoladas por centrifugao. No entanto os processos de desnaturao para solubilizar a protena

podem no permitir uma renaturao perfeita da protena no se obtendo uma protena funcional.

Para obviar estes problemas podem usar-se vectores de expresso que inserem sinais de

secreo da protena para o meio ou para o espao periplsmico. Aps produo da protena no

citoplasma ou no espao periplsmico, torna-se necessrio separar a protena de interesse das

protenas bacterianas. Este processo de isolamento passa na maior parte dos casos por uma

cromatografia.

Separao de protenas por cromatografia

A separao em cromatografia baseia-se na distribuio das substncias a analisar por duas

fases: fase estacionria (meio cromatogrfico ou adsorvente) e fase mvel (ou eluente). As

molculas com tendncia a ficarem na fase estacionria movem-se atravs do sistema a uma

velocidade menor do que as que tm maior afinidade para a fase mvel. A forma mais comum de

cromatografia a cromatografia em coluna. A fase estacionria empacotada numa coluna

atravs da qual a fase mvel ou eluente se desloca. A amostra a ser separada aplicada na

extremidade superior da coluna e os diferentes componentes da amostra migram a diferentes

velocidades, sendo detectados e recolhidos na outra extremidade.

Existem diferentes tipos de cromatografia que permitem a separao de protenas de acordo

com diferentes propriedades:


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- forma e tamanho filtrao em gel;

- carga efectiva e distribuio de carga superfcie - troca inica;- hidrofobicidade cromatografia de fase inversa;- ligao de metais cromatografia de ies metlicos imobilizados;- grupos tiol expostos cromatografia covalente;- afinidades bioespecficas de ligandos, inibidores, receptores, anticorpos -

cromatografia de afinidade.

Em cada uma das tcnicas referidas as protenas so separadas predominantemente em funo

de uma caracterstica, mas a separao no completamente independente das outras.

Cromatografia de troca inica

Na cromatografia de troca inica a separao depende da ligao competitiva de diferentes ies

(protenas ou ies salinos) com a mesma carga a um meio cromatogrfico de carga oposta, o

trocador inico. A interaco entre as protenas e o trocador inico depende de vrios factores:

carga efectiva, distribuio de carga superfcie da protena, fora inica e natureza dos ies no

solvente, pH e outros aditivos como por exemplo solventes orgnicos. Os trocadores inicos

consistem numa matriz substituida com grupos positivos e so trocadores de anies ou com

grupos negativos e so trocadores de caties. Os grupos funcionais mais comuns so as aminas

nos trocadores aninicos e os cidos carboxlicos nos trocadores catinicos. As condies de pH

condicionam a carga do trocador inico e da protena podendo ser utilizadas para influenciar o

processo de troca inica.

As protenas so molculas anfotricas contendo sua superfcie grupos carregados positiva e

negativamente. A carga efectiva da protena depende da sua composio em amino cidos e do pH

do meio. O pH ao qual o nmero de cargas positivas da protena igual ao de cargas negativas

designado ponto isoelctrico (pI). A pH superior ao seu pI a protena encontra-se carregada

negativamente; a pH inferior ao seu pI a protena encontra-se carregada positivamente.

A fora inica do eluente outro dos factores que condicionam a eluio das protenas na

cromatografia de troca inica. A uma concentrao relativamente baixa de ies competitivos, a

ligao das protenas ocorre atravs de mltiplas interaces de carga entre os vrios grupos da

protena e um nmero correspondente de cargas no trocador inico. A concentraes mais

elevadas dos ies competidores as protenas comeam a ser deslocadas do trocador inico por


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ordem da sua fora de ligao, sendo as mais fracamente ligadas as primeiras a eluir. A escolha

da fase estacionria e da fase mvel a utilizar depende das protenas a eluir, isto , dos seus pI,

solubilidade e estabilidade. A eluio pode ser isocrtica, descontnua ou de gradiente sendo esta

ltima a que permite melhores separaes entre os vrios componentes de uma amostra devido ao

poder crescente de eluio do meio.

TRABALHO PRTICO

Produo de transtirretina recombinante em E. colie seu isolamento porcromatografia de troca inica

A transtirretina (TTR) uma protena plasmtica que transporta hormonas da tiroide (em

particular, tiroxina) e tambm vitamina A (retinol) atravs da formao de um complexo com a

protena de ligao do retinol RBP (retinol binding protein). A protena tem massa molecular de

cerca de 55 000 Da sendo constituda por quatro subunidades idnticas de cerca de 14 000 Da

cada. O seu ponto isoelctrico aproximadamente 5.5. A TTR tem sido associada a diferentes

formas de amiloidose hereditria em particular polineuropatia amiloidtica familiar (PAF)

vulgarmente conhecida por doena dos pzinhos. Assim, dada a sua importncia biolgica e a

associao doena, tornou-se de extrema importncia o conhecimento da estrutura e funo da

protena. Para estes estudos necessria uma quantidade relativamente grande de protena que

no plasma humano existe apenas numa concentrao de 20-30 mg por 100 mL. Por este motivo

estabeleceu-se um sistema de produo de TTR em E. coliusando o vector de expresso pET3a

(INVITROGEN). O cDNA da TTR foi clonado neste vector sendo a sua produo induzida pela

adio de IPTG cultura de E. coli. A protena produzida mantem-se no citoplasma na sua forma

solvel e recuperada aps lise das bactrias. A TTR em seguida isolada por cromatografia de

troca inica em DEAE-celulose (fig. 1) que entre pH 2 e 9 se encontra carregada positivamente

comportando-se como trocadora de anies. Nesta cromatografia vamos usar um sistema de

tampo glicina-acetato sendo a protena eluida por aumento da fora inica do eluente.


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CH2 CH3

- O - CH2 - CH2 N + H Cl-

CH2 CH3

Figura 1 Estrutura do grupo funcional da DEAE celulose dietilaminoetil - celulose

Parte experimental

I. Produo de TTR recombinante em E. coli

Material

Stock de bactrias BL21pLysS transformadas com pTTR-ET3a. Meio LB (Luria-Bertani): 10 g bactotriptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl por

litro. Autoclavar.

Soluo de Glucose a 20% (autoclavar) Soluo de IPTG 1M (esterilizar por filtrao). Ampicilina 50 mg/ml (esterilizar por filtrao). Soluo de lise 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 2mM PMSF, 0.1% Triton X-100 pH 7.5.

Mtodo

1. Inocular 5 mL de meio LB com ampicilina com uma colnia de E. coliBL21pLysS transformada

com pTTR ET3a.

2. Crescer a cultura durante a noite a 37C num incubador com agitao.

3. Inocular 250 mL de meio LB com ampicilina + gucose com os 5 mL de pr-cultura crescida

durante a noite e crescer a cultura at esta atingir OD600=0.6-0.8.

4. Induzir a produo de TTR por adio de 100 L de IPTG 1M. Guardar uma alquota de 500 L

para anlise posterior.

5. Crescer a cultura durante mais cerca de 3 4 h a 37C. Ao fim deste tempo retirar uma

aliquota de 500 L6. Recolher as clulas por centrifugao a 4000 rpm durante 10 min.


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7. Desprezar o meio de cultura.

8. Ressuspender o pellet em 25 mL de soluo de lise.

9. Congelar o lisado a 70C e descongelar.

10. Repetir o passo anterior.

11. Sonicar o lisado 10 s.

12. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min.

13. Guardar o sobrenadante (retirar uma aliquota de 500 L).

14.Dialisar o sobrenadante em tampo de glicina-acetato 1X durante a noite.

II. Purificao da transtirretina recombinante por cromatografia de troca inica

1. Ler a OD280nm do sobrenadante dializado.2. Guardar uma aliquota de 200 L.3. Retirar o excesso de tampo da DEAE-celulose e equilibrar o sobrenadante contendo a

transtirretina, aps dilise, com a resina durante cerca de uma hora, em agitao.

4. Aplicar a resina a uma coluna de cromatografia. Deixar empacotar a coluna. Recolher umaalquota de 200 L do que no ligou resina. Lavar extensamente com tampo inicial at a

OD280 nm ser bastante baixa (0.0..)5. Eluir a transtirretina com tampo final recolhendo fraces de ~2 mL. Ler a OD 280 nm e

registar. Guardar uma alquota de 200 L da fraco com OD mais elevada.

6. Juntar as fraes de mais alta densidade ptica e dialisar contra H2O.7. As aliquotas recolhidas nas diferentes fases do trabalho sero analisadas no trabalho

seguinte.


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Trabalho Prtico n4

Separao e caracterizao de protenas por electroforese e

Immunoblotting

Objectivos

O objectivo geral do trabalho a analise de protenas por electroforese em sistema nativo

(PAGE) e sistema desnaturante (SDS-PAGE) e identificao por Immunoblotting. Em particular,

pretende-se estudar o processo de produo e isolamento de transtirretina recombinante

realizado na aula anterior, por anlise das fraces recolhidas em diferentes fases do processo.

Introduo

Electroforese

A maioria das macromolculas biolgicas possui carga elctrica, sofrendo por isso a influncia de

campos elctricos. Existem essencialmente duas respostas aplicao de um campo elctrico: a

orientao das partculas, no caso da existncia apenas de uma distribuio assimtrica de cargaou a migrao, no caso de essas partculas possurem uma carga elctrica efectiva. Designa-se por

electroforese a migrao de partculas electricamente carregadas, num determinado meio, sob a

influncia de um campo elctrico. Os meios de suporte para electroforese podem ser variados,

como por exemplo, acetato de celulose, gel de agarose e gel de poliacrilamida. Na electroforese

as macromolculas so submetidas aco da fora elctrica, na origem do seu movimento, mas

tambm de uma fora de viscosidade, em oposio a esse movimento, sendo atingida uma

velocidade de migrao constante quando a fora elctrica equilibrada pela viscosidade. Por

isso a mobilidade electrofortica das macromolculas (entendida como sendo a velocidade por

unidade de campo elctrico) depende tambm da sua forma e massa electroforese em sistema

nativo PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis).

Em condies experimentais que eliminem a influencia de diferenas na forma e na carga

elctrica entre as partculas, ser possvel obter informao acerca da sua massa molecular. Este

o fundamento de uma tcnica corrente de separao (e caracterizao) de protenas pelo

tamanho, a electroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecilsulfato de sdio (SDS)

SDS-PAGE. O SDS um detergente aninico que desnatura as protenas formando com elas,

independentemente da sua forma inicial, um complexo cilindrico. Alm disso, a maioria das


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protenas liga aproximadamente a mesma quantidade de detergente por unidade de massa,

adquirindo assim uma carga negativa proporcional sua massa. A eficincia deste processo

ainda aumentada pelo tratamento prvio da amostra de protenas pelo calor na presena de SDS

e tambm de -mercaptoetanol (um agente redutor). A amostra tratada deste modo colocada

no gel e submetida a um gradiente de potencial elctrico. Em resposta, as protenas movem-se

atravs do gel com uma velocidade que depende essencialmente da sua massa. De um modo geral

prefervel utilizar um gel descontnuo, constitudo por duas partes: uma primeira de trama mais

larga e onde se d o empacotamento das protenas stacking gel, e uma segunda onde ocorre a

resoluo dos componentes da amostra running gel. As bandas das protenas so reveladas no

fim da experincia com um corante. A sua massa molecular determinada por comparao com a

migrao de protenas padro, verificando-se que existe uma relao linear entre o logaritmo da

massa molecular e a distncia percorrida.

Curva de titulao isoelctrica

A determinao da curva de titulao isoelctrica uma tcnica bidimensional.

Numa primeira fase faz-se uma focagem isoelectrica do gel de poliacrilamida, sem amostra, para

que se estabelea um gradiente de pH determinado pela distribuio de anflitos ( cidos

poliaminados de baixo pm com diferentes pI) no gel. Numa segunda fase, aplica-se a amostra

numa linha perpendicular ao gradiente de pH estabelecido e faz-se uma electroforese. A

protena vai migrar para um e outro lado da linha de aplicao da amostra de acordo com a sua

carga em cada ponto. A curva de titulao vai cruzar a linha de aplicao da amostra no ponto

correspondente ao pI da protena.

Immunoblotting

O immunoblotting combina a resoluo da electroforese com a especificidade da deteco

imunoqumica. Basicamente, a tcnica consiste na separao de protenas, antignios, por

electroforese em gel de poliacrilamida, seguida da transferncia electrofortica das protenas

do gel para uma membrana de suporte, fazendo assim a rplica das protenas separadas no gel. A

localizao do antignio determinada usando anticorpos especficos que so marcados com

compostos fluorescentes, radioactivamente ou acoplados a uma enzima envolvida numa reao

com produo de uma substncia corada (Figura 2).


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Fig. 2 Deteco de protenas por immunoblotting. As protenas separadas em SDS-PAGE so

transferidas para uma membrana e detectadas pela utilizao de um anticorpo especfico

marcado (de Biochemistry, L. Stryer, 5th ed., 2004)

TRABALHO PRTICO:

A transtirretina uma protena tetramrica constituda por quatro subunidades idnticas de

massa molecular aproximadamente 14 000 Da. O seu ponto isoelctrico ~ 5.5. Neste trabalho

vamos analisar diferentes fraces recolhidas em diferentes fases do processo de isolamento da

protena recombinante para verificar a produo no sistema bacteriano usado e o processo de

purificao. As mesmas amostras sero analisadas por electroforese em sistema nativo

descontnuo (PAGE) e por electroforese em sistema desnaturante (SDS-PAGE). Os geis obtidos

sero corados por Coomassie Blue. Realizaremos tambm transferncia electroforctica das

protenas de gel de SDS-PAGE para posterior identificao da protena com um anticorpo

especfico (Immunoblotting).


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PARTE EXPERIMENTAL:

A Electroforese em gel de poliacrilamida em sistema nativo (PAGE)

Material

Acrilamida: 29,2% acrilamida, 0,8% bis-acrilamida Soluo tampo de electroforese 5X : 1 M glicina, 0,65 M acetato de sdio, pH 8.6 Para 500 mL: 37,54 g glicina , 26,6 g acetato de sdio Ajustar o pH at 8,6 com NaOH. 10% Persulfato de amnio Soluo de amostra: azul de bromofenol em 50% glicerol

Mtodo

1 - Para um gel de 1.5 mm prepare:

Soluo de acrilamida stock 5.4 mLSoluo tampo de electroforese 5X: 4 mLH2O 9.6 mLTEMED 20 LAPS 10% 1000 L

2 Preparao das amostras:

AmostraVolume de amostra

(L)H2O (L)

Tampo de amostra( 50% glicerol + bromoph)

(L)

1- Antes do IPTG 30 0 10

2- Depois do IPTG 30 0 10

3 - Lisado 15 15 10

4 - Pico 15 15 10

3 Aplicar 30 de cada amostra nos poos do gel.

4 - A electroforese decorre a 15-20 mA em tampo de electroforese 1X.

5 - Corar o gel com azul de Coomassie e descorar com o descorante apropriado

6 - Corar o gel em soluo corante com Coomassie blue durante cerca de 30 min a 1h e descorar

o gel em soluo descorante.


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B Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)

Material

Soluo de acrilamida: 29.2% acrilamida, 0.8% N,N-bisacrilamida (a mesma do gel nativo). Tampo do gel resolvente: 1.5 M Tris/HCl, pH 8.8. Tampo do gel de empacotamento: 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8. Tampo de amostra (4X): 0.25 M Tris/HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% -

mercaptoetanol. SDS 10%. Tampo de electroforese: 0.025M Tris/HCl, pH 8.3, 0.192 M glicina, 0.1% SDS. Persulfato de amnio 10%. TEMED Corante e descorante - os mesmos que se usaram para a electroforese anterior.

Mtodo

1 - Preparar o molde para polimerizar o gel.

2 - Num matrs, preparar a soluo para o gel resolvente:

5 ml de soluo de acrilamida2.5 ml de tampo do gel resolvente100 l de SDS 10%2.5 ml de H2O

100 l de persulfato de amnio5 l TEMED

Aplicar a soluo no molde com uma pipeta Pasteur at cerca de 1.5 cm do topo. Aplicar um pouco

de gua de modo a cobrir a soluo inicial. Deixar o gel polimerizar.

3 - Preparar a soluo para o gel de empacotamento:

1 mL de soluo de acrilamida1.250 mL de tampo do gel de empacotamento50 l de SDS 10%2.5ml de H2O100 l de persulfato de amnio 10%4 l de TEMED

Remover a gua que cobre o gel resolvente, colocar o pente e aplicar o gel de

empacotamento. Deixar polimerizar, lavar os poos com gua.

4 - Preparar as amostras:


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AmostraVolume de amostra

(L)H2O (L)

Tampo de amostra

(SB 4X) (L)

1- Antes do IPTG 30 0 10

2- Depois do IPTG 30 0 10

3 Lisado 15 15 10

4 Pico 15 15 10

5 - Ferver as amostras 2 min. Centrifugar as amostras.

6 -Aplicar 30 L de cada amostra nos poos. Aplicar, em paralelo, uma amostra com padres depeso molecular. Iniciar a electroforese, aplicando uma corrente de 30 mA at as amostras

atingirem o gel resolvente e de 40 mA at ao fim da electroforese.

7 Cortar o gel a meio. Uma das partes do gel retirada para immunoblotting e a outra para

corar.

8 - Corar e descorar o gel. Registar a distncia que cada protena migrou e calcular o seu peso

molecular a partir da curva de calibrao construda a partir dos padres de peso molecular.


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C - Immunoblotting

1 - Transferncia electrofortica de geis de poliacrilamida com SDS

Solues

Tampo de transferncia (39 mM glicina; 48 mM Tris, 0.0375 SDS; 20% metanol)

1 L: 2.93 g glicina5.81 g Tris0.375 g SDS200 ml metanol

Mtodo

- Equilibrar o gel e a membrana de nitrocelulose em tampo de transferncia durante cerca de

15 min.

- Molhar 6 folhas de papel de filtro 3 MM com o mesmo tampo.

- Preparar a cassete de transferncia colocando as folhas de papel 3MM molhadas no ctodo e

sobrepor a membrana de nitrocelulose por cima. Sobrepor o gel de poliacrilamida previamente

equilibrado em tampp de transferncia e colocar mais 6 folhas de papel 3 MM por cima.

(Nota: Ao colocar o gel em cima da membrana deve ter-se o cuidado de evitar que se formem

bolhas entre o gel e a membrana).

- A transferncia deve ocorrer durante cerca de 1 hora a 0.8 mA/cm2.

2 Revelao com anticorpo

Solues:

- PBS (phosphate buffered saline),pH 7.3

- 5% de leite em p em PBS

- 0.1% Tween-20 em PBS- Soluo de cloronaftol : 5 mg p-cloronaftol/ml metanol

- Soluo de revelao (para 6 ml): 5 ml PBS1 ml soluo de cloronaftol2 l H2O2

Nota: a soluo de revelao extempornea. O cloronaftol carcinognico pelo que deve ter-se

o mximo de cuidado ao manusear a soluo de revelao.


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Mtodo:

- Bloquear a membrana em soluo de leite em p a 5% durante 45 min a 37C.

- Lavar a membrana com 1x com PBS.

- Incubar a membrana com um anticorpo anti transtirretina humana produzido em coelho (rabbit

anti-human TTR), diludo 1:1000 em PBS, 1h a 37C

- Lava-se a membrana com :

- PBS, 10 min;

- 0.1% TW -PBS 10 min, duas vezes;

- PBS 10 min.

- Incubar a membrana com anticorpo produzido em carneiro contra imunoglobulinas de coelho

acoplado peroxidase (sheep anti-rabbit immunoglobulins peroxidase conjugate). Usar uma

diluio de 1:5000 em PBS. Incubar 1 h a 37C.

- Colocar a membrana em soluo de revelao e agitar at a cor aparecer.

- Parar a reaco com gua.

Curva de titulao isoelctrica

Material

Soluo de acrilamida: 29.1% acrilamida, 0.9% bisacrilamida. Persulfato de amnio 40%. Anflitos 3.5-10 Soluo do nodo: H3PO4 1 M. Soluo do ctodo: NaOH 1M. Soluo fixadora: 3.5% cido sulfosaliclico, 11.5% cido tricloroactico (TCA). Corante: 0.115% Coomassie blue R-250. Descorante: 10% cido actico, 30% etanol. Tina para focagem isoelctrica. Alimentador de corrente


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Mtodo

1 - Preparar a cassete do gel com uma folha de Gel-Bond, qual o gel vai ficar aderente.

Preparar a soluo do gel:

6.8 ml de acrilamida1.2 ml de anflitosH2O at 20 ml20 l de persulfato de amnio 40%3.4 l de TEMED

2 - Depois do gel ter polimerizado faz-se uma pr-focagem a potncia constante de 12 W

durante 50 min.3 - Cortam-se as pores do gel que contm os electrodos e roda-se o gel 90. Colocam-se novas

tiras de electrodo e paralelamente a estas, a amostra no meio do gel.

4 - A electroforese decorre a voltagem constante de 600 V durante 45 min.

5 - Fixa-se o gel em soluo fixadora 40 min. Lava-se em descorante 10 min. Cora-se o gel a 60C

30 min e descora-se em descorante.


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Trabalho Prtico n5

ENSAIOS IMUNOQUMICOS - Imunoensaio enzimtico (ELISA)

e immunoblotting na deteco e quantificao de transtirretina

Introduo

Os ensaios imunoqumicos baseiam-se na interaco de um anticorpo com um antignio. Um

anticorpo uma protena sintetizada por um animal em resposta presena de uma substncia

estranha, que pode ser uma protena, polissacrido ou cido nucleico, e que se designa por

antignio. Os animais tm uma gama de clulas produtoras de anticorpos, cada uma delas

produzindo um anticorpo com uma determinada especificidade. Um antignio actua estimulando a

proliferao de algumas dessas clulas produtoras de imunoglobulinas. Assim, os anticorpos que

reconhecem uma protena particular podem ser obtidos, por exemplo, injectando essa protena

num coelho duas vezes consecutivas com intervalos de 3 semanas. Algumas semanas mais tarde

recolhe-se sangue do coelho imunizado e centrifuga-se. O soro obtido chamado antisoro e em

geral contem o anticorpo para o antignio que induziu a sua sntese. O anticorpo, ou

imunoglobulina, ento purificado. Estes anticorpos so chamados policlonais pois so produtos

de muitas populaes de clulas diferentes produtoras de anticorpos e diferem apenas na

especificidade e afinidade para o antignio. Os anticorpos reconhecem regies relativamente

pequenas de um antignio designadas por eptopes. Os eptopes de um antignio proteco podem

ser formados por uma sequncia linear de resduos de aminocidos ou por sequncias no

contguas que se encontram enroladas e prximas na estrutura tridimensional superfcie do

antignio. Isso permite que os anticorpos reconheam protenas relacionadas, com eptopes

semelhantes, no entanto, isso no implica uma relao funcional entre essas protenas. Esta

tambm a base molecular das reaces cruzadas (reaces com antignios para os quais o

anticorpo no foi produzido especficamente).

A interaco de um anticorpo com um antignio baseia-se em ligaes no covalentes

ocorrendo o complexo em equlibrio com o antignio e o anticorpo livres. Estas interaces no

covalentes incluem ligaes de hidrognio, foras de van der Waals, interaces hidrofbicas e

electrostcticas entre tomos das cadeias laterais dos aminocidos e tomos das cadeia principal.Os anticorpos podem distinguir protenas muito semelhantes podendo ser usados para detectar e


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quantificar uma protena ou outro antignio. Pequenas alteraes na estrutura do antignio so

suficientes para para afectar a fora da interaco antignio - anticorpo.

A - IMUNOENSAIO ENZIMTICO - ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) -

deteco e quantificao de transtirretina

O imunoensaio enzimtico (ELISA) um ensaio de ligao que tem como base a reaco

antignio-anticorpo e tem acoplada uma reaco enzimtica como marcador.

Os imunoensaios em fase slida podem ser realizados de diferentes formas sendo

designados como ELISA directo ou ELISA de sandwich (Fig.1). No ELISA directo o antignio

imobilizado numa microplaca, suporte polimrico com capacidade para adsorver protenas. Depois

de remover o excesso de amostra adiciona-se o anticorpo especfico para o antignio que se

pretende detectar, para que se forme o complexo antignio-anticorpo. Depois de retirar o

excesso de anticorpo, o que no se ligou especficamente, adiciona-se um anticorpo secundrio

capaz de se ligar ao anticorpo primrio e que est acoplado a uma enzima, em geral a peroxidase.

Depois de se retirar o excesso de anticorpo adiciona-se o substracto (incolor) para a enzima que

aps reaco dever originar um produto corado que ser quantifcado

espectrofotometricamente. A quantidade de produto ser proporcional quantidade de antignio

na soluo teste. Alternativamente pode realizar-se o ELISA de sandwich em que o primeiro

passo a imobilizao de um anticorpo (anticorpo de captura) para o antignio que se pretende

detectar. Em seguida adiciona-se a soluo teste que dever conter o antignio. Depois de retirar

o excesso adiciona-se um segundo anticorpo para esse antignio, que tenha sido produzido num

organismo diferente do anticorpo de captura. O passo seguinte a adio de um anticorpo

secundrio acoplado a uma enzima A deteco ento feita de modo semelhante ao ELISA

directo. Estes ensaios, extremamente sensveis, so capazes de detectar menos de um nanograma

de protena.


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Fig.1 - ELISA mtodo directo e de sandwich.(de Biochemistry, L. Stryer, 5th ed., 2004).

Deteco e quantificao de transtirretina por ELISA

A transtirretina uma protena que existe no plasma a uma concentrao de cerca de

0.2- 0.3 mg/ml.O anticorpo anti-transtirretina (TTR) usado neste trabalho um anticorpo comercial

preparado a partir de um antisoro de coelhos imunizados com TTR humana pura. O soro foi

deslipidado e a fraco imunoglobulinica separada por cromatografia de troca inica. A

especificidade deste anticorpo foi depois testada por diferentes tcnicas incluindo

imunoelectroforese. A concentrao do anticorpo foi determinada por densidade ptica a 280nm.

O segundo anticorpo tambm um anticorpo policlonal produzido em carneiros imunizados

com imunoglobulinas de coelho e que foi ligado covalentemente a uma peroxidase. Comosubstractos para esta enzima usamos o perxido de hidrognio sendo o cromognio o ABTS

(2,2azino-di-(3-ethylbenzothialzoline sulphonate)). O produto da reaco, de cor verde,

quantificado por leitura de densidade ptica a 405 nm.


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Parte Experimental

Materiais e reagentes

Microplacas para imunoensaio Pipetas automticas Soluo de transtirretina humana Anticorpo anti-transtirretina produzido em coelho Anticorpo conjugado anti-imunoglobulina de coelho-peroxidase Tampo de adsoro placa (coating): 15 mM Na2CO3 (1,59 g/L), 35 mM NaHCO3 (2,93

g/L), pH 9.5 Tampo de bloqueamento da placa: 5% de leite em p em PBS PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.3. Tampo de lavagem: PBS, 0.05% Tween-20 Soluo de substracto: 1 ml de tampo citrato-fosfato ( 56.5 mM cido ctrico, 66.7 mMNa2HPO4), 0.5 ml de soluo de ABTS (2,2azino-di-(3-ethylbenzothialzoline sulphonate))

2%, 10 L de H2O2 para um volume total de 10 mL

Mtodo

1- Preparar as amostras com o antignio para aplicar na microplaca. Preparar vrias diluies de

transtirretina em tampo de adsoro (coating)para estabelecer uma curva padro. Aplicar 100 lde cada diluio por poo. Num dos poos aplicar apenas 100 l de coating (branco). Aplicar as

amostras a analisar em tampo de coating.

2- Aplicar 100 l por poo, tanto as amostras como as diferentes diluies devem ser aplicadas

em duplicado. Incubar 1h a 37C ou durante a noite a 4C.

3- Retirar o excesso e lavar os poos 1 vez com PBS.

4- Bloquear os poos com 100 l de soluo de bloqueamento, 30 min a 37C.

5 - Retirar o excesso e lavar a placa com PBS, PBS-TW e PBS respectivamente..6 - Adicionar 100 l do anticorpo anti-transtirretina (produzido em coelho), diluido 1: 5000 a

cada poo e incubar 45-60 min a 37C.

9 - Retirar o excesso e lavar os poos.

10 - Adicionar 100 l de anti- Ig coelho conjugado com peroxidase diludo 1:5000.

11 - Adicionar 100 l/poo de soluo de substracto incubar 10-15 min temperatura ambiente.

12 - Parar a reaco com 50l/poo de H2SO4 2M.

13- Ler a densidade ptica a 405 nm, em cada poo, num leitor de placas.


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Trabalho Prtico n6

Purificao da transtirretina recombinante por cromatografia deafinidade

Introduo

Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade baseia-se principalmente na actividade biolgica das protenas,mais precisamente em interaces especficas que estas possam estabelecer com outras

molculas. Estas interaces podem ser de natureza electrosttica, hidrofbica, foras de van

der Waals e/ou ligaes de hidrognio. Um processo de purificao por afinidade requer a

existncia de um ligando bioespecfico que possa ser ligado covalentemente a uma matriz

cromatogrfica. As amostras so aplicadas em condies que favorecem a ligao especfica ao

ligando. As substncias de interesse so consequentemente ligadas ao ligando enquanto as

substncias que no se ligam so lavadas da coluna. O ligando imobilizado deve manter a suaactividade especfica para a molcula alvo e aps lavagem do material no ligado a ligao entre o

ligando e a molcula alvo deve poder ser revertida para que as molculas ligadas possam ser

eludas na sua forma activa. Para a recuperao das molculas de interesse, eluio da molcula

alvo do meio de afinidade, necessrio reverter a interaco, quer especificamente usando um

ligando competitivo quer no especificamente, por alterao do pH, fora inica ou polaridade.

Em seguida apresentam-se algumas interaces biolgicas tpicas que podem ser usadas neste

tipo de cromatografia:

Enzimas - anlogos dos substratos, inibidores, cofactores

Anticorpos - antignios, vrus, clulas

Lectinas - polissacridos, glicoprotenas, receptores da superfcie celular, clulas

cidos nucleicos - sequencias de bases complementares, histonas, polimerases de acidos

nucleicos, protenas de ligao aos cidos nucleicos.

Hormonas, Vitaminas - receptores, protenas transportadoras

Glutationa - glutationa -S-transferase ou protenas de fuso com GST


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Ies metlicos - protenas de fuso com poly(His), protenas nativas com resduos de

histidina, cistena e/ou triptofano na sua superfcie.

A cromatografia de afinidade pode tambm ser utilizada para remover um contaminante

especfico. A grande selectividade da cromatografia de afinidade torna possvel que muitas

separaes sejam conseguidas num s passo de purificao. como por exemplo o isolamento de

anticorpos monoclonais ou de protenas de fuso.

Acoplamento de um ligando atravs de grupos amina primrios

A Sepharose NHS-activada permite o acoplamento covalente de ligandos que contm grupos

amino primrios (uma das formas mais comuns de acoplamento). A matriz baseia-se num gel de

agarose altamente cross-linked com braos de espaamento (spacer-arms) de 10 tomos (cido 6-

aminobenzoico) activada por N-hydroxisuccinimida. A adsoro no especfica de protenas a esta

matriz muito baixa devido grande hidrofilicidade da base da matriz. A matriz estvel a pH

alto permitindo o acoplamento especfico e lavagens fortes do ligando no adsorvido.

Os ligandos contendo grupos amina ligam-se rpida e facilmente por ataque nucleoflico da ligao

ester para originar uma ligao amida muito estvel permitindo a utilizao de pHs muito altos,

at 13, o que faz com que esta tcnica seja muito utilizada para sistemas que exigem esta gamade pH (fig. 1).

Fig. 1 Acoplamento de um ligando a Sepharose NHS-activada


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A Sepharose CNBr activada tem caractersticas semelhantes Sepharose NHS-activada. O

CNBr reage com os grupos hidroxilo da Sepharose para formar esteres de cianato (fig. 2).

Fig. 2 Activao pelo CNBr e acoplamento matriz activada.

Protenas, pptidos e aminocidos podem ser acoplados Sepharose CNBr-activada em condies

moderadas atravs dos grupos amino primrios ou de grupos nucleoflicos semelhantes. Os grupos

activados reagem com grupos amino primrios no ligando para formar ligaes de isoureia.. A

reao de acoplamento espontnea e no requer condies especiais em termos qumicos ou de

equipamento. A ligao matriz atravs de vrios pontos assegura que o ligando no vai hidrolizarfacilmente da matriz.

Trabalho prtico

Neste trabalho prtico pretende-se preparar uma coluna para cromatografia de afinidade que

permita purificar a transtirretina produzida em bactrias. Para isso vai-se acoplar um anticorpo

produzido em coelho contra a transtirretina humana a uma coluna de Sepharose NHS-activada(HiTrap NHS-activated affinity column Amersham Biosciences) de acordo com as instrues

do fornecedor. Em seguida vai-se aplicar uma soluo de TTR produzida em E. coli e isolada por

cromatografia de troca inica em DEAE-celulose. Lava-se a coluna com tampo fosfato a pH 7.4

(PBS - phosphate buffer saline). A TTR ligada coluna ser depois eludo por diminuio do pH

(tampo glicina pH 2.7). A eluio dever ser monitorizada por leitura da densidade ptica das

fraces. A eficincia do mtodo deve depois ser confirmada por anlise das fraces por

electroforese em SDS-PAGE.


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Procedimento

1. A coluna HiTrap fornecida j se encontra acoplada com um anticorpo anti TTR produzido emcoelho (rabbit anti-human transthyretin immunoglobulins - Dako).

2.Equilibre a coluna com PBS.

3. Aplique 1 mL da soluo de TTR produzida em bactria e isolada por cromatografia de trocainica (DEAE-celulose) coluna de afinidade com uma seringa, lentamente tentando no

ultrapassar um fluxo de 1 mL / min.

4. Lave a coluna com cerca de 5 10 mL de PBS, ou at que a densidade ptica a 280 nm sejamuito baixa).

5. Elua a TTR com soluo tampo de glicina-HCl 0.1 M pH 2.7. Para minimizar o tempo deexposio da protena ao pH cido deve recolher as fraces da coluna de cerca de 1 mL para

tubos contendo cerca de 100 L de tampo Tris 1 M pH 8.5. Elua a TTR com cerca de 4-5 mL

de tampo glicina pH 2.7. Verifique a eluio por leitura da OD a 280 nm ou por fluorescncia.

6. Equilibre a coluna novamente com PBS (cerca de 5 mL).Analise as fraces obtidas por electroforese de SDS-PAGE.

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