ETI-EBV-M reverse(P001605)

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TESTE IMUNOENZIMÁTICOPARA IgM ANTI-ANTIGÉNIO DO CAPSÍDEO

DO VÍRUS DE EPSTEIN-BARR

Procedimento para a determinação quantitativa/qualitativados anticorpos IgM dirigidos contra

o antigénio do capsídeo do vírus de Epstein-Barrem amostras de soro ou plasma humano

Só para uso in vitro

1. INTRODUÇÃOO vírus de Epstein-Barr (EBV) é o agente patogénico responsável pela mononucleose in-fecciosa (MI) e está envolvido no linfoma africano de Burkitt (LB), no carcinoma nasofa-ríngeo (CNF) e na síndroma linfo-proliferativa ligada ao cromossoma X (LPX). O vírusEBV é um dos sete herpesvírus patogénicos para o homem. Como a sua difusão é ubiq-uitária, infecta com aproximação 95% dos indivíduos durante sua vida em todo o mundo.O ADN do EBV é composto por uma cadeia dupla com cerca de 172 kbases de compri-mento.O EBV transmite-se principalmente por via oral. O vírus EBV efectua sua replicação noepitélio orofaríngeo e é liberado na saliva pelos linfócitos B infectados. Durante a infân-cia, a infecção primária por EBV em geral é assintomática. Durante a adolescência ou aidade adulta, contrai-se, em geral, uma mononucleose infecciosa sintomática. Após a in-fecção primária, o vírus fica latente durante toda a vida.O diagnóstico da mononucleose infecciosa baseia-se nos sintomas (caracterizados pordor de garganta, febre, linfadenite mal-estar geral), associados a manifestações hema-tológicas (linfocitose) e serológicas (presença de anticorpos heterófilos circulantes e/ouanticorpos dirigidos contra as proteínas específicas do EBV). Vários agentes patogénicos de doenças infecciosas podem provocar sintomatologia se-melhante a da mononucleose infecciosa como, por exemplo, citomegalovírus, Toxo-plasma gondii, vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência humana (HIV) e outros. Em-prega-se, em geral, o termo síndroma de mononucleose enquanto não for identificado oagente etiológico específico. Em geral, o diagnóstico de mononucleose infecciosa agudapor EBV é confirmado com um teste para anticorpos heterófilos (aglutinação de hemá-cias ovinas ou equinas pelo soro do doente). Todavia, é possível que seja difícil estabe-lecer um diagnóstico, quando o teste para anticorpos heterófilos for negativo ou a sin-tomatologia é atípica.A mononucleose infecciosa negativa ao teste para anticorpos heterófilos é verificada em10-20% dos adultos e, em percentagem ainda mais elevada, em crianças com mononu-cleose infecciosa aguda. Pode-se confirmar o diagnóstico de mononucleose infecciosanesses doentes, detectando-se os anticorpos dirigidos contra proteínas específicas deEBV, como o antigénio do capsídeo vírico (viral capsid antigen, VCA) e o antigénio pre-coce difuso [early antigen-diffuse, EA(D)]. A presença de anticorpos da classe IgM anti-VCA é essencial para estabelecer um diagnóstico de mononucleose infecciosa aguda.Recomenda-se, entretanto, uma verificação da presença de anticorpos confirmadores –tais como IgG anti-EA(D), ou IgG ou IgM anti-EBNA-1 predominantes – e uma verifi-cação com informações clínicas suplementares. A presença de IgM anti-VCA e de níveistransitórios de IgG anti-EA(D) em amostras negativas para anticorpos heterófilos é con-siderada suficiente para formular um diagnóstico de mononucleose infecciosa aguda. Os testes serológicos para as infecções por EBV permitem detectar respostas imunitá-rias características em função do tempo. Sob o ponto de vista serológico, há uma in-fecção primária por EBV quando se tem um aparecimento precoce de IgM anti-VCAcircu-lante e, a seguir, uma diminuição até níveis não detectáveis. Quase ao mesmo

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tempo, observa-se uma elevação dos níveis de IgG anti-VCA. A maior parte (> 80%) dosdoentes sintomáticos afectados pela mononucleose infecciosa apresenta níveis muito el-eva-dos de IgG e de IgM anti-VCA no primeiro teste. A IgM anti-VCA desaparece dacirculação no decorrer de dois ou três meses após o início da doença, ao passo que aIgG permanece de maneira indefinida nos indivíduos normais. A maioria dos doentesdesenvolve anticorpos anti-EA(D) de maneira transitória, mas a IgG anti-antigénio nucle-ar do vírus de Epstein-Barr (Epstein-Barr nuclear antigen, EBNA) aparece na circulaçãovárias semanas ou até vários meses após o ínicio da doença e persiste durante anos, oumesmo por toda a vida. Nos doentes sintomáticos afectados pela mononucleose infecci-osa, a detecção da IgG anti-EBNA, em combinação com a da IgM e IgG anti-VCA é útilpara diferenciar o estágio precoce da convalescença da fase aguda da doença. Uma el-evação dos níveis da IgG anti-EBNA pode indicar uma passagem da mononucleoseinfecciosa de convalescença precoce a avançada. Uma elevação dos níveis de IgG anti-VCA indica a fase aguda da infecção, assim como uma elevação dos níveis de IgM anti-VCA pode indicar a passagem da fase de incubação à fase aguda da doença. De igualmaneira, uma diminuição dos níveis de IgM anti-VCA pode indicar a passagem da faseaguda da infecção à fase de remissão. Nos indivíduos adultos sadios, a presença de IgGanti-EBNA indica que foram expostos ao EBV; a presença de IgG anti-VCA indica queforam expostos ao EBV, tanto sob forma duma infecção primária subclínica, como dumainfecção sintomática.Em virtude das relações complexas que existem entre a reacção do hospedeiro ao vírusEBV e a sintomatologia, o acompanhamento da evolução dos níveis de anticorpos anti-EBV pode ser útil para o diagnóstico de infecção por EBV. Os respectivos níveis dos an-ticorpos específicos não são forçosamente os marcadores da doença, mas podem ter umsignificado diagnóstico quando monitoram-se os perfís das respostas imunitárias. Osperfís das respostas imunitárias para os vários antigénios de EBV demostram uma ev-olução característica para a infecção primária subclínica, para a infecção latente persis-tente e para cada uma das infecções associadas ao EBV. O dispositivo utiliza o péptido sintético p18, um componente principal específico do com-plexo antigénico do capsídeo vírico, identificado e caracterizado recentemente. O pép-tido é composto de 56 resíduos de aminoácidos codificados pelo registo de leitura (openreading frame, ORF) BFRF3 e contém epítopos da proteína p18 seleccionados entre osimunodominantes, capazes de detectar o VCA com alta sensibilidade e especificidade. Aexpressão do antigénio VCA está associada à fase de revestimento do genoma víricocom as glicoproteínas do capsídeo, que ligam os vírus aos receptores celulares. Estasglicoproteínas são fortemente antigénicas e estimulam a síntese de anticorpos neutrali-zantes dirigidos contra o vírus.O teste serve para diagnosticar as infecções por EBV primárias ou reactivadas. A avalia-ção da IgM anti-VCA nas amostras recolhidas em sequência permite determinar o está-gio da infecção primária por EBV.

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2. PRINCÍPIO DO ENSAIOO método imunoenzimático para a determinação quantitativa/qualitativa de IgM específi-ca anti-antigénio do capsídeo do vírus de Epstein-Barr (péptido sintético p18) é um testeimunométrico de captura de anticorpos, baseado na técnica de ELISA (Enzyme-linkedImmunosorbent Assay), cujo esquema é ilustrado na Fig. 1.

Fig. 1

➀ Poço revestido com IgG (monoclonal de ratinho) anti-IgM humana.➁ Amostra ou calibrador: IgM anti-p18.➂ Péptido sintético p18 do VCA.➃ Conjugado enzimático: IgG (monoclonal de rato) anti-p18 conjugada com peroxidase

de rábano (HRP).

A presença de IgM específica anti-p18 permite que o conjugado ligue-se à fase sólida at-ravés da presença do péptido sintético p18 do VCA. A actividade enzimática é, portanto,proporcional à concentração de IgM anti-p18 presente nas amostras ou nos calibra-dores.A actividade enzimática é medida pela adição duma solução incolor de cromogénio/sub-estrato. A acção da enzima no cromogénio/substrato produz uma coloração que é med-ida por um fotómetro.

2

3

+

1

4

+

incubação (1 hora a 37°C)

lavagem

cromogénio/substrato

leitura no fotómetro a 450/630 nm e 405/630 nm.

incubação(30 min à T.A.)

solução de paragem

incubação (1 hora a 37°C)

lavagem

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3. REAGENTES E ACESSÓRIOS

3.1. Reagentes fornecidos no dispositivo

ARMAZENAGEM: Depois da recepção, armazene todos os reagentes a 2-8°C, ao abrigoda luz. Não congele. Após a abertura, os reagentes deste dispositivo permanecem es-táveis durante 12 semanas, se mantidos de modo adequado, salvo indicação em contrá-rio. O dispositivo é estável durante uma semana útil se utilizado oito horas por dia à tem-peratura ambiente e conservado durante a noite a 2-8°C.Não utilize reagentes expirados. O prazo de validade do dispositivo está descrito na et-iqueta externa. O prazo de validade de cada reagente está descrito na etiqueta de cadafrasco.Não misture reagentes específicos (veja §4.a) de lotes diferentes. Reagentes comuns(veja §4.b) podem ser trocados entre os diferentes lotes.

3.2. Materiais fornecidos com o dispositivo– 2 adesivos autocolantes pré-cortados para tiras– 2 adesivos autocolantes inteiros para 12 tiras (uma placa)– selador da embalagem das tiras.

3.3. Equipamentos e material necessários, mas não fornecidos– Fotómetro de leitura vertical (como o leitor ETI-SYSTEM ou equivalente) com as seg-

uintes especificações:comprimento de onda: comprimento de onda triplo, 405, 450 nm e 620-630 nmlargura de banda: ≤ 10 nm faixa de absorvância: de 0 a ≥ 2 unidades de absorvânciarepetibilidade: melhor ou igual a 0,005 unidades de absorvância, ou 1%, depende dequal opção é maiorlinearidade ou exactidão: melhor ou igual a 0,010 unidades de absorvância, ou 2%,depende de qual opção é maiorfluctuação: menos de 0,005 unidades de absorvância por hora.

– Câmara húmida com termóstato (estufa) com as seguintes especificações:temperatura: 37°C ± 1°C.

– Lavador manual ou automático dos poços (como o lavador ETI-SYSTEM ou equiva-lente) com as seguintes especificações:volume distribuído: 300-370 µLnúmero de ciclos de lavagem: 5tempo de espera: 30 segundosaspire a última alíquota de líquido distribuído: sim.

– Micropipetas com pontas descartáveis de 10 µL (exactidão ± 3%, precisão 2%) e 100,200, 1000 µL (exactidão ± 2%, precisão 1%).

– Agitador Vortex.– Tubos descartáveis de plástico.– Suporte para tubos.

Tiras sensibilizadas 12 tiras x 8 poços separáveisConjugado enzimático 1 frasco, 0,6 mLCalibradores 4 frascos, 2,5 mLDiluente do conjugado 4 frascos, liofilizadoSolução de reconstituição 1 frasco, 25 mLDiluente das amostras 2 frascos, 50 mLTampão de lavagem 1 frasco, 40 mLCromogénio/substrato 1 frasco, 16 mLSolução de paragem 1 frasco, 30 mL

Número de testes 96

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– Material de vidro.– Água destilada.Os equipamentos ETI-STAR, ETI-LAB, ETI-MAX 3000 ou OMNI SYSTEM podem ser us-ados para o processamento automático dos testes.

4. COMPOSIÇÃO E PREPARAÇÃO DOS REAGENTESTodas as unidades de soro e plasma utilizadas para produzir os componentes deste dis-positivo foram testadas para a presença de HBsAg, anti-HCV e anti-HIV-1/2 e os resulta-dos encontrados foram não reactivos. Contudo, como nenhum método pode oferecersegurança absoluta de que agentes patogénicos estejam ausentes, todas as amostrasde origem humana devem ser consideradas potencialmente infecciosas e manuseadascom cuidado.

a) REAGENTES ESPECÍFICOS DO DISPOSITIVO

4.1. Tiras sensibilizadas Os poços separáveis são revestidos com IgG (monoclonal de ratinho) anti-IgM humana(específica para as cadeias µ). Os poços estão prontos a usar e devem ser armazena-dos a 2-8°C. Deixe os poços à temperatura ambiente antes de abrir a embalagem para evitar conden-sação de água. Coloque os poços não utilizados na embalagem, feche hermeticamentee mantenha a 2-8°C por oito semanas.

4.2. Conjugado enzimático (50x) O frasco contém 0,6 mL duma solução de IgG (monoclonal de rato) anti-péptido sintéticop18 do VCA conjugada com peroxidase de rábano (HRP), tampão MES, albumina séricabovina, estabilizantes e conservantes.Antes de usar, dilua a solução a 1:50 com o diluente do conjugado reconstituído (4.4)(ex. 100 µL de conjugado + 4,9 mL de diluente do conjugado). Prepare apenas a quanti-dade de conjugado necessária para o ensaio e mantenha o conjugado enzimático con-centrado a 2-8°C. Não utilize a solução se esta estiver turva.O conjugado enzimático diluído não pode ser armazenado e deve ser utilizado 10 minapós a preparação.

4.3. Calibradores Cada frasco contém 2,5 mL duma solução de soro humano contendo IgM anti-péptidosintético p18 do VCA, diluído em tampão PBS, albumina sérica bovina, estabilizantes econservantes. As concentrações dos calibradores são as seguintes: 5 - 20 - 80 - 140UA/mL, onde UA é um valor arbitrário definido em relação a uma preparação de anticor-po de referência. O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2-8°C. Nãoutilize as soluções se estas estiverem turvas.

4.4. Diluente do conjugadoCada frasco contém o péptido sintético p18 do VCA liofilizado, tampão MES, albuminasérica bovina, IgG de rato, estabilizantes e conservantes. Antes de usar, reconstitua o conteúdo de cada frasco com 5 mL de solução de reconsti-tuição (4.5), deixe descansar por 10 min à temperatura ambiente e agite devagarinhoevitando a formação de espuma. A solução resultante é usada para diluir o conjugadoenzimático (4.2). Após a reconstituição, o reagente pode ser conservado durante quatrosemanas a 2-8°C. Não utilize a solução se esta estiver turva.

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4.5. Solução de reconstituiçãoO frasco contém 25 mL de água desmineralizada e conservantes. O reagente está pron-to a usar e deve ser armazenado a 2-8°C. A solução é utilizada para reconstituir o con-teúdo do frasco de diluente do conjugado (4.4).

b) REAGENTES COMUNS AOS DISPOSITIVOS EBV

4.6. Diluente das amostras Cada frasco contém 50 mL duma solução de tampão PBS, albumina sérica bovina, TritonX-705, Tween® 20, estabilizantes, conservantes e um corante vermelho inerte. O rea-gente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2-8°C. A solução é usada para diluiras amostras.

4.7. Tampão de lavagem (25x) O frasco contém 40 mL duma solução de tampão PBS, Tween® 20 e conservantes.Antes de usar, dilua o conteúdo do frasco num litro de água destilada. O tampão de lav-agem de uso é estável durante uma semana a 2-8°C e é utilizado para lavar os poços.Não utilize a solução se esta estiver turva.Quando a solução concentrada de tampão de lavagem é armazenada a 2-8°C, como nodispositivo ainda fechado, pode ocorrer cristalização; neste caso, aqueça o tampão a37°C e misture bem antes de diluir.

4.8. Cromogénio/substratoO frasco contém 16 mL dum sistema formado por tetrametilbenzidina e peróxido de hid-rogénio. O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2-8°C, ao abrigo daluz.A solução deve ser incolor ou ter um tom levemente azulado. Se a mistura cromogénio/substrato adquirir um tom de azul mais intenso, pode ter sido contaminada e deve sereliminada.

4.9. Solução de paragem O frasco contém 30 mL duma solução de ácido sulfúrico 0,4 N. O reagente está prontoa usar e deve ser armazenado a 2-8°C. A solução de paragem está definida como irritante na lei norte-americana (29 CFR1910.1200, Ap. A). Não é uma substância tóxica ou nociva em conformidade com a Di-rectiva do Conselho 99/45/CE.

5. COLHEITA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRASPode-se utilizar tanto soro como plasma humano para o teste. Os anticoagulantes citratode sódio, EDTA e heparina foram testados e podem ser utilizados neste teste. O sanguedeve ser colhido assepticamente por punção venosa, deixado coagular e o soro deve serseparado do coágulo tão cedo quanto possível. As amostras que contêm partículas sól-idas, turvas, l ipémicas ou com fragmentos de er i t róc i tos podem necess i tar declarificação por filtragem ou centrifugação antes de serem testadas. As amostras muitohemolisadas ou lipémicas, bem como as amostras que contêm partículas sólidas ou queexibem evidente contaminação bacteriana, não devem ser utilizadas. Se o ensaio for re-alizado dentro de 48 horas após a colheita das amostras, estas podem ser conservadasa 2-8°C. Em caso contrário, estas devem ser subdivididas em alíquotas e congeladasa –20°C ou a temperatura inferior. Se as amostras estiverem congeladas, deixe-asdescongelar e misture bem antes de utilizar. Evite ciclos repetidos de congelação edescongelação.

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Diluição das amostrasAs amostras devem ser diluídas a 1:101 com o diluente das amostras (4.6) antes doteste. Distribua 10 µL de amostra e 1 mL de diluente das amostras nos respectivos tubospara obter uma diluição a 1:101 e utilize um agitador Vortex para garantir uma misturahomogénea.Os calibradores estão prontos a usar e não devem ser diluídos.

6. PROCEDIMENTO PARA O TESTE QUANTITATIVODeixe todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25°C) antes do teste.Execute todas as etapas do teste na ordem apresentada, sem muita demora entre cadaetapa.Numere poços suficientes para efectuar o teste em duplicado dos calibradores e sim-ples das amostras. Os calibradores devem ser testados em cada placa de amostras dedoentes. Os calibradores e as amostras devem ser submetidos ao mesmo processo etempo de incubação.Prepare um poço livre para a determinação do valor do branco do substrato devido aoreagente cromogénio/substrato.Utilize uma ponta descartável para dispensar cada calibrador e amostra.Identifique os poços dos calibradores e das amostras numa folha de dados. Distribua oscalibradores e as amostras segundo o esquema abaixo:

Ajuste a temperatura da estufa a 37° ± 1°C.1. Distribua 100 µL de calibradores e amostras diluídas nos respectivos poços, ex-

cepto no branco.2. Aplique o adesivo autocolante para evitar evaporação. Bata devagarinho nos poços

de reacção para eliminar qualquer bolha de ar no líquido.3. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.

Legenda: = poço CAL = calibradoresBLK = branco S = amostras.OO

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4. Prepare a solução de conjugado enzimático diluído (4.2 + 4.4) no final da primeiraincubação.

5. Quando completar a incubação, remova e elimine o adesivo autocolante e lave as ti-ras com um equipamento automático ou semi-automático adequado: aspire o líquidoe lave os poços cinco vezes com um volume de tampão de lavagem variável entre0,30 e 0,37 mL. Evite trasbordamentos dos poços de reacção. Independentementeda utilização dum lavador automático ou semi-automático, o tempo de espera entrecada ciclo de lavagem deve ser de 30 segundos.Após a lavagem, inverta as tiras sobre um papel absorvente e bata devagarinho pararemover o excesso de líquido dos poços. Deixe as tiras invertidas sobre o papel atéter lavado todas para evitar evaporação.

6. Distribua 100 µL de conjugado enzimático diluído em todos os poços, excepto nobranco. Repita a etapa 2.

7. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.8. Repita a etapa 5.9. Distribua 100 µL de cromogénio/substrato em todos os poços.10. Incube durante 30 ± 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da luz intensa.11. Distribua 200 µL de solução de paragem em todos os poços na mesma ordem us-

ada para dispensar o cromogénio/substrato e com os mesmos intervalos de tempo.12. Meça a absorvância da solução contida em cada poço a 450/630 nm e 405/630 nm

dentro de uma hora após a adição da solução de paragem.Os equipamentos ETI-STAR, ETI-LAB, ETI-MAX 3000 ou OMNI SYSTEM podem ser us-ados para o processamento automático dos testes.

7. CÁLCULO DOS RESULTADOS PARA O TESTE QUANTITATIVOQuando são utilizados os equipamentos adequados, os valores de absorvância são for-necidos em automático ao seleccionar o protocolo correcto. Quando um fotómetro deleitura vertical diferente é utilizado, calibre o instrumento com o poço do branco, leia asabsorvâncias do conteúdo dos poços com os comprimentos de onda de 450/630 nm e405/630 nm e subtraia o valor de absorvância a 630 nm dos calibradores e das amostrasdos valores de absorvância a 450 nm e 405 nm. Os valores de absorvância a 450 nm que são superiores à capacidade de leitura lineardo fotómetro devem ser normalizados a valores de absorvância equivalente a 450 nm. Ovalor de absorvância equivalente a 450 nm para uma amostra é obtido multiplicando ovalor de absorvância a 405 nm daquela amostra por 3,2.

Exemplo de cálculoOs seguintes dados devem ser considerados apenas como exemplo e não devem ser us-ados no lugar dos dados obtidos pelo utilizador.

Descrição Absorvânciaa 450/630 nm

Absorvânciaa 405/630 nm

Calibrador 1 (5 UA/mL) 0,065 0,020

Calibrador 2 (20 UA/mL) 0,451 0,141

Calibrador 3 (80 UA/mL) 1,728 0,540

Calibrador 4 (140 UA/mL) 3,037 0,949

Amostra 1 2,036 0,636

Amostra 2 2,650 0,828

91

7.1. Critérios de validação do ensaioAs instruções abaixo devem ser usadas para validar o ensaio. Calcule e avalie sempreas absorvâncias médias dos calibradores de cada placa, mesmo que estas pertençam aomesmo lote.O valor de absorvância do poço do branco deve estar entre 0,000 e 0,150:0,000 ≤ BLK ≤ 0,150.A absorvância média do calibrador 1 deve ser menor que 0,150:Cal 1 < 0,150.A razão entre a absorvância média do calibrador 4 e a absorvância média do calibrador2 deve ser maior ou igual a 4:Cal 4 / Cal 2 ≥ 4.Caso contrário, o teste é inválido e deve ser repetido.

7.2. Interpolação dos resultadosValide sempre o ensaio quando avaliar os resultados (veja par. 7.1, Critérios de vali-dação do ensaio).Quando um fotómetro de leitura vertical é utilizado, coloque as coordenadas em papellinear-linear e faça a curva utilizando a ordenada (eixo dos y) para o valor médio de ab-sorvância de cada calibrador em função da concentração de IgM anti-VCA expressa emUA/mL na abscissa (eixo dos x).Desta forma, obtém-se uma curva de calibração. Directamente da curva de calibração,leia as concentrações de anticorpo expressas em UA/mL. Um valor em UA/mL maior ouigual ao do calibrador 2 indica a presença de IgM anti-VCA. Um valor em UA/mL menorque o do calibrador 2 indica níveis não detectáveis de IgM anti-VCA.Pela interpolação da curva de calibração, as amostras resultan conter 94 UA/mL y 122UA/mL de IgM anti-VCA e são, portanto, consideradas positivas.As amostras com concentrações de IgM anti-VCA dentro da faixa de ± 10% do valor lim-ite devem ser retestadas para confirmar o resultado inicial. As amostras repetidamentereactivas devem ser consideradas positivas. As amostras não reactivas no segundoteste devem ser consideradas negativas. Se o resultado sucessivo à repetição do testefor confirmado como duvidoso, é necessário recolher uma amostra nova depois duas outrês semanas e repetir o teste.

8. PROCEDIMENTO PARA O TESTE QUALITATIVODeixe todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25°C) antes do teste.Execute todas as etapas do teste na ordem apresentada, sem muita demora entre cadaetapa.Numere poços suficientes para efectuar o teste simples dos calibradores 1 e 4, emtriplicado do calibrador 2 e simples das amostras. Os calibradores devem ser testa-dos em cada placa de amostras de doentes. Os calibradores e as amostras devem sersubmetidos ao mesmo processo e tempo de incubação.Prepare um poço livre para a determinação do valor do branco do substrato devido aoreagente cromogénio/substrato.Utilize uma ponta descartável para dispensar cada calibrador e amostra.Identifique os poços dos calibradores e das amostras numa folha de dados. Distribua oscalibradores e as amostras segundo o esquema abaixo:

x

x x

92

Ajuste a temperatura da estufa a 37° ± 1°C.1. Distribua 100 µL de calibradores e amostras diluídas nos respectivos poços, ex-

cepto no branco.2. Aplique o adesivo autocolante para evitar evaporação. Bata devagarinho nos poços

de reacção para eliminar qualquer bolha de ar no líquido.3. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.4. Prepare a solução de conjugado enzimático diluído (4.2 + 4.4) no final da primeira

incubação.5. Quando completar a incubação, remova e elimine o adesivo autocolante e lave as ti-

ras com um equipamento automático ou semi-automático adequado: aspire o líquidoe lave os poços cinco vezes com um volume de tampão de lavagem variável entre0,30 e 0,37 mL. Evite trasbordamentos dos poços de reacção. Independentementeda utilização dum lavador automático ou semi-automático, o tempo de espera entrecada ciclo de lavagem deve ser de 30 segundos.Após a lavagem, inverta as tiras sobre um papel absorvente e bata devagarinho pararemover o excesso de líquido dos poços. Deixe as tiras invertidas sobre o papel atéter lavado todas para evitar evaporação.

6. Distribua 100 µL de conjugado enzimático diluído em todos os poços, excepto nobranco. Repita a etapa 2.

7. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.8. Repita a etapa 5.9. Distribua 100 µL de cromogénio/substrato em todos os poços.10. Incube durante 30 ± 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da luz intensa.11. Distribua 200 µL de solução de paragem em todos os poços na mesma ordem us-

ada para dispensar o cromogénio/substrato e com os mesmos intervalos de tempo.12. Meça a absorvância da solução contida em cada poço a 450/630 nm e 405/630 nm

dentro de uma hora após a adição da solução de paragem.

Legenda: = poço CAL = calibradoresBLK = branco S = amostras.OO

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Os equipamentos ETI-STAR, ETI-LAB, ETI-MAX 3000 ou OMNI SYSTEM podem ser us-ados para o processamento automático dos testes.

9. CÁLCULO DOS RESULTADOS PARA O TESTE QUALITATIVOQuando são utilizados os equipamentos adequados, os valores de absorvância são for-necidos em automático ao seleccionar o protocolo correcto. Quando um fotómetro deleitura vertical diferente é utilizado, calibre o instrumento com o poço do branco, leia asabsorvâncias do conteúdo dos poços com os comprimentos de onda de 450/630 nm e405/630 nm e subtraia o valor de absorvância a 630 nm dos calibradores e das amostrasdos valores de absorvância a 450 nm e 405 nm. Os valores de absorvância a 450 nm que são superiores à capacidade de leitura lineardo fotómetro devem ser normalizados a valores de absorvância equivalente a 450 nm. Ovalor de absorvância equivalente a 450 nm para uma amostra é obtido multiplicando ovalor de absorvância a 405 nm daquela amostra por 3,2.

Exemplo de cálculoOs seguintes dados devem ser considerados apenas como exemplo e não devem ser us-ados no lugar dos dados obtidos pelo utilizador.

9.1. Critérios de validação do ensaioAs instruções abaixo devem ser usadas para validar o ensaio. Calcule e avalie sempreas absorvâncias médias dos calibradores de cada placa, mesmo que estas pertençam aomesmo lote.O valor de absorvância do poço do branco deve estar entre 0,000 e 0,150:0,000 ≤ BLK ≤ 0,150.A absorvância do calibrador 1 deve ser menor que 0,150:Cal 1 < 0,150.O valor de absorvância de cada calibrador 2 deve estar entre ± 25% da absorvância mé-dia do calibrador 2 (valor l imite). Se um valor de absorvância do calibrador 2 nãopreencher este critério, este deve ser eliminado e a média recalculada entre os dois val-ores restantes:0,75 Cal 2 ≤ Cal 2 ≤ 1,25 Cal 2 .A razão entre a absorvância do calibrador 4 e a absorvância média do calibrador 2 deveser maior ou igual a 4:Cal 4 / Cal 2 ≥ 4.Caso contrário, o teste é inválido e deve ser repetido.

Descrição Absorvânciaa 450/630 nm

Absorvânciaa 405/630 nm

Calibrador 1 (5 UA/mL) 0,062 0,019

Calibrador 2 (20 UA/mL) 0,464 0,145

Calibrador 4 (140 UA/mL) 3,051 1,097

Amostra 1 2,065 0,645

Amostra 2 2,714 0,848

x x

x

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9.2. Interpretação dos resultadosValide sempre o ensaio quando avaliar os resultados (veja par. 9.1, Critérios de vali-dação do ensaio).O teste pode tornar-se qualitativo utilizando só o calibrador 2 com a função de calibradorde cut-off. A presença ou a ausência de IgM anti-VCA pode ser determinada pela com-paração do valor de absorvância das amostras com o índice de absorvância, que é dadopela razão entre a absorvância da amostra e a absorvância média dos três calibradoresde cut-off (valor limite).As amostras com índice de absorvância maior ou igual a 1,0 devem ser consideradas re-activas para IgM anti-VCA. As amostras com índice de absorvância inferior a 1,0 devemser consideradas não reactivas.No exemplo fornecido, as amostras são reactivas para IgM anti-VCA.As amostras com concentrações de IgM anti-VCA dentro da faixa de ± 10% do valor lim-ite devem ser retestadas para confirmar o resultado inicial. As amostras repetidamentereactivas devem ser consideradas positivas. As amostras não reactivas no segundoteste devem ser consideradas negativas. Se o resultado sucessivo à repetição do testefor confirmado como duvidoso, é necessário recolher uma amostra nova depois duas outrês semanas e repetir o teste.

10. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPENHO

10.1. Especificidade analíticaA especificidade analítica pode ser definida como a capacidade do teste de detectar comcuidado o analito específico na presença de factores potencialmente interferentes namatriz da amostra (ex. anticoagulantes, hemólise, efeitos de tratamentos da amostra) oude reacções cruzadas com anticorpos potencialmente interferentes.Estudos controlados de substâncias ou condições potencialmente interferentes demos-traram que o desempenho do ensaio não é afectado por anticoagulantes (citrato desódio, EDTA, heparina), hemólise (até a 2,5 g/L de hemoglobina), lipemia (até a 10 g/Lde triglicéridos ou 10 g/L de colesterol), bilirrubinemia (até a 0,3 g/L de bilirrubina) ou umciclo de congelação e descongelação das amostras. Normalmente, a presença de anti-corpos potencialmente interferentes (anticorpos heterófilos e anticorpos dirigidos contraoutros agentes patogénicos) não interfere de modo significativo no ensaio.

10.2. PrecisãoDiferentes grupos de amostras, que contêm diferentes títulos de analito específico, fo-ram testados para determinar a repetibilidade e a reprodutibilidade do teste (isto é, a va-riabilidade intra e inter-ensaio).

Repetibilidade Grupo A Grupo B Grupo C

Número de determinações 10 10 10Média (UA/mL) 3,89 35,48 127,28Desvio padrão 0,65 1,48 4,37Coeficiente de variação (%) 16,61 4,17 3,44

Reprodutibilidade Grupo D Grupo E Grupo F

Número de determinações 10 10 10Média (UA/mL) 4,11 23,28 57,50Desvio padrão 0,60 1,85 2,59Coeficiente de variação (%) 14,61 7,94 4,51

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10.3. ExactidãoA exactidão do teste foi controlada pelo teste de diluição.

Teste de diluição. Foram testadas diluições em série de dois soros que contêm umaconcentração elevada de IgM anti-VCA efectuadas com o diluente das amostras.

10.4. Especificidade diagnósticaA especificidade diagnóstica é definida como a probabilidade do teste ser negativo naausência do analito específico.A especificidade diagnóstica foi determinada ao testar 250 amostras seleccionadasduma população presumivelmente negativa para IgM anti-VCA (dadores de sangue).Cinco resultados positivos foram observados na população estudada (especificidade di-agnóstica: 98,0%; intervalo de confiança a 95%: 93,40-99,35%). A análise da distribuição dos valores, expressos em UA/mL, observados no meio dumapopulação negativa para IgM anti-VCA (n = 368), indica que 95% da população exami-nada apresenta uma concentração aparente de IgM anti-VCA inferior a 13,3 UA/mL.

10.5. Sensibilidade diagnósticaA sensibilidade diagnóstica é definida como a probabilidade do teste ser positivo napresença do analito específico.A sensibilidade diagnóstica foi determinada ao testar 100 amostras seleccionadas dumapopulação presumivelmente positiva para IgM anti-VCA (doentes com mononucleose in-fecciosa em curso). Quatro resultados negativos foram observados na população estu-dada (sensibilidade diagnóstica: 96,0%; intervalo de confiança a 95%: 90,07-98,90%). A análise da distribuição dos valores, expressos em UA/mL, observados no meio dumapopulação positiva para IgM anti-VCA (n = 158), indica que a população examinada ap-resenta uma concentração aparente de IgM anti-VCA superior a 20 UA/mL.

DiluiçãoConcentração

esperada,UA/mL

Concentraçãomedida,UA/mL

% Recuperação

puro – 162,26 –1:2 81,13 81,52 100,51:4 40,56 40,53 99,91:8 20,28 20,88 103,0

1:16 10,14 10,49 103,5

puro – 158,63 –1:2 79,31 79,17 99,81:4 39,66 40,70 102,61:8 19,83 19,87 100,2

1:16 9,91 9,71 98,0

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11. VALORES ESPERADOSUm resultado positivo (≥ 20 UA/mL) indica infecção recente (até no máximo três mesesantes do teste). Um resultado negativo (< 20 UA/mL), porém, não exclui com certezauma infecção aguda. Em caso de suspeita exposição ao vírus de Epstein-Barr, apesardo resultado negativo do teste da IgM anti-VCA, é necessario recolher uma segundaamostra ao menos uma semana mais tarde e testá-la para observar um aumento signifi-cativo dos níveis de IgM ou IgG anti-VCA, que indica infecção primária em curso.Os anticorpos da classe IgM anti-VCA podem, em geral, ser detectados nos doentescom infecção primária recente por EBV, mas podem-se também encontrar nos doentesimunocomprometidos sujeitos a reactivação da infecção por EBV. Nos doentes assin-tomáticos, é possível observar títulos baixos de IgM anti-VCA, que indicam infecção cró-nica activa por EBV.A interpretação do resultado analítico depende da aplicação clínica específica do teste:portanto, cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores clinicamente relevan-tes para a população considerada. A prevalência pode variar de acordo com área geo-gráfica, idade, condições socioeconómicas, raça, tipo de teste utilizado, modalidade decolheita e preparação das amostras, dados clínicos e epidemiológicos dos doentes.

* É necessário recolher e testar uma segunda amostra.

12. LIMITAÇÕES DO TESTEContaminações bacterianas das amostras, ciclos repetidos de congelação e desconge-lação ou inactivação pelo calor podem afectar os valores de absorvância das amostrascom consequente alteração dos níveis de anticorpos anti-EBV.O diagnóstico duma doença infecciosa não deve basear-se no resultado dum únicoteste, mas é necessário ter em consideração a anamnese e a sintomatologia do doente,assim como os dados serológicos. Todavia, é importante lembrar que os resultados dostestes serológicos devem ser interpretados com cautela nos doentes imunocomprome-tidos.

Esquema de reactividade em ELISAEstágio de infecção por

EBVIgGanti-EA(D)

IgManti-VCA

IgGanti-VCA

IgGanti-EBNA

– – – – Negativo para EBV

– – + + Infecção passada por EBV

–+–

+++

–++

–––

Infecção primária por EBV(fase aguda)

+–

+–

++

+*–*

Infecção primária por EBV(fase de transição)

–+

––

++

++*

Infecção primária por EBV(fase de convalescença)

++

–+

++

+*+*

React ivação da infecçãopor EBV

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13. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕESPara obter resultados fiáveis, é necessário seguir correctamente as instruções de uso epossuir uma adequada formação técnica. Em especial, é essencial uma boa precisão napreparação e distribuição dos reagentes, na aspiração e na lavagem.Resultados não reprodutíveis podem ser devidos a erros de execução, tais como:– troca das tampas dos frascos– uso da mesma ponta para dispensar soluções ou amostras diferentes– exposição dos reagentes ou das amostras ao calor intenso ou a fontes de contami-

nação bacteriana– lavagem inadequada dos poços– contaminação dos rebordos dos poços com o conjugado ou com as amostras– troca de reagentes específicos de diferentes lotes.

São indispensáveis as seguintes precauções adicionais:– para evitar contaminação, utilize um dispensador limpo e exclusivo para o conjugado

enzimático– o tampão de lavagem deve ser armazenado em recipiente limpo para prevenir con-

taminação com substâncias que inactivem a actividade enzimática.

14. REGRAS DE SEGURANÇA– Manuseie com cuidado o cromogénio/substrato e a solução de paragem. Evite o con-

tacto dessas substâncias com agentes oxidantes ou com superfícies metálicas.– Não coma, beba, fume ou aplique cosméticos durante a execução do teste.– Não pipete as soluções com a boca.– Evite o contacto directo com todos os materiais potencialmente infecciosos usando

equipamentos de protecção como luvas descartáveis, óculos e aventais. Lave bem asmãos no final de cada teste.

– Evite salpicos ou formação de aerossóis. Qualquer reagente derramado deve ser la-vado com uma solução de hipoclorito de sódio a 5% e tratado como material residualpotencialmente infeccioso.

– Todas as amostras, os reagentes biológicos e os materiais utilizados nos testes de-vem ser considerados potencialmente capazes de transmitir agentes infecciosos. Porisso, os resíduos devem ser eliminados conforme as regras emitidas pelos órgãos au-torizados que administram o laboratório e conforme o regulamento específico de cadapaís. O material descartável deve ser incinerado, os resíduos líquidos devem serdescontaminados com uma solução de hipoclorito de sódio a 5% no mínimo durantemeia hora. Líquidos que contêm ácido deverão ser neutralizados antes do tratamento.Qualquer material reutilizado deve ser autoclavado usando a abordagem de sobrede-st ru ição (overk i l l ) (USP 24, 2000, p . 2143) . Em gera l , uma hora a 121°C éconsiderado um tempo de esterilização adequado, mas os utilizadores devem verificara eficiência do seu sistema de descontaminação através de validação e utilização roti-neira de indicadores biológicos.

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ESQUEMA DO TESTE

1 - DILUA AS AMOSTRAS A 1:101 COM O DILUENTE DAS AMOSTRAS.

2 - DISTRIBUA OS REAGENTES NOS POÇOS RESPECTIVOS DE ACORDO COM OESQUEMA ABAIXO, DEIXANDO UM POÇO VAZIO PARA O BRANCO:

* Variável depende se o teste é quantitativo ou qualitativo.

3 - INCUBE DURANTE UMA HORA A 37°C.

4 - ASPIRE O LÍQUIDO E LAVE MAIS VEZES COM TAMPÃO DE LAVAGEM.

5 - DISTRIBUA 100 µL DE CONJUGADO ENZIMÁTICO DILUÍDO EM TODOS OSPOÇOS, EXCEPTO NO BRANCO.

6 - INCUBE DURANTE UMA HORA A 37°C.

7 - ASPIRE O LÍQUIDO E LAVE MAIS VEZES COM TAMPÃO DE LAVAGEM.

8 - DISTRIBUA 100 µL DE CROMOGÉNIO/SUBSTRATO EM TODOS OS POÇOS.

9 - INCUBE DURANTE 30 MIN À TEMPERATURA AMBIENTE, AO ABRIGO DA LUZ.

10 - DISTRIBUA 200 µL DE SOLUÇÃO DE PARAGEM EM TODOS OS POÇOS.

11 - LEIA AS ABSORVÂNCIAS NO FOTÓMETRO A 450/630 nm E 405/630 nm.

Distribuído no Brasil por: DiaSorin Ltda - CNPJ 01.896.764/0001-70 Av. Ermano Marchetti, 1435 B - Lapa - São Paulo SP S.A.C 0800 7716216 e-mail: diasorin@diasorin.com.br

REAGENTES N° DE REPLICATAS VOLUME

CALIBRADORES 1-3* 100 µLAMOSTRAS DILUÍDAS 1 100 µL

ETI-EBV-M reverse / JUNE 2008 200/007-620Rev. I

DiaSorin S.p.A. 13040 SALUGGIA (VERCELLI) - ITALYTel. 39.0161.487093 - Fax 39.0161.487628